Nghiên cứu xác định nấm Aspergillus sinh độc tố aflatoxin trên lạc bằng phản ứng pcr đặc hiệu

Chia sẻ: Leon Leon | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

146
lượt xem 21
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Aflatoxins là chất chuyển hóa chất gây ung thư được sản xuất thành viên byseveral của Aspergillusgroup, chẳng hạn như Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nomius.Number các phương pháp đã được phát triển để phát hiện độc tố aflatoxin trong ngũ cốc và thực phẩm, bao gồm cả phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký overpressured, phản ứng chuỗi polymerase (PCR), xét nghiệm miễn dịch enzyme (ELISA) .... ít nhất, hơn 20 gen đã được xác định để được tham gia vào con đường sinh tổng hợp Aflatoxin. Trong đó, các...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu xác định nấm Aspergillus sinh độc tố aflatoxin trên lạc bằng phản ứng pcr đặc hiệu

NGHIÊN C U XÁC Đ NH N M Aspergillus SINH Đ C T AFLATOXIN TRÊN L C B NG PH N NG PCR Đ C HI U Tr n Tu n Tú, àm Quang Hi u, Hoàng Th Ngát, Lê Huy Hàm và Ph m Xuân H i Summary Identification of Aspergillus flavus induced Aflatoxin in peanut in the orth of Vietnam using PCR method Aflatoxins are carcinogenic metabolites produced by several members of Aspergillus group, such as Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nomius.Number of methodologies have been developed for detection of aflatoxin in grain and food, including thin-layer chromatography (TLC), high-performance liquid chromatography (HPLC), overpressured chromatography, polymerase chain reaction (PCR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)....At least, more than 20 genes have been determined to be involved in Aflatoxin biosynthesis pathway. In which, genes ver-1, omt-1 and apa-2 play an important role in the pathway. In this study, we use ver as a target gene to detect peanut contaminated aflatoxin in the North of Vietnam by employing PCR approach. Peanut samples on the field, household and market from different area have been collected for isolating Aspergillus flavus induced Aflatoxin strains using from a separate hypha. A primer pair complementing the coding portion of ver gene was generated. DNA extracted from Aspergillus flavus, Aspergillus niger strains from Nghean, Haiduong and Hanoi provinces was used as PCR template. Positive results as designed PCR products were observed only with all DNA templates of Aspergillus flavus from different sources, while no PCR products were observed with DNA templates of Aspergillus niger. The results is suggesting a posibility to use PCR as selective method for early, accurate detection of aflatoxin contaminated in peanut as well as in grains and foods. Keywords: Aflatoxin, Aspergillus flavus, peanut, PCR, identification. tương.... Các lo i h t có d u ( c bi t như I. TV N l c) r t thích h p cho s phát tri n c a n m N m sinh c t là m t trong nh ng tác Aspergillus spp. cũng như s hình thành c nhân gây b nh ph bi n làm gi m ch t lư ng t Aflatoxin. và giá tr s n phNm nông nghi p do sinh ra Xu t phát t th c t trên, ã có nhi u các lo i c t gây h i cho s c kho con phương pháp ư c nghiên c u và áp d ng ngư i và v t nuôi. Ph bi n nh t trong nhóm trên th gi i nh m phát hi n s m ngu n n m sinh c t là n m b nh Aspergillus spp. n m b nh, i u này có ý nghĩa quan tr ng (A. flavus; A. parasiticus; A. fumigatus...) có trong vi c h n ch tác h i n m b nh trên kh năng sinh c t gây ung thư Aflatoxin. nông s n. Phương pháp PCR ã ư c s Các ch ng n m này có ph ho t ng r t d ng phát hi n các lo i n m và vi khuNn r ng vì v y có kh năng lây nhi m trên nhi u gây b nh và sinh c t trên nông s n, th c lo i nông s n như ngô, l c, bông, u phNm và các lo i th c ăn gia súc, do ti n
l i, d áp d ng, có kh năng phát hi n s m s i n m m c trên l c và v h t l c, xác m m b nh k c khi chúng chưa sinh c nh các i m m c n m thích h p ti n t . Có ít nh t 20 gen tham gia vào con hành c y chuy n và phân l p. ư ng t ng h p aflatoxin, m t s gen quan 2.2. Phương pháp phân l p n m: S tr ng trong s ó ã xác nh ư c tr t t d ng phương pháp tách s i n m ơn nucleotid và ch c năng như apa, omt, ver, làm thu n các isolate. Trên ĩa môi trư ng nor... Trong nghiên c u này chúng tôi s c, ti n hành c y chuy n b ng cách l y d ng gen ver - mã hoá cho enzyme chuy n s i n m t i các i m ngoài rìa c a khuNn versicolorin thành sterigmatocystin (ti n l c c y chuy n sang ĩa môi trư ng ch t u tiên trong nhánh sinh t ng h p m i. M i khuNn l c trên ĩa môi trư ng Aflatoxin B1- ch t c nh t và ph bi n ch n t 3 n 5 i m c y chuy n theo trong nhóm Aflatoxin) làm gen ích nguyên t c ng u nhiên. Ti n hành phân l p bư c u xác nh s có m t c a n m b nh nh ng m u n m Aspergillus có c i m Aspergillus sinh c t trên các m u l c thu hình thái i n hình trên c 2 lo i môi th p m t s t nh mi n B c Vi t N am. trư ng PDA c (120 ml d ch chi t khoai tây, 12 g dextrose, 10 g agar cho 1L môi II. V T LI U VÀ PHƯƠN G PHÁP trư ng - là môi trư ng giàu dinh dư ng) và N GHIÊN C U môi trư ng Czapek c (là môi trư ng 1. V t li u nghiên c u dinh dư ng trung bình) cho n khi t t i Các gi ng l c thu th p trong nhà dân, ng u v màu s c và t c phát trên ng ru ng và trên th trư ng các tri n c a khuNn l c. D a vào các c i m t nh N gh An, H i Dương và Hà N i ư c nh n d ng m u s c khuNn l c, hình d ng s d ng phân l p ngu n n m b nh. C p s i n m, v t loang l i trên môi trư ng m i c hi u cho gen ver, các hóa ch t s quan sát trên ĩa petri và k t h p v i hình d ng trong sinh h c phân t ph c v vi c d ng bào t , cu ng sinh bào t , th bình... tách chi t ADN t ng s s i n m và các quan sát trên kính hi n vi chúng tôi ti p nguyên li u cho ph n ng PCR ư c mua t c làm thu n các isolate b ng vi c ch n c a hãng Sigma, Fermentas... l c và c y chuy n các m u n m trên môi trư ng c. Trên cơ s các c i m nh n 2. Phương pháp nghiên c u d ng trong quá trình phân l p, các m u 2.1. Thu th p m u l c và thu nh n n m ư c phân thành các isolate A. flavus, n m b nh t m u l c. Các m u l c thu v A. paraciticus hay A. niger. Sau ó, các ư c b o qu n trong phòng l nh i u m u n m này ư c s d ng làm nguyên ki n 4 - 80C t i B môn B nh h c phân t li u ph c v cho các thí nghi m ti p sau. th c v t. thu ư c n m b nh, chúng tôi 2.3. Tách chi t ADN t ng s . Các m u ti n hành theo 2 cách: (i) t h t l c tr c n m thu ư c trên môi trư ng c ư c ti p ti p trên ĩa petri có lót gi y kh trùng t c nuôi c y l c 200v/p trong môi trư ng s ch, gi trong i u ki n 280C và Nm PDA và Czapek l ng t 5 - 7 ngày, 280C kho ng 80%; (ii) C t v h t l c t trên thu sinh kh i. Sau khi ư c r a b ng môi trư ng PDA c, gi nhi t 280C. nư c c t t 3 - 4 l n các m u n m ư c gi Sau 3 - 5 ngày t m u, ti n hành quan sát trong t l nh sâu - 800C làm nguyên li u
tách chi t ADN t ng s . Trong nghiên c u Các m u ADN t ng s sau ó s ư c này, chúng tôi ã s d ng phương pháp ki m tra ch t lư ng b ng phương pháp i n tách chi t ADN t ng s t n m Aspergillus di trên gel agarose 1% và o quang ph h p theo quy trình c a Eric W. Boehm. Cho 200 th (OD260/280nm) ki m tra hàm lư ng và - 300 mg sinh kh i n m ã ư c nghi n nh ch t lư ng ADN t ng s thu ư c. b ng nitơ l ng vào ng eppendorf 1,5 ml, 2.4. Thi t k Primer c hi u. Trên cơ s b sung 500 l dung d ch tách chi t (100 mM Tris-pH 8.0, 10 mM EDTA, 2% trình t gen ver (Acession number: M91369) SDS, 1% β-mercaptoethanol), m u ã ư c ăng ký trong ngân hàng gen th 0 65 C trong 1h, o u m u 5 phút m t l n. gi i, chúng tôi s d ng chuơng trình CLC B sung 300 l dung d ch CTAB Bio 3.1 thi t k c p m i VER-496F (5’- (5M N aCl, 10% CTAB), m u trong ATGTCGGATAAT CACCGTTTAGATGGC-3’) 30 phút. Ti p ó, b sung thêm 450 l dung và VER-1391R (5’-ATGTCGGATAAT d ch chloroform-isoamyl alcohol t l 24:1 CACCGTTTAGATGGC-3’) nhân phân (v/v), o u và ly tâm 12000 vòng/phút o n có kích thư c 896 bp c a gen ver-1 trong 15 phút. Chuy n pha d ch trong phía (Hình 1). N h ng ch ng n m có băng ADN trên sang ng m i, b sung 600 l dung kích thư c 900bp ư c khuy ch i b ng c p d ch isopropanol l nh và m u - 200C ít m i trên ư c xem là có kh năng sinh c t nh t 3 h. Sau ó, ly tâm m u 12000 Aflatoxin. Hư ng nghiên c u trên s là cơ s vòng/phút trong 10 phút. Lo i b d ch phía cho chúng tôi xây d ng phương pháp có th trên và r a k t t a thu ư c b ng 300 l chuNn oán s nhi m và nh lư ng ư c EtOH l nh 70%, o nh và ly tâm 12000 m c nhi m n m Aspergillus spp. sinh c vòng/phút trong 5 phút. Thu l i và làm khô t Aflatoxin t các m u l c hay các cây lương k t t a; hòa tan k t t a v i 50 l nư c c t th c khác. kh ion sau ó x lý lo i b ARN . 400 - ATG 1393 - GAT Intron Ver –496F 5’UTS 3’UTS 5’ Exon 1 Exon 2 Exon 3 3’ Ver –1391R 896 bp 1765 bp Hình 1. C u trúc gen ver và v trí c p m i ư c thi t k trên gen. Gen ver có kích thư c kho ng 1.76 kb, t n cùng u 5’ và u 3’ là vùng không phiên mã (5’UTS và 3’UTS) dài kho ng 400bp và 372bp; khung c m (ORF) n m t v trí 400 n v trí 1393, mã hoá cho 262 a.amin; trong khung c m có t n t i 3 o n exon và 2 o n intron. C p m i ư c thi t k n m tr n trong khung c m , có kích thư c lý thuy t 896bp (~ 900bp). 2.5. Ph n ng PCR c hi u. Các m u PCR c hi u xác nh s t n t i c a gen DN A ã tách chi t ư c pha loãng v n ng ver trong genome. Ph n ng PCR ư c 20ng/ l làm khuôn cho ph n ng ti n hành th tích 20 l ch a 0,2 l Taq
polymerase (5 u/ l) c a Promega, 2 l Hình 2. Phương pháp thu nh n và phân l p buffer 10X, 0,2 mM dNTPs và 20 pmol m u n m b nh t h t l c trên gi y th m m i m i. Ph n ng PCR ư c th c hi n kh trùng ư c làm ư t (A) và t v h t l c trên môi trư ng PDA c (B). b ng máy nhân gen Genius trong 35 chu kỳ v i chương trình nhi t ư c thi t l p Qua theo dõi và th ng kê chúng tôi như sau: Bi n tính 940C trong 45 giây, g n nh n th y t l các h t l c b nhi m n m là m i 550C trong 45 giây và kéo dài r t cao (dao ng t 80 - 100%) và không 720C trong 1 phút. Các phân o n s n có s khác bi t l n v t l nhi m n m c a phNm ư c i n di ki m tra trên gel l c thu th p trong dân (sau khi thu ho ch) agarose 1% và ghi nh n hình nh b ng h so v i ngu n l c trên th trư ng. i u ó th ng máy nh N ikon. cho th y ngu n n m b nh ã ư c lây nhi m t ng ru ng n kho b o qu n và ngư c l i. H u h t các m u l c b nhi m III. K T QU VÀ TH O LU N n m A. flavus (có khuNn l c màu xanh 1. Phân l p n m b nh Aspergillus vàng, m t sau màu vàng - Hình 3A1) và spp. t m t s m u l c c a Vi t N am. S A. niger (khuNn l c màu en, m t sau màu d ng c 2 phương pháp thu th p n m: tr ng ho c vàng - Hình 3A2) và không thu (i) t h t l c lên ĩa petri có l p gi y nh n ư c b t kỳ m u n m nào có c i m th m kh trùng ư c làm ư t (5 - 6 hình thái c a n m A. paraciticus. i u này h t/ ĩa) và (ii) t v l a h t l c lên môi cho th y n m b nh Aspergillus spp. sinh trư ng PDA c (5 - 6 mi ng v / ĩa) chúng c t Aflatoxin ph bi n trên l c Vi t tôi ã thu ư c các ch ng n m Aspergillus N am là ch ng A. flavus. spp. nh vào các c i m hình thái bên Trên hai môi trư ng PDA và Czapek ngoài như màu s c và v t loang c a c ư c s d ng, có s khác bi t v hình khuNn l c trên môi trư ng (Hình 2). K t thái khuNn l c và t c phát tri n c a n m qu nh n th y b ng phương pháp t v khi nuôi c y (Hình 3). T c phát tri n c a l c trên ĩa môi trư ng PDA c, n m Aspergillus spp. trên môi trư ng nhi m khuNn và l n nhi u lo i n m khác Czapek ch m hơn so v i trên môi trư ng (nhi m 40%) là th p hơn nhi u so v i PDA. Trên môi trư ng PDA, ư ng kính phương pháp t c h t l c trên gi y khuNn l c n m t trung bình là 6 - 7 cm qua th m kh trùng (nhi m 70%). 7 ngày nuôi c y và t m c t i a 9 cm sau kho ng 20 ngày. Trên môi trư ng Czapek, qua 7 ngày nuôi c y, ư ng kính trung bình c a khuNn l c ch t ư c là 3,5 - 4 cm, t i a t ư c là 7 cm sau 20 ngày. Xét riêng v i 2 loài n m A. flavus và A. niger, chúng tôi nh n th y m c nhi m n m trên l c cũng B như t c phát tri n c a n m loài A. flavus là A cao hơn so v i loài A. niger, t ó có th th y
nguy cơ l n c a vi c nhi m n m cũng như ư c kh o sát Vi t N am (Hình 3). nhi m c t Aflatoxin cao trên các m u l c A A1 A2 A3 A4 B B1 B2 Hình 3. Hình thái n m Aspergillus spp. phân l p ư c t m u l c. A. M u n m A. flavus: trên môi trư ng PDA (A1) khu n l c phát tri n nhanh và vùng n m m i phát tri n có màu vàng nh t, vùng n m bên trong có màu xanh. Trên môi trư ng Czapek (A2) n m sinh trư ng ch m hơn, màu s c m hơn và có xu t hi n các h ch n m màu en. A3: Hình nh th bình và cu ng sinh bào t c a n m A.flavus quan sát dư i kính hi n vi (X 1600). A4: m A. flavus trong nuôi c y l ng. B. M u n m A. niger: Trên môi trư ng Czapek (B1) khu n l c phát tri n ch m hơn và màu c a khu n l c cũng m hơn và có xu t hi n m t s “h ch n m” trên khu n l c - có th do môi trư ng Czapek nghèo dinh dư ng hơn; B2: Hình nh s i n m A. niger quan sát dư i kính hi n vi (X 1600). Các m u n m Aspergillus thu ư c sau môi trư ng c và làm tiêu b n v i m u khi làm thu n s ư c c y chuy n sang môi n m nuôi c y l ng quan sát hình d ng trư ng PDA và Czapek l ng nuôi c y bào t , cu ng sinh bào t , th bình..., so thu sinh kh i. K t qu cho th y, không có sánh kh ng nh chính xác hơn các loài s khác bi t nào áng k khi nuôi c y n m n m ã phân l p (Hình 3). Aspergillus trên 2 môi trư ng l ng này, sau 2. K t qu tách chi t ADN. Trong thí kho ng 5 ngày, s thu ư c lư ng sinh kh i nghi m này chúng tôi ã kh o sát m t s n m tách chi t ADN t ng s . i u phương pháp tách chi t ADN t ng s n m ki n t i ưu c a quá trình nuôi c y này là men, n m s i cũng như n m Aspergillus spp. 200 v/p, 28 - 300C (Hình 3A4). Chúng tôi ã ư c công b . Tuy nhiên, sau khi th cũng ti n hành làm các tiêu b n n m nghi m chúng tôi nh n th y phương pháp Aspergillus phân l p ư c b ng hai cách, tách chi t d a trên quy trình c a Eric W. làm tiêu b n v i m u n m nuôi c y trên
Boehm v i các m u n m nuôi c y trong hình nh i n di trên gel agarose 1% rõ nét môi trư ng l ng là hi u qu nh t. v i hàm lư ng ADN trung bình t 300 - 500 ng/ l (Hình 4) và 5 m u ADN t ng s Vì th chúng tôi quy t nh s d ng phương pháp này tách chi t cho các m u n m A. niger s d ng làm i ch ng cho n m ã ư c làm thu n mang các c i m ph n ng PCR. Các m u ADN t ng s hình thái c trưng c a n m A. flavus và ư c s d ng làm s i khuôn cho ph n ng PCR c hi u v i c p m i ã thi t k . n m A. niger. K t qu chúng tôi thu ư c 15 m u ADN t ng s n m A. flavus v i Hình 4. nh i n di AD t ng s các m u n m trên gel agarose 1%. M: Marker λ HindIII; 1 - 4: m A. flavus gh An, 5 - 7: m A. flavus H i Dương; 8 - 10 n m A. flavus Hà i; 11 - 13: m A. niger gh An; 14: m A. niger H i Dương và 15: m A. niger chu n. 3. K t qu phân tích b ng ph n ng chúng tôi nh n th y nhi t g n m i 0 PCR c hi u. T 15 m u ADN t ng s 50 C các băng c n khuy ch i u xu t thu ư c c a isolate A. flavus chúng tôi hi n tuy nhiên có xu t hi n nh ng băng ch n ra 7 m u ADN t ng s làm khuôn không c hi u. nhi t g n m i 550C, cho thí nghi m t i ưu hoá i u ki n ph n hi u su t g n m i và khuy ch i gen v n ng PCR c hi u v i c p m i VER. i u ư c duy trì và các băng không c hi u ki n cho ph n ng PCR như ã trình bày ã bi n m t. ph n v t li u và phương pháp. N ng Sau khi ã thi t l p ư c i u ki n khuôn ADN t ng s ư c thay i t 1 ng, thích h p cho ph n ng m i c hi u, 2 ng, 10 ng, 20 ng, 100 ng và 200 ng cho chúng tôi ã ti n hành ph n ng PCR v i th tích ph n ng là 20 l t i ưu hoá t t c các m u ADN t ng s c a các m u n ng khuôn ADN. K t qu phân tích n m phân l p ư c và i ch ng ư c s cho th y kho ng n ng thích h p cho d ng trong thí nghi m này là m u ADN m i VER dao ng t 2 - 20 ng, tuy nhiên t ng s c a m u A. niger. K t qu thu n ng 20 ng các phân o n ADN ư c ư c các băng ADN khuy ch i có kích khuy ch i t t nh t và n ng 20 ng thư c x p x 900bp, tương ng v i kích ư c chúng tôi duy trì t i ưu hoá nhi t thư c lý thuy t ã tính toán là 896bp t t g n m i. Vi c t i ưu nhi t g nm i c các ph n ng PCR s d ng s i khuôn là là r t quan tr ng và trong thí nghi m này ADN t ng s n m A. flavus. Các isolate
A. flavus phân l p ư c các vùng sinh A. flavus và A. niger. i u ó cũng có thái khác nhau u cho k t qu dương tính nghĩa là phương pháp c a chúng tôi hoàn v i các m i c hi u, trong khi các ch ng toàn có th nh n bi t ư c các n m có kh A. niger s d ng làm i ch ng u cho năng sinh c t Aflatoxin v i các n m k t qu âm tính v i các m i c hi u (Hình không sinh c t , b i các n m A. flavus 5). i u này ch ng t c p m i ã thi t k ư c coi là loài sinh c t Aflatoxin r t và i u ki n ph n ng PCR chúng tôi thi t m nh trong khi n m A. niger là loài hoàn l p ư c là có th s d ng phân bi t loài toàn không sinh c t . M 1 2 3 4 5 6 7 M C 1500bp 1000bp 900bp 800bp Hình 5. Hình nh i n di s n ph m khuy ch i v i m i Ver trên gel agarose 1% M: Marker; 1 - 3: A. flavus gh An; 4 - 6: A. flavus H i Dương; 7: A. flavus Hà i; C: i ch ng A. niger chu n. Các m u có c i m hình thái i n hình c a A. flavus u cho băng c hi u ~ 900bp còn m u i ch ng là m u A. niger chu n không có băng c hi u (Hình nh thu nh n b ng máy ch p nh ikon) n m Apergillus sinh c t Aflatoxin b ng IV. K T LU N k thu t PCR (Hình 6). Con ư ng sinh t ng h p Aflatoxin Trong nghiên c u có tính ch t bư c u n m b nh Aspergillus ã ư c nghiên c u th nghi m kh năng s d ng phương pháp khá chi ti t m c phân t . Ít nh t có 20 PCR chNn oán n m Apergillus sinh c gen mã hóa cho các enzyme tham gia vào t Aflatoxin. Chúng tôi ã thi t l p ư c con ư ng này và m t s gen quan tr ng ã phương pháp t i ưu phân l p n m A. flavus, ư c gi i trình t và nghiên c u ch c năng phương pháp t i ưu tách chi t ADN t ng s y . Trong các gen quan tr ng tham gia và c bi t là chúng tôi ã t i ưu ư c i u vào quá trình sinh t ng h p Aflatoxin, ver, ki n cho ph n ng PCR có th chNn oán omt và apa ang ư c quan tâm và s d ng s có m t c a n m A. flavus v i c p m i gen làm gen ích trong các nghiên c u xác nh ver. ây là cơ s cho phép chúng tôi ti p t c
hoàn thi n phương pháp có th xác nh m t phương pháp b sung có hi u qu các ch ng n m Apergillus có kh năng sinh nh m chNn oán nhanh và chính xác n m c t Aflatoxin nh ph n ng PCR c b nh Aspergillus spp. sinh c t Aflatoxin hi u v i các gen khác như ver, omt, apa... trên l c cũng như các lo i nông s n khác tr c ti p trên các m u l c nghiên c u, t o c a Vi t Nam Hình 6. Sơ minh h a con ư ng sinh t ng h p Aflatoxin B1 n m b nh Aspergillus. Gen apa là gen i u khi n liên quan n vi c chuy n averufin thành versiconal hemiacetal acetate, d n n s t p trung acetate c n thi t trư c khi bư c vào con ư ng sinh t ng h p Aflatoxin. Gen ver mã hoá cho enzyme chuy n hoá versicolorin A thành sterigmatocystin và gen omt mã hoá cho enzyme chuy n hoá sterigmatocystin thành O- methylsterigmatocystin là ti n ch t c a Aflatoxin B1. 1. Kurtzman C.P., et al., 1987. Antonie TÀI LI U THAM KH O Leeuwenhoek 53:147-157.
2. Yu J., et al., 2005. Rev. Iberroem.Miccil. 22:194-202. 3. Kolosova A.Y., et al., 2006. Anal. Bioanal.Chem. 384:286-94. 4. Jarvis B., D.A.L.Seiler., A.J.L.Ould and A.P.William, 1983. J.Appl.Bacteriol. 55:325-336. 5. Stroka J., Van O. R. and Anklam E, 2000. J.Chromatoqr.A. 904(2):251-6. 6. Jaimez J., Fente CA., Vazquez BI., Franco CM., Cepeda A., Mahuziez G., and Pronqnon P, 2000. J.Chromatoqr A. 882(1-2):1-10. 7. Bintvihok, A., Y. Adachi, and K. Hirano, 1992. Toxicon 30:492-497. 8. Cheng, R., J. Tsay, Y. Huang, and R. Y. Chiou, 2002. J. Food Prot., 65:840-844. 9. Farber, P., R. Geison, and W. H. Holzapfel, 1997. Int. J. Food Microbiol. 36:215-220. 10. Geisen, R, 1996. Syst. Appl. Microbiol. 19:388-392. 11. http://csm.colostate- pueblo.edu/biology/dcaprio/351L/Proje ct1351L.html 12. http://www.aspergillusflavus.org/pdfs/C TAB%20Method.pdf 13. http://www.protocol- online.org/prot/Protocols/Fungal- Genomic-DNA-Extraction-1200.html 14. http://www.upstate.edu/biochem/amber g/protocols/yeast_genomic_DNA.html 15. www.fgsc.net/fgn37/borges.html gư i ph n bi n: gô Vĩnh Vi n
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 10