Luận văn Thạc sĩ Sinh học thí nghiệm: Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng khuẩn của các hợp chất thứ cấp từ chủng vi nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:98

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học thí nghiệm "Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng khuẩn của các hợp chất thứ cấp từ chủng vi nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01" trình bày xác định được thành phần và cấu trúc của một số hợp chất có mặt trong chủng nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01 có nguồn gốc từ hạt lạc, đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng khuẩn của các hợp chất đó, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu y sinh, dược lý sau này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học thí nghiệm: Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng khuẩn của các hợp chất thứ cấp từ chủng vi nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Lê Ngọc Anh NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ VÀ KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ CHỦNG VI NẤM Aspergillus niger IMBC-NMTP01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Lê Ngọc Anh NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ VÀ KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ CHỦNG VI NẤM Aspergillus niger IMBC-NMTP01 Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : 1. TS. Trần Hồng Quang 2. TS. Trần Thị Hồng Hạnh Hà Nội - 2021
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của TS. Trần Hồng Quang và TS. Trần Thị Hồng Hạnh. Các số liệu, kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, các kết quả này chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Lê Ngọc Anh
ii LỜI CẢM ƠN Luận văn này đƣợc hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận đƣợc nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, gia đình và bạn bè. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Trần Hồng Quang và TS. Trần Thị Hồng Hạnh – những ngƣời thầy đã tận tâm hƣớng dẫn, chỉ dạy cho tôi về chuyên môn, đồng thời động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn cũng nhƣ quá trình tôi làm việc tại Viện Hóa sinh biển. Tôi xin cảm ơn lãnh đạo và các đồng nghiệp phòng Dƣợc liệu biển, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ, truyền kinh nghiệm, đƣa ra những lời khuyên bổ ích và góp ý quý báu trong suốt thời gian tôi làm việc tại phòng. Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả các thầy cô, cán bộ của Học viện Khoa học và Công nghệ đã giảng dạy, cung cấp cho tôi các kiến thức mới và giúp tôi hoàn thành chƣơng trình đào tạo. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, ngƣời thân và bạn bè đã quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Luận văn đƣợc giúp đỡ về mặt kinh phí và thực hiện trong khuôn khổ Đề tài trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN: ―Nghiên cứu nhận dạng các chất độc và độc tố có trong nấm mốc ở các thực phẩm có thành phần (đậu tương, lạc, ngô, vừng) bảo quản không đúng quy định, kém chất lượng‖. Mã số: TĐNDTP.06/19-21. Học viên Lê Ngọc Anh
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... ii MỤC LỤC .......................................................................................................................... iii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... vi DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................... viii MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................... 4 1.1. Vi nấm và tầm quan trọng của nghiên cứu các hợp chất tự nhiên từ vi nấm ........ 4 1.1.1. Giới thiệu chung về vi nấm ................................................................................ 4 1.1.2. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu các hợp chất từ vi nấm ............................ 5 1.2. Giới thiệu chung về Aspergillus niger ...................................................................... 8 1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về Aspergillus niger ........................................ 11 1.3.1. Một số ứng dụng của Aspergillus niger ............................................................... 11 1.3.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Aspergillus niger ....................... 12 1.3.2.1. Pyranones ................................................................................................... 13 1.3.2.2. Alkaloid .................................................................................................. 14 1.3.2.3. Cyclopeptide ........................................................................................... 16 1.3.2.4. Polyketide ............................................................................................... 17 1.3.2.5. Sterol....................................................................................................... 18 1.4. Tình hình nghiên cứu Aspergillus niger tại Việt Nam ........................................... 18 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 20 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ......................................................... 20 2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất ...................................................................................... 20 2.1.2. Thiết bị nghiên cứu .............................................................................................. 21
iv 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 21 2.2.1. Phƣơng pháp tạo dịch chiết nấm mốc .................................................................. 21 2.2.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất .................................................................... 21 2.2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất ...................................................... 22 2.2.4. Phƣơng pháp tính toán phổ ECD ......................................................................... 22 2.2.5. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ ..................................... 22 2.2.6. Phƣơng pháp đánh giá ức chế sự sản sinh nitric oxide (NO) .............................. 23 2.2.6.1. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào in vitro ......................................................... 23 2.2.6.2. Phƣơng pháp MTT ..................................................................................... 24 2.2.6.3. Phƣơng pháp đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO ................................ 24 2.2.7. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng sinh ........................................................ 25 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 26 3.1. Kết quả nhân sinh khối lƣợng lớn và tạo cao chiết tổng chủng Aspergillus niger IMBC-NMTP01 ................................................................................................... 26 3.2. Kết quả phân lập, làm sạch, tinh chế các hợp chất từ các chủng nấm mốc A. niger IMBC-NMTP01 ................................................................................................... 27 3.3. Kết quả xác định cấu trúc hóa học các hợp chất..................................................... 28 3.3.1. Hợp chất A1: epi-Aspergillusol (chất mới) ......................................................... 28 3.3.2. Hợp chất A3: Aspernigin (chất mới) ................................................................... 36 3.3.3. Hợp chất A2: Pyrophen ....................................................................................... 45 3.3.4. Hợp chất A4: 2-(Hydroxyimino)-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid .............. 46 3.3.5. Hợp chất A5: Aspergillusol A ............................................................................. 47 3.3.6. Hợp chất A6: Rubrofusarin B .............................................................................. 48 3.3.7. Hợp chất A7: Nigerasperone A ........................................................................... 50 3.3.8. Hợp chất A8: Fonsecin ........................................................................................ 51 3.3.9. Hợp chất A9: TMC-256C1 .................................................................................. 52 3.3.10. Hợp chất A10: Pyranonigrin A .......................................................................... 53
v 3.3.11. Hợp chất A11: Orlandin .................................................................................... 54 3.3.12. Hợp chất A12: Nigerasperone C ........................................................................ 55 3.3.13. Hợp chất A13: Asperpyrone A .......................................................................... 57 3.3.14. Hợp chất A14: 5-(Hydroxymethyl)-2-furancarboxylic acid.............................. 59 3.3.15. Tổng hợp các hợp chất đã đƣợc phân lập .......................................................... 60 3.4. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất ..................... 61 3.5. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế NO của các hợp chất ........................................ 62 3.6. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các hợp chất ................. 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................................... 66 Kết luận ............................................................................................................................. 66 Kiến nghị ........................................................................................................................... 66 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .................................................................. 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 68
vi DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT A. niger Aspergillus niger 13 C-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 1 H-1H COSY Phổ tƣơng tác proton-proton 1 H-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton CC Cột sắc ký CD Circular dichroism Spectroscopy – Phổ lƣỡng sắc tròn CYA Czapek Yeast Agar DMSO Dimethylsulfoside GC-MS Gas chromatography – mass spectrometry – Sắc ký khí – khối phổ Hep-G2 Tế bào ung thƣ biểu mô gan HL-60 Tế bào ung thƣ máu ở ngƣời HMBC Phổ tƣơng tác di hạt nhân qua nhiều liên kết HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao HSQC Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua một liên kết IC50 Nồng độ ức chế 50% KB Tế bào ung thƣ biểu mô ở ngƣời MCF-7 Tế bào ung thƣ vú ở ngƣời MIC50 Nồng độ ức chế tối thiểu 50% MS Phổ khối lƣợng NOESY Phổ NOESY PDA Potato Dextrose Agar TCA Trichloro acetic acid PDB Potato Dextrose Broth SK-Mel-2 Tế bào ung thƣ da ở ngƣời TLC Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng SRB Sulforhodamine B LNCaP Tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến tR Thời gian lƣu
vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số hợp chất dùng trong dƣợc phẩm có nguồn gốc từ vi nấm ................... 7 Bảng 3.1. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A1 ……………………………31 Bảng 3.2. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A3 ............................................... 38 Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A2 ............................................... 45 Bảng 3.4. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A4 ............................................... 46 Bảng 3.5. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A5 ............................................... 48 Bảng 3.6. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A6 ............................................... 49 Bảng 3.7. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A7 ............................................... 50 Bảng 3.8. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A8 ............................................... 51 Bảng 3.9. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A9 ............................................... 52 Bảng 3.10. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A10 ........................................... 53 Bảng 3.11. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A11 ........................................... 54 Bảng 3.12. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A12 ........................................... 56 Bảng 3.13. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A13 ........................................... 58 Bảng 3.14. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A14 ........................................... 59 Bảng 3.15. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất A1-A14 ....................... 61 Bảng 3.16. Hoạt tính ức chế NO của các hợp chất A1-A14 .......................................... 63
viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Một số loài vi nấm phổ biến................................................................................ 5 Hình 1.2. Một số loại kháng sinh đƣợc sản xuất bởi vi nấm .............................................. 7 Hình 1.3. Một số loài nấm thuộc chi Aspergillus ............................................................... 9 Hình 1.4. Sinh sản vô tính của A. niger ..................................................................... 10 Hình 1.5. A. niger trong môi trƣờng Czapek và PDA...................................................... 10 Hình 1.6. Bào tử A. niger chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope – SEM) .......................................................................................................... 10 Hình 1.7. Các cụm gen sinh tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp của 12 chủng A. niger .. 13 Hình 1.8. Một số hợp chất pyranones từ A. niger ............................................................. 14 Hình 1.9. Một số hợp chất alkaloids từ A. niger ............................................................... 16 Hình 1.10. Một số hợp chất cyclopeptides từ A. niger ..................................................... 17 Hình 1.11. Một số hợp chất polyketide từ A. niger ........................................................... 17 Hình 1.12. Một số hợp chất sterol từ A. niger ................................................................... 18 Hình 3.1. Lên men nhân sinh khối lƣợng lớn mẫu IMBC-NMTP01……………….. 26 Hình 3.2. Ngâm chiết, siêu âm và thu dịch chiết mẫu A. niger IMBC-NMTP01 .......... 26 Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ chủng nấm mốc A. niger IMBC-NMTP01 . 28 Hình 3.4. Cấu trúc và tƣơng tác HMBC ( và COSY (—) của hợp chất A1 ............... 29 Hình 3.5. Phổ ECD tính toán lý thuyết và thực nghiệm của hợp chất A1 ..................... 30 Hình 3.6. Phổ HRESIMS của A1 ................................................................................... 31 Hình 3.7. Phổ 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) của A1 ...................................................... 32 Hình 3.8. Phổ 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) của A1 ..................................................... 32 Hình 3.9. Phổ HSQC (CDCl3, 500 MHz) của A1 .......................................................... 33 Hình 3.10. Phổ HMBC (CDCl3, 500 MHz) của A1 ....................................................... 33 Hình 3.11. Phổ 1H NMR (CD3OD, 500 MHz) của A1 .................................................. 34 Hình 3.12. Phổ 13C NMR (CD3OD, 125 MHz) của A1 ................................................. 34 Hình 3.13. Phổ HSQC (CD3OD, 500 MHz) của A1 ...................................................... 35 Hình 3.14. Phổ HMBC (CD3OD, 500 MHz) của A1 ..................................................... 35 Hình 3.15. Phổ COSY (CD3OD, 500 MHz) của A1 ...................................................... 36 Hình 3.16. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC (), COSY (—) của hợp chất A3 . 36 Hình 3.17. Phổ HRESIMS của A3 ................................................................................. 38 Hình 3.18. Phổ 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của A3............................................... 39 Hình 3.19. Phổ 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của A3 ............................................. 39 Hình 3.20. Phổ HSQC (DMSO-d6, 500 MHz) của A3 .................................................. 40
ix Hình 3.21. Phổ HMBC (DMSO-d6, 500 MHz) của A3 ................................................. 40 Hình 3.22. Phổ COSY (DMSO-d6, 500 MHz) của A3 .................................................. 41 Hình 3.23. Phổ NOESY (DMSO-d6, 500 MHz) của A3 ............................................... 41 Hình 3.24. Phổ 1H NMR (CD3OD, 500 MHz) của A3 .................................................. 42 Hình 3.25. Phổ 13C NMR (CD3OD, 125 MHz) của A3 ................................................. 42 Hình 3.26. Phổ HSQC (CD3OD, 500 MHz) của A3 ...................................................... 43 Hình 3.27. Phổ HMBC (CD3OD, 500 MHz) của A3 ..................................................... 43 Hình 3.28. Phổ COSY (CD3OD, 500 MHz) của A3 ...................................................... 44 Hình 3.29. Phổ NOESY (CD3OD, 500 MHz) của A3 .................................................. 44 Hình 3.30. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC (), COSY (—) của hợp chất A2 . 45 Hình 3.31. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC () của hợp chất A4 ...................... 46 Hình 3.32. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC () của hợp chất A5 ...................... 47 Hình 3.33. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC () của hợp chất A6 ...................... 48 Hình 3.34. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC () của hợp chất A7 ...................... 50 Hình 3.35. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC () của hợp chất A8 ...................... 51 Hình 3.36. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC () của hợp chất A9 ...................... 52 Hình 3.37. Cấu trúc hóa học của hợp chất A10 ............................................................. 53 Hình 3.38. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC () của hợp chất A11 .................... 54 Hình 3.39. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC () của hợp chất A12 .................... 55 Hình 3.40. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC () của hợp chất A13 .................... 57 Hình 3.41. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC () của hợp chất A14 .................... 59 Hình 3.42. Cấu trúc hóa học của các hợp chất A1-A14 ................................................. 61
1 MỞ ĐẦU Vi nấm là những sinh vật sinh bào tử nhân chuẩn đƣợc tìm thấy ở hầu hết mọi môi trƣờng sống. Để tồn tại và sinh sản, chúng cạnh tranh với các sinh vật khác. Vi nấm tạo ra rất nhiều chất chuyển hóa thứ cấp. Các chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau có tác dụng gây hại nhƣ độc tố nấm mốc, tuy nhiên, một số trong số chúng có thể tăng cƣờng sức khỏe và tuổi thọ. Các đặc tính y học của nấm đã đƣợc khám phá và sử dụng trong điều trị bệnh, tăng cƣờng sức khỏe của con ngƣời. Một số chất chuyển hóa thứ cấp của nấm nhƣ penicillin, cyclosporin, statin và acid mycophenolic đƣợc biết đến với ứng dụng trong việc kéo dài tuổi thọ của con ngƣời. Hiện nay, ngày càng có nhiều nghiên cứu về các chất chuyển hóa thứ cấp của nấm để tìm ra các loại thuốc mới. Một số vai trò có lợi của nấm đối với loài ngƣời bao gồm kháng sinh, enzyme, chất tạo màu thực phẩm và thực phẩm bổ dƣỡng. Nhiều ngành công nghiệp khác nhau sử dụng các sản phẩm từ nấm nhƣ enzyme, chất màu thực phẩm và dƣợc phẩm. Hoạt tính sinh học của các chất chuyển hóa thứ cấp của nấm bao gồm : chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, kháng virus và chống ung thƣ. Các loài nấm khác nhau tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp quan trọng về mặt dƣợc lý nhƣ Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Beauveria bassiana, Cephalosporium acremonium, Micromonospora purpurea, Monascus purpureus, Penicillium griseofulvum, Penicillium notatum, Streptomyces griseusadium và Tolya. Trong những thập kỷ gần đây, các hợp chất thứ cấp từ vi nấm đã tạo ra một cuộc cách mạng trong nhiều lĩnh vực. Kể từ khi phát hiện ra penicillin, kháng sinh nhóm β- lactam đầu tiên, vi nấm đã cung cấp cho y học hiện đại những loại kháng sinh và dƣợc liệu quan trọng. Các loại thuốc hoặc sản phẩm dùng trong nông nghiệp có nguồn gốc từ vi nấm bao gồm statin, echinocandin và strobilurins. Sử dụng vi nấm để sản xuất công nghiệp các hormone steroid là một trong những thành công quan trọng của công nghệ sinh học. Do tính đa dạng sinh học của nấm cũng nhƣ các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, vi nấm hứa hẹn nhiều tiềm năng ứng dụng trong dƣợc phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp và nhiều lĩnh vực khác [1]. Aspergillus niger là một loại nấm phổ biến có mặt ở hầu hết mọi nơi. Do đặc tính phát triển nhanh, phân bố trên nhiều loại cơ chất tự nhiên, ít gây bệnh cho con ngƣời, có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme, chủng nấm này đƣợc sử dụng rộng rãi để sản xuất các enzyme công nghiệp nhƣ glucoamylase, pectinase, alpha- galactosidase, glucose oxidase và nhiều hợp chất khác, ứng dụng trong công nghiệp
2 chế biến thực phẩm và dƣợc phẩm. A. niger cũng đã đƣợc chứng minh là một nguồn giàu các chất chuyển hóa thứ cấp, bao gồm diketopiperazine, alkaloid, pyrones, bicoumarins, malformins, trong đó một số hợp chất đƣợc chứng minh là có tác dụng điều hòa miễn dịch và có các phản ứng gây độc tế bào. Việt Nam là một đất nƣớc có khí hậu nóng ẩm, với đa dạng các loại lƣơng thực và nông sản có giá thành rẻ, là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển. Aspergillus niger xuất hiện ở rất nhiều nơi nhƣ trên đất, trên bề mặt hầu hết các loại nông sản nếu không đƣợc xử lý đúng cách. Hiện nay, chƣa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của các chủng nấm mốc, trong đó có A. niger trên bề mặt hạt lạc. Do đó, xác định đƣợc các thành phần hóa học cũng nhƣ hoạt tính của các hợp chất thứ cấp sản sinh bởi chủng A. niger từ hạt lạc đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện các hợp chất mới, các độc tố cũng nhƣ các hoạt chất tốt, góp phần trong nghiên cứu các dƣợc phẩm điều trị bệnh, đảm bảo an toàn thực phẩm, nâng cao sức khỏe và tuổi thọ của con ngƣời. Hiện nay ở Việt Nam có một số nghiên cứu sử dụng A. niger trong sinh tổng hợp pectinase, cellulase để sản xuất công nghiệp. Tuy nhiên chƣa có nhiều nghiên cứu hóa học về chủng nấm này trên hạt lạc. Việc xác định thành phần hóa học của chủng nấm A. niger từ hạt lạc, qua đó phát hiện các hợp chất có hoạt tính tốt, cũng nhƣ phát hiện các hợp chất mới, chƣa đƣợc biết đến đóng vai trò rất quan trọng trong kiểm soát an toàn thực phẩm, đặc biệt là sản xuất dƣợc phẩm, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và ung thƣ. Trên cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn đề tài : « Nghiên cứu phân lập một số hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ và kháng khuẩn từ chủng vi nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01». Mục tiêu của luận văn : Xác định đƣợc thành phần và cấu trúc của một số hợp chất có mặt trong chủng nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01 có nguồn gốc từ hạt lạc, đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ và kháng khuẩn của các hợp chất đó, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu y sinh, dƣợc lý sau này. Nội dung luận văn bao gồm : 1. Phân lập, lên men sinh khối lƣợng lớn, tạo cao chiết tổng của chủng nấm A. niger IMBC-NMTP01 2. Phân lập các hợp chất từ cao chiết tổng của chủng A. niger IMBC-NMTP01 bằng các phƣơng pháp sắc ký kết hợp
3 3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc bằng các phƣơng pháp vật lý, hóa học 4. Phân tích hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ và hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất phân lập đƣợc
4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Vi nấm và tầm quan trọng của nghiên cứu các hợp chất tự nhiên từ vi nấm 1.1.1. Giới thiệu chung về vi nấm Giới Nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn dị dƣỡng có thành tế bào bằng kitin (chitin). Phần lớn nấm phát triển dƣới dạng các sợi đa bào đƣợc gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên thể sợi (mycelium), một số nấm khác lại phát triển dƣới dạng đơn bào. Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô tính) của nấm thƣờng là qua bào tử, đƣợc tạo ra trên những cấu trúc đặc biệt hay thể quả. Một số loài mất khả năng tạo nên những cấu trúc sinh sản đặc biệt và nhân lên qua hình thức sinh sản sinh dƣỡng. Vi nấm là các sinh vật nhân chuẩn thuộc giới Nấm, có cấu tạo đa bào, tế bào không có diệp lục, sống dị dƣỡng, vách tế bào cấu tạo chủ yếu bởi chitin, có hoặc không có cellulose, sinh trƣởng bằng cách kéo dài sợi. Cấu tạo của vi nấm thƣờng gồm những sợi kéo dài, gọi là sợi nấm (hyphae), lan ra trên bề mặt mà chúng bám vào. Thể sợi tạo ra các bào tử, đƣợc phát tán và lây lan nấm ra các bề mặt, sinh vật khác. Vi nấm phân bố ở hầu khắp các vùng khí hậu, từ nóng đến lạnh, nhiệt đới hay ôn đới, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc ký sinh trên cơ thể động, thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các vật chất hữu cơ và không thể thiếu đƣợc trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất. Nhiều loại vi nấm là có lợi, chẳng hạn nhƣ làm sinh vật phân giải trong đất, phần lớn không thể nhìn thấy bằng mắt thƣờng. Hàng ngàn loài vi nấm đƣợc tìm thấy trong địa y, một dạng cộng sinh giữa nấm và tảo. Tuy nhiên cũng có một số loài nấm có chứa các độc tố, chẳng hạn nhƣ Penicillium, Aspergillus và Neurospora đƣợc phát hiện là những loại nấm mốc làm hỏng trái cây và bánh mì, gây ảnh hƣởng đến quá trình bảo quản thực phẩm. Một số loài vi nấm còn có giá trị thƣơng mại. Vi nấm còn đƣợc dùng để sản xuất chất kháng sinh, dƣợc phẩm trong y học và nhiều loại enzyme, ngày nay nhiều loại nấm đƣợc biết đến và sử dụng trong phòng chống nhiều loại bệnh hiểm nghèo nhƣ viêm gan, mỡ máu, đột quỵ, ung thƣ... Tuy vậy, nhiều loại nấm lại có chứa các chất hoạt động sinh học đƣợc gọi là mycotoxin, nhƣ ankaloid và polyketide - là những chất độc đối với động vật lẫn con ngƣời. Một số loại nấm có thể gây ra các chứng bệnh cho con ngƣời và động vật, cũng nhƣ bệnh dịch cho cây trồng, mùa màng và có thể gây tác động lớn lên an ninh lƣơng thực và kinh tế.
5 Hình 1.1. Một số loài vi nấm phổ biến [1] 1.1.2. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu các hợp chất từ vi nấm Vi nấm đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp chế biến thực phẩm dùng để sản xuất tƣơng, chao, xì dầu…, các loại axit hữu cơ nhƣ citric acid, oxalic acid, các enzyme thực phẩm nhƣ protease, pectinase, amylase. Trong y học, nấm mốc đƣợc dùng để sản xuất các loại kháng sinh nhƣ penicillin, cephalosporin, griseofulvin, các vitamin nhóm B và các dƣợc phẩm khác. Trong nông nghiệp, vi nấm đƣợc ứng dụng trong sản xuất các chất kích thích tăng trƣởng kéo dài ngọn, lá, rễ cho cây trồng nhƣ gibberellin, auxin, các chế phẩm phân bón hữu cơ, phân vi sinh giúp tăng độ màu mỡ, cải tạo đất hoặc là thiên địch chống lại côn trùng. Tầm quan trọng của việc khai thác các hợp chất tự nhiên từ vi nấm lần đầu tiên đƣợc ghi nhận vào năm 1928, khi kháng sinh penicillin đƣợc tìm ra bởi Alexander Fleming từ chủng nấm Penicillium notatum. Kể từ đó, việc phát hiện ra các sản phẩm tự nhiên từ vi nấm đã thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà khoa học trong sản xuất và phát triển thuốc. Trong những thập kỷ gần đây, các hợp chất trao đổi thứ cấp từ vi nấm đang ngày càng đƣợc quan tâm nghiên cứu, nhiều hợp chất có cấu trúc độc đáo, thể hiện nhiều hoạt tính sinh học và tác dụng dƣợc học nhƣ ức chế khối u, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng enzyme và ức chế ung thƣ [2, 3]. Các lớp chất chủ yếu sản sinh bởi vi nấm là các polyketide, alkaloid, terpene, peptide, lipid, các hợp chất chứa nitro và các chất sinh tổng hợp hỗn hợp khác [4].
6 Nhiều công bố đã cho thấy tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của nguồn vi nấm và khả năng phát triển các hợp chất tự nhiên thành các thuốc kháng sinh mới ứng dụng trong điều trị [5]. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hầu hết các hợp chất kháng sinh mới đƣợc phát hiện chủ yếu từ các loài vi nấm thuộc chi Aspergillus và Penicillium. Một trong các kháng sinh phổ biến nhất này là các hợp chất có chứa nhân β- lactam trong cấu trúc hóa học của chúng, bao gồm penicillin (penam), cephalosporin (cephems), monobactams và carbapenems [6]. Các hợp chất này hoạt động bằng cách ức chế sự tổng hợp lớp peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn, từ đó gây chết tế bào vi khuẩn. Thuốc kháng sinh β-Lactam, chủ yếu là penicillin và cephalosporin, là một trong những loại thuốc phổ biến nhất trên thế giới, chiếm khoảng 65% thị trƣờng thuốc kháng sinh [1]. Griseofulvin là một trong những sản phẩm tự nhiên chống nấm đầu tiên đƣợc phát hiện ở nấm sợi [7]. Hợp chất này có nguồn gốc từ nấm mốc Penicillium griseofulvum và thƣờng đƣợc sử dụng để điều trị nhiễm nấm do có khả năng ức chế mạnh quá trình nguyên phân ở tế bào nấm [1]. Fusidic acid, một loại kháng sinh nhóm steroid, đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1962, từ môi trƣờng lên men của nấm Fusidium coccineum, có khả năng ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn [8], do đó, hợp chất này đƣợc đƣa vào sử dụng nhƣ một loại kháng sinh phổ biến và hiệu quả. Bên cạnh các hoạt chất phổ biến có nguồn gốc từ vi nấm nhƣ fusidic acid, griseofulvin, một số loại thuốc kháng nấm mới nhƣ anidulafungin (eraxis), caspofungin (cancidas), reptapamulin đƣợc bán tổng hợp từ các hợp chất đƣợc phân lập từ vi nấm [9, 10]. Các hoạt chất statin sử dụng trong điều trị bệnh mạch vành, đƣợc bán tổng hợp từ các hợp chất mevastitin và lovastatin phân lập từ các loài nấm Penicillium citrinum và Aspergillus terreus [9, 11].
7 Hình 1.2. Một số loại kháng sinh đƣợc sản xuất bởi vi nấm Các nghiên cứu đã chứng minh rằng một số nhóm thuốc kháng sinh có nguồn gốc từ vi nấm đã đƣợc sử dụng thành công trong điều trị các bệnh ung thƣ bao gồm anthracycline, actinomycin và bleomycin. Trong đó, nhiều hợp chất thuộc nhóm anthracycline đóng vai trò quan trọng trong điều trị lâm sàng các bệnh ung thƣ máu, ung thƣ bạch cầu, ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ vú và ung thƣ bàng quang [12]. Theo nghiên cứu của Wang và cộng sự (2013), hợp chất kháng sinh anthraquinone SZ-685C thuộc nhóm anthracycline đƣợc phân lập từ chủng vi nấm Halorosellinia sp. No. 1403 thể hiện hoạt tính kháng đặc hiệu đối với cả hai dòng tế bào ung thƣ vòm họng ở ngƣời gồm CNE2 và CNE2R [13]. Hợp chất này còn có khả năng ức chế hiệu quả sự gia tăng của sáu dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời gồm ung thƣ vú kháng adriamycin, ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ thần kinh đệm và ung thƣ gan [14]. Vì vậy, việc đánh giá khả năng kháng ung thƣ của các chủng vi nấm và đặc biệt là các hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng sinh đang đƣợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Bảng 1.1. Một số hợp chất dùng trong dƣợc phẩm có nguồn gốc từ vi nấm Hợp chất Tác dụng Nguồn gốc Tài liệu tham khảo Penicillins Kháng sinh Penicillium notatum [15] Cephalosporins Kháng sinh Cephalosporium [16, 17] acremonium Griseofulvin Kháng nấm Penicillium Griseofulvin [7] Fusidic acid Kháng sinh Fusidium [8] coccineum Cyclosporine Ức chế miễn dịch Tolypocladium inflatum [18, 19] Mevastatin Chống mỡ máu Penicillium citrinum [20] Lovastatin Chống mỡ máu Monascus ruber, [21] Aspergillus terreus Strobilurins Kháng nấm Strobilurus tenacellus, các [22] chi Basidiomycete, Ascomycete, Bolinea lutea Echinocandin Kháng nấm Aspergillus nidulans, [23] Aspergillus rugulovalvus PF1022A Chống giun sán Camellia japonica [24]
8 Nodulisporic acid Diệt côn trùng Nodulisporium sp. [25] A Không chỉ sinh tổng hợp các hợp chất kháng sinh, kháng ung thƣ, vi nấm còn là một nguồn tiềm năng các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh, kháng viêm, kháng lao, và nhiều hoạt tính có giá trị khác. Với các hoạt tính sinh học có giá trị đã thể hiện, các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm đƣợc xem là nguồn đầy hứa hẹn cho các sản phẩm y dƣợc mới. Do đó, cần có những nghiên cứu chi tiết hơn về điều tra và thu nhận các hợp chất tự nhiên mới từ vi nấm nhằm đáp ứng đƣợc nhu cầu phát triển của các hoạt chất sinh học. 1.2. Giới thiệu chung về Aspergillus niger Aspergillus niger là một trong những loài phổ biến nhất của chi Aspergillus [26]. A. niger thuộc giới Nấm, ngành Ascomycota, lớp Eurotiomycetes, bộ Eurotiales, họ Aspergillaceae, chi Aspergillus, phân chi Nigri, hoặc có thể đƣợc gọi là phân nhóm Aspergillus đen. Trong phân nhóm này có 14 loài có bào tử màu đen, dễ nhầm với A. niger [27]. Mô tả đầu tiên về Aspergillus xuất hiện vào năm 1729. Pier Antonio Micheli (1679-1737) đã mô tả Aspergillus là một trong 1400 chi mới của thực vật trong chi Nova plantarum. Micheli đã nhận ra sự giống nhau giữa cấu trúc hình thành của nấm và Aspergillum [28]. Aspergillus niger đƣợc mô tả vào năm 1867 trong một bản thảo có tựa đề ―Physiologie des mucédinées‖ của nhà thực vật học ngƣời Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem. Ông đã phân lập loại nấm này từ những túi mật bị mốc để nghiên cứu sản xuất acid gallic bằng quá trình lên men. Ông đã phân lập đƣợc hai loại nấm là Penicillium glaucum và một loài Aspergillus, tƣơng tự nhƣ Aspergillus glaucus, nhƣng màu đen của nó đƣợc duy trì trên các môi trƣờng khác nhau và có một số đặc điểm khác, ông đặt tên là Aspergillus niger [29].
9 Hình 1.3. Một số loài nấm thuộc chi Aspergillus [30] Khuẩn lạc A. niger phát triển nhanh và có thể dễ dàng nhận biết thông qua hình thái của chúng. Ban đầu sợi nấm có màu trắng, sau đó dần dần trở nên sẫm màu hơn thành màu đen tuyền hoặc nâu sẫm. Từ sợi đầu tiên, chúng phân nhánh tạo thành từ 2 đến 4 sợi, các sợi này tiếp tục phân nhánh tạo thành khuẩn lạc. Khuẩn lạc của A. niger có hình dạng tròn, lồi, xốp và đều. Trong môi trƣờng CYA (Czapek Yeast Extract Agar), Czapek và PDA (Potato Dextrose Agar), A. niger có dạng sợi, bào tử ở đầu sợi có màu đen. Hình ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope - SEM) cho thấy bào tử A. niger có dạng hình cầu lõm 2 mặt, đƣờng kính trung bình khoảng 2.5 – 3 µm (Hình 1.6). Khi nhìn ngƣợc lại đĩa thạch, có thể quan sát sự phát triển của sợi nấm, sợi nấm màu trắng đến vàng, nhăn nheo. Sau 7 ngày nuôi cấy ở 25°C, khuẩn lạc trên môi trƣờng CYA có đƣờng kính 90 mm, trong khi khuẩn lạc trên môi trƣờng Czapek có đƣờng kính 70 ± 2,5mm [26].