Nuôi cấy tăng sinh tế bào TCD8 ở bệnh nhân ung thư phổi

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> NUÔI CẤY TĂNG SINH TẾ BÀO TCD8<br /> Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI<br /> Vũ Văn Quý, Trần Huy Thịnh, Nguyễn Quý Linh,<br /> Nguyễn Thanh Bình, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Liệu pháp miễn dịch sử dụng tế bào lympho tự thân là một trong những liệu pháp điều trị kết hợp an toàn<br /> và khá hiệu quả cho nhiều loại ung thư hiện nay, trong đó có ung thư phổi. Mục đích của nghiên cứu là hoàn<br /> thiện quy trình tách chiết, nuôi cấy và hoạt hóa tế bào TCD8 từ bệnh nhân ung thư phổi. 10 bệnh nhân ung<br /> thư phổi được lựa chọn vào nghiên cứu, mỗi bệnh nhân được thu thập 10 ml máu chống đông trong heparin,<br /> tiến hành tách chiết, nuôi cấy, hoạt hóa và đánh giá. Kết quả nghiên cứu cho thấy số lượng tế bào bạch cầu<br /> đơn nhân tách được từ 10ml máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư phổi trung bình là (5,13 ± 2,97) x 106 tế<br /> bào. Số lượng tế bào trung bình thu được sau nuôi cấy là (3,9 ± 1,45) x 109 tế bào, tỷ lệ sống trung bình đạt<br /> 90,37% ± 1,88%. Trong đó, tỷ lệ tế bào TCD4 chiếm 22,1% ± 9,59 %, TCD8 chiếm 66,11% ± 11,02%.<br /> Không phát hiện thấy sự có mặt của vi khuẩn, mycoplasma và nội độc tố trong môi trường sau nuôi cấy.<br /> Từ khóa: Liệu pháp tế bào miễn dịch, tế bào TCD8, ung thư phổi<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> đặc biệt rồi truyền trở lại các tế bào này vào<br /> Ung thư phổi là một trong những bệnh ung<br /> <br /> cơ thể của chính bệnh nhân. Có nhiều dòng tế<br /> <br /> thư phổ biến nhất về tỷ lệ mắc là nguyên nhân<br /> <br /> bào được phân tách và sử dụng trong liệu<br /> <br /> tử vong hàng đầu do ung thư trên thế giới và<br /> <br /> pháp này như tế bào lympho T hỗ trợ (TCD4)<br /> <br /> ở Việt Nam [1]. Tuy đã có nhiều tiến bộ trong<br /> <br /> và tế bào lympho T gây độc (TCD8), tế bào<br /> <br /> chẩn đoán và điều trị, song ung thư phổi vẫn<br /> <br /> tua (Dendritic cells- DC), tế bào diệt tự nhiên<br /> <br /> là một trong những ung thư có tiên lượng xấu<br /> <br /> (Natural killer cells-NK) [5; 6]. Các tế bào<br /> <br /> hiện nay với tỷ lệ sống thêm sau 5 năm của<br /> <br /> TCD8 được cho là đóng vai trò trung tâm<br /> <br /> bệnh nhân ung thư phổi nói chung chỉ ở mức<br /> <br /> trong đáp ứng miễn dịch chống ung thư còn<br /> <br /> 18% [2]. Do đó, việc phát triển các phương<br /> <br /> các tế bào TCD4 đóng vai trò quan trọng trong<br /> <br /> pháp điều trị hiệu quả mới là điều hết sức cần<br /> <br /> việc duy trì chức năng của các tế bào T gây<br /> <br /> thiết. Trên thế giới hiện nay, liệu pháp sử<br /> <br /> độc [7]. Các tế bào Lympho T có thể được<br /> <br /> dụng tế bào miễn dịch đã được phát triển để<br /> <br /> nuôi cấy, hoạt hóa trong môi trường được bổ<br /> <br /> điều trị nhiều loại ung thư, bao gồm cả ung<br /> <br /> sung huyết thanh, các cytokine và một số yếu<br /> <br /> thư phổi với những kết quả ban đầu đầy hứa<br /> <br /> tố kích thích khác như kháng thể kháng CD3/<br /> <br /> hẹn [3; 4]. Trong liệu pháp này, các tế bào<br /> <br /> CD28 để tăng số lượng cũng như khả năng<br /> <br /> miễn dịch được tách từ máu ngoại vi của<br /> <br /> nhận diện và tiêu diệt tế bào ung thư. Kể từ<br /> <br /> người bệnh, nuôi cấy tăng sinh và hoạt hóa<br /> <br /> khi được công bố lần đầu tiên vào năm 1982<br /> <br /> một hoặc nhiều loại tế bào trong môi trường<br /> <br /> đến nay đã có nhiều quy trình nuôi cấy hoạt<br /> hóa tế bào lympho tách từ bệnh nhân ung thư<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Tạ Thành Văn, Trung tâm nghiên cứu Gen<br /> -Protein, Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Email: tathanhvan@hmu.edu.vn<br /> Ngày nhận: 18/9/2018<br /> Ngày được chấp thuận: 11/10/2018<br /> <br /> 8<br /> <br /> phổi được xây dựng, các tác giả đã đi xa hơn<br /> và đánh giá hiệu quả điều trị của liệu pháp sử<br /> dụng tế bào lympho T thẩm quyền miễn dịch<br /> trên bệnh nhân. Nhiều thử nghiệm lâm sàng<br /> <br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> sử dụng tế bào lympho kết hợp với hóa chất,<br /> <br /> Kỹ thuật nuôi cấy hoạt hóa tế bào lympho:<br /> <br /> xạ trị ở bệnh nhân ung thư phổi cho thấy hiệu<br /> <br /> Sau khi tách chiết, các tế bào được nuôi cấy<br /> <br /> quả đáng kể trong việc kéo dài thời gian sống<br /> <br /> trong môi trường RPMI 1640 chứa 10% huyết<br /> <br /> thêm của bệnh nhân đồng thời chất lượng<br /> <br /> thanh người có bổ sung thêm các cytokin IL-2<br /> <br /> cuộc sống của bệnh nhân được cải thiện rõ<br /> <br /> (nồng độ 10 U/L). Khi các tế bào ổn định, đạt<br /> <br /> rệt [8 - 10]. Hiện tại, Việt Nam vẫn đang trong<br /> <br /> mật độ nuôi cấy cần thiết (70 - 80%), sẽ được<br /> <br /> giai đoạn tiếp cận với liệu pháp tế bào miễn<br /> <br /> chuyển sang các điều kiện nuôi cấy hoạt hóa<br /> <br /> dịch trong điều trị ung thư và chưa có nhiều<br /> <br /> và biệt hóa có bổ sung kháng thể kháng CD3<br /> <br /> công trình nghiên cứu được công bố trong lĩnh<br /> <br /> và CD28. Tổng thời gian nuôi cấy và hoạt hóa<br /> <br /> vực này. Do đó, nghiên cứu được tiến hành<br /> <br /> tế bào lympho là 14 ngày.<br /> <br /> với mục tiêu áp dụng và hoàn thiện quy trình<br /> tách chiết, nuôi cấy hoạt hóa tế bào TCD8 trên<br /> bệnh nhân ung thư phổi.<br /> <br /> Kỹ thuật phân loại tế bào nuôi cấy bằng<br /> Flow-Cytometry<br /> Dựa trên sự biểu hiện của các marker đặc<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Đối tượng<br /> <br /> hiệu trên bề mặt tế bào tương ứng với mỗi<br /> giai đoạn hoạt hóa và biệt hóa của mỗi loại tế<br /> bào lympho. Các marker được sử dụng là:<br /> <br /> 10 bệnh nhân (6 nam, 4 nữ) ung thư phổi<br /> <br /> CD3, CD4, CD8, CD19, CD56. Các tế bào<br /> <br /> không tế bào nhỏ nguyên phát, giai đoạn III (5<br /> <br /> lympho được nhuộm với kháng thể kháng<br /> <br /> bệnh nhân), IV (5 bệnh nhân) được lựa chọn<br /> <br /> marker đặc hiệu tế bào cho từng giai đoạn<br /> <br /> vào nghiên cứu. Bệnh nhân ≥ 18 tuổi, toàn<br /> <br /> hoạt hóa và biệt hóa của mỗi loại tế bào và<br /> <br /> trạng ECOG ≤ 3.<br /> <br /> được đếm trên máy đếm dòng chảy tế bào BD<br /> <br /> Các bệnh nhân có bệnh lý tự miễn, dùng<br /> thuốc ức chế miễn dịch, bệnh lý mãn tính kết<br /> hợp, bệnh lý ác tính dòng tế bào lympho T sẽ<br /> bị loại trừ khỏi nghiên cứu này.<br /> <br /> FACS Canto II.<br /> Phương pháp xác định tỷ lệ tế bào sống sử<br /> dụng Trypan blue<br /> Tế bào sau khi tách chiết từ máu ngoại vi<br /> <br /> 2. Phương pháp<br /> <br /> và sau nuôi cấy được nhuộm với Trypan blue<br /> <br /> 2.1. Phương pháp thu thập mẫu<br /> <br /> sống, chết.<br /> <br /> 10 ml máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư<br /> phổi được lấy vào ống chống đông heparin,<br /> <br /> Phương pháp đánh giá khả năng nhiễm vi<br /> sinh vật và vi nấm<br /> <br /> bảo quản ở nhiệt độ phòng và được xử lý<br /> <br /> - Kiểm tra vi khuẩn trong môi trường nuôi<br /> <br /> trong vòng 6 giờ.<br /> 2.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên<br /> cứu<br /> Kỹ thuật phân tách tế bào lympho từ máu<br /> ngoại vi: Các tế bào miễn dịch được tách<br /> bằng phương pháp ly tâm thay đổi tỷ trọng sử<br /> dụng Ficoll [11].<br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br /> để đếm số lượng và xác định tỷ lệ tế bào<br /> <br /> cấy sử dụng môi trường nuôi cấy tăng sinh vi<br /> khuẩn Thioglycollate medium (BD Bioscience,<br /> USA).<br /> - Kiểm tra độc tố Endotoxin trong môi<br /> trường nuôi cấy bằng bộ KIT E-TOXATE.<br /> - Kiểm tra mycoplasma trong môi trường<br /> nuôi cấy bằng bộ KIT Mycosensor.<br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 3. Đạo đức nghiên cứu<br /> Nghiên cứu này thuộc đề tài cấp Bộ “Tiếp nhận và nghiên cứu phát triển công nghệ nền tế<br /> bào miễn dịch trong điều trị ung thư từ Nhật Bản về Việt Nam” đã được đồng ý thông qua giai<br /> đoạn thử nghiệm trên người tình nguyện khoẻ mạnh và bệnh nhân ung thư bởi Hội đồng đạo đức<br /> của Trường Đại học Y Hà Nội (số 128/HĐĐĐ-ĐHYHN ngày 20/9/2017).<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> 1. Số lượng tế bào bạch cầu thu được sau tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân ung<br /> thư phổi<br /> Bảng 1. Đặc điểm tế bào thu được sau tách chiết từ máu ngoại vi<br /> Mẫu<br /> <br /> Số lượng tế bào thu được<br /> <br /> Tỷ lệ sống (%)<br /> <br /> % Lympho T<br /> <br /> MS01<br /> <br /> 2,04 x 106<br /> <br /> 97,42<br /> <br /> 80,39<br /> <br /> MS02<br /> <br /> 0,5 x 106<br /> <br /> BN01<br /> <br /> 96,54<br /> <br /> 84,39<br /> <br /> 6<br /> <br /> 97,47<br /> <br /> 50,5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 93,86<br /> <br /> 58,8<br /> <br /> 6<br /> <br /> 96,98<br /> <br /> 58,8<br /> <br /> 6<br /> <br /> 8,34 x 10<br /> <br /> BN02<br /> <br /> 2,16 x 10<br /> <br /> BN03<br /> <br /> 3,54 x 10<br /> <br /> BN08<br /> <br /> 9,18 x 10<br /> <br /> 98,55<br /> <br /> 46,2<br /> <br /> BN10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 6,8 x 10<br /> <br /> 97,32<br /> <br /> 68,2<br /> <br /> BN16<br /> <br /> 7,02 x 106<br /> <br /> 98,7<br /> <br /> 54,6<br /> <br /> BN20<br /> <br /> 4,64 x 106<br /> <br /> 96,71<br /> <br /> 58,4<br /> <br /> BN23<br /> <br /> 7,08 x 106<br /> <br /> 98,26<br /> <br /> 65,1<br /> <br /> (5,13 ± 2,97) x 106<br /> <br /> 97,18 ± 1,38<br /> <br /> 62,54 ± 12,27<br /> <br /> X ± SD<br /> <br /> Số lượng tế bào bạch cầu tách được từ 10 ml máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư phổi trung<br /> bình là (5,13 ± 2,97) x 106. Trong đó, tế bào lympho T chiếm đa số với tỷ lệ 62,54 ± 12,27 %. Tỷ<br /> lệ tế bào sống đạt 97,18 ± 1,38 %.<br /> 2. Số lượng tế bào bạch cầu thu được sau nuôi cấy tế bào tách tách từ máu ngoại vi<br /> bệnh nhân ung thư phổi.<br /> Số lượng tế bào trung bình thu được sau nuôi cấy là (3,9 ± 1,45) x 109, tỷ lệ sống đạt 90,3 ±<br /> 1,88 %. So sánh với trước khi nuôi cấy, tế bào nhân lên từ 396 đến 2000 lần, trung bình là<br /> 1175,3 lần (bảng 2).<br /> <br /> 10<br /> <br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bảng 2. Đặc điểm tế bào thu được sau nuôi cấy hoạt hóa<br /> Mẫu<br /> <br /> Số lượng tế bào thu được<br /> <br /> Tỷ lệ sống (%)<br /> <br /> Hệ số nhân lên<br /> <br /> MS01<br /> <br /> 5,8 x 109<br /> <br /> 92,13<br /> <br /> 2843<br /> <br /> MS02<br /> <br /> 1,0 x 109<br /> <br /> 87,4<br /> <br /> 2000<br /> <br /> BN01<br /> <br /> 3,3 x 109<br /> <br /> 87,21<br /> <br /> 396<br /> <br /> BN02<br /> <br /> 4,04 x 109<br /> <br /> 90,44<br /> <br /> 1870<br /> <br /> BN03<br /> <br /> 6,22 x 109<br /> <br /> 93,24<br /> <br /> 1757<br /> <br /> BN08<br /> <br /> 3,2 x 109<br /> <br /> 90,53<br /> <br /> 349<br /> <br /> BN10<br /> <br /> 3,71 x 109<br /> <br /> 90,98<br /> <br /> 546<br /> <br /> BN16<br /> <br /> 3,36 x 109<br /> <br /> 90,23<br /> <br /> 479<br /> <br /> BN20<br /> <br /> 4,4 x 109<br /> <br /> 91,4<br /> <br /> 948<br /> <br /> BN23<br /> <br /> 4,0 x 109<br /> <br /> 90,13<br /> <br /> 565<br /> <br /> X ± SD<br /> <br /> (3,9 ± 1,45) x 109<br /> <br /> 90,37 ± 1,88%<br /> <br /> 1175,3 ± 874,16<br /> <br /> 3. Kết quả đánh giá marker bề mặt của các tế bào thu được sau nuôi cấy tế bào tách từ<br /> máu ngoại vi bệnh nhân ung thư phổi<br /> Bảng 3. Tỷ lệ các quần thể tế bào thu được sau nuôi cấy hoạt hóa<br /> <br /> Mẫu<br /> <br /> Tỷ lệ các quần thể tế bào (%)<br /> CD3+<br /> <br /> CD3+CD8+<br /> <br /> CD3+CD4+<br /> <br /> CD19+<br /> <br /> CD16+CD56+<br /> <br /> MS01<br /> <br /> 98,03<br /> <br /> 55,24<br /> <br /> 33,92<br /> <br /> 4,75<br /> <br /> 0,81<br /> <br /> MS02<br /> <br /> 92,51<br /> <br /> 48,88<br /> <br /> 35,74<br /> <br /> 0,12<br /> <br /> 3,44<br /> <br /> BN01<br /> <br /> 97,9<br /> <br /> 65,0<br /> <br /> 31,0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> BN02<br /> <br /> 98,8<br /> <br /> 87,0<br /> <br /> 11,0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> BN03<br /> <br /> 97,9<br /> <br /> 74,0<br /> <br /> 21,0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 1,0<br /> <br /> BN08<br /> <br /> 98,62<br /> <br /> 74,17<br /> <br /> 23,75<br /> <br /> 0,01<br /> <br /> 1,03<br /> <br /> BN10<br /> <br /> 95,8<br /> <br /> 56,1<br /> <br /> 9,76<br /> <br /> 0<br /> <br /> 4,0<br /> <br /> BN16<br /> <br /> 95,15<br /> <br /> 69,38<br /> <br /> 24,98<br /> <br /> 0<br /> <br /> 4,39<br /> <br /> BN20<br /> <br /> 95,6<br /> <br /> 64,76<br /> <br /> 18,91<br /> <br /> 0,03<br /> <br /> 7,65<br /> <br /> BN23<br /> <br /> 82,85<br /> <br /> 66,58<br /> <br /> 10,91<br /> <br /> 0<br /> <br /> 16.83<br /> <br /> X ± SD<br /> <br /> 95,32 ± 4,80<br /> <br /> 66,11 ± 11,02<br /> <br /> 22,01 ± 9,59<br /> <br /> 0,49 ± 1,5<br /> <br /> 4,22 ± 4,98<br /> <br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br /> 11<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Các tế bào thu được sau nuôi cấy chủ yếu là lympho T với tỷ lệ 95,32 ± 4,80% và một tỷ lệ<br /> nhỏ các tế bào NK (?): 4,22 ± 4,98%. Trong đó, quần thể tế bào TCD8 chiếm đa số với 66,11 ±<br /> 11,02%, TCD4 chiếm 22,01 ± 9,59%.<br /> 4. Đánh giá tính an toàn của tế bào miễn dịch sau nuôi cấy<br /> Không phát hiện thấy sự có mặt của vi khuẩn, mycoplas và endotoxin trong các môi trường<br /> sau nuôi cấy tế bào.<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> Trên thế giới hiện nay, liệu pháp miễn dịch<br /> sử dụng tế bào lympho T thích ứng (Adoptive<br /> <br /> pho và bạch cầu đơn nhân khác nằm ở trên<br /> lớp Ficoll. Thu hoạch lớp tế bào ở trên lớp<br /> Ficoll rất giàu tế bào Lympho.<br /> <br /> T cell therapy) mà chủ yếu là các lympho<br /> <br /> Trong quần thể tế bào thu được, tế bào<br /> <br /> TCD8 đã có những tiến bộ vượt bậc và đang<br /> <br /> Lympho chiếm đa số với tỷ lệ trung bình<br /> <br /> trở thành hướng tiếp cận chính cho điều trị<br /> <br /> > 60%. Số lượng tế bào của các mẫu sau khi<br /> <br /> nhiều loại ung thư hiện nay trong đó có ung<br /> <br /> tách đều ≥ 4 x 106 tế bào, riêng mẫu bệnh<br /> <br /> thư phổi. Nhiều quy trình nuôi cấy và hoạt hóa<br /> <br /> nhân mã số BN02, do vừa trải qua 1 giai đoạn<br /> <br /> tế bào lympho T đã được thiết lập và đưa vào<br /> <br /> điều trị bằng hóa chất nên số lượng tế bào<br /> <br /> sử dụng dựa vào vị trí thu nhận tế bào cho<br /> <br /> tách được thấp hơn so với các mẫu còn lại.<br /> <br /> điều trị. Trong đó, liệu pháp sử dụng tế bào<br /> <br /> Tất cả các mẫu đều đạt tỷ lệ sống của tế bào<br /> <br /> lympho T tách chiết từ máu ngoại vi (CTL ther-<br /> <br /> trên 90%.<br /> <br /> apy) là một phương pháp có nhiều ưu điểm<br /> <br /> Các tế bào lympho T tách chiết từ máu<br /> <br /> như ít xâm lấn, ít ảnh hưởng đến quá trình<br /> <br /> ngoại vi phần lớn không tiếp xúc trực tiếp với<br /> <br /> sinh hoạt, công việc của bệnh nhân. 10 ml<br /> <br /> các tế bào ung thư do đó chúng có thể ở trạng<br /> <br /> máu tĩnh mạch bệnh nhân được thu thập vào<br /> <br /> thái chưa hoạt hoá và ít có tính đặc hiệu với<br /> <br /> ống chống đông EDTA để tách chiết tế bào<br /> <br /> kháng nguyên ung thư cũng như không đủ số<br /> <br /> lympho sử dụng cho nuôi vấy. Trong nghiên<br /> <br /> lượng cần thiết cho điều trị. Chính vì vậy, sau<br /> <br /> cứu này, phương pháp ly tâm thay đổi tỷ trọng<br /> <br /> khi được thu thập, các tế bào lympho T được<br /> <br /> sử dụng Ficoll được sử dụng để tách chiết các<br /> <br /> nuôi cấy tăng sinh hoạt hóa và tăng độ mẫn<br /> <br /> tế bào lympho. Đây là phương pháp hiệu quả<br /> <br /> cảm với các tế bào ung thư [12]. Bên cạnh đó,<br /> <br /> với số lượng tế bào thu được, tỷ lệ sống và<br /> <br /> nhằm tăng sinh các tế bào lympho T đạt số<br /> <br /> chức năng của tế bào sau khi tách chiết cao<br /> <br /> lượng lớn đủ cho điều trị, đồng thời vẫn bảo<br /> <br /> hơn các phương pháp khác. Nguyên lý của<br /> <br /> toàn được các đặc tính, chức năng miễn dịch<br /> <br /> phương pháp ly tâm thay đổi tỷ trọng sử dụng<br /> <br /> của tế bào, môi trường nuôi cấy tế bào cần<br /> <br /> Ficoll dựa vào tỷ trọng của Ficoll và tỷ trọng<br /> <br /> phải bổ sung thêm các cytokin như IL-2, IL-15<br /> <br /> của tế bào máu: tỷ trọng của Ficoll là 1,077,<br /> <br /> và IL-21. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử<br /> <br /> cao hơn tỷ trọng của bạch cầu lympho nhưng<br /> <br /> dụng kháng thể kháng CD3/CD28 và bổ sung<br /> <br /> lại thấp hơn tỷ trọng của hồng cầu và bạch<br /> <br /> thêm IL-2. Việc gắn kết của kháng thể kháng<br /> <br /> cầu hạt. Khi ly tâm, hồng cầu và bạch cầu hạt<br /> <br /> CD3 với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào<br /> <br /> lắng xuống đáy ống ly tâm, còn bạch cầu lym-<br /> <br /> kích thích hoạt hoá tế bào không phụ thuộc<br /> <br /> 12<br /> <br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br />