Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật phân hủy nhựa cây trên nguyên liệu dăm mảnh keo nhằm ứng dụng trong sản xuất bột giấy thân thiện với môi trường

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Trần Thị Hƣơng

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY TRÊN NGUYÊN LIỆU DĂM MẢNH KEO NHẰM ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BỘT GIẤY THÂN THIỆN VỚI MÔI TRƢỜNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Hà Nội - 2020

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Trần Thị Hƣơng

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY TRÊN NGUYÊN LIỆU DĂM MẢNH KEO NHẰM ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BỘT GIẤY THÂN THIỆN VỚI MÔI TRƢỜNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

Hƣớng dẫn : Phan Thị Hồng Thảo

Hà Nội - 2020

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật phân hủy nhựa cây trên nguyên liệu dăm mảnh keo nhằm ứng dụng trong sản xuất bột giấy thân thiện với môi trƣờng” là kết quả nghiên cứu của mình không có sự sao chép của ngƣời khác. Đề tài là sản phẩm mà tôi đã nỗ lực nghiên cứu trong quá trình học tập tại Học viện và làm việc tại phòng Vi sinh vật đất.

Số liệu và kết quả nghiên cứu thực hiện trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chƣa từng sử dụng và công bố ở bất kì công trình nào khác. Tất cả các tài liệu tham khảo sử dụng để viết bài đều có nguồn gốc rõ ràng, dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Phan Thị Hồng Thảo – Trƣởng phòng Vi sinh vật đất – Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ.

Tôi xin cam đoan tất cả các điều trên là sự thật, nếu có vấn đề gì tôi xin

chịu hoàn toàn trách nhiệm.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Học viên

Trần Thị Hƣơng

Lời cảm ơn

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS. Phan Thị Hồng Thảo – Trƣởng phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghê Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học đã hƣớng dẫn, định hƣớng nghiên cứu và tận tình giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu làm luận văn tốt nghiệp.

Em cũng xin cám ơn các thầy, cô trong Ngành Sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong khoảng thời gian đào tạo tại đây.

Em cũng xin gửi lời cám ơn tới toàn thể cán bộ phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về phƣơng tiện, hƣớng dẫn em trong suốt quá trình thực tập.

Em xin cảm ơn kinh phí của đề tài: “Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học để phân hủy nhựa cây trong dăm mảnh gỗ keo, bạch đàn làm nguyên liệu sản xuất bột giấy thân thiện với môi trƣờng tại Việt Nam: Mã số: 05/HĐ- ĐT.05.18/CNSHCB của TS. Phan Thị Hồng Thảo.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Học viên

Trần Thị Hƣơng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABTS Adt CMC DNA DNSA pNBP RBBR Tris-HCl U VSV : 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) : Tấn khô gió : Carboxymethyl Cellulose : Deoxyribonucleic acid : 3,5-dinitrosalicylic acid : p -nitrophenyl butyrate : Remazol Brilliant Blue R : Tris hydrochloride : Unit : Vi sinh vật

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3. 1. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn phân lập ở nhiệt độ 37oC và 45oC trong các mẫu .................................................................................................. 31 Bảng 3. 2. Khả năng phân hủy stigmassterol, sinh tổng hợp cellulase và lipase của vi khuẩn, xạ khuẩn phân lập ..................................................................... 36 Bảng 3.3. Hoạt tính enzym sterol esterase, laccase và cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập ở 37oC ................................................................................ 41 Bảng 3. 4. Hoạt tính enzym sterol esterase, laccase và cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập ở 45oC ................................................................................ 42 Bảng 3. 5. Khả năng phân hủy nhựa của các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn tuyển chọn ................................................................................................................. 45 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng CVSVC1-1 ...................................................................................................... 48 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng phát triển của CVSVC1-1 ...................................................................................................... 48 Bảng 3.8. Mức độ tƣơng đồng di truyền giữa chủng CVSVC1-1 với các loài vi khuẩn có họ hàng gần dựa vào trình tự gen16S rDNA ............................... 50 Bảng 3. 9. Khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym của chủng CVSVC1-1 trên một số môi trƣờng khảo sát .................................................. 51 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến sinh trƣởng và hoạt tính enzyme sterol esterase, laccase và cellulase của chủng CVSVC1-1 ............................ 55 Bảng 3. 11. Khả năng sinh sterol esterase, laccase và cellulase của chủng CVSVC1-1 trên dăm mảnh gỗ ở các tỷ lệ giống khác nhau ........................... 58 Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến khả năng giảm nhựa trên nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo ..................................................................................... 59 Bảng 3.13. Hiệu suất nấu bột ở một số mẫu có lƣợng nhựa giảm tốt ............. 60 Bảng 3. 14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng giảm nhựa của chủng CVSVC1-1 ...................................................................................................... 60 Bảng 3. 15. Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng giảm nhựa của chủng CVSCV1-1 ...................................................................................................... 61

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1. Đồ thị đƣờng chuẩn Glucose ........................................................... 28 Hình 3. 1. Hình ảnh vi sinh vật phát triển trên môi trƣờng phân lập .............. 31 Hình 3.2. Khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn trên môi trƣờng phân lập lỏng ....................................................................................... 33 Hình 3.3. Khả năng sinh enzym lipase ngoại bào của một số chủng phân lập34 Hình 3.4. Khả năng sinh cellulase ngoại bào của một số chủng phân lập ...... 34 Hình 3.5. Dăm mảnh gỗ keo đƣợc ngâm ngập trong dịch lên men của các chủng tuyển chọn ............................................................................................ 44 Hình 3.6. Quá trình chiết nhựa ........................................................................ 45 Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào vi khuẩn CVSVC1-1 dƣới kính hiển vi quang học (100x) (B) và kính hiển vi điện tử ở độ phóng đại (50000X) (C) và (10000X) (D) ........................................................................................ 46 Hình 3.8. Khả năng sinh bảo tử của chủng vi khuẩn CVSVC1-1 .................. 47 Hình 3.9. Khả năng phân hủy một số cơ chất của vi khuẩn CVSVC1-1 ........ 49 Hình 3.10. Điện di đồ DNA tổng số (A), sản phẩm PCR (B) trên gel agarose 1,0 % và cây phát sinh chủng loài của vi khuẩn CVSVC1-1 ......................... 50 Hình 3.11. Khả năng sinh trƣởng của chủng CVSVC1-1 trên các môi trƣờng khảo sát ............................................................................................................ 51 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ (A) và pH (B) đến khả năng sinh trƣởng của chủng CVSVC1-1 trên môi trƣờng MPA bổ sung 0,5g/L ....................... 53 Hình 3. 13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính enzyme sterol esterase và laccase của chủng CVSVC1-1 ...................................................... 53 Hình 3. 14. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy đến hoạt tính enzyme sterol esterase và laccase của chủng CVSVC1-1 ................................................................... 54 Hình 3.15. Nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo đƣợc xử lý với chủng CVSVC1-1 ở các tỷ lệ giống bổ sung khác nhau .................................................................. 57 Hình 3.16. Nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo đƣợc xử lý với chủng CVSVC1-1 sau rửa và sấy .................................................................................................. 57 Hình 3.17. Mật độ vi sinh trên mẫu có và không bổ sung chủng CVSVC1-1 ở nồng độ 105 ...................................................................................................... 57

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU .............................................................................. 6

DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................ 7

MỤC LỤC ......................................................................................................... 8

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3

1.1. PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT BỘT GIẤY ........................................... 3

1.2. NHỰA CÂY VÀ NHỮNG TÁC ĐỘNG CỦA CHÚNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT GIẤY ............................................................. 5

1.2.1. Nhựa cây ................................................................................................. 5 1.2.2. Tác động của nhựa cây đến quá trình sản xuất bột giấy ......................... 7 1.3. VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY ................................................ 9

1.3.1. Nấm phân hủy nhựa cây .......................................................................... 9 1.3.2. Vi khuẩn, xạ khuẩn phân hủy nhựa cây. ............................................... 12 1.3.3. Hệ enzym phân hủy nhựa cây. .............................................................. 14 1.3.2.1. Esterase .............................................................................................. 14 1.3.2.2. Lipase ................................................................................................. 15 1.3.2.3. Laccase ............................................................................................... 16 1.3.4. Cơ chế phân hủy lignin và các chất chiết trong gỗ ............................... 17 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ............................................................................ 22 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................ 22 2.1.2. Thiết bị .................................................................................................. 22 2.1.3. Hóa chất................................................................................................. 22 2.1.4. Môi trƣờng ............................................................................................ 23 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 23 2.2.1. Chuẩn bị chất chiết nhựa cây ................................................................ 23 2.2.2. Phƣơng pháp sàng lọc vi sinh vật phân hủy nhựa. ................................ 23

2.2.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật đƣợc tuyển trọn. ............................................................................................. 24 2.2.4. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật và thu nhận enzym.......................... 25 2.2.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzym ................................................ 26 2.2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nhựa cây bằng chiết trong aceton .. 29 2.2.7. Phƣơng pháp nấu bột giấy sunfate ........................................................ 29 2.2.8. Phƣơng pháp xác định chỉ số Kappa (đánh giá hàm lƣợng lignin) ....... 30 2.2.9. Phƣơng pháp phân tích thống kê. .......................................................... 30 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 31

3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÀ XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA CÂY. ........................................................ 31 3.1.1. Phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân hủy nhựa cây ......................................................................................... 31 3.1.2. Khả năng sinh tổng hợp sterol esterase, laccase và cellulase của các chủng tuyển chọn .................................................................................. 40 3.1.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn có khả năng phân hủy nhựa

cây 43

3.2. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG CVSVC1-1 ............................................................................... 46 3.2.1 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của chủng vi khuẩn CVSVC1-1 ................................................................................. 46 3.2.2. Định danh chủng vi sinh vật tuyển chọn bằng phƣơng pháp phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA ................................................................. 49 3.3. NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP STEROL ESTERASE CỦA CHỦNG CVSVC1-1 ................................ 51 3.3.1. Lựa chọn môi trƣờng thích hợp cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp một số enzym của chủng CVSVC1-1 .......................................................... 51 3.3.2. Ảnh hƣởng cả các yếu tố nhiệt độ, pH và tốc độ lắc đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym của chủng CVSVC1-1 ....................... 52 3.4. NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN BỔ SUNG VI SINH VẬT TUYỂN CHỌN VÀO DĂM MẢNH GỖ KEO. ................................................... 56 3.4.1. Ảnh hƣởng tỷ lệ giống đến khả năng sinh trƣởng và loại nhựa............ 56

3.4.3. Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng giảm nhựa cây trong dăm mảnh gỗ ......................................................................................................... 61 4.1. Kết luận ................................................................................................... 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 63

MỞ ĐẦU

Sản xuất giấy đƣợc xem nhƣ là một ngành công nghiệp trọng điểm của nhiều quốc gia trên thế giới. Các sản phẩm từ giấy không chỉ đƣợc sử dụng trong ngành giáo dục, báo chí, in ấn, hội họa… mà còn đƣợc sử dụng trong nhu cầu tiêu dùng hàng ngày khác của con ngƣời nhƣ khăn giấy, giấy vệ sinh, thùng chứa… Ngày nay, các sản phẩm từ giấy còn đƣợc khuyến khích trong việc sử dụng làm bao bì, giấy gói, dụng cụ dùng một lần v.v. nhằm hạn chế rác thải nhựa.

Hiện nay, công nghệ sản xuất giấy đã đƣợc cải tiến nhiều kể cả về trang thiết bị máy móc cũng nhƣ quy trình sản xuất để có thể đáp ứng nhu cầu thị hiếu của khách hàng. Tuy nhiên, ngành giấy vẫn gặp nhiều vấn đề liên quan tới tiêu thụ năng lƣợng, nƣớc và ô nhiễm môi trƣờng do phải sử dụng một lƣợng lớn hóa chất trong sản xuất. Một trong những khó khăn lớn mà ngành giấy hiện nay đang gặp phải là những ảnh hƣởng của nhựa cây đến quá trình sản xuất và chất lƣợng của giấy. Mặc dù hàm lƣợng của nhựa cây chỉ chiếm 2-8%, nhƣng với thành phần và đặc điểm cấu tạo các chất nhựa trong gỗ có thể gây ra những vấn đề nghiêm trọng, ảnh hƣởng đến hiệu quả của quá trình công nghệ và chất lƣợng sản phẩm. Nhựa cây đóng cặn làm giảm chất lƣợng của bột giấy và có thể gây ngừng quá trình nghiền bột, giảm hiệu quả sản xuất và tăng chi phí để loại bỏ hay kiểm soát nhựa cây. Thành phần nhựa trong gỗ keo bao gồm: sáp, axit béo, các alkanol, các chất chiết hydroxy, rƣợu béo, các trygliceride, diglyceride, sterol, steryl ester, phospholipid và một số thành phần khác. Các thành phần axit béo không xà phòng hóa đƣợc (ví dụ các alkanol, sterol, este và steryl) và các axit béo chuỗi dài bão hòa và không bão hòa rất khó xử lý trong quá trình sản xuất giấy vì chúng không đƣợc loại bỏ trong quá trình nấu, tẩy trắng và rửa bột. Để hạn chế vấn đề nhựa cây, có thể sử dụng các phƣơng pháp truyền thống, hóa học và sinh học.

Trong những năm gần đây, ứng dụng công nghệ sinh học trong việc sản xuất bột giấy đƣợc xem nhƣ là một công nghệ sản xuất sạch với mục đích tăng sản lƣợng và chất lƣợng giấy, thân thiện với môi trƣờng. Phƣơng pháp này đã thu hút nhiều sự quan tâm, chú ý không chỉ của các nhà nghiên cứu mà

còn cả các cấp quản lý và các nhà sản xuất giấy. Trong phƣơng pháp này, các chủng vi sinh vật có khả năng tiết ra hệ enzym phân hủy nhựa cây đƣợc sử dụng trong giai đoạn tiền xử lý nguyên liệu nhằm giảm hàm lƣợng nhựa cây trong nguyên liệu giúp giảm hóa chất sử dụng, bảo vệ môi trƣờng và tăng quá trình chạy máy. Trong tự nhiên, các loài nấm mốc, nấm dát gỗ, nấm đảm, vi khuẩn, xạ khuẩn đều là các đối tƣợng đã và đang đƣợc quan tâm trong nghiên cứu giảm nhựa nhờ hệ enzym phong phú nhƣ esterase, laccase, lipase v.v. Nấm đảm và nấm dát gỗ trƣớc nay đƣợc xem là hai đối tƣợng đƣợc quan tâm nhiều nhất, tuy nhiên sức phát triển và khả năng chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trƣờng là một nhƣợc điểm của chúng. Xuất phát từ thực tế đó, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật phân hủy nhựa cây trên nguyên liệu dăm mảnh keo nhằm ứng dụng trong sản xuất bột giấy thân thiện với môi trƣờng”, nhằm giảm ảnh hƣởng của nhựa cây đến quá trình sản xuất bột giấy.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT BỘT GIẤY

Hiện nay có 2 phƣơng pháp chính để sản xuất bột giấy là phƣơng pháp

truyền thống (cơ học) và phƣơng pháp hóa học.

Sản xuất bột giấy bằng phƣơng pháp truyền thống là phƣơng pháp đƣợc áp dụng tại nhiều nhà máy lớn và nhỏ. Trong phƣơng pháp này, nguyên liệu dăm mảnh đƣợc thu mua và lƣu kho trong thời gian dài. Trong quá trình bảo quản, dăm mảnh đƣợc tiến hành phun nƣớc giảm hàm lƣợng nhựa. Ƣu điểm của phƣơng pháp truyền thống là tận dụng nguồn vi sinh vật và các tác nhân bên ngoài để phân hủy một số thành phần nhựa trong nguyên liệu giúp giảm chi phí trong quá trình sản xuất. Tuy nhiên, nó lại không kiểm soát đƣợc các loài vi sinh vật gây hại, do đó, rất dễ gây thất thoát Cellulose, giảm hiệu xuất thu hồi và ảnh hƣởng đến chất lƣợng bột giấy. Việc áp dụng phƣơng pháp truyền thống vào sản xuất bột giấy cũng chỉ giảm tối 20% hàm hƣợng nhựa, chủ yếu là các hợp chất dễ phân hủy, các thành phần khó phân hủy nhƣ sterol, sterol este, axit nhựa,… vẫn đƣợc giữ lại trong nguyên liệu gây ra các vấn đề trong sản xuất bột giấy. Hiệu suất thu hồi bột đạt từ 85 – 98%, chi phí thấp. Bột giấy sản xuất theo phƣơng pháp này thƣờng có khả năng thấm hút mực in tốt nên thƣờng đƣợc sử dụng trong một số sản phẩm nhƣ: giấy in báo, giấy in tạp chí cao cấp (SC), giấy in tạp chí có tráng nhẹ (LWC), giấy dán tƣờng, giấy làm bao bì (FBB), giấy in giấy viết thông thƣờng... Tuy nhiên, chất lƣợng bột giấy thƣơng phẩm khi sản xuất bột giấy lại có nhiều điểm hạn chế nhƣ: giấy thƣờng bị đục, không bền, dễ bị thủng…

Sản xuất giấy bằng phƣơng pháp hóa học là sử dụng hóa chất để biến đổi nguyên liệu ban đầu thành bột giấy (bột hóa học). Các dăm mảnh gỗ đƣợc xử lý hóa học bằng cách nấu. Sau khi nấu 12 đến 15 tiếng xơ sợi sẽ đƣợc tách ra khỏi các thành phần cứng và thu đƣợc sợi cellulose. Bột giấy đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp hóa học đã cải thiện đáng kể về chất lƣợng thành phẩm. Phƣơng pháp hoá học đã loại bỏ triệt để lignin nên bột giấy hóa học có chất lƣợng tốt hơn so với bột giấy cơ học. Bên cạnh đó, phƣơng pháp này cũng có những mặt hạn chế nhất định đặc biệt là hiệu suất thu hồi bột không cao, chỉ

đạt 40 - 50%. Bên cạnh đó việc sử dụng một lƣợng lớn hóa chất gây ảnh hƣởng đến môi trƣờng xung quanh, tốn kém chi phí trong quá trình xử lý.

Bột Sulfat (bột Kraft): Dịch nấu gỗ gồm (NaOH + Na2S) (có thể bổ sung xúc tác và các chất trợ nấu), pH từ 13 trở lên, nhiệt độ từ 155-170oC, thời gian 2 - 4 giờ. Nhƣợc điểm lớn nhất của phƣơng pháp này là sinh ra hợp chất lƣu huỳnh có mùi thối, gây tác động lớn đến môi trƣờng xung quanh. Nấu kiềm, đặc biệt là nấu sunfat, là phƣơng pháp phổ biến nhất hiện nay, sản xuất ra phần lớn lƣợng bột giấy hằng năm. Hiện nấu sunfat (Kraft) là phƣơng pháp đƣợc áp dụng ở quy mô lớn tại nhà máy Giấy Bãi Bằng của Tổng Công ty Giấy VN và tại Công ty cổ phần giấy An Hòa, hai nhà máy có thị phần bột giấy nấu từ nguyên liệu thô lớn nhất Việt Nam. Nguyên liệu chính dùng trong sản xuất chủ yếu là gỗ keo và bạch đàn. Tuy nhiên lƣợng gỗ keo chiếm trên 70%. Tại tổng Công ty Cổ phần giấy An Hòa, quy mô sản xuất bột giấy Kraft, nấu liên tục, tƣơng đối lớn 130.000 tấn/năm, bột giấy đƣợc tẩy trắng theo quy trình tẩy tiên tiến không sử dụng clo nguyên tố. Hiện tại hai nhà máy này chịu ảnh hƣởng nặng nề của vấn đề nhựa cây, làm giảm năng suất quá trình sản xuất bột giấy và tăng giá thành sản xuất.

Hiện nay, ngoài hai phƣơng pháp sản xuất bột giấy trên các nhà máy sản xuất giấy cũng đang hƣớng đến một phƣơng pháp sản xuất sạch hơn, giảm thiểu những tác động của nhựa cây đến môi trƣờng. Xử lý giấy bằng phƣơng pháp sinh học không chỉ giúp loại bỏ nhựa trên nguyên liệu, chúng còn làm giảm lƣợng hóa chất sử sụng trong quá trình xử lý, giảm năng lƣợng tiêu thụ và chi phí sản xuất. Phƣơng pháp sinh học thƣờng đƣợc áp dụng trong giai đoạn tiền xử lý nguyên liệu nhằm giảm hàm lƣợng nhựa, trong giảm năng lƣợng nghiền hoặc tẩy trắng bột giấy,… Trên thế giới, một số chế phẩn phân hủy nhựa cây đã đƣợc sử dụng trong xử lý gỗ mềm nhƣ Cartapip 97 đƣợc tạo thành từ các chủng bạch tạng của Ophiostoma piliferum. Sử dụng chế phẩm Cartapip có thể loại đƣợc đến 90% hàm lƣợng các triglycerides, cao hơn so với phƣơng pháp lƣu giữ gỗ, tuy nhiên, hiệu quả loại các axit nhựa, sterol este và sáp trong 2 tuần tƣơng tự so với bảo quản tự nhiên trong cùng một điều kiện. Ở Việt Nam, sản xuất bột giấy bằng phƣơng pháp sinh học chƣa đƣợc áp

dụng, chúng chỉ là những thử nghiệm của các đề tài, dự án trên các nhà máy, tuy nhiên, các kết quả thu đƣợc mang lại nhiều triển vọng trong sƣ phát triển bền vững của ngành Giấy.

1.2. NHỰA CÂY VÀ NHỮNG TÁC ĐỘNG CỦA CHÚNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT GIẤY

1.2.1. Nhựa cây

Nhựa cây chỉ chiếm một lƣợng nhỏ 2 – 8% khối lƣợng gỗ nhƣng chúng lại cần thiết cho sự sống của cây. Trong cây đang sống, nhựa cây đƣợc tạo ra để bảo vệ cây khỏi bị vi sinh vật tấn công phá hủy các mô gỗ. Tƣơng tự nhƣ vậy là vai trò của dịch rỉ (exdudates), đƣợc đùn ra ở những chỗ cây bị tổn thƣơng bởi tác động bên ngoài. Nhựa cây là nhân tố chính góp phần tạo ra màu sắc, mùi hƣơng và độ bền của gỗ. Một số chất chiết còn có hoạt tính sinh học nên từ lâu nhiều loại gỗ đã đƣợc dùng làm dƣợc liệu hoặc thuốc [1,2]. Trong công nghiệp chế biến đồ dùng từ gỗ, nhựa cây có ảnh hƣởng tới quá trình sấy khô, khả năng kết dính, tính hút ẩm và âm thanh của gỗ [1]. Trong ngành sản xuất vật liệu composite từ chất dẻo và gỗ sử dụng trong xây dựng và công nghiệp ô tô, thì gỗ cũng đƣợc sử dụng nhƣ một thành phần gia cố, tuy nhiên, hàm lƣợng nhựa trong gỗ cao có thể dẫn tới những tính chất không mong muốn của vật liệu composite [3,4]. Nhựa cây không tan trong nƣớc nhƣng tan đƣợc trong dầu mỏ và một số dung môi hữu cơ trung tính, có độ phân cực thấp. Thành phần hóa học của nhựa cây bao gồm các axit béo tự do, axit nhựa, sáp, các rƣợu béo, steryl este, các sterol, glyceride, ketone và các hợp chất chứa oxy khác. Theo Black và Ekman (2000), có thể chia các hợp chất trong thành phần nhựa cây gồm 4 nhóm chính nhƣ [5]:

- Các chất béo (triglyxerit) và axit béo; - Steryl este và sterol; - Terpen và terpenoid (các axit nhựa và polyisopren); - Các chất sáp (ester của rƣợu béo và axit béo).

Nhựa cây đƣợc chứa chủ yếu ở trong các kênh dẫn nhựa (resin canals), trong các túi nhựa (resin pockets), trong các tế bào nhu mô (parenchyma cells) hoặc ở một số tế bào chỉ có ở một số loại gỗ cứng nhiệt đới nhƣ các tế

bào dầu (oil cells) và các tế bào latex (latex cells). Nhựa trong các kênh dẫn nhựa thông thƣờng là hỗn hợp vô định hình của các terpen và terpenoit mạch vòng đƣợc hình thành từ các đơn vị isopren nhờ sự tiếp xúc của các enzyme tạo mạch vòng xyclaza. Theo một số tài liệu nghiên cứu, hàm lƣợng và thành phần hóa học của nhựa cây phụ thuộc vào loài cây, độ tuổi, yếu tố về di truyền, mùa sinh trƣởng, điều kiện phát triển (ánh sáng, độ ẩm, thành phần dinh dƣỡng của đất,…), khí hậu vùng miền. Các cây trồng ở vùng có khí hậu ấm áp có lƣợng axit béo bão hòa cao hơn. Thậm chí giữa các bộ phận khác nhau của cây cũng có sự khác biệt đáng kể. Nhựa cây thƣờng có nhiều trong tâm gỗ hơn so với ở dát gỗ, tạo nên một môi trƣờng bảo quản tự nhiên cho tâm gỗ. Trong các kênh dẫn nhựa và tế bào biểu mô chứa nhiều chất chiết có vai trò quan trọng trong quá trình bảo quản gỗ, giúp duy trì các đặc tính của gỗ. Nhựa ở gỗ mềm có chứa 90% hàm lƣợng các chất xà phòng hoá cao là các axit nhựa và axit béo. Các axit nhựa, axit béo, triglyceride, sterol và các este của chúng là các nhóm chất béo chính của nhựa gỗ vân sam và thông. Các triglyceride chiếm ƣu thế ở phần dát gỗ của cả vân sam và thông trong khi ở tâm gỗ thông chứa nhiều axit nhựa, gấp khoảng 2 lần so với phần dát gỗ. Nhựa của gỗ cứng bạch dƣơng và gỗ dƣơng có nhiều các sterol và các chất béo không xà phòng hóa hơn so với gỗ mềm mặc dù vẫn chứa nhiều triglyceride. Các sterol este và sáp cũng có trong nhựa của gỗ dƣơng, nhựa gỗ bạch dƣơng có triterpenol và các axit béo bão hòa.

(2,5%) ở gỗ keo 6

(5,95%),

Thành phần nhựa có trong gỗ keo bao gồm: đối với gỗ keo trên 5 tuổi thành phần nhựa chủ yếu là 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl-với hàm lƣợng lên đến trên 70%, hợp chất này giảm khi độ tuổi tăng. Tuy nhiên, xuất hiện một số hợp chất mới với hàm lƣợng tƣơng đối nhƣ 1,2-benzenedicarboxylic tuổi và 1,2- acid, bis(2-ethylhexyl) ester benzenedicarboxylic acid, diisooctyl ester (2-hydroxyethyl)- triphenylphosphonium chloride (8,06%) trên gỗ keo 7 tuổi. Ngoài ra còn có các axit béo, axit nhựa (axit n – hexadecanoic, axit octadecanoic) trong thành phần nhựa cây.

1.2.2. Tác động của nhựa cây đến quá trình sản xuất bột giấy

Trong sản xuất bột giấy, nhựa cây là thành phần không mong muốn nên

cần đƣợc loại bỏ một cách triệt để.

Trong quá trình nấu bột giấy sunfat, một phần axit béo, axit nhựa tự do, triglyxerit, steryl ester phản ứng với xút, đƣợc xà phòng hóa và tan vào trong dịch nấu. Tuy nhiên, nhựa đã xà phòng hóa vẫn có thể kết hợp với các thành phần nhựa không xà phòng hóa, rất dễ kết tủa tạo ra cặn nhựa trên bề mặt các bộ phận của thiết bị trong dây chuyền khi điều kiện của quá trình sản xuất (độ pH và nhiệt độ) thay đổi [6]. Hơn nữa, các hợp chất hữu cơ trong nhựa thƣờng tƣơng tác với nhau và với các hóa chất trong quá trình nấu bột và làm giấy, tạo ra cặn nhựa (pitch deposit). Cặn nhựa dính vào các lƣới lô rửa làm giảm hiệu quả rửa bột giấy, gây đóng cặn ở các thiết bị chƣng bốc dịch đen, nhất là thiết bị chƣng bốc màng rơi, làm giảm năng suất do phải dừng để rửa thiết bị và tiêu tốn thêm nhiên liệu. Nhựa cây liên kết với lignin trong dịch đen, kết thành mảng dày trên bề mặt bể, gây khó khăn cho công đoạn oxy hóa dịch đen [7,8]. Mặt khác, các chất chiết nhựa này trong bột sau nấu và rửa vẫn có thể bám trên xơ sợi, cản trở sự liên kết giữa các xơ sợi và làm giảm độ bền của giấy trong quá trình xeo vì gây đứt giấy. Trong quá trình tẩy trắng bột giấy, các chất nhựa này đƣợc tách ra và tích lũy trong nƣớc trắng, nhƣng dễ kết hợp với các hóa chất khác (nhƣ cacbonat canxi) tạo thành các hạt màu đen bám lên thành đƣờng ống, bể chứa và bề mặt của các thiết bị và có thể tạo thành mảng lớn rơi vào dòng bột. Trong quá trình sản xuất bột giấy Kraft và tẩy trắng bằng ClO2 có tới 80% axit béo của gỗ keo vẫn còn lƣu lại trong bột giấy tẩy trắng, vì vậy có khả năng tạo cặn nhựa rất cao [9]. Cặn nhựa còn lại trong bột sẽ làm giảm chất lƣợng của giấy sản phẩm nhƣ đốm đen, đứt gẫy giấy, thủng, mỏng (ở vị trí có nhựa cây) và tạo ra vùng giấy không bám mực khi in ấn [10]. Ở những nhà máy có mức độ tuần hoàn nƣớc sản xuất cao thì vấn đề này càng trở nên nghiêm trọng hơn. Nhƣ vậy, nếu không loại bỏ tối đa đƣợc nhựa cây trong các giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu và nấu bột thì sẽ làm giảm hiệu quả hoạt động của thiết bị, giảm chất lƣợng giấy và hiệu quả kinh tế. Bên cạnh đó, trong nƣớc rửa bột, 20-70% độc tính đƣợc xác định là do các

axit nhựa từ nguyên liệu gỗ, rất khó bị phân hủy và thƣờng tạo thành các keo tụ. Các hợp chất này và dẫn xuất của chúng, nhƣ dehydroabietin hay tetrahydroretene, đƣợc xác định là rất độc hại cho động vật thủy sinh trong các lƣu vực nhận dòng thải từ nhà máy.

Trong quá trình sản xuất bột giấy, nhựa cây tiếp tục đƣợc giảm thiểu bằng hóa chất, làm tăng lƣợng hóa chất cần phải xử lý trong nƣớc tuần hoàn và nƣớc thải. Nƣớc thải từ các nhà máy giấy và bột giấy có chứa nồng độ cao lignin và các axit nhựa bị tích tụ từ quá trình xử lý hóa và cơ học của gỗ, và lắng đọng lại trong nƣớc, gây ra ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng. Axit nhựa (là một chất chiết xuất trong nhựa cây và có thể chiếm 0,2-0,8% tổng trọng lƣợng của gỗ) trong nƣớc thải từ các nhà máy sản xuất bột giấy hóa học là nguồn gây độc tính chính (chiếm 70% tổng số các chất gây độc) gây ảnh hƣởng đến cá và các loài động vật thủy sinh khác [11].

Hiện nay, ngành sản xuất bột giấy và giấy đang chịu áp lực nặng nề do yêu cầu giảm xả thải các hợp chất hữu cơ (axit béo, axit nhựa v.v.) có độc tính cao vào môi trƣờng. Để hạn chế sự tạo cặn nhựa trong dây chuyền sản xuất và giảm xả thải, cần phải loại bỏ đƣợc các hợp chất này trong nguyên liệu gỗ trƣớc khi sản xuất bột giấy. Thông thƣờng, nhựa cây trong nguyên liệu đƣợc loại bớt bằng cách lƣu giữ trên sân bãi từ 15 – 45 ngày trƣớc khi đƣa vào nấu. Trong quá trình bảo quản, các axit béo và rƣợu béo sẽ bị thủy phân bởi các yếu tố môi trƣờng, một số steryl este và sterol, các axit nhựa ester của rƣợu béo và axit béo cũng đƣợc loại bỏ bởi vi sinh vật tạp nhiễm.

Ngoài ra, độ tuổi, mùa khai thác cũng quyết định hàm lƣợng nhựa trên nguyên liệu. Thời gian bảo quản của nguyên liệu gỗ bạch đàn có tỷ lệ giảm hàm lƣợng nhựa sau 03 tháng bảo quản cao nhất từ 56,5 % (5 tuổi) đến 72,2% (6 tuổi), nguyên liệu gỗ keo hàm lƣợng nhựa giảm sau 03 tháng bảo quản từ 55,2% (6 tuổi) và 43% (7 tuổi). Mức giảm hàm lƣợng nhựa trung bình có trong nguyên liệu giảm 10 – 20% sau 30 ngày bảo quản đối với các loại nguyên liệu, độ tuổi cây và mùa khai thác. Hàm lƣợng nhựa có xu hƣớng tăng khi độ tuổi của cây nguyên liệu tăng và mùa khai thác là một trong những yếu tố ảnh hƣởng rất quan trọng đến hàm lƣợng nhựa trong nguyên liệu. Nguyên

liệu gỗ keo, bạch đàn khai thác vào mùa xuân có hàm lƣợng nhựa cao hơn so với mùa hạ, mùa thu và mùa đông. Khai thác vào mùa thu và mùa đông hàm lƣợng nhựa trong nguyên liệu (bạch đàn, keo) giảm từ 10 – 30% so với nguyên liệu (bạch đàn, keo) khai thác vào mùa xuân. Hàm lƣợng nhựa trong nguyên liệu khai thác vào mùa hạ giảm từ 1 – 5% so với nguyên liệu đƣợc khai thác vào mùa xuân. Các phƣơng pháp giảm nhựa trên chủ yếu là giải pháp tạm thời vì lƣợng nhựa giảm khá ít, hàm lƣợng nhựa giảm chủ yếu là các axit béo dễ bị tác động bởi nhiệt độ, độ ẩm, các chất sterol este hầu nhƣ không bị ảnh hƣởng nhiều. Không những thế, việc giảm nhựa bằng phƣơng lƣu kho sẽ làm mất kiểm soát đối với sự phát triển và tác động của vi sinh vật gây thất thoát cellulose ảnh hƣởng đến chất lƣợng bột giấy bị giảm sút

1.3. VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY

1.3.1. Nấm phân hủy nhựa cây

Nấm mốc

Nấm mốc có khả năng phân hủy các chất chiết trên nhựa nhƣng sự phát triển trên gỗ kém hơn các loại nấm khác. Chúng phát triển tốt trên gỗ ƣớt hoặc gỗ lƣu trữ ở độ ẩm cao trong thời gian dài. Đối với gỗ mềm nấm mốc phát triển chủ yếu trên bề mặt, còn đối với gỗ cứng, mốc có thể xâm nhập vào mô mềm hở hoặc tế bào vỡ, rồi phát triển trong khối gỗ. Nấm mốc phát triển trên gỗ chủ yếu thuộc chi Penicillium, Trichoderma, Rhizopus và Aspergillus. Tuy nhiên, sự phát triển của nấm mốc trên gỗ làm giảm chất lƣợng nguyên liệu, do chúng phân hủy đồng thời cellulose.

Nấm dát gỗ

Một nhóm nấm túi nhỏ hay còn gọi là nấm dát gỗ, phát triển và xâm nhập qua các tế bào nhu mô và kênh dẫn nhựa. Chúng gây ra sự thay đổi màu sắc trên các mô nhựa do khả năng sinh sắc tố melanin trên sợi nấm [8] nhƣng chúng lại có khả năng thủy phân môt số thành phần nhựa thành các chất hòa tan trong nƣớc [12]. Do hầu hết các hợp chất lipophilic đều tích tụ và tập trung ở các tia gỗ và kênh nhựa, nên nấm dát gỗ là ứng cử viên đầu tiên cho việc sử lý nhƣa. Với khả năng xâm nhiễm nhanh trên cả nguyên liệu không vô trùng, chúng có thể hạn chế sự phát triển của vi sinh vật tạp nhiễm và kiểm

soát sinh học cao [8]. Các loài nấm dát gỗ, đại diện là Ophiostoma, Ceratocystis, Leptographium và Sphareopsis, sử dụng axit béo, triglycerid, carbohydrat đơn giản, và các thành phần khác của gỗ [13]. Một số ít loài nấm trong nhóm này không có khả năng sinh sắc tố melanin, còn đƣợc gọi là các chủng nấm bạch tạng, các loài này thƣờng thuộc chi Ophiostoma nhƣ Ophiostoma valdivianum, O. piliferum, Ophiostoma ainoae… có khả năng giảm nhựa tốt, không gây biến đổi màu sắc của nguyên liệu và không gây ảnh hƣởng đến các thành phần chính của gỗ nhƣ cellulose, lignin và phân hủy nhẹ hemicellulose. Hiện nay, loài O. piliferum đã đƣợc ứng dụng trong sản suất chế phẩm Cartapip 97, là sản phẩm của công ty Parrac Ltd. (New Zealand) dùng trong xử lý nguyên liệu gỗ thông. Chế phẩm Cartapip 97 có khả năng loại bỏ 60% sterol tự do trên gỗ mềm, tuy nhiên, hiệu quả trong việc loại bỏ nhựa trên gỗ cứng còn hạn chế [14,15].

Nấm đảm (basidiomycetes)

Nấm đảm loài loài nấm lớn có khả năng hình thành quả thể trong điều kiện tự nhiên. Ở giai đoạn sinh dƣỡng, các loài nấm đảm phát triển thành dạng sợi bám sát bề mặt hoặc ăn sâu vào trong thân gỗ. Giai đoạn sinh sản, chúng hình thành các bào tử đảm chứa trong những thân hình dùi gọi là đảm (quả thể). Các loài nấm mục trắng (white-rot fungi), nấm mục nâu (brown-rot fungi) và nấm mục mềm (soft-rot fungi) đều thuộc ngành nấm đảm, chúng có khả năng phát triển nhanh trên gỗ. Một số loài nấm đảm có khả năng phân hủy các hợp chất nhựa, lignin.

Nấm mục nâu phân hủy gỗ khá mạnh, chúng ƣu tiên phân hủy polysaccharide, phân cắt mạch cellulose do đó làm giảm mức độ trùng hợp của mạch sợi và làm suy giảm hàm lƣợng cellulose đáng kể nên chúng thƣờng không đƣợng sử dụng trong vẫn đề loại nhựa trên gỗ.

Các loài nấm mục mềm thƣờng ƣu tiên phân hủy carbohydrate trong thành tế bào gỗ mềm và gỗ cứng. Nấm tấn công từ trên bề mặt gỗ, làm cho các lớp ngoài có màu đen hoặc đen xám, trơn mềm và bị nứt ngang thớ khi gỗ khô. Chúng lấy Nitơ cố định từ gỗ hoặc môi trƣờng xung quanh để sinh tổng

hợp enzym. Trong tự nhiên, nấm mục mềm phân hủy gỗ kém hơn nấm mục trắng.

Nấm mục trắng đƣợc biết đến là những tác nhân phân hủy lignin mạnh trong điều kiện tự nhiên nhờ có hệ enzym oxy hóa mạnh và tính đặc hiệu cơ chất thấp. Một số loại nấm mục trắng phân hủy lignin và hemicellulose nhƣng không gây thất thoát cellulose. Ngoài ra một số loài nấm mục trắng còn có khả năng phân hủy các chất chiết nhựa trong cả gỗ mềm và gỗ cứng [8]. Theo một báo cáo về sự phân hủy hợp chất nhựa, nấm mục trắng có khả năng loại bỏ hoàn toàn triglyceride, chất béo, axit, este sterol và sáp trong gỗ thông, thậm chí cả sterol và axit nhựa cũng bị phân hủy mạnh [8]. Nấm mục trắng và hệ enzym của chúng là chất xúc tác sinh học mạnh hơn có khả năng loại lipid khó phân hủy. Nhờ có hệ enzym oxi hóa mạnh nhƣ esterase, laccase, lignin peroxidase, magan peroxidase, lipase,… nấm mục trắng vừa có khả năng phân hủy đƣợc nhựa cây vừa loại bỏ lignin còn tồn dƣ. Do đó hỗ trợ hiệu quả cho quá trình tẩy trắng bột giấy hoàn toàn không chlorine (TCF) [16]. Nhựa cây gây ra sự ức chế khả năng phát triển của nhiều loài nấm trên gỗ. Tuy nhiên, nhiều loài nấm mục trắng có khả năng chịu độc tố của chất chiết nhƣ Bjerkandera sp. và Trametes versicolor. Kết quả phân tích gỗ đã ủ với các chủng Bjerkandera sp. và Trametes versicolor cho thấy lƣợng chất chiết béo giảm tới 90%, đồng thời độc tố giảm từ 7-17% [8]. Nấm Trametes versicolor làm giảm 40% axit nhựa, 100% các triglycerides và làm giảm độc tố trong môi trƣờng nƣớc của gỗ Vân Sam sau 4 tuần nuôi ủ [17]. Thậm chí, một số loài nấm mục trắng có thể loại bỏ hoàn toàn các chất chiết chính trong gỗ bạch đàn. Nấm Phlebia và Ceriporiopsis có thể phân hủy hoàn toàn các sterol tự do và sterol ester hóa, vốn là những thành phần rất phổ biến trong gỗ bạch đàn.

Ngoài ra, một số chủng nấm men nhƣ Trichosporon pullulans, Cryptococcus albidus, Sporobolomyces salmonicolor và Debaryomyces occidentalis var. occidentalis đã loại đƣợc 60% nhựa cây gỗ thông, chủ yếu là các axit nhựa, steryl este và triglyceride [8].

1.3.2. Vi khuẩn, xạ khuẩn phân hủy nhựa cây.

Trong tự nhiên, bên cạnh các loài nấm phân hủy gỗ và các chất chiết trong cây, còn có nhiều loài vi khuẩn và xạ khuẩn trong đất, trong nƣớc thải nhà máy giấy và đống ủ compost cũng có khả năng phân hủy nhanh các axit nhựa. Chúng có tốc độ phát triển nhanh hơn nấm, nhiều loài có khả năng tạo bào tử và chịu đƣợc nhiệt độ cao nên dễ dàng sử dụng trong công nghiệp [18].

Vi khuẩn phân hủy nhựa cây.

triển

Vi khuẩn có khả năng phân hủy nhựa cây đã đƣợc chứng minh, mặc dù số lƣợng công bố là ít hơn so với nấm. Một số có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzym và sinh trƣởng trên các loại gỗ có chất chiết với nồng độ axit nhựa cao. Một số vi khuẩn phân lập từ đất, gỗ và các nguồn nƣớc tự nhiên nhƣ Arthrobacter sp., Alcaligenes eutrophus, Pseudomonas sp., và Flavobacterium resinovorum đều có khả năng phát trên axit dehydroabietic nhƣ nguồn carbon duy nhất. Một số vi khuẩn Gr (-) cũng có khả năng phân hủy các axit nhựa khác nhau trong gỗ cũng đã đƣợc công bố nhƣ chi Sphingomonas Cornamonas, Alcaligenes và Pseudomonas... Hơn 75% axit nhựa đã bị phân hủy trong vòng 8 ngày bởi Sphingomonas sp. và Z. ramigera. Chi Sphingomonas sp. có thể sử dụng nhiều loại cacbon thƣờng thấy trong nƣớc thải của nhà máy bột giấy và có thể phát triển trên axit nhựa nhanh hơn trên glucose. Các loài Pseudomonas đã đƣợc công bố là có thể phát triển trên nguồn carbon duy nhất là axit isopimaric. Ngoài ra, chúng có thể phát triển trên axit pimaric và dehydroabietic và axit abietic. Trong một số nghiên cứu về các vi khuẩn phân lập từ nƣớc thải sản xuất bột giấy kraft, hai trong số 9 vi khuẩn phân lập có thể phân hủy trên 50% axit dehydroabietic (ở nồng độ ban đầu là 40 pg mL-l) trong vòng 24 giờ. Các vi khuẩn còn lại có khả năng phân hủy khoảng 30% axit dehydroabietic trong cùng khoảng thời gian. Tuy nhiên, các loài vi sinh vật khác nhau thì khả năng phân hủy các thành phần axit nhựa là khác nhau [11].

Theo Burnes và cộng sự (2000) tiền xử lý gỗ thông không cần khử trùng với các chủng P. fluorescens NRRL B21432 và Pseudomonas sp. UM-74 đã làm giảm 40 và 34%, tƣơng ứng chất chiết nhựa trên các loại dăm mảnh tƣơi.

Trong đó, các axit nhựa giảm 25% và các axit béo giảm 36%, tƣơng tự khi xử lý dăm mảnh gỗ với các chủng nấm bạch tạng. Bên cạnh đó, sử dụng các chủng vi khuẩn làm giảm hàm lƣợng các chất chiết trong gỗ trƣớc khi sản xuất bột giấy dẫn đến giảm các vấn đề về nhựa trong suốt quá trình sản xuất giấy và giảm nồng độ các axit nhựa trong dòng thải [19]. Các vi sinh vật này có tiềm năng ứng dụng cao do có khả năng chịu nhiệt, sinh trƣởng và phát triển trong môi trƣờng trung tính hoặc hơi kiềm mà nấm phân hủy gỗ không sinh trƣởng đƣợc. Bên cạnh đó, sử dụng vi khuẩn có thể mang lại hiệu quả cao do khả năng phát triển nhanh trên gỗ không cần khử trùng và lấn át đƣợc sự phát triển của các loài nấm tạp nhiễm.

1.3.1.3. Xạ khuẩn phân hủy nhựa cây.

Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt, G(+), phân bố rộng rãi trong tƣ nhiên (đất, nƣớc) tham gia vào quá trình chuyển tự nhiên của nhiều hợp chất có trong đất. Xạ khuẩn có hệ enzym phân hủy giúp làm giảm các hợp chất hữu cơ có trong thực vật (axit nhựa, lignin) và chitin. Xạ khuẩn có khả năng sinh enzym phân hủy nhựa cây nhựa esterase, lipase, một số chủng xạ khuẩn nhƣ Streptomyces griseus, Streptomyces cyaneus, Streptomyces coelicolor, Streptomyces ipomoea, Streptomyces sviceus, Streptomyces sp. còn có khả năng sinh laccase phân hủy các hợp chất vòng nhân thơm, cắt đứt các liên kết este có trong thành phần nhựa cây. Cấu trúc của enzym laccase trong xạ khuẩn có điểm rất khác so với nấm và vi khuẩn. Thay vì cấu trúc 3 miền enzym laccase trọng xạ khuẩn chỉ có cấu trúc 2 miềm nên đƣợc gọi là laccase nhỏ [20].

Trong một số nghiên cứu cho thấy, xạ khuẩn có khả năng sinh trƣởng nhanh và thích nghi tốt với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Khi nhiệt độ tăng cao xạ khuẩn hình thành nên các thể bào tử để thích nghi tốt hơn với điều kiện môi trƣờng. Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng trung tính hoặc hơi kiềm mà một số loài nấm phân hủy khó có thể phát triển đây đƣợc xem nhƣ tiềm năng ứng dụng cao do của xạ khuẩn. Bên cạnh đó, với khả năng phát triển nhanh trên gỗ, và sinh một số hoạt chất kháng

khuẩn, kháng nấm, xạ khuẩn có thể át đƣợc sự phát triển của các loài nấm tạp nhiễm mà không cần khử trùng.

1.3.3. Hệ enzym phân hủy nhựa cây.

1.3.2.1. Esterase

Các esterase sterol (EC 3.1.1.13) là các hydrolases đƣợc tìm thấy trong vi khuẩn, nhƣ Pseudomonas aeruginosa, nấm men, Candida rugosa và nấm dát gỗ thuộc chi Ophiostoma, Melanocarpus albomyces, Trichoderma sp. Chúng có khả năng phân cắt các ester của Sterol và axit béo chuỗi dài. Trong một số nghiên cứu cho rằng các enzyme esterase sterol từ P. aeruginosa, C. rugosa, M. albomyces, hoặc O. piceae, cũng có khả năng thuỷ phân các chất lipase điển hình và carboxylesterase điển hình [21]. Enzyme tiết ra bởi O. piceae là một chất xúc tác sinh học mạnh mẽ có khả năng thủy phân hỗn hợp tinh khiết hoặc tự nhiên của este sterol có trong gỗ cứng và mềm, liên quan đến sự hình thành các chất lắng không mong muốn trong quá trình sản xuất bột giấy sản xuất giấy, nhƣng nó cũng là một chất xúc tác sinh học hiệu quả trong phản ứng tổng hợp để tạo ra estrogen phytosterol, hợp chất đƣợc công nhận để làm giảm LDL cholesterol [21].

Sterol esterase có khối lƣợng phân tử 56,5 kDa, điểm đẳng điện là 3,3, phạm vi pH hoạt động 6 – 8 , pH tối ƣu từ 6,2 – 7, nhiệt độ thích hợp 37 oC [22]. Khi có cơ chất, sterol esterase sẽ thủy phân cắt các liên kết ester theo phản ứng

Sterol esterase

este steryl + H2O sterol + axit béo.

Esterase thủy phân các liên kết ester của ester acyl tan trong nƣớc và glycerolester đƣợc nhũ hóa với các nhóm acyl chuỗi ngắn (≤C8 [23]. Esterase thuộc nhóm siêu cấu trúc α /-hydrolase với các chuỗi song song chúng đƣợc bao quanh bởi các kết nối xoắn ốc. Enzyme này cũng chứa một bộ ba xúc tác đƣợc tạo thành từ dƣ lƣợng serine, histidine và aspartate / glutamate trong chuỗi polypeptide; dƣ lƣợng serine của enzym nằm ở trung tâm của chuỗi

trình tự pentapeptide có tính bảo tồn gồm Gly-X-Ser-X-Gly, trong đó X có thể là bất kỳ axit amin nào [24].

Sterol esterase có tính đặc hiệu cơ chất thấp, ngoài việc tham gia phân cắt este sterol chúng còn tham gia thủy phân chất béo trung tính và p- nitrophenyl khác nhau. Tuy nhiên, khả năng thủy phân este sterol là đƣợc coi là một đặc điểm điển hình của nhóm này [8]. Trong xử lý nhựa cây trong dăm mảnh, Sterol esterase tham gia vào quá trình phân cắt este các axit nhựa, Stigmasterol, Steryl este và sterol, các gốc rƣợu béo, axit béo, triglyceride,… thành các nhóm acyl chuỗi ngắn dễ thủy phân.

Esterase đã đƣợc công nhận là chất xúc tác sinh học hữu ích vì sự linh hoạt của chúng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp các ứng dụng, bao gồm việc sử dụng chúng trong chất tẩy rửa hoặc nhƣ chất phụ gia trong ngành công nghiệp thực phẩm (Harwood 1989, Jaeger và Reetz 1998) [25].

1.3.2.2. Lipase

Staphylococcus euruginosa,

Lipase (EC 3.1.1.3) thuộc nhóm Enzyme lipolytic (EC 3.1.1.-), phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là một nhóm hydrolase đa dạng xúc tác cho sự phân tách hoặc hình thành liên kết ester [26]. Lipase đƣợc tìm thấy ở một số loài vi hyicus, Bacillus khuẩn Pseudomonas stearothermophilus, Geobacillus zalihae,… [27].

Khác với esterase tham gia vào phân cắt acyl chuỗi ngắn thì lipase lại tham gia vào quá trình thủy phân các este acyl không tan trong nƣớc và chất nền nhũ hóa với các nhóm acyl chuỗi dài [24]. Lipase xúc tác quá trình thủy phân triacylglycerol thành glycerol và axit béo tự do dƣới dạng lipid-nƣớc, trong đó chất nền lipolytic là trạng thái cân bằng giữa monomeric, micellar và nhũ hóa [28]. Hai tiêu chí đƣợc sử dụng để nhận biết lipase thực sự là sự xuất hiện nhũ tƣơng khi thủy phân triglyceride hoặc nó phải tạo vòng kết tủa bề mặt tại vị trí hoạt động của enzyme. Quá trình thủy phân glycerolester có chiều dài chuỗi acyl <10 nguyên tử carbon với Tributyrylglycerol (Tributyrin) làm chất nền tiêu chuẩn thƣờng cho thấy sự có mặt của các ester [29]. Mặc dù vai trò sinh lý của nhiều lipase ở vi sinh vật vẫn chƣa rõ ràng, nhƣng ở vi

khuẩn, hầu hết các lipase là các enzyme ngoại bào đƣợc tiết ra và thực hiện các phản ứng phân hủy các hợp chất lipid [26]. Ngày nay, Lipase đã đƣợc thƣơng mại hóa bởi Novozymes A / S (Bagsvaerd, Đan Mạch). Chế phẩm thƣơng mại này có tên gọi là Resinase A2X đƣợc sử dụng thành công ở quy mô nhà máy để kiểm soát nhựa trong nghiên bột cơ ở Nhật Bản. Ở châu Âu, Lipase đƣợc dùng trong các thử nghiệm loại bỏ chất chiết trong quá trình sản xuất bột giấy sunfit từ gỗ mềm cũng mang lại những kết quả đầy hứa hẹn. 1.3.2.3. Laccase

Laccase (p- benzenediol:oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) đƣợc tìm thấy trong một số loài vi khuẩn Bacillus tequilensis [30], B. subtilis, E. coli [31], xạ khuẩn S. griseus [32], nấm T. versicolor, Phlebia fascicularia, P. floridensis, D. squalens, …

Laccase (Lac) thuộc nhóm enzym oxidase (polyphenol oxidase). Phân tử laccase thƣờng là monomeric protein (chỉ một số là oligomeric protein) có khối lƣợng phân tử dao động trong khoảng 32 – 90 kD, hoạt động tối thích ở phổ pH từ 4 – 6, bền ở nhiệt độ 30oC – 50oC và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 60oC.

Laccase tham gia các phản ứng xúc tác trùng hợp các monome, phân hủy polyme và oxy hóa các hợp chất phenolic. Laccase có thể tác động lên các hợp chất không phenol bằng cách sử dụng các chất trung gian, trải qua chu trình oxy hóa - khử, do đó, chuyển các electron giữa hợp chất không phenol và enzyme. Các hệ thống trung gian laccase (LMS) này đã đƣợc sử dụng trong một số quy trình bao gồm phân lớp bột giấy và oxy hóa các chất ô nhiễm hữu cơ. Bên cạnh việc đƣợc sử dụng thƣơng mại trong tẩy trắng, laccase cũng đã đƣợc áp dụng trong việc khử màu và biến đổi thuốc dệt nhuộm và xử lý ô nhiễm môi trƣờng do thuốc nhuộm [33]. Trong nghiên cứu của Gutie hungrrez, 2006, laccase từ nấm Pycnoporus cinnabarinus đã loại bỏ 95 – 100% sterol liên hợp khi nấu bột từ gỗ bạch đàn theo chu trình Kraft, 65 -100% triglyceride, axit nhựa và sterol từ cây vân sam (bột giấy TMP) và 40 - 100% rƣợu béo, ankan và sterol [8]. Việc loại bỏ lipid bằng cặp laccase-HBT là hiệu quả, tổng hàm lƣợng lipid của bột giấy giảm đáng kể, và nhiều hợp

chất béo đã đƣợc loại bỏ hoàn toàn. Trong nghiên cứu bổ sung laccase vào trong quá trình tẩy trắng bột giấy từ gỗ bạch đàn, các sitosterol tự do và liên hợp đã đƣợc loại bỏ hoàn toàn và độ sáng của bột giấy cũng đƣợc cải thiện do đã loại bỏ đƣợc lignin [34]. Khảo sát các chất chiết nhựa trong cả gỗ cứng, gỗ mềm và bột giấy phi gỗ, sau 2 giờ xử lý với laccase-HBT các hợp chất axit abietic, trilinolein, axit linoleic và oleic, sitosterol, cholesteryl palmitate, oleate, linoleate đã giảm 60% đến 100%, các lipit không bão hòa giảm 20 - 40% và axit abietic giảm 95% so với ban đầu, các cholesteryl palmitate và sitosterol không bị ảnh hƣởng [35].

Cho đến nay, chỉ có Laccase nấm có liên quan đến một số ngành công nghiệp, tuy nhiên chúng lại bị một số nhƣợc điểm, nhƣ thiếu biểu hiện chức năng hoặc hiệu quả trong các vật chủ dị hợp, thời gian lên men tƣơng đối dài và năng suất tƣơng đối thấp. Laccase từ vi khuẩn thích hợp cho biểu hiện dị thể ở E. coli, enzyme có thể dễ dàng đƣợc điều chỉnh bằng cách sử dụng các kỹ thuật mới [36]. Dựa trên các đặc tính bên trong của Laccase từ vi khuẩn, các enzyme này có tiềm năng lớn làm chất xúc tác sinh học cho các phản ứng oxy hóa, vì chúng hoạt động trong dung môi nƣớc ở pH trung tính đến pH cơ bản, ổn định nhiệt độ, độc lập với cofactor và ít sản phẩm phụ [37].

1.3.4. Cơ chế phân hủy lignin và các chất chiết trong gỗ

Cơ chế phân hủy lignin và các chất chiết trong gỗ của các loài vi sinh vật là dựa vào khả năng chúng sinh trƣởng và phát triển trong các tế bào gỗ, tấn công vào các kênh dẫn nhựa, ống nhựa, tế bào nhu mô. Trong quá trình phát triển, chúng sinh tổng hợp các enzym phân hủy lignin và chất chiết nhựa, nhờ đó chúng xâm nhập sâu vào các tế bào gỗ. Sự xâm nhập và làm rỗng một phần tế bào gỗ bị bít bởi các hợp chất nhựa và làm thay đổi thành tế bào gỗ nhƣ cellulose, hemicellulose, lignin và làm yếu các liên kết này, từ đó tạo điều kiện cho hóa chất nấu thẩm thấu dễ dàng vào nguyên liệu. Vì vậy, việc sử dụng các chủng vi sinh vật trong tiền xử lý gỗ sẽ giúp giảm lƣợng nhựa, giảm hóa chất nấu, thời gian nấu, tăng độ trắng của giấy, giảm năng lƣợng nghiền và toàn bộ quá trình sản xuất hiệu quả hơn [38,39]. Bên cạnh đó, sự giảm lƣợng nhựa và chất béo trong quá trình tiền xử lý nguyên liệu cũng sẽ làm

giảm lƣợng nhựa bị clo hóa và axit béo tạo ra trong quá trình tẩy trắng bột giấy và làm giảm các dẫn xuất clo khó phân hủy hơn trong nƣớc thải [38].

trong dung môi, sản phẩm chính tạo

Nấm mục trắng sinh ra một số loại enzyme peroxidase chứa nhân heme có chức năng khởi phát quá trình phân hủy lignin. Trƣớc đây, khi chƣa phát hiện đƣợc những dạng đồng đẳng với các enzyme nói trên ở vi khuẩn thì dƣờng nhƣ nhóm peroxidase phân hủy lignin thuộc liên họ (superfamily) peroxidase của thực vật chỉ thấy có ở nấm bậc cao. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn sản sinh khá nhiều enzyme thuộc loại peroxidase khác, đƣợc gọi là peroxidase khử màu thuốc nhuộm (EC 1.11.1.19), viết tắt là DyPs [40]. DyPs là nhóm enzyme peroxidase chứa nhân heme mới đƣợc phát hiện và đƣợc chú ý bởi chúng có khả năng phân hủy lignin và nhiều hợp chất khác. Năm 1988 enzym này đƣợc phát hiện từ Streptomyces viridosporus và năm 1999 ở Bjerkandera adusta. Gần đây, rất nhiều enzyme DyPs của vi khuẩn đã đƣợc mô tả, cho thấy rằng vi khuẩn có nguồn gen rất phong phú mã hóa cho DyPs. Tuy có cấu trúc phân tử khác với peroxidase của nấm, nhƣng DyPs của vi khuẩn lại có những điểm tƣơng tự nhƣ của nấm, đó là sự tiết enzyme ra ngoài tế bào bằng cơ chế Tat (Twin Arginine Translocation) và đặc tính xúc tác. Enzyme DyP ở vi khuẩn và xạ khuẩn có phổ cơ chất rộng, bao gồm một số nhóm thuốc nhuộm tổng hợp, các hợp chất monophenol, veratryl alcohol, carotene, Mn+2 và hợp chất lignin. Gần đây, một số peroxidase kiểu DyP của vi khuẩn đƣợc ứng dụng để phân hủy lignin và những hợp chất giống lignin [41, 42]. Bên cạnh đó, một số enzyme DyP của vi khuẩn, nhƣ Pseudomonas fluorescence Pf-5 lại có hoạt tính đối với lignin Kraft kiềm. Enzyme vi khuẩn bền nhiệt và chịu kiềm SviDyP đã đƣợc ứng dụng thành công trong khử màu của bột giấy Kraft bạch đàn [41]. DyPB, một peroxidase của vi khuẩn phân hủy lignin từ Rhodococcus jostii RHA1, có gốc Asn246 đƣợc thay thế bằng alanine (N246A), có hoạt tính biến đổi kraft lignin của gỗ cứng và các phân đoạn chiết là 2,6- thành 2 dimethoxybenzoquinone and 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzaldehyde [43].

Laccase (EC 1.10.3.2) là nhóm enzyme oxidase có chứa 4 ion đồng ở tâm heme, có chức năng oxi hóa các hợp chất hữu cơ thành các gốc tƣơng ứng, sau đó các gốc này đƣợc oxi hóa hoặc chuyển hóa tiếp. Laccase rất phổ biến trong tự nhiên, có ở trong thực vật, nấm, vi khuẩn và côn trùng. Laccase có trọng lƣợng phân tử và cấu trúc khác nhau tùy theo xuất xứ của chúng [44]. Nhóm enzyme này thƣờng là ngoại bào, xúc tác các phản ứng polymer hóa hoặc phân giải polymer [45]. Tƣơng tự laccase của nấm, nhiều loại laccase của vi khuẩn cũng đƣợc tiết ra ngoài tế bào nhờ hệ thống Tat. Tuy nhiên, khác với nhóm enzyme oxy hóa-khử, phản ứng xúc tác của laccase không cần có cofactor. Và cũng khác với nhóm enzyme oxy hóa, phản ứng không tạo ra H2O2. Trƣớc đây, những enzyme của nhóm laccase đƣợc phát hiện, nghiên cứu và ứng dụng trong phân hủy lignin đều có nguồn gốc từ nấm. Tuy vậy, những năm gần đây thì laccase của vi khuẩn đƣợc chú ý hơn vì tiềm năng của chúng trong phân hủy lignin và nhiều ứng dụng khác. Trong tự nhiên, trong quá trình phân hủy lignocellulose, vai trò của laccase của vi khuẩn là làm thay đổi đặc tính của lignin để cho các hệ enzyme khác tiếp cận cellulose và hemicellulose.

Laccase của vi khuẩn đầu tiên đƣợc phát hiện ra năm 1995, nhƣng tới nay đã có một số lƣợng lớn laccase của vi khuẩn đƣợc xác định [40, 44, 46, 47], đồng thời vai trò và hiệu quả của chúng trong phân hủy lignin đang đƣợc đẩy mạnh nghiên cứu [48]. Laccase của vi khuẩn đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là ở xạ khuẩn, đặc biệt là các loài Streptomyces (Fernandes et al., 2014) nhƣ Laccase chịu mặn (SilA) của chủng S. ipomoea CECT 3341, và 4 laccase từ Streptomyces (S. coelicolor A3(2), S. lividans TK24, S. viridosporus T7A) và Amycolatopsis sp. 75iv2. Những enzyme này có độ ổn định hoạt tính cao trong dải pH rộng từ 3-10, là những tác nhân xúc tác tiềm năng trong công nghiệp giấy.

Thông báo đầu tiên về ứng dụng laccase của vi khuẩn trong sản xuất bột giấy và giấy là trƣờng hợp của chủng siêu chịu nhiệt Thermus thermophilus. Laccase tái tổ hợp của chủng này đƣợc dùng để tẩy trắng bột giấy từ rơm lúa mỳ, làm tăng độ sáng lên 3.3% ISO và giảm chỉ số kappa 5,6 U, giảm 25%

lƣợng dùng H2O2 trong công đoạn tẩy trắng tiếp theo. Khi bổ sung 5 mM ABTS thì độ sáng tăng thêm 1,5% ISO mà không ảnh hƣởng tới xơ sợi [49]. Các loài Bacillus sinh ra laccase chịu nhiệt độ cao và môi trƣờng kiềm, tuy nhiên đa số là enzyme nội bào. Laccase ngoại bào đƣợc phát hiện ở chủng B. tequilensis SN4 đƣợc phân lập từ nƣớc thải của nhà máy bột giấy [30]. Enzyme của chủng này có nhiệt độ tối ƣu ở 80-90 oC, thậm chí còn một phần hoạt tính ở 100 oC, và pH tối ƣu là 8 và độ ổn định hoạt tính cao. Laccase của chủng này làm giảm 28% chỉ số kappa và tăng độ sáng của bột giấy lên 7,6%. Khi bổ sung một lƣợng nhỏ (2 mM) chất hỗ trợ N-hydroxybenzotriazole (HBT) thì hiệu quả tăng lên rõ rệt.

Ngoài ra, một số enzyme của vi khuẩn nhƣ etherase phụ thuộc glutathione, superoxide dismutase và dioxygenase cũng có vai trò trong biến đổi/ phân hủy lignin và các hợp chất hữu cơ khác trong nhựa cây. Năm 2013, một enzyme ngoại bào đặc biệt đƣợc phát hiện ở Streptomyces, có một vùng dioxygenase và một vùng gắn lignin [40]. Enzyme này có hoạt tính nhƣ dioxygenase đối với một số dẫn suất của catechol, đồng thời lại có ái lực đối với một số phân tử lignin tổng hợp.

Nhìn chung, vai trò của nấm trong phân hủy lignin và các hợp chất hữu cơ trong nhựa cây đã đƣợc nghiên cứu từ nhiều thập kỷ và ứng dụng có hiệu quả. Vi khuẩn, xạ khuẩn tuy không có hệ enzyme peroxidase thông thƣờng nhƣ ở nấm, nhƣng lại có hệ enzyme rất phong phú và đa dạng, bao gồm những enzyme đã biết nhƣ DyP, laccase, etherase, dismutase, dioxygenase, và còn nhiều enzyme chƣa đƣợc phát hiện. Tất cả đều tham gia vào quá trình biến đổi phân tử lignin và phân hủy các axit béo, axit nhựa và các hợp chất hữu cơ khó phân hủy khác trong nhựa cây. Vi khuẩn có lợi thế hơn nấm mục trắng ở chỗ có thể nhanh chóng phát triển sau khi cấy vào nguyên liệu gỗ nên giảm nguy cơ gỗ bị nhiễm các vi sinh vật không mong muốn khác. Bên cạnh đó, vi khuẩn và xạ khuẩn có thể phát triển trong điều kiện có nồng độ oxy thấp mà nấm không phát triển đƣợc. Và cộng đồng hỗn hợp vi khuẩn sẽ có khả năng phân hủy lignin và các hợp chất trong gỗ tốt hơn các loài riêng lẻ. Do đó, việc tìm kiếm và phối hợp các chủng vi sinh vật trong tiền xử lý dăm

mảnh nguyên liệu gỗ sản xuất bột giấy và giấy sẽ khiến cho giải pháp này càng trở nên khả thi và hiệu quả hơn trong thực tiễn sản xuất. Đây là một hƣớng giúp cho sản xuất an toàn mà không cần đầu tƣ lớn cho các nhà máy hiện hành.

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu.

Các mẫu VSV đƣợc phân thập từ các mẫu mùn đất, dăm gỗ thu thập xung quanh nhà máy giấy Bãi Bằng - Tổng Công ty Giấy Việt Nam, huyện Phù Ninh, tỉnh Phú Thọ.

2.1.2. Thiết bị

- Kính hiển vi quang học Olympius (Model CHD, Nhật Bản). - Máy đo pH (Metter Toledo, Thụy Sỹ). - Nồi hấp khử trùng (ALP MC-40DP, Nhật Bản) - Tủ ấm vô trùng, tủ sấy Memmert (Trung Quốc) - Cân điện tử (Metteler Toledo, Thụy Sỹ) - Máy lắc ổn nhiệt (Hàn Quốc) - Bốc vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy ly tâm Hettich (Đức) - Pipet, máy sấy, đĩa petri, ông đong, bình thủy tinh 100ml, 250ml, 500ml,

1000ml, ống falcon, ống eppendorf 1,5 ml...

- Các dụng cụ khác...

2.1.3. Hóa chất

Các loại đƣờng chuẩn: glucose, saccarose, lactose, fructose, mantose...

của hãng Merck (Đức) và Trung Quốc.

- Các loại muối: K2HP)4, MgSO4.7H2O,NaH2PO4, Na2HPO4, CaCl2, FeSO4.7H2O, MnSO4, ZnSO4, CuSO4, (NH4)2 SO4, CaCO3, MnCl2, Na2SO3,ZnCl2, Tris HCl, Tris Base, EDTA, Isomylalcohol, chloroform, isopropanol, glacial acetic acid, ethidium bromide, agarose... có xuất sứ từ Đức Đức và Trung Quốc có độ tinh khiết cao.

- Cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone, p -nitrophenyl butyrate (p- NPB) (Merck), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA), agar, tinh bột tan, casein,

Remazol Brilliant Blue R (RBBR), Carboxymethyl Cellulose (CMC) của Nhật, Trung Quốc.

- Các hóa chất khác đƣợc sử dụng trong thí nghiệm có độ tinh khiết cao và

đảm bảo sử dụng trong phân tích.

2.1.4. Môi trƣờng

Môi trƣờng phân lập (g/l): NaNO3: 3g, K2HPO4: 1g, MgSO4.7H2O:

0,5g KCl: 0,5g, FeSO4.7H2O: 0,01g. pH=7,0. Bổ sung 100mg stigmasterol.

MT1 (g/l) Môi trƣờng giữ và nhân giống (môi trƣờng Bennet): Cao nấm men: 1g Cao thịt: 1g, casein thủy phân: 2g, Glucose: 10g, CoCl2.6H2O: 0.01g, thạch: 18g, pH=7.

MT2 (g/l): Môi trƣờng khoáng NaNO3: 3g, K2HPO4: 1g, MgSO4.7H2O: 0,5g KCl: 0,5g, FeSO4.7H2O: 0,01g, 0,2% pepton, 0,5% glucose và 0,5% chất chiết nhựa cây.

MT3 (ISP2) (g/l): Môi trƣờng nhân giống và xác định đặc điểm sinh

học Glucoza: 10g, Cao nấm men: 4g, Cao Malt: 4g, pH=7.

MPA (g/L) (Meat-peptone agar): cao thịt 3,0; pepton 5,0. pH 7,0.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Chuẩn bị chất chiết nhựa cây Chất chiết nhựa đƣợc tách từ dăm gỗ nghiền theo phƣơng pháp chiết trong aceton. Các bƣớc tiến hành đƣợc thực hiện nhƣ mục 2.2.7. Nhựa cây sau khi làm bay hơi aceton sẽ đƣợc thu hồi và dùng cho các mục đích thí nghiệm tiếp theo.

2.2.2. Phƣơng pháp sàng lọc vi sinh vật phân hủy nhựa.

Mẫu mùn thu thập từ nhà máy giấy Bãi Bằng đƣợc pha loãng đến nồng độ thích hợp theo phƣơng pháp pha loãng tới hạn và trang đĩa trên môi trƣờng khoáng có bổ sung stigmasterol làm nguồn cơ chất. Các đĩa phân lập đƣợc ủ ở 37oC và 45ºC trong 3 ÷ 5 ngày. Tách và làm sạch các chủng VSV xuất hiện trên đĩa.

Xác định sự phát triển của vi sinh vật trên stigmasterol lỏng: Các chủng VSV đƣợc nuôi cấy trên các ống nghiệm lỏng chứa 5 ml môi trƣờng phân lập. Sau 48 giờ nuôi cấy tiến hành kiểm tra khả năng phát triển của các chủng. Những chủng không phát triển trên môi trƣờng sẽ đƣợc loại bỏ.

Xác định khả năng sinh tổng hợp lipase (phương pháp định tính): là phƣơng pháp thử nghiệm kết tủa sử dụng môi trƣờng thạch có chứa Tween 20 để xác nhận hoạt động lipolytic. Môi trƣờng xác định sự có mặt của lipase (g/L); 10g peptone, 5g NaCl 2; 0,1g CaCl2. 2H2O, 20g agar và 10ml (v/v) tween 20. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc kết tủa muối canxi. Sự thủy phân của tween 20 sẽ giải phóng các axit béo liên kết với canxi trong môi trƣờng để tạo thành các tinh thể không hòa tan xung quanh điểm tiêm chủng. Các sinh vật đƣợc cấy vào các đĩa và đƣợc ủ ở 37°C trong 2 - 4 ngày. Một lƣợng kết tủa sẽ xuất hiện xung quanh khuẩn lạc cho thấy dấu hiệu hoạt động của lipase [50].

Kiểm tra khả năng phân giải cellulose: Các vi sinh vật chọn lọc đƣợc ở trên đƣợc kiểm tra khả năng phân hủy Cellulose bằng kiểm tra vòng phân hủy trên môi trƣờng thạch chọn lọc. Cấy chấm điểm các chủng vi sinh vật trên đĩa Petri chứa 1% CMC và 1% tinh thể cellulose trên môi trƣờng khoáng phân lập. Các chủng phân lập tạo thành vòng phân hủy lớn và rõ trên môi trƣờng có tinh thể cellulose khi bổ sung thuốc thử công gô đỏ 0,5% ở 50oC trong 2 giờ và rửa lại bằng NaCl 0,9% sẽ đƣợc loại bỏ.

2.2.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật đƣợc tuyển trọn.

Quan sát hình thái vi sinh vật: Hình thái vi khuẩn đƣợc quan sát dƣới

kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử JSM-5410LV (Jeol - Japan).

Phương pháp kiểm tra khả năng sinh bào tử: Thí nghiệm kiểm tra khả năng sinh nội bào tử của chủng vi khuẩn đƣợc thực hiện bằng cách giữ chủng trong dung dịch nƣớc muối sinh lý và ủ ở 80oC trong 15 phút. Sau khi ủ ở 80oC trong 15 phút và kiểm tra bằng cách cấy trải trên môi trƣờng Bennet.

Sau 24-48 giờ chủng vi khuẩn phát triển trở lại trên môi trƣờng kiểm tra thì có khả năng sinh bào tử.

Tách chiết DNA và phân tích trình tự vùng gen 16S rDNA

và 1492R

Phƣơng pháp tách chiết DNA đƣợc tiến hành theo Sambrook và Russell [51]. Gen 16S rRNA đƣợc khuếch đại bằng cặp mồi 27f (5'- TAACACATGCAAGTCGAACG-3') (5’- GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) theo chu trình nhiệt: 94oC trong 5 phút, 30 chu trình (94oC trong 60 giây, 60oC trong 60 giây, 72oC trong 90 giây), 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC. Trình tự 16S rDNA nucleotide đƣợc phân tích dựa trên dữ liệu Ngân hàng gen của NCBI. Độ tƣơng đồng về trình tự đƣợc xác định và so sánh với các trình tự khác đƣợc so sánh trên nhân hàng GenBank bằng BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov). Mức độ tƣơng đồng di truyền của các chủng đƣợc xây dựng dựa trên phần mềm CLC DNA workbench 6.6.

Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp một số enzyme ngoại bào: Khả năng sinh tổng hợp các enzym ngoại bào của các chủng nấm đƣợc khảo sát trên môi trƣờng khoáng, có bổ sung 1% các nguồn cơ chất khác nhau nhƣ: tinh bột tan, casein, xylan, RBBR (Remazol Brilliant Blue R) và Guaiacol, nuôi ở nhiệt độ 28°C. Khả năng sinh enzym ngoại bào đƣợc quan sát và đo đƣờng kính vòng phân hủy xung quanh khuẩn lạc.

2.2.4. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật và thu nhận enzym

Nuôi cấy trong môi trường lỏng: Thực hiện trên bình nón dung tích 250 ml với 75 ml môi trƣờng khoáng phân lập có bổ sung thêm 0,2% pepton và 0,5% glucose. Các bình môi trƣờng đƣợc khử trùng ở 121 oC trong 30 phút, và đƣợc làm nguội về nhiệt độ phòng, tiến hành bổ sung 0,5 % (w/v) chất chiết nhựa thu nhận từ gỗ keo và 2% (v/v) giống, các bình đƣợc nuôi cấy ở tốc độ lắc 200 vòng/phút. Sau 3-5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp, tiến hành ly tâm thu dịch nổi để xác định hoạt tính các enzyme.

Phương pháp nuôi cấy trên dăm gỗ: Nuôi cấy vi sinh vật trên dăm gỗ đƣợc thực hiện theo Su et al. (2011) với một vài thay đổi nhỏ. Dăm gỗ keo thu nhận tại nhà máy có kích thƣớc từ 1-2 cm2, đƣợc làm ẩm đến 60% (v/w) và khử trùng 121oC trong vòng 15 phút. 2 kg gỗ đƣợc bổ sung giống vi sinh vật

ở tỷ lệ kiểm tra và đƣợc ủ trong 7, 14 và 21 ngày. Mẫu đối chứng đƣợc xử lý tƣơng ứng bằng nƣớc [52].

Phương pháp thu nhận enzyme thô: Lấy ra 10 gram dăm mảnh gỗ đƣợc ủ với vi sinh vật cho vào trong 100ml dung dịch đệm và lắc trên máy có tốc độ vòng 200 vòng/ phút trong vòng 2 giờ. Thu dịch và tiến hành xác định hoạt độ các enzym (laccase, sterol esterase, cellulase).

2.2.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzym

Phương pháp xác định hoạt tính sterol esterase

Nguyên tắc: Dựa trên sự thuỷ phân của pNBP thành sản phẩm oxy hoá hấp thụ mạnh ở bƣớc sóng 410nm [53]. Dung dịch phản ứng bao gồm pNBP 2 mM pha trong đệm Tris-HCl (pH 7) và dịch enzyme tỷ lệ 1:1. Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng khi bắt đầu khi bổ sung dung dịch pNBP 2 mM trong 15 phút. Dừng phản ứng bằng cách ủ trong đá lạnh 5 phút. Đo giá trị hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 410nm. Mẫu đối chứng dịch enzyme đƣợc thay bằng dung dịch đệm Tris-HCl (pH 7) không có bổ sung cơ chất. Một đơn vị hoạt độ (U) esterase đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme cần thiết để oxy hóa 1 µmol pNBP trong một phút ở nhiệt độ phòng.

( )

Công thức tính:

Hoạt tính = (U/ml)

Trong đó:

t: thời gian phản ứng (phút);

V: tổng thể tích dung dịch phản ứng (ml);

v: thể tích dịch enzym thô (ml);

ε: hệ số hấp thụ (15.200 M-1cm-1).

Phương pháp xác định hoạt tính laccase

Nguyên tắc: Dựa trên sự oxy hoá 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulphonic acid) (ABTS) thành sản phẩm oxy hoá hấp thụ mạnh ở bƣớc sóng 460nm. Dung dịch phản ứng bao gồm 1,5 ml đệm acetat 50 mM pH 4,8, 0,5

ml ABTS 0,4 mM và 0,5 ml dịch enzym. Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng khi bắt đầu khi bổ sung dung dịch cơ chất ABTS 0,4 mM. Đọc giá trị hấp thụ ở 460 nm sau 3 phút ở nhiệt độ 30oC. Mẫu đối chứng, enzyme phản ứng đƣợc bất hoạt ở 100oC trong 15 phút [54].

Một đơn vị hoạt độ laccase đƣợc định nghĩa là lƣợng enzym cần thiết

để oxy hóa 1 µmol ABTS trong một phút ở điều kiện phản ứng.

( )

Công thức tính:

Hoạt tính = (U/ml)

Trong đó: Trong đó:

t: thời gian phản ứng (phút);

V: tổng thể tích dung dịch phản ứng (ml);

v: thể tích dịch enzym thô (ml);

ε: hệ số hấp thụ 36000 (M-1cm-1)

Phương pháp xác định hoạt tính cellulase

Nguyên tắc: Phƣơng pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC bởi cellulase. Lƣợng đƣờng khử sinh ra phản ứng với 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA) cho dung dịch có màu vàng cam. Dung dịch màu này đƣợc xác định bằng phƣơng pháp so màu trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 540 nm. Lƣợng đƣờng khử tạo ra đƣợc xác định từ đƣờng chuẩn glucose đƣợc xây dựng trƣớc. Đơn vị hoạt tính cellulase (U/L) đƣợc xác định nhƣ là lƣợng enzyme phân giải tạo ra lƣợng đƣờng khử trong điều kiện thí nghiệm.

Phương pháp: Dung dịch phản ứng chứa 1 ml dung dịch enzyme và 1ml dung dịch cơ chất nồng độ 1%. Giữ các ống phản ứng ở 50oC trong 30 phút. Lấy 1ml dịch phản ứng, bổ sung thêm 1 ml dung dịch DNSA, sau đó đem đun sôi trong 10 phút. Để lạnh trong 5 phút. Tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 540 nm. Đối với mẫu đối chứng tiến hành giống nhƣ trên nhƣng không có ủ ở 50oC trong 30 phút. Hàm lƣợng glucose đƣợc xác định bằng phƣơng trình đƣờng chuẩn chuẩn glucose [55].

Xây dựng phương trình đường chuẩn

Chuẩn bị dung dịch glucose chuẩn có nồng độ 10 mg/ml để làm dung dịch gốc. Tiến hành pha dãy ống nghiệm có nồng độ glucose liên tiếp từ 0 – 1 mg/ml, bằng cách bổ sung nƣớc cất theo tỷ lệ:

Nồng độ (mg/ml) 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Glucose (ml) 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 Nƣớc cất (ml) 1 0,995 0,99 0,985 0,98 0,975 0,97

Bổ sung vào từng ống nghiệm 1ml thuốc thử DNSA, đun sôi trong 10 phút, tiến hành làm lạnh nhanh. Đo độ hấp thụ màu của các ống bằng máy quang phổ ở bƣớc sóng 540nm. Dựng đƣờng chuẩn glucose ở dạng phƣơng trình y = ax +b với R2 ≥ 0,99 (Hình 2.1)

Hình 2. 1. Đồ thị đƣờng chuẩn Glucose

Hoạt tính Cellulase đƣợc tính toán theo công thức

U/L = ×1000

Trong đó: X: Lƣợng đƣờng khử tƣơng đƣơng đƣợc tạo ra (mg/ml)

D: Hệ số pha loãng enzyme

V: Thể tích enzyme (ml)

T: Thời gian phản ứng

2.2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nhựa cây bằng chiết trong aceton

Dăm mảnh gỗ ủ với vi sinh vật đƣợc rửa bằng nƣớc cất khử trùng, sấy ở 60 oC trong 2 giờ, chẻ nhỏ mảnh rồi nghiền thành bột gỗ kích thƣớc 0,3 - 0,4 mm. Hàm lƣợng chất chiết đƣợc xác định theo phƣơng pháp chiết Soxhlex bằng aceton trong 6 giờ theo Martinez-Inĩgo et al. (2000a) và TAPPI T204- 2007 với vài thay đổi nhỏ [56].

Các bƣớc tiến hành:

- Cho mẫu vào bộ Soxhlex cùng với 150 ml axeton. - Đặt bộ Sohlex vào bếp cách thủy ở nhiệt độ 72oC, thời gian chiết 6 giờ. - Lấy bình chứa dung dịch chiết ra khỏi Soxhlex rồi mang đi sấy ở 105 oC

trong thời gian 2 giờ.

- Đặt bình chứa dung dịch chất chiết vào bình hút ẩm để nguội và cân chính

xác tới 0,0001g.

Tiến hành thí nghiệm trắng: Để 150 ml dung môi bay hơi tới khô và tiến hành cân chính xác tới 0,0001g. Hiệu chỉnh khối lƣợng chất chiết với khối lƣợng cân đƣợc trong thí nghiệm trắng.

Hàm lƣợng các chất chiết đƣợc tính theo công thức sau:

Trong đó:

- Wc: khối lƣợng chất chiết - Wb: Khối lƣợng chất chiết còn lại trong thí nghiệm trắng (g) - Wp: Khối lƣợng mẫu thử khô tuyệt đối (g)

2.2.7. Phƣơng pháp nấu bột giấy sunfate

Dăm mảnh sau khi xử lý với chế phẩm sinh học đƣợc tiến hành nấu theo

phƣơng pháp Sunphat trong nồi nấu thí nghiệm 4,5 lít, gia nhiệt gián tiếp bằng điện theo các điều kiện công nghệ nhất định. Quy trình nấu bột giấy đƣợc lựa chọn tƣơng tự nhƣ quy trình nấu hiện đang áp dụng tại Tổng Công ty Giấy Việt Nam. Tuy nhiên, một số yếu tố nhƣ thời gian tăng ôn và thời gian bảo ôn dài hơn phụ thuộc vào yêu cầu của thiết bị nấu trong phòng thí nghiệm tại Viện Công nghiệp Giấy và Xenluylô. Hóa chất và quy trình thực hiện: NaOH, 20%; sulfide, 25%; mảnh/nƣớc, 1:4; nhiệt độ nấu, 170 oC; thời gian nấu, 150 phút. Bột giấy sau nấu đƣợc rửa trên các lƣới rửa với số mắt lƣới là 40 mesh và 100 mesh. Bột giấy hợp cách qua lƣới 40 mesh đƣợc vắt khô, bảo quản để sử dụng cho các công đoạn thí nghiệm tiếp theo. Bột giấy thu đƣợc đem đi xác định hiệu suất, trị số Kappa, tàn kiềm và hàm lƣợng nhựa trong bột sau nấu.

2.2.8. Phƣơng pháp xác định chỉ số Kappa (đánh giá hàm lƣợng lignin)

Định nghĩa: Chỉ số Kappa của bột là số ml của dung dịch kali permanganat 0,02 mol/l tiêu hao cho 1 g bột (đƣợc tính trên cơ sở sấy khô) trong điều kiện quy định.

Nguyên tắc: Bột đƣợc đánh tơi sẽ đƣợc phản ứng với một lƣợng dung dịch kali permanganat quy định trong một thời gian nhất định. Số lƣợng bột đƣợc chọn để sao cho khoảng 50 % tổng khả năng ôxi hóa của permanganat còn lại không tiêu thụ hết vào cuối thời gian phản ứng.

Chỉ số kappa của bột nấu đƣợc đánh giá theo tiêu chuẩn TCVN 4361:1907, ISO 302:1904, liên quan trực tiếp đến lƣợng lignin (độ cứng) hoặc khả năng tẩy trắng của bột.

2.2.9. Phƣơng pháp phân tích thống kê.

Tất cả các thí nghiệm đều đƣợc thực hiện 3 lần. Số liệu đƣa ra trong báo cáo này là giá trị trung bình theo phƣơng pháp phân tích phƣơng sai (ANOVA), tiếp theo là so sánh giữa các nhóm thông qua tính khác biệt nhỏ nhất có ý nghĩa (Least significant difference – LSD) ở mức ý nghĩa p < 0,05, sử dụng phần mền thống kê phân tích dữ liệu Excel.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÀ XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA CÂY.

3.1.1. Phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân hủy nhựa cây

Cơ chất sterol là thành phần đƣợc đánh giá rất khó phân hủy trong các chất chiết nhựa. Nó là nguyên nhân gây nhiều vấn đề lớn cặn nhựa trong sản xuất giấy. Trong nguyên liệu gỗ stigmasterol là thành phần sterol có mặt trong hầu hết các loại gỗ, vì vậy đƣợc sử dụng làm cơ chất tuyển chọn các chủng có tiềm năng phân hủy nhựa trong nghiên cứu này.

Từ 19 mẫu mùn đất phân lập đƣợc 162 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn (92 chủng phát triển ở nhiệt độ 37oC và 70 chủng phát triển ở 45 oC). Các chủng này đƣợc tách, làm sạch trên môi trƣờng phân lập và giữ giống trên môi trƣờng Bennet (Bảng 3.1).

Hình 3. 1. Hình ảnh vi sinh vật phát triển trên môi trƣờng phân lập

Bảng 3. 1. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn phân lập ở nhiệt độ 37oC và 45oC trong các mẫu

Nhiệt độ phân lập 450C

Mẫu

Nhiệt độ phân lập 37oC Xạ khuẩn

Vi khuẩn

Xạ khuẩn

CVSBG-2, CVSBG-3

CXBG-23

BG

XBG-2, XBG-3, XBG-4, XBG-5

CVSĐ1-6

Đ1

XĐN-1

CVSĐN-1, CVSĐN-2

CXĐN-1, CXĐN-3

ĐN

CVSD1-4, CVSD1-1

D1

Vi khuẩn VSBG-1, VSBG-2, VSBG-3 VSBG-4, VSBG-5 VSĐ1-1, VSĐ1-4, VSĐn-1, VSĐN-2, VSĐn-3, VSĐn-4, VSĐn-5 VSD1-1, VSD1-2, VSD1-3, VSD1-4

XD1-1, XD1-2, XD1-3

CXD1-1, CXD1-4

VSD2-1, VSD2-3

XD2-2, XD2-3

CXD2-15, CXD2-17

D2

CVSD2-1, CVSD2-2, CVSD2-3, CVSD2-4

XD3-1, XD3-2

CVSD3-4

CXD3-1, CXD3-2

D3

CVSD4-1

CXD4-1, CXD4-2

D4

XS1-2, XS1-4

CVSS1-1, CVSS1-2

CXSS1-1

S1

XS2-2, XS2-3

CVSS2-1

CXS2-2, CXS2-3

S2

CVSS3-2, CVSS3-1,

CXS3-1, CXS3-3

S3

CVSM1-1,

CXM1-20

M1

VSD3-1, VSD3-2, VSD3-3, VSD3-4 VSD4-1, VSD4-2, VSD4-3, VSD4-4, VSD4-5 VSS1-1, VSS1-2, VSS1-3 VSS2-1, VSS2-2, VSS2-3 VSS3-1, VSS3-3 VSM1-1, VSM1-2, VSM1-3, VSM1-4

XS3-1, XS3-2 XM1-1, XM1-2, XM1-3

CXM2-2, CXM2-3

VSM2-3, VSM2-2 XM2-1, XM2-2

M2

VSM3-1,

CXM3-2

M3

M4

XM4-1, XM4-2 XM4-3

CVSM2-1, CVSM2-2, CVSM2-3, CVSM2-4 CVSM3-1, CVSM3-2, CVSM3-3, CVSM4-1, CVSM4-2, CVSM4-3

CXM4-3, CXM4-4, CXM4-5

CVSM6-1

CXM6-2

M6

XMT-1

MT

VSM4-1, VSM4-2, VSM4-2, VSM4-3 VSM6-1, VSM6-2, VSM6-3 VSMT-1, VSMT-2, VSMT-3, VSMT-4

MT2

VSMT2-1, VSMT2- 2, VSMT2-3

VC1

VSVC1-1, VSVC1- 2, VSVC1-3

XVC1-1, XVC1- 3, XVC1-2

CXVC1-2, CXVC1- 1

VC2

VSVC2-1, VSVC2- 2, VSVC2-3

CXVC2-1, CXVC2- 25

CVSMT-1, CVSMT-2, CVSMT-3 CVSMT2-1, CVSMT2-2, CVSMT2-3, CVSMT2-4 CVSVC1-1, CVSVC1-2 CVSVC2-1, CVSVC2-2, CVSVC2-3

Ghi chú: (BG) Mẫu được lấy cạnh nguồn nước thải. (Đ1, Đn): Mẫu đất được lấy xung

quanh khu vực nhà mấy giấy bãi bằng, (D1, D2, D3, D4): dăm mảnh gỗ, (S1, S2, S3): mẫu trong khu vực xuất hiện lignin, (M1, M2, M4, M5, M6): Mẫu mùn trong bãi gỗ nguyên

liệu, (MT, MT2): mạt cưa, (VC1, VC2): vỏ cây.

Các chủng vi sinh vật tách từ môi trƣờng phân lập ban đầu đƣợc kiểm tra khả năng phát triển trên môi trƣờng phân lập lỏng. Sau 48 giờ nuôi cấy, có 104 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn phát triển trên môi trƣờng này (trong đó có 51 chủng phân lập ở 37oC và 53 chủng phân lập ở 45oC (Hình 3.3 và Bảng 3.2). Một số chủng VSM4-3, VSD1-2, VSD1-3, VSD2-1, VSD4-4, VSD4-5,

VSBG-3, VSS1-2, VSS3-3, VSVC2-2, CVSMT2-4, CVSM2-3, CVSVC2-3, CVSD2-1, CXD2-17 phát triển nhanh và tốt nên chúng đƣợc xem là những chủng có triển vọng trong những ứng dụng loại bỏ chất chiết nhựa.

Hình 3.2. Khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn trên môi trƣờng phân lập lỏng

Bên cạnh đó các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn phân lập, đƣợc đánh giá khả năng sinh lipase và khả năng phân hủy cellulose (1% CMC và tinh thể cellulose) bằng các vòng phân hủy xuất hiện trên môi trƣờng kiểm tra. Kết quả đƣợc thể hiện trên Hình 3.3, 3.4 và Bảng 3.2.

Trong số 162 chủng phân lập, 17 chủng có khả năng sinh lipase, đáng chú ý nhất là các chủng VSMT-1, XM4-3, VSD3-4, VSBG-3 tạo vòng kết tủa lớn xung quanh điểm cấy (đƣờng kính vòng phân hủy > 20 mm) (Hình 3.3 và Bảng 3.2). Lipase là một enzym trong nhóm hydrolase tham gia vào quá trình thủy phân của chất triacylglycerol có trong nhựa cây. Sự hoạt động của lipase

đƣợc nhận biết dựa trên nguyên tắc kết tủa của muối canxi. Lipase thủy phân Tween 20 có trong môi trƣờng giải phóng các axit béo liên kết với canxi trong môi trƣờng tạo thành các tinh thể không hòa tan xung quanh điểm cấy [50].

Hình 3.3. Khả năng sinh enzym lipase ngoại bào của một số chủng phân lập

Hình 3.4. Khả năng sinh cellulase ngoại bào của một số chủng phân lập

Trong ngành công nghiệp sản xuất bột giấy, việc thất thoát cellulose có ảnh hƣởng lớn đến hiệu suất và chất lƣợng sản phẩm, giảm hiệu quả kinh tế. Chính vì thế, các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn đƣợc tuyển chọn có khả năng phân hủy nhựa phải không hoặc ít làm ảnh hƣởng đến hàm lƣợng cellulose có trong gỗ. Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng sàng lọc nhận thấy, các chủng XM1-1, VSM6-2, XD1-2, XBG-3, VSS1-3, XS2-2, XS3-2, VSVC1-3, XVC1-2, VSVC2-1, VSVC2-2, VSVC2-3, CVSM1-1, CVSM2-1, CVSM3-3, CXM3-2, CXM4-4, CVSM4-1, CXM6-2, CVSĐN-2, CXD4-2, CXS3-3, là những chủng tạo vòng phân hủy lớn (>20mm) (Hình 3.4 và Bảng 3.2), do đó các chủng này có khả năng sinh cellulase nên không đƣợc tuyển chọn. Các chủng còn lại có vòng phân hủy cellulose nhỏ hoặc không đƣợc lựa chọn.

Thông qua quá trình sàng lọc ban đầu từ 162 chủng phân lập lựa chọn đƣợc 87 chủng tiềm năng (42 chủng phát triển ở nhiệt độ 37oC và 45 chủng phát triển ở 45oC). Các chủng này đều có khả năng sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng có bổ sung stigmasterol, một số chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme phân hủy lipase và không hoặc ít phân hủy cellulose. Các chủng này đƣợc sử dụng để khảo sát trong các thí nghiệm tiếp theo.

Bảng 3. 2. Khả năng phân hủy stigmassterol, sinh tổng hợp cellulase và lipase của vi khuẩn, xạ khuẩn phân lập

STT

Mẫu

Cellulase Lipase

Mẫu

Cellulase Lipase

Chủng

MT

MT2

M1

M2

M4

M6

Các chủng phân lập ở 37oC Stigmasterol lỏng - - - + + + + + - - - - - + + + + - - + + ++ - - - - + -

XMT-1 VSMT-1 VSMT-2 VSMT-3 VSMT-4 VSMT2-1 VSMT2-2 VSMT2-3 XM1-1 XM1-2 XM1-3 VSM1-1 VSM1-2 VSM1-3 VSM1-4 VSM2-2 VSM2-3 XM2-1 XM2-2 VSM3-1 VSM4-2 VSM4-3 XM4-1 VSM4-1 XM4-2 XM4-3 VSM6-1 VSM6-2

+ - - - - - - - ++ + - - - - - - - - + - - + - +/- +/- +/- ++

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M3 21 22 23 24 25 26 27 28

93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 M2 103 104 105 106 107 108 109 M3 110 111 112 113 M4 114 115 116 117 118 119 M6 120

- +++ - - - - - - - - + - - - + - - ++ - - - - - - - +++ - ++

Các chủng phân lập ở 45oC Stigmasterol lỏng + + - + + + ++ + + + + - ++ + + + + + + + + + + - - + + +

CVSMT-1 CVSMT-2 CVSMT-3 CVSMT2-1 CVSMT2-2 CVSMT2-3 CVSMT2-4 CVSM1-1 CXM1-20 CVSM2-2 CXM2-2 CVSM2-1 CVSM2-3 CVSM2-4 CXM2-3 CVSM3-1 CVSM3-2 CVSM3-3 CXM3-2 CXM4-3 CXM4-4 CXM4-5 CVSM4-1 CVSM4-2 CVSM4-3 CVSM6-1 CXM6-2 CVSĐN-2

+/- - + - + + - ++ + - + ++ - - + +/- - ++ ++ + ++ + ++ - - - ++ ++

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

ĐN

Đ1

D1

D2

D3

D4

29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

VSM6-3 XĐN-1 VSĐN-1 VSĐN-2 VSĐN-3 VSĐN-4 VSĐN-5 VSĐ1-1 VSĐ1-4 VSD1-1 VSD1-2 VSD1-3 VSD1-4 XD1-1 XD1-2 XD1-3 VSD2-1 VSD2-3 XD2-2 XD2-3 VSD3-1 VSD3-2 VSD3-3 VSD3-4 XD3-1 XD3-2 VSD4-1 VSD4-2 VSD4-3 VSD4-4 VSD4-5 VSBG-1

- - - - + - - + - + ++ ++ + + - + ++ + + + + + - + + - + + + ++ ++ -

+ + - - - - - - - - - - + ++ - - - + - - + - - + +/- - - - - - -

+ - - + + + ++ - - - - - - - - - - - + - - - - +++ + - - - + - - -

121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152

CXĐN-1 CXĐN-3 CVSĐN-1 CVSĐ1-6 CVSD1-1 CVSD1-4 CXD1-1 CXD1-4 CVSD2-1 CVSD2-2 CVSD2-3 CVSD2-4 CXD2-15 CXD2-17 CVSD3-4 CXD3-1 CXD3-2 CVSD4-1 CXD4-1 CXD4-2 CVSBG-2 CVSBG-3 CXBG-23 CVSS1-1 CVSS1-2 CXSS1-1 CVSS2-1 CXS2-2 CXS2-3 CVSS3-2 CXS3-1 CXS3-3

- + - + + - + + ++ + + - + ++ - - + + - + + + + + + + - + - - + +

+ + + + - + - - - +/- - - + + - - + - +/- ++ + + + - - + - + + + + ++

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

BG

ĐN Đ1 D1 D2 D3 D4 BG S1 S2 S3

- + + - - + + ++ - +

- - + - - - +/- + +

- - - - - - - - - -

CVSS3-1 153 154 CVSVC1-1 155 CVSVC1-2 CXVC1-2 156 VC1 CXVC1-1 157 158 CVSVC2-1 159 CVSVC2-2 160 VC2 CVSVC2-3 CXVC2-1 161 162 CXVC2-25

S1

(-): không phát triển hoặc không có vòng phân hủy

Cellulase, lipase.

(+/-):có vòng phân hủy Cellulase, lipase < 5 mm

S2

(+):phát triển hoặc không có vòng phân hủy Cellulase,

lipase từ 5 – 10 mm

S3

(++):phát triển nhanh hoặc có vòng phân hủy Cellulase, lipase 10 – 20 mm (+++): phát triển rất nhanh hoặc có vòng phân hủy Cellulase, lipase >20 mm

VC1

VC2

61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92

VSBG-2 VSBG-3 VSBG-4 XBG-2 XBG-3 XBG-4 XBG-5 VSBG-5 VSS1-1 VSS1-2 VSS1-3 XS1-2 XS1-4 XS2-1 XS2-2 XS2-3 VSS2-1 VSS2-2 VSS2-3 VSS3-1 VSS3-3 XS3-1 XS3-2 VSVC1-1 VSVC1-2 VSVC1-3 XVC1-2 XVC1-3 XVC1-2 VSVC2-1 VSVC2-2 VSVC2-3

- ++ - - - - - + - ++ + + + + - + + - - + ++ - - - + + - - + + ++ +

- +/- - + ++ + + - - - ++ + - - ++ - - - - - - +/- ++ - - ++ ++ + - ++ ++ ++

- +++ - - - - - - - - - - - - ++ - - - - - - - - - - - - - - -

3.1.2. Khả năng sinh tổng hợp sterol esterase, laccase và cellulase của các chủng tuyển chọn

Theo nghiên cứu của Chandra và Chowdhary (2015), vi sinh vật rất cần nguồn cacbon và nitơ cho quá trình sinh trƣởng ban đầu, và sử dụng cơ chất nhƣ một chất cảm ứng kích thích sinh tổng hợp enzym [4]. Việc bổ sung glucose và pepton với hàm lƣợng thấp nhằm cung cấp nguồn cacbon và nitơ cần thiết cho quá trình phát triển ban đầu thúc đẩy chúng sinh tổng hợp các enzym. Trong phần này, 87 chủng lựa chọn đƣợc đánh giá khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme trên môi trƣờng MT2. Kiểm tra hoạt tính sterol esterase, laccase và cellulase sau 72 – 120 giờ.

Trên môi trƣờng khảo sát, hầu hết các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn lựa chọn đều có khả năng sinh sterol esterase và laccase. Hoạt độ laccase của hầu hết các chủng sinh ra là khá thấp hầu hết đều dƣới 1 U/L, riêng chỉ có chủng VSS3-3 sinh laccase cao nhất với hoạt độ enzym 2,24 U/L. Hoạt độ sterol esterase sinh tổng hợp trên môi trƣờng MT2 của các chủng đều khá cao. Trong số 87 chủng đƣợc đánh giá có 21 chủng có hoạt độ sterol esterase trên 4000 U/L, trong đó hai chủng xạ khuẩn CXM1-20, CXD2-17 cho hoạt tính enzym đạt cao nhất lần lƣợt là 4768 U/L và 5162 U/L, có 14 chủng vi khuẩn có hoạt tính sterol esterase cao trên 4000 U/L, đáng chú ý là chủng VSD3-1 và VSM2-3 là hai chủng sinh tổng hợp enzym tốt nhất phân lập ở nhiệt độ 37oC với hoạt độ đạt trên 6000 U/L và chủng CVSVC1-1 và CVSM6-2 phân lập ở nhiệt độ 45oC có hoạt lực enzyme đạt lần lƣợt 4592 và 4992 U/L (Bảng 3.3 và 3.4). Từ 87 chủng, nhóm nghiên cứu lựa chọn hai chủng vi khuẩn phát triển 37oC: VSD3-1, VSM2-3, một chủng xạ khuẩn phát triển ở 37oC: XS1-2, hai chủng vi khuẩn phát triển ở 45oC: CVSM6-1, CVSVC1-1 và hai chủng xạ khuẩn phát triển ở 45oC: CXM1-20, CXD2-17 là những chủng vừa có khả năng sinh laccase, esterase cao và không sinh cellulase để khảo sát khả năng giảm nhựa cây.

Bảng 3.3. Hoạt tính enzym sterol esterase, laccase và cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập ở 37oC

Hoạt độ enzym

STT

Chủng

STT

Chủng

Lac (U/L)

Esterase (U/L)

Cellulase (U/L)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

VSMT-3 VSMT-4 VSMT2-2 VSĐN-3 VSD1-2 VSD3-1 VSS2-1 VSM2-2 VSM2-3 VSS3-1 VSM1-3 VSM1-4 VSM6-1 VSD3-2 VSD3-4 VSĐ1-1 VSD1-1 VSD1-3 VSD1-4 VSD4-1 VSD4-2

0,85 0,42 0,11 0,46 0 0 0,53 0,48 0,04 0,04 0,39 0 0,51 0 0 0 0,11 0 0 0 0

4793,86 4631,58 4500,00 4841,23 4800,00 7236,84 4912,28 4921,05 6337,72 5013,16 2517,54 2614,04 3201,75 2912,28 2241,23 3078,95 1324,56 2767,54 1311,40 2052,63 2473,68

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

Hoạt độ enzym Sterol esterase (U/L) 2390,35 2074,56 2258,77 2293,86 1508,77 1912,28 2144,74 21,93 0 855,26 1390,35 1714,91 1614,04 1894,74 1346,49 1679,82 1162,28 1004,39 1008,77 798,25 1179,82

0 0 0,07 0,11 0,39 0,42 2,24 0,04 0,21 0 0 0,83 0,28 0 1,09 0 0 0,07 0,74 1,62 0,14

0 0 0 0 0 15,34 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

VSD4-3 VSD4-4 VSD4-5 VSBG-3 VSM3-1 VSMT2-3 VSS3-3 VSD2-1 VSD2-3 VSBG-5 VSM4-2 VSM4-3 VSMT2-1 VSVC1-2 XS1-2 XS1-4 XS2-1 XS2-3 XD2-2 XD2-3 XD3-1

Bảng 3. 4. Hoạt tính enzym sterol esterase, laccase và cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập ở 45oC

Hoạt độ enzym

STT

Chủng

STT

Chủng

Laccase (U/L)

cellulase (U/L)

Laccase (U/L)

Cellulase (U/L)

CVSMT-1 CVSMT2-1 CVSMT2-4 CVSD2-1 CVSD2-2 CVSD2-3 CXM1-20 CXM2-2 CXM2-3 CXM4-3 CXĐN-3 CXD1-1 CXD2-15 CXD2-17 CXD3-2 CXSS1-1 CXS2-2 CXS3-1 CXVC2-25 CXM4-5 CXBG-23 CXD1-4

0,11 0,32 0,42 0,16 0,14 0,46 0 0 0 0,46 0,53 0,21 0,32 0 0,62 0,81 0 0,07 0 0 0 0,25

Sterol esterase (U/L) 1228,07 1929,82 1815,79 1495,61 2004,39 1500,00 4768,42 3561,40 3486,84 4000,00 3719,30 3219,30 3513,16 5162,28 4627,19 4521,93 3596,49 4561,40 4070,18 2811,40 3157,89 438,60

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Hoạt độ enzym Sterol esterase (U/L) 4692,98 2692,98 4552,63 4162,28 4592,11 3359,65 3675,44 3662,28 2815,79 2052,63 2171,05 2008,77 0 0 372,81 197,37 491,23 807,02 258,77 596,49 815,79 1728,07 1916,67

0 137,74 21,70 132,17 0 12,16 0 0 0 0 0 0 0 32,03 0 101,97 7,39 0 0 0 0 0 0

0,53 0,02 0,65 0 0,44 0,02 0,72 0,39 0 0,09 0,11 0,32 0,07 0 0 0,32 0,42 0 0 0 0 0,48 0,92

CVSM6-1 CVSMT2-2 CVSMT2-3 CVSD4-1 CVSVC1-1 CVSM2-2 CVSD1-1 CVSMT-2 CVSM2-3 CVSM3-2 CVSĐ1-6 CVSBG-3 CVSVC1-2 CVSVC2-1 CVSVC2-2 CVSVC2-3 CVSBG-2 CVSĐN-2 CVSS1-1 CVSS1-2 CVSS3-1 CVSM2-4 CVSM3-1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Ghi chú: Các chủng vi khuẩn được nuôi và kiểm tra enzyme sau 3 ngày và xạ khuẩn kiểm tra sau 4 ngày

43

3.1.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn có khả năng phân hủy nhựa cây

Các chủng VSD3-1, VSM2-3, XS1-2, CVSM6-1, CVSVC1-1, CXM1- 20, CXD2-17 đƣợc tiến hành kiểm tra khả năng phân hủy chất chiết nhựa bằng phƣơng pháp ngâm ngập dăm mảnh keo trong dịch lên men của chúng. Các chủng chọn lọc đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng khoáng phân lập có bổ sung 0,5g/L chất chiết nhựa. Sau 72 giờ nuôi cấy với vi khuẩn và 96 giờ nuôi cấy với xạ khuẩn, thu hồi toàn bộ dịch lên men và sử dụng chúng để ngâm ngập dăm mảnh gỗ. Sau 10, 24 giờ tiến hành lấy mẫu và kiểm tra khả năng phân hủy chất chiết nhựa của các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn kiểm tra (Hình ảnh ngâm đƣợc thể hiện trong Hình 3.5 và chiết nhựa Hình 3.6). Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.5.

Hầu hết các chủng đƣợc lựa chọn đều có khả năng làm giảm chất chiết có trong nhựa cây. Sau 10 giờ ngâm ngập, các chủng đều làm giảm nhựa trong dăm mảnh, đặc biệt chủng CVSVC1-1 làm giảm hàm lƣợng nhựa tốt nhất, hàm lƣợng nhựa giảm so với mẫu đối chứng ban đầu lên tới 45%, chủng CVSM6-1 giảm 30 % sau 24 giờ , chủng XS1-2 làm giảm trên 37% và chủng CXD2-17 làm giảm trên 30%. Sự giảm nhựa trong quá trình này chủ yếu dựa vào sự tác động của hệ enzym do vi sinh vật tiết ra khi lên men. Sau 24 giờ, hàm lƣợng nhựa ở từng mẫu giảm rõ rệt. Có thể giai đoạn này ngoài enzym sinh ra ban đầu, các chủng vi sinh vật bắt đầu phát triển trên dăm mảnh và tiếp tục sinh enzym phân cắt các mạch triacylglycerol có trong nhựa cây. Từ bảng 3.5 cho thấy, chủng CVSVC1-1 là vi khuẩn có tiềm năng giảm nhựa rõ rệt nhất trên 46 % so với đối chứng, do đó, chủng đƣợc tuyển chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

44

XS1-2

VSD3-1

VSM2-3

CVSM6-1

CVSVC1-1

CXD2-17

CXM1-20

Hình 3.5. Dăm mảnh gỗ keo đƣợc ngâm ngập trong dịch lên men của các chủng tuyển chọn

45

Hình 3.6. Quá trình chiết nhựa

Bảng 3. 5. Khả năng phân hủy nhựa của các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn tuyển chọn

Gỗ keo

Chủng/mẫu

Thời gian (giờ) Hàm lƣợng nhựa có trong mẫu (%) Hàm lƣơng nhựa giảm (%)

ĐC 2,44 ±0,031 -

Đối chứng mảnh gỗ ban đầu Đối chứng ngâm nƣớc

CVSM6-1

CVSVC1-1

CXM1-20

CXD2-17

VSD3-1

VSM2-3

XS1-2 24 10 24 10 24 10 24 10 24 10 24 10 24 10 24 2,26 ±0,021 1,84±0,026 1,58±0,023 1,32±0,015 1,28 ±0,028 1,79±0,026 1,79±0,025 1,87±0,015 1,51± 0,007 1,78±0.025 1,98±0,026 1,86±0,015 1,99±0,025 1,74±0,021 1,52±0,012 8,50 18,94 30,40 45,90 47,54 20,79 20,79 17,25 33,18 21,24 12,38 17,70 11,95 28,68 37,70

46

3.2. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG CVSVC1-1

3.2.1 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của chủng vi khuẩn CVSVC1-1

Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn

Trên môi trƣờng Bennet, vi khuẩn CVSVC1-1 phát triển khá nhanh tạo thành các khuẩn lạc có dạng tròn, trơn bóng, màu vàng hơi nâu, mép ngoài khuẩn lạc trơn. Sau 24 giờ lên men lỏng, mật độ tế bào đạt khoảng 108 – 109 CFU/ml.

A

B

C

D

Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào vi khuẩn CVSVC1-1 dƣới kính hiển vi quang học (100x) (B) và kính hiển vi điện tử ở độ phóng đại (50000X) (C) và (10000X) (D)

47

Trên kính hiển vi quang học vi khuẩn CVSVC1-1 là trực khuẩn gram (+), bắt màu tím. Trên kính hiển vi điện tử, vi khuẩn CVSVC1-1 có hình elip, kích thƣớc tế bào khoảng 4-6 x 10-14 µm (Hình 3.7).

Khả năng sinh bào tử của chủng vi khuẩn CVSVC1-1

Một số vi sinh vật khi gặp điều kiện sống bất lợi chúng thƣờng sản sinh bảo tử. Việc sản sinh bào tử giúp bảo vệ vi sinh vật tránh đƣợc những tác nhân bất lợi của môi trƣờng: nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, môt trƣờng sống nghèo dinh dƣỡng, pH môi trƣờng bất lợi ... thông thƣờng nấm và xạ khuẩn là những loài đƣợc biết đến là những loài có khả năng sinh bào tử và đƣợc xem là một hình thức sinh sản điển hình, tuy nhiên, ở một số loài vi khuẩn đặc biệt là các loài thuộc chi Bacillus vẫn có khả năng sinh nội bào tử khi gặp điều kiện bất lợi.

Hình 3.8. Khả năng sinh bảo tử của chủng vi khuẩn CVSVC1-1

Sau ử 80oC, chủng vi khuẩn CVSVC1-1 có khả năng phát triển lại trên đĩa nhƣ vậy chủng này có khả năng sinh bào tử. So sánh một số đặc điểm nghiên cứu trên với khóa phân loại Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology nên có thể xếp chủng CVSVC1-1 thuộc chi Bacillus.

Khảo sát khoảng pH và nhiệt độ cho phát triển của chủng CVSVC1-1.

Kết quả khảo sát khoảng nhiệt độ và pH thích hợp cho sự sinh trƣởng và

phát triển của chủng CVSCV1-1 đƣợc thể hiện ở Bảng 3.6 và 3.7.

48

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng CVSVC1-1 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng phát triển của CVSVC1-1

Nhiệt độ, oC

Độ pH 4 5 6 7 9 10 11 Sinh trƣởng - ± + ++ ++ + -

Ghi chú: (-) Không sinh trưởng, (±) sinh trưởng yếu, (+) sinh trưởng tốt; (++) sinh trưởng rất tốt.

10 25 30 37 45 55 60 Sinh trƣởng - + + ++ ++ + ±

Kết quả cho thấy, chủng CVSVC1-1 phát triển ở khoảng pH từ 5-10 và phát triển tốt nhất ở pH 7- 9. Chủng CVSVC1-1 có khả năng sinh trƣởng ở khoảng nhiệt độ 25 – 60 oC và phát triển tốt nhất 37 - 45oC. Nhƣ vậy chủng vi khuẩn CVSVC1-1 là chủng vi khuẩn chịu nhiệt và phát triển ở môi trƣờng trung tính đến kiềm.

Khả năng sinh tổng hợp một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn CVSVC1-1.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào là một trong những đặc điểm cho biết sự thích nghi của chủng vi khuẩn đối với môi trƣờng sống và khả năng sử dụng nhiều nguồn cơ chất. Trong thí nghiệm này, chủng đƣợc khảo sát khả năng phân hủy guaiacol, RBBR (cơ chất tƣơng tự lignin), CMC, Xylan, Casein và tinh bột. Hình ảnh kiểm tra đƣợc thể hiện ở Hình 3.9.

49 B

A

C

D

F

E

Hình 3.9. Khả năng phân hủy một số cơ chất của vi khuẩn CVSVC1-1

(A: Guaiacol, B: RBBR, C: Casein, D: Tinh bột, E: xylan, F: cellulase)

Chủng vi khuẩn CVSVC1-1 có khả năng phân hủy casein tạo thành vòng phân hủy trong xung quanh khuẩn lạc, do đó, chủng có khả năng sinh protease. Chủng CVSVC1-1 không có khả năng phân hủy cơ chất guaiacol, RBBR, tinh bột, xylan, và cellulose.

3.2.2. Định danh chủng vi sinh vật tuyển chọn bằng phƣơng pháp phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA

Vi khuẩn CVSVC1-1 đƣợc tiến hành tách chiết DNA tổng số và nhân gen 16S-rDNA bằng cặp mồi đặc hiệu 27F và 1492R. Kết quả tách chiết DNA cho một băng sáng và rõ, nhƣ vậy, DNA của chủng vi khuẩn đã đƣợc tách chiết thành công, toàn vẹn, có thể sử dụng để làm khuôn nhân gen 16S- rDNA bằng phƣơng pháp PCR (Hình 3.10 A).

50 A

Điện di đồ Cây phát sinh chủng loài

Hình 3.10. Điện di đồ DNA tổng số (A), sản phẩm PCR (B) trên gel agarose 1,0 % và cây phát sinh chủng loài của vi khuẩn CVSVC1-1

Bảng 3.8. Mức độ tƣơng đồng di truyền giữa chủng CVSVC1-1 với các loài vi khuẩn có họ hàng gần dựa vào trình tự gen16S rDNA

Chủng so sánh

Mã số trên Genbank

Brevibacillus agri strain WCD 49 Brevibacillus agri strain EB54 Brevibacillus limnophilus strain 1P07PD Brevibacillus sp. Bac171R Brevibacillus agri strain ZJY-275 Brevibacillus agri strain: JCM 8507 Brevibacillus brevis strain HMF7750 Brevibacillus formosus strain LMG 16101

MN049193.1 KC352740.1 EU977766.1 KP795832.1 KP282796.1 LC379070.1 KY047407.1 AF378234.1

Độ tƣơng đồng, % 99,83% 99,83% 99,83% 99,74% 99,65% 99,65% 99,57% 99,39%

Sản phẩm khuếch đại từ DNA tổng số của các chủng vi khuẩn tuyển chọn với cặp mồi 27F và 1492R cho một băng DNA duy nhất có kích thƣớc khoảng 1337 Nucleotit (Hình 3.10b). Khi phân tích trình tự gen vùng 16S rDNA và so sánh trên ngân hàng Genbank cho thấy, chủng có độ tƣơng đồng cao với các loài thuộc chi Brevibacillus: loài Brevibacillus agri strain WCD 49, Brevibacillus agri strain EB54 (99.83%), Brevibacillus agri strain ZJY-275, Brevibacillus agri strain: JCM 8507 (99,65%), Brevibacillus limnophilus strain 1P07PD (99,83%), Brevibacillus sp. Bac171R (99,74%), Brevibacillus brevis strain HMF7750 (99,57%), Brevibacillus formosus strain LMG 16101 (99,39%). Từ kết quả giải trình tự gen 16S rDNA kết hợp với một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa, chủng CVSVC1-1 đƣợc xếp vào

51

loài Brevibacillus agri và đƣợc đặt tên là Brevibacillus agri CVSVC1-1

(Mã số đăng ký trên Genbank MT534040).

3.3. NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP STEROL ESTERASE CỦA CHỦNG CVSVC1-1

3.3.1. Lựa chọn môi trƣờng thích hợp cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp một số enzym của chủng CVSVC1-1

Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng sinh trƣởng và sinh enzym của chủng CVSVC1-1 đƣợc tiến hành khảo sát trên các môi trƣờng MPA, môi trƣờng MT2, Bennet có bổ sung 0,5 g nhựa cây. Sau 48 giờ nuôi cấy tiến hành kiểm tra khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.9 và Hình 3.11.

Hình 3.11. Khả năng sinh trƣởng của chủng CVSVC1-1 trên các môi trƣờng khảo sát

Bảng 3. 9. Khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym của chủng CVSVC1-1 trên một số môi trƣờng khảo sát

Hoạt độ enzyme

Môi trƣờng Esterase (U/L) Mật độ (CFU/g) Sinh khối ƣớt (g/L) Laccase (U/L) CMCase (U/L)

MPA 30,83

MT2 28,33

Bennet 24,53 4,00 x109 5485,38±140,44 0,76±0,096 1,23 ± 0,02 3,09 x109 4592,11±309,05 0,62±0,026 0,78± 0,012 2,72 x109 3701,75±235,54 0,85±0,096 135,73±6,02

52

Chủng CVSVC1-1 có khả năng sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng MPA, Czapek cải tiến và Bennet với mật độ tế bào đạt trên 109 CFU/ml. Môi trƣờng MPA thúc đẩy quá trình phát triển của chủng CVSVC1-1 tốt nhất, lƣợng sinh khối ƣớt của chủng thu đƣợc 30,83 g/L với mật độ tế bào đạt 4,00 x 109 CFU/ml. Ngoài ra, môi trƣờng MT2 cũng là môi trƣờng thích hợp cho sự tăng sinh của chủng CVSVC1-1, lƣợng sinh khối ƣớt thu đƣợc trên môi trƣờng là 28,33 g/L với mật độ tế bào đạt 3,09.109.

Khi nuôi cấy ở các môi trƣờng lên men MPA, MT2 và Bennet có bổ sung 0,5 g/l nhựa cây, chủng CVSVC1-1 đều có khả năng sinh enzym esterase, laccase. Trên môi trƣờng MPA khả năng sinh tổng hợp sterol esterase của chủng CVSVC1-1 hoạt độ đạt 5485,38 (U/L), hoạt độ laccase đạt 0,76 (U/L). Trên MT2 chủng CVSVC1-1 sinh sterol esterase đạt 4592,11 U/L và laccase đạt 0,62 U/L. Chủng hầu nhƣ không sinh CMCase trên môi trƣờng MPA và MT2. Tuy nhiên khi nuôi cấy trên môi trƣờng Bennet lại kích khả năng sinh enzym này, hoạt độ CMCase đạt 135,73 U/L. Từ kết quả đạt thu đƣợc, lựa chọn môi trƣờng MPA có bổ sung 0,5% nhựa cây làm môi trƣờng thu nhận sinh khối và sinh tổng hợp enzym cho chủng CVSVC1-1.

3.3.2. Ảnh hƣởng cả các yếu tố nhiệt độ, pH và tốc độ lắc đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym của chủng CVSVC1-1

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Chủng CVSVC1-1 đƣợc khảo sát khả năng sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp enzym ở các nhiệt độ: nhiệt độ phòng, 37oC và 45oC trên môi trƣờng MPA có bổ sung chất chiết nhựa cây. Sau 72 giờ nuôi cấy, tiến hành kiểm tra hoạt độ sterol esterase, laccase và cellulase sinh ra trên môi trƣờng. Kết quả đƣợc thể hiện trên Hình 3.12a và 3.13.

Vi khuẩn CVSVC1-1 sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng MPA ở nhiệt độ phòng, 37oC và 45oC. Ở 37- 45 oC chủng sinh trƣởng tốt nhất, sau 72 h nuôi cấy mật độ tế bào đạt đều đạt 109 CFU/ml, ở nhiệt độ phòng (28oC) chủng phát triển khá chậm mật độ vi khuẩn chỉ đạt 3,18 x 107 CFU/ml.

53 A

B

Nhiệt độ pH

Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ (A) và pH (B) đến khả năng sinh trƣởng của chủng CVSVC1-1 trên môi trƣờng MPA bổ sung 0,5g/L

Hình 3. 13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính enzyme sterol esterase và laccase của chủng CVSVC1-1

Ở nhiệt độ phòng, 37oC và 45oC, vi khuẩn CVSVC1-1 đều sinh tổng hợp enzym sterol esterase (>1900 U/L), laccase (> 0,8 U/L) và không thấy sự có mặt của enzym cellulase. Vi khuẩn CVSVC1-1 sinh tổng hợp sterol esterase tốt nhất khi nuôi cấy ở 45oC với hoạt độ enzym đạt đƣợc 3903,51 U/L. Hoạt độ enzym laccase sinh ra cao nhất khi nuôi cấy ở 37 oC đạt 5,92 U/L, ở 45oC hoạt độ laccase đạt 2,38 U/L. Kết quả kiểm tra hoạt độ enzym khá phù hợp với khả năng phát triển của chủng. Theo nghiên cứu của Camacho và cs (2009), vi khuẩn ƣu nhiệt Haloarcula marismortui phát triển chậm ở 30oC và phát triển tốt nhất ở 42,5oC. Khi tăng nhiệt độ từ 30 – 50oC, hoạt tính esterase của chủng tăng từ 1,8 – 2,1 (U/ml) [57]. Nhƣ vậy với chủng CVSVC1-1 có thể nhân nuôi trong khoảng nhiệt độ 37-45oC.

54

Ảnh hưởng của yếu tố pH

Độ pH môi trƣờng cũng là một trong những yếu tố quyết định đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym phân hủy. Ở ngƣỡng pH thích hợp sẽ thúc đầy quá trình sinh trƣởng và kích thích khả năng sinh tổng hợp enzym, ngoài ngƣỡng pH này chủng có thể phát triển yếu hoặc chết. Mỗi loài vi sinh vật khác nhau sẽ có một ngƣỡng pH thích hợp, do đó, việc khảo sát tối ƣu điều kiện pH là rất cần thiết. Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym của vi khuẩn CVSVC1-1 đƣợc tiến hành trên môi trƣờng MPA có bổ sung 0,5 g nhựa cây và nuôi cấy ở 45oC. Sau 72 giờ nuôi cấy tiến hành lấy mẫu và kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzym của chủng.

Với pH 5 – 10, chủng CVSVC1-1 đều có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng, tuy nhiên pH thích hợp nhất cho sự phát triển của chủng là pH 7-9 với mật độ tế bào đều đạt đƣợc trên 109 CFU/ml dịch lên men.

Hình 3. 14. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy đến hoạt tính enzyme sterol esterase và laccase của chủng CVSVC1-1

Hầu hết ở các mức pH môi trƣờng từ 5 – 10 chủng CVSVC1-1 đều có khả năng sinh tổng hợp sterol esterase và laccase và không sinh cellulase. Ở pH 5-6 chủng sinh tổng hợp sterol ssterase kém, hoạt độ enzym đạt dƣới 500 U/L. Hoạt độ sterol ssterase sinh ra cao nhất khi nuôi cấy trên môi trƣờng có pH 8 – 9 với hoạt độ đạt đƣợc từ 6640,35 – 7213,45 U/L. Chủng CVSVC1-1 sinh tổng hợp laccase cao nhất ở pH 7 – 8 với hoạt độ enzym đo đƣợc 1,98 – 2,47 U/l. Nhiều loài vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp esterase tốt nhất ở pH 7 -8. Chủng vi khuẩn H. marismortui sinh tổng hợp esterase tối ƣu ở pH

55

7,5 với hoạt độ enzm đạt đƣợc 2,3 U/ml [57]. Tuy nhiên, đối với một số chủng sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng hơi kiềm tính thì pH tối thích cho sự sinh tổng hợp 8 – 9. Chủng Bacillus pseudofirmus OF4 có thể thích ứng và sinh tổng hợp esterase ở khoảng pH 7 – 10,5 hoạt độ enzym đo đƣợc tốt nhất khi ở ph 8,5 dạt 6,6 U/mg protein [58].

Thông qua khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt và pH đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của chủng CVSVC1-1 có thể thấy, ở 45oC là nhiệt độ thích hợp cho khả năng sinh trƣởng cũng nhƣ sinh tổng hợp sterol esterase. Khoảng pH 7-9 thích hợp cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn CVSVC1-1 trên môi trƣờng lên men, pH thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzym sterol esterase là 8 -9.

Ảnh hưởng của tốc độ lắc

Ngoài việc lựa chọn môi trƣờng, nhiệt độ và pH thích hợp cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme của chủng CVSVC1-1 thì ảnh hƣởng của tốc độ lắc cũng là một yếu tố cần thiết trong quá trình khảo sát. Thay đổi tốc độ lắc ảnh hƣởng đến việc cung cấp oxy thiết yếu cho các quá trình trao đổi của vi sinh vật, dẫn đến sự thay đổi lƣợng sinh khối thu nhận và các sản phẩm thứ cấp sinh ra, do vậy việc khảo sát tốc độ lắc trong quá trình lên men là rất cần thiết.

Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến sinh trƣởng và hoạt tính enzyme sterol esterase, laccase và cellulase của chủng CVSVC1-1

Hoạt độ enzyme

Chủng

Mật độ (CFU/g)

Esterase (U/L)

Tốc độ lắc (v/p)

Laccase (U/L)

Cellulase (U/L)

CVSVC1- 1

100 150 200

Sinh khối ƣớt (g/L) 25,23 28,75 31,32

6,36.108 1671,05±117,85 0,625±0,032 1,91.109 1736,84±12,41 0,532±0,098 4,00.109 5485,38±140,44 0,76±0,096

0 0 0

Tiến hành nuôi cấy chủng CSVC1-1 trên môi trƣờng và điều kiện thích hợp đã tuyển chọn ở trên với các tốc độ lắc khác nhau: 100, 150, 200 (v/p). Sau 72 h nuôi cấy tiến hành xác định khả năng sinh trƣởng và hoạt độ enzym sinh ra. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.10.

56

Chủng CVSVC1-1 sinh trƣởng tốt khi lắc ở các tốc độ 100, 150, 200 v/p, tuy nhiên hai chủng sinh trƣởng tốt nhất khi nuôi ở tốc độ lắc 200v/p. Sinh khối ƣớt chủng CVSVC1-1 đạt đƣợc từ 25 – 31 (g/L) với mật độ tế bào từ 108-109. Ở tốc độ lắc 200v/p kích thích sự sinh tổng hợp enzym của vi khuẩn CVSVC1-1 hoạt độ esterase và Laccase đạt đƣợc lần lƣợt là 5485,38 và 0,76 (U/L). Chủng CVSVC1-1 không sinh cellulase. Tốc độ lắc có ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng và khả năng trao đổi chất của vi sinh vật. Khi nuôi cấy ở tốc độ lắc 200 v/p đã thúc đẩy khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym của vi khuẩn CVSVC1-1.

3.4. NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN BỔ SUNG VI SINH VẬT TUYỂN CHỌN VÀO DĂM MẢNH GỖ KEO.

Để đánh giá đƣợc tiềm năng ứng dụng vào sản xuất giấy của chủng CVSVC1-1, trƣớc tiên cần đánh giá khả năng giảm nhựa trên nguồn nguyên liệu ở quy mô phòng thí nghiệm. Thí nghiệm đƣợc tiến hành, trên các túi 2 kg nguyên liệu dăm mảnh gỗ, khảo sát tỷ giống bổ sung và độ ẩm trên nguyên liệu. Mẫu đƣợc lấy và xác định mật độ vi sinh vật, hoạt tính sterol estease, laccase, cellulase sinh ra và hàm lƣợng nhựa còn lại theo thời gian ủ.

3.4.1. Ảnh hƣởng tỷ lệ giống đến khả năng sinh trƣởng và loại nhựa

Khảo sát tỷ lệ bổ sung giống vào nguyên liệu sản xuất là rất cần thiết, nó không chỉ xác định mức sử dụng giống thích hợp cho sự giảm nhựa hiệu quả mà còn là yếu tố quyết định đến hiệu quả kinh tế khi đƣa vào thực tiễn. Bản thân nguồn nguyên liệu sản xuất đã có vi sinh vật tạp nhiễm, tuy mật độ vi sinh tạp nhiễm trên nguyên liệu mới không cao 103 – 104 CFU/g, tuy nhiên với điều kiện thuận lợi, chúng có thể bùng phát mạnh mẽ gây một số vấn đề không mong muốn: thất thoát cellulose, ảnh hƣởng đến chất lƣợng giấy. Sử dụng lƣợng giống bổ sung thích hợp không chỉ làm giảm hàm lƣợng nhựa trên nguyên liệu mà còn có thể ức chế sự phát triển của vi sinh vật tạp nhiễm.

Chủng CVSVC1-1 đƣợc tiến hành lên men trên môi trƣờng MPA có bổ sung 0,5 g nhựa cây. Sau 24 giờ lên men, chủng phát triển tốt, mật độ tế bào sử dụng để phun vào mảnh là 2,09 x 107 CFU/ml. Giống CVSVC1-1 đƣợc sử

57

dụng để tiến hành khảo sát mức dùng với tỷ lệ bổ sung 1, 5, 10 và 20% và theo dõi theo thời gian. Sau 7, 14, 21 và 28 ngày, tiến hành lấy mẫu và kiểm tra mật độ vi sinh vật, hoạt độ enzym và hàm lƣợng nhựa giảm trên nguyên liệu gỗ. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.12; 3.13 và Hình 3.15; 3.16.

Hình 3.15. Nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo đƣợc xử lý với chủng CVSVC1-1 ở các tỷ lệ giống bổ sung khác nhau

Hình 3.16. Nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo đƣợc xử lý với chủng CVSVC1-1 sau rửa và sấy

A

B

Hình 3.17. Mật độ vi sinh trên mẫu có và không bổ sung chủng CVSVC1-1 ở nồng độ 105

Chủng CVSVC1-1 có khả năng phát triển trên mảnh nguyên liệu. Gỗ sau khi đƣợc xử lý với chủng vi khuẩn không bị tối mầu so với đối chứng (Hình

58

3.16.). Tiến hành trang đĩa kiểm tra mật độ cho thấy, ở tất cả các mẫu thí nghiệm có bổ sung vi khuẩn đều xuất hiện vi khuẩn CVSVC1-1 với mật độ ban đầu sau phun đạt khoảng 104-5 CFU/g gỗ mảnh và tăng gấp 10 lần sau 7 ngày ủ. Sau 14 và 21 ngày ủ mật độ vi khuẩn trong mảnh đạt 107 CFU/g.

Bảng 3. 11. Khả năng sinh sterol esterase, laccase và cellulase của chủng

CVSVC1-1 trên dăm mảnh gỗ ở các tỷ lệ giống khác nhau

Hoạt tính enzym sinh ra trên dăm mảnh (U/100g gỗ)

Ngày

Thí nghiệm

Tỷ lệ tiếp giống

laccase

cellulase

7 CVSVC1- 1

Sterol esterase Đối chứng Nƣớc 842,11±13,6 1 5 10 20

0,081±0,006 0,34±0,04 1949,56±30,71 1,04±0.043 0,002±0.001 0 0,00±0,05 1381,58±4,09 1,18±0,012 0 2703,95±5,89 0 0,9±0.02 2934,21±8,06 0,110±0.003 0,003±0,001

14 CVSVC1- 1

Đối chứng Nƣớc 1010,96±21,98 0,00 0,00 2975,88±3,1 0,63±0,021 0 2478,07±20,4 3578,95±18,61 0,12±0,01 0 3697,37±71,33 0,83±0,015 0

1 5 10 20

21 CVSVC1- 1

Đối chứng Nƣớc 1508,77±13,02 0,60±0,014 0,122±0,002 0 3403,51±14,88 0,00 3567,98±40,32 0,00 0 3458,33±15,51 0,79±0,054 0 0 3719,30±46,52 0,00

1 5 10 20

Chủng CVSVC1-1 có khả năng sinh tổng hợp sterol esterase khi nuôi cấy trên dăm mảnh. Hầu hết ở các mức tỷ lệ sử dụng 1, 5, 10 và 20% hoạt độ sterol esterase có xu hƣớng tăng lên theo thời gian, quá trình sinh tổng hợp enzym diễn ra mạnh mẽ nhất sau khi xử lý 14 – 21 ngày. Với tỷ lệ giống 10 và 20%, quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym diễn ra mạnh mẽ hơn so với mức dùng 1 và 5 %. Tại thời điểm 14 ngày, hoạt độ sterol esterase thu đƣợc ở thí nghiệm sử dụng 10 và 20 % lần lƣợt là 3578,95 và 3697,37 U/100g, trong khi đó ở thí nghiệm 1 va 5 % hoạt độ enzym chỉ đạt lần lƣợt 2975,88 và 2478,07 U/100g gỗ. Ở thời điểm 21, hoạt độ esterase của chủng

59

CVSVC1-1 với các mẫu thí nghiệm mức dùng tƣơng đối ổn định, hoạt độ do đƣợc trên 3000 U/ 100g gỗ. Chủng có khả năng sinh laccase, tuy nhiên, hoạt tính enzym đo đƣợc tƣơng đối thấp đạt 0,12 – 1,3 U/100 g gỗ. Trên các đống ủ thí nghiệm hoạt tính cellulase phát hiện rất thấp hoặc không có khi nuôi cấy trên gỗ. Hoạt tính sterol esterase cũng xuất hiện trên các mẫu bổ sung nƣớc (Đ/C) với hoạt tính đạt dƣới 1508 U/100 g gỗ, nguyên nhân có thể là do vi sinh vật tạp nhiễm trong gỗ sinh ra.

Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến khả năng giảm nhựa trên nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo

Ngày

Đối chứng xử lý nƣớc -

Hàm lƣợng nhựa còn lại trên nguyên liệu , % 20 -

10 -

1 -

5 -

Mẫu gỗ nguyên 2,64±0,026 2,58±0,031 2,20±0,012 1,94±0,015 2,13±0,025 2,35±0,015 2,02±0,03 2,47±0,025 2,48±0,015 1,92±0,021 1,85±0,017 1,82±0,021 1,66±0,015 2,56±0,021 2,20±0,026 1,46±0,017 1,20±0,006 0,89±0,015 1,58±0,021

0 7 14 21

Chú ý: (-) Không xác định

Hàm lƣợng nhựa tổng chiết trong axeton sau khi ủ theo thời gian cho thấy, tổng lƣợng nhựa trên gỗ ban đầu là 2,64%, trên dăm mảnh ủ đối chứng theo thời gian lƣợng nhựa giảm 2,20 %. Có thể thấy trong quá trình lƣu giữ dăm mảnh hàm lƣợng nhựa có giảm 4,22 - 16,67%, tuy nhiên, khả năng giảm nhựa là không đáng kể, quá trình giảm nhựa này chủ yếu là sự thủy phân của một số axit béo chuỗi ngắn dễ bị thủy phân bởi các yếu tố môi trƣờng và vi sinh vật tạp nhiễm.

Trên các mẫu thí nghiệm, ở thời điểm 7 ngày, khả năng giảm nhựa khi sử dụng các mức dùng khác nhau không có sự thay đổi đáng kể, hàm lƣợng nhựa giảm từ 10,98 - 26,52%. Tại thời điểm 14 ngày, khả năng giảm nhựa ở các mức dùng có sự thay đổi rõ rệt, sử dụng mức dùng 20% cho khả năng giảm nhựa tốt nhất, hiệu quả giảm nhựa đạt 37,12% so với mẫu gỗ ban đầu. Tại thời điểm 21 ngày ủ nguyên liệu, tất cả các mẫu thí nghiệm đều làm giảm hàm lƣợng nhựa 38 đến 65% so với nguyên liệu ban đầu và giảm 33-59 % so với đối chứng bổ sung nƣớc, trong đó sử dụng mức dùng 10% cho hiệu quả giảm nhựa tốt nhất. Với các mẫu thí nghiệm mức dùng 1, 5, 10 và 20 %, hàm lƣợng nhựa giảm mạnh nhất tại thời điểm 21 ngày.

60

Các mẫu có khả năng giảm nhựa tốt nhất sẽ đƣợc tiến hành nấu bột để xác định hiệu xuất nấu, chỉ số Kappa, hàm lƣợng kiềm dƣ và tỷ lệ bột sống. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở Bảng 3.13.

Bảng 3.13. Hiệu suất nấu bột ở một số mẫu có lƣợng nhựa giảm tốt

Nấu bột

Mẫu nhựa giảm

Ngày

Chỉ số Kappa

0 Gỗ ban đầu

Hiệu suất nấu, % 47,99

18,07

14 Mẫu đối chứng nƣớc

46,23

18,06

21 Mẫu đối chứng nƣớc

46,01

18,01

10 % giống

47,12

17,52

14 20 % giống

47,16

17,39

21 10 % giống

46,04

15,21

Hiệu suất nấu ở các mẫu thí nghiệm không thay đổi nhiều so với mẫu gỗ ban đầu. Một số mẫu nấu có hiệu suất nấu thấp hơn so với mẫu ban đầu, tuy nhiên sự sụt giam đấy không đáng kể. So với mẫu đối chứng nƣớc, hiệu suất nấu thu hồi cao hơn đặc biệt sau 14 ngày ủ.

3.4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng giảm nhựa cây trong dăm mảnh gỗ keo

Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình xử lý loại nhựa đối với chủng vi khuẩn CVSVC1-1. Hai nhiệt độ đƣợc tuyển chọn để ủ dăm mảnh là nhiệt độ thƣờng dao động trong khoảng từ 28 - 32oC và nhiệt độ 45oC.

Bảng 3. 14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng giảm nhựa của chủng CVSVC1-1

Phần trăm hàm lƣợng nhựa giảm trong nguyên liệu so với đối chứng, % Ngày ủ 45oC

14 Nhiệt độ thƣờng (28 - 32oC) 26,61 40,00

21 59,55 50,02

61

Kết quả khảo sát cho thấy, ở nhiệt độ 45oC khả năng giảm nhựa sau 14 ngày tốt hơn so với nhiệt độ thƣờng. Tuy nhiên sau 21 ngày thì khả năng giảm nhựa ở nhiệt độ thƣờng lại tốt hơn so với nhiệt độ 45oC. Điều này có thể giải thích do sinh trƣởng của chủng vi khuẩn tốt nhất trong khoảng 37-45oC nên giúp giảm nhựa nhanh trong thời gian đầu. Nhƣ vậy, khi nhiệt độ đống ủ thực tế trong lòng đống tăng lên chủng vẫn có thể tăng trƣởng và giảm nhựa của đống ủ.

3.4.3. Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng giảm nhựa cây trong dăm mảnh gỗ

Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng sinh trƣởng và giảm nhựa của vi khuẩn CVSVC1-1 đƣợc đánh giá bằng cách ủ dăm mảnh nguyên liệu với 10% giống và nuôi ở 45oC. Sau 14 và 21 ngày ủ tiến hành đánh giá khả năng giảm nhựa của chủng, kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.15.

Bảng 3. 15. Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng giảm nhựa của chủng CVSCV1-1

Đối chứng xử lý nƣớc

Hàm lƣợng nhựa còn lại, %

Ngày

40

50

60

40

50

60 -

0 Mẫu dăm gỗ ban đầu 2,34 ±0,025

-

14 -

21 2,20 ± 0,015 1,98 ±0,025

2,22 ±0,017 2,12 ±0,021

2,20 ±0,021 2,18 ±0,017

1,52 ±0,025 1,60 ±0,012

1,29 ±0,010 1,12 ±0,013

1,32 ±0,015 1,09 ±0,021

Ghi chú: (-) không khảo sát

Tổng lƣợng nhựa trên gỗ ban đầu là 2,34%, lƣợng nhựa cây trên dăm mảnh đối chứng nƣớc giảm 2,18 -1,98%, giảm 9,4 – 17 %. Ở tất cả các mẫu thí nghiệm, nhựa cây giảm rõ rệt theo thời gian khảo sát so với đối chứng và mẫu gỗ ban đầu. Độ ẩm 50 và 60 % cho hiệu quả giảm nhựa tốt nhất, hàm lƣợng nhựa giảm đến 52,14 % và 53,42% so với mẫu dăm mảnh ban đầu.

62

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Từ 19 mẫu thu thập đã tuyển chọn đƣợc 4 chủng vi khuẩn VSD3-1, VSM2-3, CVSM6-1, CVSVC1-1 và 3 chủng xạ khuẩn XS1-2, CXM1-20 và CXD2-17 có tiềm năng phân hủy nhựa cây. Thông qua quá trình đánh giá sơ bộ khả năng loại nhựa cây khi ngâm ngập dăm mảnh gỗ keo với dịch lên men đã lựa chọn chủng vi khuẩn CVSVC 1-1 có khả năng giảm nhựa lớn nhất đến 46,72% sau 24 giờ ngâm đƣợc lựa chọn.

2. Đã nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng CVSVC1-1. Vi khuẩn tuyển chọn là trực khuẩn gram (+), có khả năng sinh bào tử, phát triển ở nhiệt độ 25 – 60oC, pH 6 – 10. Thông qua phân tích trình tự gen 16S rDNA, chủng CVSVC1-1 đƣợc định danh là Brevibacillus agri CVSVC1- 1, mã số đăng ký trên Genbank là MT534040.

4.1. Kết luận

3. Đã nghiên cứu đƣợc môi trƣờng thích hợp cho sự sinh tổng hợp enzym phân hủy nhựa cây. Môi trƣờng thích hợp nhất cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme là MPA có bổ sung 0,5 % nhựa cây và điều kiện thích hợp cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme sterol esterase của chủng là 45oC, pH là 8 - 9. Enzym laccase của chủng sinh tổng hợp tốt nhất ở 37oC và pH 7.

4. Đã khảo sát đƣợc điều kiện thích hợp cho giảm nhựa cây của chủng vi khuẩn CVSVC1-1 là độ ẩm 50-60%, tỉ lệ tiếp giống 10%. Dải nhiệt độ phù hợp cho giảm nhựa là nhiệt độ thƣờng cho tới 45oC. Với điều kiện thích hợp hàm lƣợng nhựa trong dăm mảnh sau 21 ngày có thể giảm đến 60%.

4.2. Kiến nghị

1. Tiếp tục nghiên cứu khả năng loại nhựa của chủng Brevibacillus agri

CVSVC1-1 trên nguyên liệu gỗ keo với các quy mô lớn hơn

2. Nghiên cứu tạo và sản xuất chế phẩm từ chủng Brevibacillus agri

CVSVC1-1 để giảm nhựa cây trong dăm mảnh gỗ.

63

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Kirker G. T., Blodgett A. B., Arango R. A., Lebow P. K., & Clausen C. A., 2013, The role of extractives in naturally durable wood species, International Biodeterioration & Biodegradation, 82, pp. 53–58.

2. Feng J., Shi W., Miklossy J., Tauxe G., McMeniman C., & Zhang Y., 2018, Identification of Essential Oils with Strong Activity against Stationary Phase Borrelia burgdorferi, Antibiotics, 7(4), pp. 89.

3. Poletto M., Zattera A. J., Forte M. M. C., & Santana R. M. C., 2012, Thermal decomposition of wood: Influence of wood components and cellulose crystallite size, Bioresource Technology, 109, pp. 148–153. 4. Ashori A., Sheshmani S., & Farhani, F., 2013, Preparation and characterization of bagasse/HDPE composites using multi-walled carbon nanotubes, Carbohydrate Polymers, 92(1), pp. 865–871.

5. Back E. L., Allen L. H., 2000, Pitch Control, Wood Resin and

Deresination. TAPPI Press, Atlanta.

6. Bajpai S., Gupta S. K., Dey A., Jha M. K., Bajpai V., Joshi S., & Gupta, A., 2012, Application of Central Composite Design approach for removal of chromium (VI) from aqueous solution using weakly anionic resin: Modeling, optimization, and study of interactive variables, Journal of Hazardous Materials, 227-228, pp. 436–444. 7. Gutiérrez A., del Río J. C., Martínez A. T., 2009, Microbial and enzymatic control of pitch in the pulp and paper industry, Appl Microbiol Biotechnol, 82, pp. 1005–1018.

8. Gutiérrez A., del Río, J. C., & Martínez, Á. T., 2010, Fungi and Their Enzymes for Pitch Control in the Pulp and Paper Industry, Industrial Applications, pp. 357–377.

9. Freire R., van Dort S. and Rogers L.J., 2006, Pre- and post-hatching effects of corticosterone treatment on behavior of the domestic chick, Horm. Behav, 49, pp.157 -165.

10. Coloma J.; Reyes L.; Navarrete J.; Alarcón J.; Delgado L.; Vera R.; Ubilla P.; Vásquez K.; Becerra J., 2015, Effect of Albino Ophiostoma

64

strains on Eucalyptus nitens extractives. Maderas, Ciencia y Tecnología 17(1), pp.161-170.

11. Liss S. N., Bicho P. A., Mc Farlane P. N., Saddler J. N., 1997, Microbiology and degradation of resin acids in pulp mill effluents: a mini review, Can. J. Microbiol., 75, pp.599-611 .

12. Martı´nez A.T., Speranza M., Ruiz-Duen˜as F.J., Ferreira P., Camarero S., Guille´n F., Martı´nez M.J., Gutie´rrez A., del Rı´o J.C., 2005, Biodegradation of lignocellulosics: Microbiological, chemical and enzymatic aspects of fungal attack to lignin, Intern Microbiol 8, pp. 195–204l

13. Farrell R.L., Blanchette R.A., Brush T.S., Hadar Y., Iverson S., Krisa K., Wendler P.A., Zimmerman W., 1993, CartapipTM: a biopulping product for control of pitch and resin acid problems in pulp mills, J Biotechnol 30, pp.115–122.

14. Chen T., Wang Z., Gao Y., Breuil C., Hatton J.V., 1994, Wood extractives and pitch problems. Analysis and partial removal by biological treatment, Appita 47, pp. 463–466.

15. Dorado J., Claassen F.W., Lenon G., van Beek T.A., Wijnberg J.B.P.A., Sierra-Alvarez R., 2000, Degradation and detoxification of softwood extractives by sapstain fungi, Bioresour Technol 71, pp. 13– 20.

16. Covarrubias et al., 2012, Methods to control lipophilic extractives in

acacia wood pulp and fiber, United States Patent.

17. Van Beek T. A., Kuster B., Claassen F. W., Tienvieri T., Bertaud F., Lenon G., … Sierra-Alvarez R., 2007, Fungal bio-treatment of spruce wood with Trametes versicolor for pitch control: Influence on extractive contents, pulping process parameters, paper quality and effluent toxicity, Bioresource Technology, 98(2), pp. 302–311.

18. Větrovský, T., Steffen, K. T., & Baldrian, P., 2014, Potential of Cometabolic Transformation of Polysaccharides and Lignin in Lignocellulose by Soil Actinobacteria. PLoS ONE, 9(2), e89108.

65

19. Burnes, T.A., Blanchette, R.A., & Farrell, R.L., 2000, Bacterial Biodegradation of Extractives and Patterns of Bordered Pit Membrane Attack in Pine Wood, Applied and Environmental Microbiology, 66(12), pp. 5201–5205.

20. Saini, A., Aggarwal, N. K., Sharma, A., & Yadav, A., 2015, Actinomycetes: A Source of Lignocellulolytic Enzymes. Enzyme Research, pp. 1–15.

21. Cedillo, V. B., Martínez, M. J., Arnau, C., & Valero, F., 2014, Production of a sterol esterase fromOphiostomapiceae in batch and fed- batch bioprocesses using.

22. Olga C.R., Francisco J.P., Antonio B., Angel T.M., and María J.M., 2002, Production, isolation and characterization ò a sterol esterase from Ophiostoma piceae, Biochimica et Biophysica Acta, pp. 28 – 35.

23. Bornscheuer U., 2002, Microbial carboxyl esterases: classification, in biocatalysis, FEMS Microbiology

properties and application Reviews, 26(1), pp. 73–81.

24. Sriyapai, P., Kawai, F., Siripoke, S., Chansiri, K., & Sriyapai, T., 2015, Cloning, Expression and Characterization of a Thermostable Esterase HydS14 from Actinomadura sp. Strain S14 in Pichia pastoris, International Journal of Molecular Sciences, 16(12), pp. 13579–13594. 25. Young O. K., Yu Li H., Bo H. Nam, Dong G. K., Young J. J., Sang J. L., and Cheul M. A., 2013, Molecular Cloning, Purification, and Characterization of a Cold-Adapted Esterase from Photobacterium sp. MA1-3, Fisheries and Aquatic Sciences, 16(4), pp. 311-318.

26. Ribera J., Estupiñán M., Fuentes A., Fillat A., Martínez J., & Diaz P., 2017, Bacillus sp. JR3 esterase LipJ: A new mesophilic enzyme showing traces of a thermophilic past, PLOS ONE, 12(7), e0181029. 27. Ishak S. N. H., Masomian M., Kamarudin N. H. A., Ali M. S. M., Leow T. C., and Rahman R. N. Z. R. A., 2019, Changes of Thermostability, Organic Solvent, and pH Stability in Geobacillus zalihae HT1 and Its Mutant by Calcium Ion, International Journal of Molecular Sciences, 20(10), pp. 2561.

66

28. Martinelle M., Holmquist M. and Hult K., 1995, On the interfacial activation of Candida antarctica lipase A and B as compared with Humicola lanuginosa lipase, Biochem. Biophys. Acta, 1258, pp. 272- 276.

29. Sharma D., Sharma B. and Shukla A.K., 2011, Biotechnological Approach of Microbial Lipase: A Review, Biotechnology, 10 (1), pp. 23-40.

30. Sondhi S., Sharma P., Saini S., Puri N., and Gupta N., 2014, Purification and Characterization of an Extracellular, Thermo-Alkali- Stable, Metal Tolerant Laccase from Bacillus tequilensis SN4, PLoS ONE, 9(5), e96951.

31. Kim C., Lorenz W. W., Hoopes J. T., and Dean, J. F. D., 2001, Oxidation of Phenolate Siderophores by the Multicopper Oxidase Encoded by the Escherichia coli yacK Gene, Journal of Bacteriology, 183(16), pp. 4866–4875.

32. Endo K., 2003, Enzymological Characterization of EpoA, a Laccase- Like Phenol Oxidase Produced by Streptomyces griseus, Journal of Biochemistry, 133(5), pp. 671–677.

33. Reiss R., Ihssen J., Thöny-Meyer L., 2011, Bacillus pumilus laccase: a heat stable enzyme with a wide substrate spectrum, BMC Biotechnology, 11(1), pp. 9.

34. Gutie´rrez A., del Rı´o J.C., Ibarra D., Rencoret J., Romero J., Speranza M., Camarero S., Martı´nez M.J., Martı´nez A.T., 2006, Enzymatic removal of free and conjugated sterols forming pitch deposits in environmentally sound bleaching of eucalypt paper pulp, Environ Sci Technol, 40, pp. 3416–3422.

35. Molina S., Rencoret J., del Río J. C., Lomascolo A., Record E., Martínez A. T., Gutiérrez, A., 2008, Oxidative degradation of model lipids representative for main paper pulp lipophilic extractives by the laccase–mediator system, Applied Microbiology and Biotechnology, 80(2), pp. 211–222.

67

36. Williams G. J., Nelson A. S., Berry A., 2004, Directed evolution of enzymes for biocatalysis and the life sciences, Cellular and Molecular Life Sciences, 61(24), pp. 3034–3046.

37. Teria M., Wells A., Eve T., 2006, Green oxidations with laccase– mediator systems, Biochemical Society Transactions, 34(2), pp 304. 38. Burnes T. A., Blanchette R. A., & Farrell R. L., 2000, Bacterial Biodegradation of Extractives and Patterns of Bordered Pit Membrane Attack in Pine Wood, Applied and Environmental Microbiology, 66(12), pp. 5201–5205.

39. Watanabe T., Koller K., & Messner K., 1998, Copper-dependent depolymerization of lignin in the presence of fungal metabolite, pyridine, Journal of Biotechnology, 62(3), pp. 221–230.

involved

40. Gonzalo de G., Colpa D.I., Habibb M.H.M., Fraaije M.W., 2016, lignin degradation, Journal of in Bacterial enzyme Biotechnology, 236, pp. 110–119.

41. Yu X., Blanden A. R., Narayanan S., Jayakumar L., Lubin D., Augeri D.,…Carpizo D. R., 2014, Small molecule restoration of wildtype structure and function of mutant p53 using a novel zinc- metallochaperone based mechanism, Oncotarget, 5(19).

42. Van Bloois E., Torres Pazmiño D. E., Winter R. T., Fraaije, M. W., 2009, A robust and extracellular heme-containing peroxidase from Thermobifida fusca as prototype of a bacterial peroxidase superfamily, Applied Microbiology and Biotechnology, 86(5), pp. 1419–1430.

43. Singh M.P., Vishwakarma, S.K., Srivastava A. K., 2013, Bioremediation of Direct Blue 14 and Extracellular Ligninolytic Enzyme Production by White Rot Fungi: PleurotusSpp, BioMed Research International, 2013, pp. 1–4.

44. Santhanam N., Vivanco J.M., Decker S.R., Reardon K.F., 2011, Expression of industrially relevant laccases: prokaryotic style, Trends in Biotechnology, 29(10), pp. 480–489.

45. Riva S., 2006, Laccases: blue enzymes for green chemistry, Trends in

Biotechnology, 24(5), pp. 219–226.

68

46. Alexandre G and Zhulin I.B., 2000., Laccases Are Widespread in

Bacteria, Trends Biotechnol, 18(2), pp. 41-2.

47. Martins L. O., Durão P., Brissos V., Lindley P. F., 2015, Laccases of prokaryotic origin: enzymes at the interface of protein science and protein technology, Cellular and Molecular Life Sciences, 72(5), pp. 911–922.

48. Chandra R., Chowdhary P., 2015, Properties of bacterial laccases and their application in bioremediation of industrial wastes, Environmental Science: Processes & Impacts, 17(2), pp. 326–342.

49. Singh R.P., Dubey C. S., Singh S.K., Shukla D.P., Mishra B.K., Tajbakhsh M., … Singh N., 2012, A new slope mass rating in mountainous terrain, Jammu and Kashmir Himalayas: application of geophysical technique in slope stability studies, Landslides, 10(3), pp. 255–265.

50. Ramnath L., Sithole B., Govinden, R., 2017, Identification of lipolytic enzymes isolated from bacteria indigenous to Eucalyptus wood species for application in the pulping industry, Biotechnology Reports, 15, pp. 114–124.

51. Sambrook J, Russell DW., 2001, Molecular cloning: A Laboratory Mannual, 1sted. Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor Laboratory, New York.

52. Su Y, Ho C, Hsu K, Chang H, Farrell R, Wang E., 2011, Screening of Ophiostoma species for removal of Eucalyptus extractives. J. Wood Chemistry and Technology, 31, pp. 282–297

53. Gutierrez-Fernández J., Vaquero M.E., Prieto A., Barriuso J., Martínez M.J., 2014, Crystal structures of Ophiostoma piceae sterol esterase: structural insights into activation mechanism and product release, J Struct Biol, 187, pp: 215–222.

54. Bourbonnais R. and PaiceM.G., 1990, Oxidation of Non-Phenolic Substrates. An Expanded Role for Laccase in Lignin Biodegradation, FEBS Lett, 267(1), pp. 99-102.

69

and Productions Xylanase by

55. Sinjaroonsak S., Chaiyaso T., H-Kittikun A., 2019, Optimization of Streptomyces Cellulase thermocoprophilus Strain TC13W Using Oil Palm Empty Fruit Bunch and Tuna Condensate as Substrates, Applied Biochemistry and Biotechnology.

56. Martinez-Inĩgo M., Classen F, Joseleau B., Van-Beek T., Lenon G., Evaluation of fungal capacity for Sierra-Alvarez R., 2000, detoxification of extractives in Scots pine sapwood, Environmental Technology, 61, pp. 569-575.

Journal of

57. Camacho R. M., Mateos J. C., González-Reynoso O., Prado L. A., Córdova J., 2009, Production and characterization of esterase and Industrial from Haloarcula marismortui, lipase Microbiology & Biotechnology, 36(7), pp. 901–909.

58. Rao L., Xue Y., Zheng Y., Lu J. R., Ma Y., 2013, A Novel Alkaliphilic Bacillus Esterase Belongs to the 13th Bacterial Lipolytic Enzyme Family, PLoS ONE, 8(4), e60645.