Xây dựng phương pháp định lượng voriconazol trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao phục vụ giám sát trị liệu

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

6
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Xây dựng phương pháp định lượng voriconazol trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao phục vụ giám sát trị liệu nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng VCZ trong huyết tương bằng HPLC-DAD phục vụ TDM cho VCZ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng phương pháp định lượng voriconazol trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao phục vụ giám sát trị liệu

Xây dựng phương pháp định lượng voriconazol trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao phục vụ giám sát trị liệu Nguyễn Thị Thùy Linh, Phùng Thị Hường Vũ Ngân Bình, Phạm Thị Thanh Hà* Trường Đại học Dược ội Summary A liquid chromatographic method was developed for the determination of voriconazole in human plasma using high performacne liquid chromatography with UV detection. The LC conditions were as follows: C8 column (150 mm  4.6 mm, 5 m) as stationary phase, mixture of 10 mM amoni acetate (pH 7) buffer – acetonitrile (63:37, v/v) as mobile phase, UV detection at 260 nm. All validation parameters met the criteria set out in FDA guidelines for bioanalytical methods. This method showed good linearity range of 0.5 - 12.5 mg/L voriconazole (R2 = 0.9993) and acceptable precision (RSD 0.9 - 9.7%) and accuracy (86.7 - 113.2%) at investigated concentrations suitable for therapeutic drug monitoring practice. Analytes in plasma samples were stable under different temperatures and storage conditions. Keywords: Voriconazole, determination, liquid chromatography, therapeutic drug monitoring, plasma. Đặt vấn đề Một số nghiên cứu dược động học/ dược lực Voriconazol (VCZ) là một loại thuốc kháng học (PK/PD) cho thấy nồng độ đáy (Cmin) của nấm triazol thế hệ thứ hai, phổ rộng, có khả VCZ trong huyết tương từ 1,0 - 5,5 mg/L cải năng chống lại hầu hết các loại nấm mốc và thiện kết quả điều trị và giảm thiểu nguy cơ các nấm men có ý nghĩa lâm sàng, bao gồm cả tác dụng ngoại ý [3] . Thử nghiệm lâm sàng cho Aspergillus, Candida và Cryptococcus thấy khi giám sát nồng độ thuốc trong điều trị [1] neoformans . VCZ được chuyển hóa qua hệ (Therapeutic Drug Monitoring - TDM) cho các enzym gan CYP450 và chủ yếu là CYP2C19. bệnh nhân dùng VCZ sau khi hiệu chỉnh liều thì Tính đa hình di truyền của CYP2C19 và các yếu nồng độ thuốc đúng vào ngưỡng điều trị, hiệu tố không di truyền như tuổi tác, tương tác thuốc, quả điều trị lên tới 81% so với 57% của nhóm bệnh gan... đã tạo ra sự khác biệt lớn về nồng bệnh nhân không giám sát [3]. độ VCZ trong một cá nhân và giữa các cá nhân Để triển khai giám sát điều trị (TDM), việc khác nhau [2]. xây dựng phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học là khâu then chốt, đóng vai trò quyết định. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã Chịu trách nhiệm: Phạm Thị Thanh Hà xây dựng được các phương pháp để định lượng Email: thanhha.pham@hup.edu.vn VCZ trong huyết tương sử dụng sắc ký khí khối Ngày nhận: 16/02/2022 phổ (GC-MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Ngày phản biện: 07/3/2022 với detector huỳnh quang [4], DAD [5] hoặc LC- Ngày duyệt bài: 24/3/2022 MS [6]. Tuy nhiên, tại Việt Nam, chưa có nghiên 32 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022
cứu nào công bố về xây dựng phương pháp hẩm định phương pháp định lượng voriconazol trong huyết tương phục Sử dụng các mẫu tự tạo (thêm chuẩn VCZ vụ TDM. Khoảng nồng độ VCZ trong TDM vào huyết tương trắng) để thẩm định phương không đòi hỏi kỹ thuật phân tích có độ nhạy cao pháp. Tính phù hợp của hệ thống, độ chọn lọc, như LC-MS. Mặt khác, HPLC - DAD là thiết bị khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới được sử dụng phổ biến. Vì vậy, nhóm nghiên LLOQ, độ đúng, độ chính xác trong ngày và cứu xây dựng phương pháp định lượng VCZ khác ngày, độ thu hồi (hiệu suất chiết), độ ổn trong huyết tương bằng HPLC-DAD phục vụ định (dung dịch chuẩn gốc sau thời gian ngắn ở TDM cho VCZ. nhiệt độ phòng mẫu chuẩn trong huyết tương guyên vật iệu thiết ị và phương sau thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng, sau 3 chu pháp nghiên cứu kỳ đông - rã đông, sau thời gian dài ở nhiệt độ oá chất - thuốc thử bảo quản mẫu chuẩn trong huyết tương sau khi Chất chuẩn đối chiếu: Voriconazol mua từ xử lý mẫu) theo các tiêu chí của US - FDA [7]. Hãng Sigma - Aldrich (99,8%, lot. LRAC2092). ết quả nghiên cứu Hoá chất: Acetonitril (MeCN) và methanol Xây dựng phương pháp (MeOH) tinh khiết HPLC được mua từ Hãng Từ tham khảo một số tài liệu [8, 9, 10, 11], chúng Merck (Mỹ), acid percloric, amoni acetat và tôi đã lựa chọn một số điều kiện ban đầu, và n-hexan (PA) từ Hãng Prolabo (Đức), huyết khảo sát một số thông số: Thành phần và tỷ lệ tương trắng (HTT) từ Viện Huyết học - Truyền pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ cột, thể tích máu Trung ương (Lot. 20PO184747). tiêm mẫu và bước sóng phát hiện. Các dung dịch chuẩn gốc voriconazol: Điều kiện xử lý mẫu Hòa tan voriconazol chuẩn đối chiếu và pha Do nền mẫu là huyết tương chứa một lượng loãng chính xác đến nồng độ 2 mg/mL bằng lớn protein, ngoài ra còn chứa nhiều thành phần methanol được dung dịch chuẩn gốc VCZ 2000 khác như acid béo, cholesterol… là các chất μg/mL (G2000), bảo quản ở 2 - 8°C. Pha loãng thân dầu, kém phân cực, nếu không được loại bằng acetonitril để được dung dịch chuẩn trung bớt thì trong mẫu thì gây nhiễu đường nền, cản gian VCZ 100 μg/mL (G100), 20 μg/mL (G20). trở quá trình phân tích và làm giảm tuổi thọ của Mẫu chuẩn trong huyết tương: Pha loãng cột sắc ký. Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát các dung dịch chuẩn, thêm vào huyết tương xử lý mẫu qua hai bước: 1) Kết tủa protein với 3 trắng sao cho nồng độ VCZ trong huyết tương dung môi: HClO4 2 - 3%, MeOH, ACN và 2) Loại tương ứng lần lượt là 0,5; 1; 2; 5; 10; tạp thân dầu bằng chiết lỏng-lỏng với 3 dung 12,5 μg/mL. Chuẩn bị các mẫu tương tự ở nồng môi: Dicloromethan, cloroform và n-hexan. độ định lượng tối thiểu LLOQ (0,5 μg/mL), nồng Bước 1 – Kết tủa protein độ kiểm tra thấp, trung bình và cao (LQC, MQC, Kết quả cho thấy ACN là lựa chọn phù hợp HQC) tương ứng là 1,0 μg/mL; 5,0 μg/mLvà nhất cho bước kết tủa protein. Khi thêm HClO4 10 μg/mL. 2 - 3% vào mẫu huyết tương trắng và mẫu trắng hiết ị nghiên cứu thêm chuẩn, nhận thấy lượng protein kết tủa Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Aligent nhiều nhất nhưng sắc đồ thu được cho đường 1100, detector PDA. nền xấu. Mẫu thêm chuẩn xuất hiện pic có thời Cân phân tích A&D, Model GR-200 (Nhật), gian lưu gần với thời gian lưu của VCZ nhưng máy ly tâm Kubota 6500 (Nhật), máy lắc xoáy phổ của nó không tương đồng với VCZ do Labinco L46 (Hà Lan), phễu lọc Buchner, màng HClO4 là một chất oxi hóa mạnh nên VCZ và lọc cellulose 0,45 m, tủ lạnh âm sâu (-86C) một số thành phần khác trong huyết tương có Panasonic (Nhật), máy đo pH Eutech thể bị oxy hóa thành các chất khác. Với dung Instruments (Singapore). môi MeOH, khả năng kết tủa protein kém nhất, TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022 33
sau khi thêm dung môi chiết loại tạp vào lắc, ly và sắc đồ thu được từ mẫu huyết tương trắng tâm, vẫn còn một phần tủa phân tán trong nước, thêm chuẩn có đường nền không quá nhiễu, pic dung dịch đục. Dung môi ACN có khả năng tủa VCZ có phổ tương đồng phổ của dung dịch protein tốt, sau khi ly tâm thu được dung dịch chuẩn trong dung môi. trong, kết tủa hoàn toàn lắng xuống phía dưới, ( 1:1) (1:2) VCZ VCZ Hình 1. Sắc ký đồ VCZ 5 μg/mL trong HTT kết tủa bằng MeCN với các tỷ lệ khác nhau Các tỷ lệ huyết tương - MeCN khác nhau đã tuy nhiên, hiện tượng tăng áp suất vẫn xuất hiện. được khảo sát: 1 : 1, 1 : 2, 2 : 5 và tỷ lệ Do đó, bước 2 - chiết lỏng - lỏng đã được khảo HT-MeCN 2 : 5 được lựa chọn vì nền mẫu huyết sát với 3 dung môi thân dầu để loại các tạp thân tương sạch hơn, ít pic tạp trên sắc ký đồ. dầu trong huyết tương, tránh bị lưu giữ làm Bước 2 – Loại tạp thân dầu giảm hiệu lực cột. Kết quả cho thấy với dung Trong quá trình khảo sát, nhận thấy các mẫu môi dicloromethan sự tách lớp 2 pha không rõ chỉ xử lý bằng MeCN có rất nhiều pic tạp lớn ràng, 2 pha đều bị đục; với dung môi cloroform rửa giải muộn, có thể là các thành phần thân thì hai pha tách lớp tốt, tuy nhiên VCZ chuyển dầu chưa được loại hết khỏi mẫu huyết tương. sang pha dung môi, lượng VCZ nằm lại ở pha Hơn nữa, sau khi phân tích chỉ khoảng 10 - 20 nước ít ảnh hưởng tới giới hạn phát hiện của mẫu huyết tương theo quy trình, chỉ có 1 bước phương pháp. Dung môi n-hexan tách khá tốt kết tủa protein, hiệu lực cột đã bị ảnh hưởng, khỏi pha H2O - MeCN ngay cả ở tỷ lệ dung môi thể hiện ở thời gian lưu của VCZ bị tăng lên và thấp (2 : 7), phần lớn các chất kém phân cực áp suất cột cũng tăng. Chỉ sau khi cột được rửa chuyển sang pha n-hexan (hình 2b) mặt khác trong thời gian dài (1 ngày), thậm chí với 100% VCZ không chuyển sang dung môi, VCZ nằm MeCN, áp suất cũ mới được phục hồi. Để rửa toàn bộ trong pha H2O - MeCN (hình 2a) nên giải tốt hơn các chất phân cực, chương trình n-hexan đã được chọn làm dung môi loại tạp, pha động đã được thay đổi, bổ sung thêm một cho hiệu quả loại tạp khá tốt. bước rửa tạp (post-run) với tỷ lệ MeCN cao hơn, 34 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022
(a) (b) PHA NƯỚC PHA N-HEXAN KTZ VCZ Hình 2. VCZ 10 μg/mL/HTTchiết loại tạp với dung môi n-hexan. Sắc ký đồ của (a) pha nước và (b) pha n-hexan Quy trình xử lý mẫu được lựa chọn như sau: 1,3 ml/phút thì thời gian rửa giải ngắn hơn 200 L HTT + 200L Gx + 300 L MeCN (~ 12 phút) nhưng pic VCZ không cân đối (hình (Gx: nồng độ VCZ khác nhau của đường chuẩn, 3e). Với tỉ lệ 37% MeCN, tốc độ dòng 1 ml/phút chuẩn VCZ pha trong MeCN) hoặc 200 L HT thì VCZ rửa giải khoảng 8 phút và VCZ tách bệnh + 500 L MeCN (đối với mẫu bệnh nhân), hoàn toàn với thành phần khác trong mẫu huyết lắc xoáy trong vòng 30 giây, sau đó thêm tương (Rs > 1,5), áp suất qua cột 90 bar, đảm 200 L n-hexan vào, lắc xoáy 30 giây, ly tâm bảo sự ổn định của hệ thống sắc ký (hình 3c và 14.000 vòng/phút trong 5 phút, hút lớp nước ở 3d). phía dưới tiêm sắc ký. Điều kiện sắc ký cuối cùng được lựa chọn Điều kiện sắc ký như sau: Tiến hành khảo sát pha động acetonitril - - Cột InterSustain C8 (150 mm x 4,6 mm, đệm amoni acetat 10 mM, pH = 7, với tỷ lệ 5 m) và tiền cột (5 mm x 4,6 mm, 5 m) ở nhiệt thành phần MeCN thay đổi từ 30 - 50% và tốc độ phòng. độ dòng 1 ml/phút thì càng tăng MeCN và thời - Pha động: Acetonitril - đệm amoni acetat gian lưu của VCZ càng giảm. Ở tỷ lệ MeCN 10mM pH 7,0 (37: 63, tt/tt), tốc độ dòng 50% thì pic của VCZ (tR ~ 4,8 phút) không tách 1,0 ml/phút. được khỏi pic tạp trong nền mẫu huyết tương - Detector UV 260 nm, bước sóng hấp thụ (hình 3a và 3b). Giảm tỷ lệ MeCN 30% thì thời cực đại của VCZ (hình 3g). gian phân tích rất dài nếu tăng tốc độ dòng lên - Thể tích tiêm mẫu: 50 L. TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022 35
(a) HTT/ 50% MeCN (c) HTT/37% MeCN (b) C4 /50% MeCN (d) C4/37% MeCN VCZ (e) C4/30% MeCN; (g) f = 1,3 ml/phút 260 nm VCZ Hình 3. Sắc ký đồ của: (a) mẫu huyết tương trắng và (b) mẫu chuẩn C4 với pha động 50% MeCN; (c) mẫu huyết tương trắng và (d) mẫu chuẩn C4 với pha động 37% MeCN và f = 1ml/ phút; (e) mẫu chuẩn C4 với pha động 30% MeCN và f = 1,3 ml/phút; (g) Phổ hấp thụ của VCZ. Khảo sát chất chuẩn nội khảo sát để sử dụng làm chất chuẩn nội. Điều Trong quá trình khảo sát xây dựng phương kiện sắc ký cũng đã được lựa chọn để tách pháp, ketoconazol và fluconazol là các hợp chất được tốt voriconazol khỏi cả hai chất này. Tuy cùng nhóm, có cấu trúc tương tự cũng đã được nhiên, fluconazol rửa giải khá nhanh, bị lẫn vào 36 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022
các pic trong huyết tương nên để sử dụng gian lưu (RSD ≤ 1%) và 0,52% với diện tích pic fluconazol làm chất chuẩn nội cần điều chỉnh (RSD ≤ 2%) đạt yêu cầu. pha động để các chất đều rửa giải chậm hơn. Tính chọn lọc Khi đó, pic VCZ doãng và kém cân xứng hơn Phân tích 6 mẫu huyết tương trắng có nguồn dẫn đến độ lặp lại của diện tích pic kém đi. gốc khác nhau và 6 mẫu chuẩn trong huyết Ketoconazol (KTZ) rửa giải chậm hơn VCZ tương chứa VCZ ở nồng độ 0,5 µg/mL (LLOQ). nhưng vẫn ở thời gian lưu không quá dài (pic Kết quả nhận thấy trên sắc ký đồ mẫu huyết KTZ ở 7,7 phút trong sắc đồ hình 2a). Tuy nhiên, tương trắng, không xuất hiện pic tại thời gian pic KTZ lại có đáp ứng không lặp lại tốt như lưu của VCZ và sắc ký đồ huyết tương trắng VCZ nên độ lặp lại của phương pháp khi định thêm VCZ, xuất hiện pic của VCZ (tR = 8,0 phút) lượng sử dụng chất chuẩn nội lại thấp hơn khi và tách khỏi các pic nền huyết tương trắng không có chất chuẩn nội. Mặt khác, kết quả (RS > 1,5), độ tinh khiết của pic sắc ký đạt thẩm định sơ bộ cho thấy độ lặp lại của phương 0,9995. Tiến hành chồng phổ hấp thụ UV của pháp khá tốt ngay cả khi không sử dụng chất pic VCZ của mẫu chuẩn trong huyết tương với chuẩn nội. Với một phương pháp định lượng phổ hấp thụ UV pic VCZ trong nước thì thấy phổ thuốc trong huyết tương, sự khác biệt giữa các tương đồng, hệ số chồng phổ 99,99%. Tại thời cá thể đã là quá lớn nên yêu cầu về độ lặp lại điểm trùng với thời gian lưu VCZ, đáp ứng của không cao như với các phương pháp định mẫu LLOQ đều lớn hơn 5 lần so với mẫu HTT lượng thuốc trong chế phẩm. Đặc biệt, với một tương ứng. ứng dụng như TDM, yêu cầu có kết quả nhanh Khoảng tuyến tính là rất cần thiết để có thể kịp thời điều chỉnh liều Kết quả phân tích các dung dịch chuẩn trong điều trị nên phương pháp phân tích cần phải huyết tương ở 6 nồng độ khác nhau trong càng đơn giản càng tốt. Việc tìm kiếm một chất khoảng 0,5 - 12,5 µg/ml cho thấy có mối quan chuẩn nội khác có lẽ là không cần thiết vì sẽ gây hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ VCZ tốn kém và phức tạp thêm cho phương pháp trong khoảng khảo sát, với R2 > 0,999 (phương phân tích. trình hồi quy: y = 20,55x - 3,531) và giá trị độ hẩm định phương pháp chệch Δi không vượt quá 15% ở các nồng độ Tính ph hợp của hệ thống thấp, trung bình và cao (1,66 - 5,66%); riêng ở Tiêm lặp lại 6 lần mẫu chuẩn VCZ có nồng nồng độ LLOQ nằm trong khoảng giới hạn 20% độ 10 μg/mL, RSD thu được là 0,50% với thời (16,85%). HTT (C) TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022 37
LLOQ (D) Hình 4. SKĐ mẫu HTT (C), mẫu LLOQ (0,5 µg/mL) (D) Giới hạn định lượng dưới LLOQ (10 μg/mL), mỗi lô gồm 5 mẫu độc lập và phân Phân tích 6 mẫu HTT và 6 mẫu chuẩn trong tích trong cùng 1 ngày và lặp lại quy trình tương huyết tương chứa VCZ 0,5 µg/ml. Kết quả cho tự trong 3 ngày khác nhau. Kết quả với LQC, thấy tại thời gian lưu của VCZ, mẫu chuẩn VCZ MQC, HQC đạt yêu cầu theo US-FDA: Độ đúng 0,5 µg/ml có đáp ứng pic lớn hơn 5 lần đáp ứng 86,7 - 113,2% (giới hạn 85 - 115%), và CV% pic của mẫu huyết tương trắng, độ đúng từ 92,8 0,907 - 9,740% ( 15%). Mẫu LLOQ có độ đúng - 104,6% ( yêu cầu 80 - 120%) và độ lặp lại có trong 85,5 - 110,2% (giới hạn 80 - 120%) và RSD = 4,538% (≤ 20%). Vậy nồng độ VCZ CV% 3,35 - 8,18% ( 20%). Mặt khác, độ chính 0,5 µg/ml đạt yêu cầu giới hạn định lượng dưới xác giữa 3 ngày có CV% giữa các lần định của phương pháp. lượng của mỗi nồng độ nồng độ thấp, trung bình, Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác cao 2,66 - 6,48% ( 15%) và với LLOQ 7,23% ngày ( 20%). Như vậy, độ đúng đáp ứng theo tiêu Phân tích các lô mẫu LLOQ (0,5 μg/mL), chuẩn của FDA. Kết quả thể hiện ở bảng 1. LQC (1 μg/mL), MQC (5μg/mL), HQC Bảng 1. Kết quả độ đúng, độ chính xác khác ngày LLOQ LQC MQC HQC (0,5 μg/mL) (1 μg/mL) (5 μg/mL) (10 μg/mL) Ngày Mẫu Độ Độ Độ Độ Nồng độ (a) Nồng độ (a) Nồng độ (a) Nồng độ (a) đúng đúng đúng đúng (μg/mL) (μg/mL) (μg/mL) (μg/mL) (%) (%) (%) (%) 1 0,534 106,8 0,948 94,8 5,141 102,8 9,80 98,0 2 0,487 97,4 0,867 86,7 4,949 99,0 10,16 101,6 3 0,500 100,0 1,000 100,0 4,808 96,2 9,94 99,4 4 0,551 110,2 1,132 113,2 4,881 97,6 9,92 99,2 1 5 0,496 99,1 1,000 100,0 4,889 97,8 9,82 98,2 TB 0,514 102,7 0,989 98,9 4,934 98,7 9,93 99,3 CV (%) 5,368 9,740 2,560 1,428 Phương trình hồi quy: y =23,41x - 0,010; R2 = 0,999 38 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022
1 0,445 88,9 0,927 92,7 5,239 104,8 10,04 100,4 2 0,524 104,8 0,915 91,5 5,256 105,1 9,66 96,6 3 0,456 91,2 0,938 93,8 5,500 110,0 10,38 103,8 4 0,445 88,9 0,927 92,7 5,477 109,5 9,64 96,4 2 5 0,427 85,5 0,932 93,2 5,188 103,8 10,25 102,5 TB 0,459 91,9 0,928 92,8 5,332 106,6 9,99 99,9 CV (%) 8,176 0,907 2,726 3,396 2 Phương trình hồi quy: y = 17,62x - 0,565 ; R = 0,998 1 0,464 92,8 0,906 90,6 5,267 105,3 9,63 96,3 2 0,488 97,6 0,947 94,7 5,090 101,8 9,54 95,4 3 0,505 101,1 0,953 95,3 5,337 106,7 9,63 96,3 4 0,482 96,4 1,006 100,6 5,343 106,9 9,89 98,9 3 5 0,470 94,0 1,006 100,6 5,279 105,6 10,23 102,3 TB 0,482 96,4 0,964 96,4 5,263 105,3 9,784 97,8 CV (%) 3,349 4,438 1,951 2,875 Phương trình hồi quy: y = 16,97x - 2,277 ; R2 = 0,994 TB 3 ngày 0,485 97,0 0,960 96,0 5,176 103,5 9,902 99,0 CV 3 ngày (%) 7,226 6,483 4,142 2,663 (a) : Nồng độ tìm lại theo đường chuẩn cùng ngày. Kết quả với LQC, MQC, HQC đạt yêu cầu tỷ lệ thu hồi VCZ ở LQC, MQC và HQC lần lượt theo US-FDA: Độ đúng 86,7 - 113,2% (giới hạn là 86,6% 103,5% và 101,8% đều nằm trong giới 85 - 115%), và CV% 0,907 - 9,740% ( 15%). hạn cho phép của FDA (≤ 15% ) với CV 1,72 - Mẫu LLOQ có độ đúng trong 85,5 - 110,2% (giới 7,68%. hạn 80 - 120%) và CV% 3,35 - 8,18% ( 20%). Độ ổn định Mặt khác, độ chính xác giữa 3 ngày có CV% Chuẩn bị các lô chuẩn VCZ trong huyết giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ nồng tương LQC (1 μg/mL) và HQC (10 μg/mL), mỗi độ thấp, trung bình, cao 2,66 - 6,48% ( 15%) lô 3 mẫu độc lập để xác định độ ổn định của và với LLOQ 7,23% ( 20%). Như vậy độ đúng mẫu chuẩn trong huyết tương sau thời gian đáp ứng theo tiêu chuẩn của FDA. ngắn ở nhiệt độ phòng; sau 3 chu kỳ đông - rã Tỷ lệ thu hồi của chất phân tích đông sau thời gian bảo quản dài ngày ở tủ lạnh Phân tích các lô mẫu chuẩn VCZ nồng độ 1; âm sâu (-80°C) trong 7, 14, 21 ngày; mẫu sau 5; 10 μg/mL trong huyết tương, mỗi lô 5 mẫu khi xử lý mẫu và bảo quản 2-8°C trong vòng 24 độc lập đã qua quá trình xử lý mẫu và các lô giờ. Phân tích các lô mẫu theo điều kiện sắc ký mẫu chuẩn có nồng độ VCZ tương ứng trong đã thiết lập, nồng độ tìm lại theo đường chuẩn dung dịch nhưng không qua xử lý mẫu. Kết quả cùng ngày. Các kết quả được thể hiện ở bảng 2. TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022 39
Bảng 2. Thẩm định độ ổn định ở các điều kiện khác nhau LQC (1 μg/mL) HQC (10 μg/mL) Điều kiện thử độ ổn định CV % Chênh lệch (%) CV % Chênh lệch (%) Sau 6 giờ ở nhiệt độ phòng 5,759 0,62- 8,71 2,246 1,01- 1,30 Sau 3 chu kỳ đông - rã đông 6,049 0,80- 4,23 0,782 1,22- 3,67 Sau 7 ngày ở -80°C 3,162 3,22- 7,77 2,060 1,91- 8,86 Sau 14 ngày ở -80°C 2,919 0,18- 6,48 3,121 0,87- 3,39 Sau 21 ngày ở -80°C 3,736 9,05- 9,91 1,351 0,97- 2,72 Sau 24 giờ ở 2 - 8°C 5,635 0,05- 1,36 3,698 1,98- 3,18 Các mẫu LQC và HQC có độ lặp lại giữa các cột sắc ký, gây nhiễu đường nền thậm chí tắc mẫu tốt (CV < 15%) và độ chênh lệch nồng độ cột, ảnh hưởng đến quá trình phân tích. So tìm lại với nồng độ ban đầu đều < 15%, nằm sánh với kỹ thuật chiết lỏng - lỏng [5,9], sau khi trong giới hạn cho phép của US-FDA. chiết với dung môi hữu cơ bay hơi dung môi và Ngoài ra, phân tích dung dịch chuẩn VCZ hòa tan cắn, quá trình chuẩn bị mẫu phức tạp, 1 μg/mg và 10 μg/mL từ dung dịch chuẩn gốc, kéo dài. Việc lựa chọn không sử dụng chất mỗi lô 3 mẫu độc lập tại thời điểm ngay sau xử chuẩn nội mà vẫn cho phương pháp có độ lặp lý mẫu và sau 6 giờ bảo quản ở nhiệt độ phòng. lại đạt yêu cầu cũng là một ưu thế của phương Kết quả cho thấy nồng độ VCZ mới pha và sau pháp để giữ cho phương pháp đơn giản nhất có 6 giờ có chênh lệch 0 - 1,564% (< 2%). Như vậy, thể, phù hợp với ứng dụng trong TDM để hiệu dung dịch chuẩn gốc ổn định sau 6 giờ bảo chỉnh liều kịp thời. Mặt khác, lượng MeCN trong quản ở nhiệt độ phòng. pha động sử dụng ở tỉ lệ thấp, tiết kiệm dung Kết luận môi. Phương pháp xây dựng có khoảng nồng Phương pháp phân tích có tính chọn lọc, độ độ định lượng là 0,5 - 12,5 μg/mL phù hợp để lặp lại tốt, độ đúng, độ chính xác cao, giới hạn ứng dụng trong TDM cho VCZ, với nồng độ đáy định lượng dưới thấp, tỷ lệ thu hồi cao, độ ổn của VCZ là 1,0 - 5,5 μg/mL. Với khoảng nồng độ định của mẫu trong huyết tương ở các điều kiện định lượng phù hợp, thời gian phân tích hợp lý, khác nhau đều đáp ứng các tiêu chí thẩm định phương pháp đơn giản và thiết bị khá phổ biến, phương pháp phân tích trong dịch sinh học theo phương pháp đã xây dựng có tính khả thi trong hướng dẫn của US-FDA. việc ứng dụng định lượng nồng độ VCZ trong Kết luận và đề xuất huyết tương trong thực tế, phục vụ giám sát Nghiên cứu đã xây dựng được phương pháp điều trị bằng VCZ nhằm cải thiện hiệu quả điều định lượng VCZ trong huyết tương bằng HPLC- trị cũng như giảm nguy cơ độc tính trên gan, UV. Phương pháp được thẩm định theo hướng thần kinh và giảm tỷ lệ ngừng VCZ do biến cố dẫn US-FDA cho thấy độ tin cậy, chính xác và bất lợi. độ đúng đảm bảo, với cách tiến hành đơn giản. Tài liệu tham khảo Một kỹ thuật xử lý mẫu đơn giản, có tính thực 1. Theuretzbacher U., Ihle F., et al. tiễn cao, hiệu suất chiết chất phân tích với tỷ lệ (2006), "Pharmacokinetic/ pharmacodynamic thu hồi cao và ổn định. So sánh với kỹ thuật tủa profile of voriconazole", Clinical protein trong các nghiên cứu [8,11], mẫu sau xử lý Pharmacokinetics, 45 (7), pp. 649 - 663. còn chứa nhiều tạp chất làm giảm tuổi thọ của 2. Lazarus H. M., Blumer J. L., et al. (2002), 40 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022
"Safety and pharmacokinetics of oral 26, pp. 650-657. voriconazole in patients at risk of fungal infection: 7. FDA (2018), Bioanalytical method A dose escalation study", J. Clin. Pharmacol, 42 validation guidance for industry. (4), pp. 395 - 402. 8. Chawla P. K., Dherai A. J., et al. (2015), 3. Park W. B., Kim N. H., et al. (2012), "The "Plasma voriconazole estimation by HPLC", Ind. effect of therapeutic drug monitoring on safety J. Clin. Biochem., 31 (2), pp. 209 - 214. and efficacy of Voriconazole in invasive fungal 9. Chhun S., Rey E., et al. (2007), infections: A randomized controlled trial", Clin. "Simultaneous quantification of voriconazole Infect. Dis., 55 (8), pp. 1080-1087. and posaconazole in human plasma by high- 4. Michael C., Teichert J., et al. (2008), performance liquid chromatography with ultra- "Determination of voriconazole in human plasma violet detection", Journal of Chromatography B, and saliva using high - performance liquid 852 (1-2), pp. 223-228. chromatography with fluorescence detection", 10. Khoschsorur G., Fruehwirth F., et al. J. Chromatogr. B: Analyt. Technol. Biomed. Life. (2005), "Isocratic high - performance liquid Sci., 865, pp. 74-80. chromatographic method with ultraviolet 5. Langman L. J., Agyeman F. B., et al. detection for simultaneous determination of (2007), "Measurement of voriconazole in serum levels of voriconazole and itraconazole and its and plasma", Clinical Biochemistry, 40 (18), pp. hydroxy metabolite in human serum", Antimicrob 1378 - 1385. Agents Chemother, 49 (8), pp. 3569-3571. 6. Keevil B. G., Newman S., et al. (2004), 11. Tang P. H. (2013), "Quantification of "Validation of an assay for voriconazole in antifungal drug voriconazole in serum and serum samples using liquid chromatography- plasma by HPLC-UV", J. Drug Metab. Toxicol., tandem mass spectrometry", Ther. Drug. Monit., 4, pp. 144. TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022 41