Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng vi khuẩn tả (Vibrio cholera) và độc tố tả còn hoạt tính bằng ELISA

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016<br /> <br /> NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG<br /> KHÁNG THỂ IgY KHÁNG VI KHUẨN TẢ (Vibrio cholera) VÀ<br /> ĐỘC TỐ TẢ CÒN HOẠT TÍNH BẰNG ELISA<br /> Phạm Văn Hiển*; Vũ Bình Dương*; Ngô Xuân Trình*<br /> Hồ Bá Ngọc Minh*; Ngô Thị Tuyết Mai*; Nguyễn Thị Hồng Thanh**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng vi khuẩn (VK) tả và độc<br /> tố tả còn hoạt tính. Đối tượng: kháng thể IgY kháng VK tả và kháng độc tố tả được sản xuất tại<br /> Học viện Quân y. Phương pháp: thẩm định theo Hướng dẫn của ICH, Bộ Y tế Việt Nam. Kết<br /> quả: xác định được điều kiện phân tích bằng phương pháp ELISA nhờ phản ứng tạo màu của<br /> phức hợp kháng thể - HRP với cromogen đo ở bước sóng 450 nm. Phương pháp đã được<br /> thẩm định, bảo đảm yêu cầu của phương pháp phân tích gồm tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính,<br /> độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD). Kết luận: đã xây<br /> dựng và thẩm định được phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng VK tả và độc tố tả còn<br /> hoạt tính bằng phương pháp ELISA.<br /> * Từ khóa: Vi khuẩn tả; Kháng thể IgY kháng vi khuẩn tả; Kháng thể IgY kháng độc tố tả; ELISA.<br /> <br /> Determination of Activation of Anti-vibrio Cholera and Anti-vibrio<br /> Cholera Toxin IgY by ELISA Method<br /> Summary<br /> Objectives: Establishment and validation of IgY anti-vibrio and anti-vibrio toxin by ELISA. Materials:<br /> IgY anti-vibrio and IgY anti-vibrio toxin were prepared at Vietnam Military Medical University.<br /> Methods: Using ELISA method based on colourimetry of complex IgY-HRP-cromogen at 450 nm.<br /> The validation was carried out in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health guideline.<br /> Results: The quantification method of IgY anti-vibrio cholera and anti-vibrio cholera toxin was<br /> established and validated completing of selectivity, linerity, presison, accuracy, LOD and LOQ.<br /> Conclusions: The quantification method of IgY anti-vibrio cholera and anti-vibrio cholera toxin<br /> was validated fully in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health.<br /> * Key words: Cholera; Anti-vibrio cholera IgY; Anti-vibriocholera toxin IgY; ELISA.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Bệnh tả gây ra bởi VK tả (Vibrio cholera)<br /> và độc tố tả (Vibrio cholera toxin), đặc biệt<br /> <br /> đối với các nước nhiệt đới như Việt Nam,<br /> là một mối đe dọa lớn đối với sức khỏe<br /> cộng đồng. Theo báo cáo của WHO năm<br /> 2007, toàn thế giới có 177.963 trường hợp<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Đại học Y khoa Vinh<br /> Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbd2978@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 15/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/08/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 07/09/2016<br /> <br /> 110<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016<br /> mắc dịch tả và con số tử vong là 4.301<br /> người [5]. Hàng năm, có trên 100.000 người<br /> mắc tả và 90% tập trung ở khu vực châu<br /> Á và châu Phi. Để điều trị tả, ngoài sử<br /> dụng các biện pháp dự phòng và điều trị<br /> kinh điển như vắc xin, bù nước điện giải,<br /> kháng sinh…, việc sử dụng các kháng thể<br /> kháng VK tả và độc tố tả đường uống là<br /> biện pháp khá hữu hiệu [4]. Kháng thể<br /> IgY là một immunoglobin có tác dụng tốt<br /> để điều trị các dịch bệnh nhiễm trùng,<br /> nhiễm độc đường tiêu hóa [6, 7, 8]. Hiện<br /> nay, Học viện Quân y đã chế tạo thành<br /> công kháng thể IgY kháng VK tả và độc tố<br /> tả có nguồn gốc từ trứng gà mái được<br /> gây miễn dịch [2]. Nhằm làm cơ sở cho<br /> đánh giá chất lượng kháng thể và bào chế<br /> chế phẩm dùng đường uống từ nguồn<br /> nguyên liệu này, chúng tôi xây dựng phương<br /> pháp định lượng kháng thể IgY kháng VK<br /> tả và độc tố tả còn hoạt tính bằng phương<br /> pháp ELISA.<br /> NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên liệu và thiết bị.<br /> - Kháng thể chuẩn IgY kháng VK tả<br /> (Vibrio cholera) và IgY kháng độc tố tả<br /> (chuẩn đối chiếu) được Virusys Corporation<br /> (Mỹ) cung cấp (10 µg/ml; 0,1 ml).<br /> - Kháng thể IgY kháng VK tả và IgY<br /> kháng độc tố tả được Bộ môn Miễn dịch,<br /> Học viện Quân y cung cấp.<br /> - Kháng nguyên: chủng VK tả (Vibrio<br /> cholerae) do Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện<br /> Quân y 103 cung cấp, phân lập từ các mẫu<br /> bệnh phẩm của bệnh nhân mắc bệnh tả<br /> tại Việt Nam giai đoạn 2010 - 2015. Độc<br /> tố tả được Sigma (Mỹ > 98,0%) cung cấp.<br /> - Các hóa chất, trang thiết bị khác đạt<br /> tiêu chuẩn phân tích dược học và vi sinh.<br /> <br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> Định lượng hoạt tính kháng thể IgY<br /> kháng VK tả và độc tố tả bằng phương<br /> pháp ELISA. Thẩm định phương pháp<br /> theo chỉ dẫn của ICH và Bộ Y tế Việt Nam<br /> gồm: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ<br /> đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng<br /> và giới hạn phát hiện [1, 3].<br /> - Mẫu chuẩn: chuẩn bị các chuẩn làm<br /> việc có nồng độ 1,56 - 50 ng/ml bằng pha<br /> loãng chuẩn gốc IgY kháng VK tả và độc<br /> tố tả (10 µg/ml) với dung môi pha loãng.<br /> - Mẫu thử: sử dụng dung môi pha<br /> loãng kháng thể để chuẩn bị mẫu thử có<br /> nồng độ khoảng 10 ng/ml.<br /> - Mẫu trắng: dung dịch đệm pha loãng<br /> khoáng thể IgY (Virusys Corporation, Mỹ,<br /> IgY Sample Diluent 1x, chứa 10 mM Tris,<br /> pH 7,4 và 150 mM NaCl).<br /> * Tiến hành: kháng nguyên VK tả và<br /> độc tố tả được chuẩn bị ở các nồng độ<br /> 7,5 x 106 CFU/ml và 10 µg/ml. 100 µl mỗi<br /> loại dung dịch được gắn lên đĩa 96 giếng<br /> trong dung dịch đệm 0,1 M carbonatbicarbonat pH 9,6 ở 40C và để qua đêm.<br /> Sau đó, thêm 200 µl dung dịch PBS chứa<br /> 0,05 Tween 20 và 1% BSA. Các giếng<br /> này sau đó ủ với 100 µl kháng thể IgY<br /> kháng độc tố tả hoặc VK tả với nồng độ<br /> khác nhau trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.<br /> Sau đó, ủ các giếng với phức hợp HRP kháng thể IgG cừu kháng IgY gà. Ở giữa<br /> mỗi bước, rửa giếng với 200 µl dung dịch<br /> PBS chứa 0,05% Tween 20. Màu của<br /> phản ứng được khai triển bằng cách thêm<br /> 100 µl dung dịch cromogen 1x (IAV_TMB chứa 3,3', 5,5;-tetramethylbenzidine) ủ tiếp<br /> trong 15 phút trong bóng tối. Dừng phản<br /> ứng bằng thêm 100 µl dung dịch axít HCl<br /> 1N. Đem đọc mật độ quang ở bước sóng<br /> 450 nm.<br /> 111<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Tính đặc hiệu của phương pháp.<br /> (a)<br /> <br /> (b)<br /> <br /> (c)<br /> <br /> Hình 1: Kết quả quét phổ của dung dịch đem đo quang định lượng IgY kháng VK tả.<br /> (a) Dung dịch thử; (b) Dung dịch chuẩn; (c) Mẫu trắng.<br /> (a)<br /> <br /> (b)<br /> <br /> (c)<br /> <br /> Hình 2: Kết quả quét phổ của dung dịch đem đo quang định lượng IgY kháng độc tố tả<br /> (a) Dung dịch thử; (b) Dung dịch chuẩn; (c) Mẫu trắng.<br /> Quét phổ để xác định cực đại hấp thụ của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng.<br /> Kết quả cho thấy phổ chuẩn và phổ thử đều xuất hiện cực đại hấp thụ ở bước sóng<br /> 450 nm. Trên mẫu trắng không có cực đại hấp thụ này, cho thấy phương pháp đảm bảo<br /> tính đặc hiệu.<br /> 2. Khoảng tuyến tính.<br /> Chuẩn bị dãy chuẩn từ 1,56 - 100,0 ng/ml bằng pha loãng dung dịch chuẩn gốc<br /> với dung dịch pha loãng (chứa 10 mM Tris, pH 7,4 và 150 mM NaCl). Thực hiện<br /> phản ứng theo như mô tả ở phương pháp nghiên cứu. Đánh giá mối tương quan<br /> giữa nồng độ IgY và độ hấp thụ quang đo được. Kết quả trình bày như bảng 1, 2 và<br /> hình 3, 4.<br /> 112<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016<br /> Bảng 1: Mối tương quan giữa mật độ quang nồng độ IgY kháng VK tả.<br /> Nồng độ IgY kháng VK tả (ng/ml)<br /> <br /> Mật độ quang<br /> <br /> X<br /> <br /> SD<br /> <br /> 50<br /> <br /> 2,212<br /> <br /> 2,21<br /> <br /> 2,196<br /> <br /> 2,206<br /> <br /> 0,009<br /> <br /> 25<br /> <br /> 1,115<br /> <br /> 1,102<br /> <br /> 1,106<br /> <br /> 1,108<br /> <br /> 0,007<br /> <br /> 12,5<br /> <br /> 0,572<br /> <br /> 0,565<br /> <br /> 0,582<br /> <br /> 0,573<br /> <br /> 0,009<br /> <br /> 6,25<br /> <br /> 0,307<br /> <br /> 0,301<br /> <br /> 0,303<br /> <br /> 0,304<br /> <br /> 0,003<br /> <br /> 3,13<br /> <br /> 0,161<br /> <br /> 0,161<br /> <br /> 0,164<br /> <br /> 0,162<br /> <br /> 0,002<br /> <br /> 1,56<br /> <br /> 0,098<br /> <br /> 0,093<br /> <br /> 0,102<br /> <br /> 0,098<br /> <br /> 0,005<br /> <br /> Độ hấp thụ<br /> <br /> lgY kháng VK tả<br /> <br /> Nồng độ (ng/ml)<br /> <br /> Hình 3: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang và<br /> nồng độ IgY kháng VK tả.<br /> Bảng 2: Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ kháng thể IgY kháng độc<br /> tố tả.<br /> Nồng độ IgY kháng độc tố tả<br /> (ng/ml)<br /> <br /> Mật độ quang<br /> <br /> X<br /> <br /> SD<br /> <br /> 50<br /> <br /> 2,201<br /> <br /> 2,145<br /> <br /> 2,189<br /> <br /> 2,178<br /> <br /> 0,029<br /> <br /> 25<br /> <br /> 1,146<br /> <br /> 1,123<br /> <br /> 1,133<br /> <br /> 1,134<br /> <br /> 0,012<br /> <br /> 12,5<br /> <br /> 0,567<br /> <br /> 0,545<br /> <br /> 0,572<br /> <br /> 0,561<br /> <br /> 0,014<br /> <br /> 6,25<br /> <br /> 0,302<br /> <br /> 0,311<br /> <br /> 0,305<br /> <br /> 0,306<br /> <br /> 0,005<br /> <br /> 3,13<br /> <br /> 0,165<br /> <br /> 0,161<br /> <br /> 0,163<br /> <br /> 0,163<br /> <br /> 0,002<br /> <br /> 1,56<br /> <br /> 0,095<br /> <br /> 0,091<br /> <br /> 0,087<br /> <br /> 0,091<br /> <br /> 0,004<br /> <br /> 113<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016<br /> <br /> Độ hấp thụ<br /> <br /> lgY kháng độc tố tả<br /> <br /> Nồng độ (ng/ml)<br /> <br /> Hình 4: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang và<br /> nồng độ IgY kháng độc tố tả.<br /> Kết quả bảng 1, 2; hình 1 và 2 cho thấy: nồng độ IgY cũng như nồng độ kháng thể<br /> IgY kháng độc tố tả và mật độ quang có tương quan chặt chẽ với nhau, hệ số tương<br /> quan tuyến tính xấp xỉ bằng 1.<br /> 3. Độ lặp lại.<br /> Tiến hành xử lý mẫu với các mẫu chuẩn kháng thể IgY kháng độc tố tả và VK tả có<br /> nồng độ khác nhau: LQC (3,13 ng/ml), MQC (6,25 ng/ml)) và HQC (25 ng/ml). Phân<br /> tích trong cùng 1 ngày, để bảo quản, sau đó phân tích sau 3 ngày để xác định độ lặp<br /> lại của phương pháp phân tích.<br /> Bảng 3: Kết quả xác định độ lặp lại trong ngày và khác ngày định lượng IgY kháng<br /> VK tả và độc tố tả.<br /> Loại<br /> <br /> LQC (3,13 ng/ml)<br /> <br /> IgY kháng<br /> VK tả<br /> <br /> 3,08 ± 0,04<br /> <br /> IgY kháng<br /> độc tố tả<br /> <br /> 3,06 ± 0,05<br /> <br /> 1,29%<br /> <br /> 1,52%<br /> <br /> a<br /> <br /> c<br /> <br /> c<br /> <br /> 3,06 ± 0,04<br /> 1,23%<br /> <br /> a<br /> <br /> MQC (6,25 ng/ml)<br /> <br /> c<br /> <br /> 3,06 ± 0,05<br /> 1,64%<br /> <br /> b<br /> <br /> c<br /> <br /> 6,33 ± 0,07<br /> 1,11%<br /> <br /> b<br /> <br /> c<br /> <br /> 6,38 ± 0,11<br /> 1,67%<br /> <br /> a<br /> <br /> c<br /> <br /> 6,40 ± 0,09<br /> 1,40%<br /> <br /> a<br /> <br /> HQC (25 ng/ml)<br /> <br /> c<br /> <br /> 6,41 ± 0,08<br /> 1,24%<br /> <br /> b<br /> <br /> c<br /> <br /> a<br /> <br /> 24,82 ± 0,15<br /> 0,62%<br /> <br /> b<br /> <br /> c<br /> <br /> 0,57%<br /> a<br /> <br /> 25,59 ± 0,27<br /> 1,05%<br /> <br /> c<br /> <br /> b<br /> <br /> 24,85 ± 0,14<br /> c<br /> <br /> b<br /> <br /> 25,67 ± 0,14<br /> 0,55%<br /> <br /> c<br /> <br /> (a<br /> <br /> Độ lặp lại trong ngày được tính ± SD, n = 3; b) Độ lặp lại khác ngày (sau 3 ngày)<br /> tính là ± SD, n = 6; c) RSD tính là SD/ × 100%.<br /> Kết quả cho thấy, RSD ở 3 mức nồng độ ngoại suy từ đường chuẩn, kể cả trong<br /> ngày và khác ngày đều < 2,0%. Với kết quả này, phương pháp phân tích đáp ứng yêu<br /> cầu về độ lặp lại.<br /> 4. Độ đúng.<br /> Sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định độ đúng của phương pháp định lượng.<br /> Thêm các lượng kháng thể IgY chuẩn vào mẫu thử đã biết hàm lượng. Tiến hành xử lý<br /> mẫu theo phương pháp đã lựa chọn ở trên. Sau đó, đo mật độ quang ở bước sóng<br /> 450 nm và dựa vào đường chuẩn để ngoại suy lượng thêm vào.<br /> 114<br /> <br />