Phát hiện đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A

TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN F8 GÂY BỆNH HEMOPHILIA A<br /> Lưu Vũ Dũng, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, Nguyễn Đức Hinh, Trần Vân Khánh<br /> Trư ng h YH N<br /> <br /> H h nh r n ng tr n n tr n nh th g t nh g r t n tr n<br /> g n t n t nh 1 5000 tr tr Ch nn r t nh ngh n t ng n ư<br /> g h nh tN hư ngh n n t n n ng t n ư ng<br /> t ngh n ư th h n nh nh ng t n tr n g n nh nh n h h t tN<br /> 0 nh nh n H h ư h n n tr n ng ư h n h nt hg n th t n r n<br /> - PC t PC th t g tr nh t g n ư ụng h th n t n tr n t n g n t<br /> h th 2 0 nh nh n t ng n g 9 nh nh n t n n 1 nh nh n t n<br /> 1 nh nh n t n t n t 0 nh nh n hư h t h n ư t n tr n g n<br /> <br /> Từ khóa: Hemophilia A, đột biến gen F8.<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ có nhiều kỹ thuật xác định như kỹ thuật Southern Blot,<br /> kỹ thuật LD - PCR (Long distance - PCR) và kỹ thuật<br /> Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu di truyền I - PCR (Inversion - PCR), mỗi kỹ thuật đều có những<br /> hay gặp nhất với tần suất mắc 1/5000 trẻ trai [1]. Bệnh ưu nhược điểm khác nhau, kỹ thuật Southern Blot được<br /> gây nên do thiếu hoặc không có yếu tố VIII trong huyết phát triển đầu tiên để phát hiện đột biến đảo đoạn intron<br /> tương - đó là một trong những yếu tố tham gia quá trình 1 và intron 22, tuy nhiên kỹ thuật này khá phức tạp, mất<br /> đông máu. Gen F8 là một trong những gen lớn nhất cơ thời gian thường khoảng 8 - 10 ngày và có sử dụng<br /> thể, nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể giới tính X chất phóng xạ nên khá độc hại. Kỹ thuật LD - PCR<br /> (Xq28) và không có alen tương ứng trên nhiễm sắc thể không phức tạp như kỹ thuật Southern Blot, thời gian<br /> Y, kích thước 186 kb gồm 26 exon, mỗi exon có chiều tiến hành nhanh hơn nhưng cần phải khuếch đại đoạn<br /> dài từ 69 đến 3106 cặp bp [2]. PCR khá dài (10 - 12 kb) nên đôi khi gặp nhiều khó<br /> Kể từ khi trình tự gen F8 được công bố năm 1984, khăn, nhất là ở những vùng gen có chứa những đảo<br /> một số lượng lớn các đột biến gây bệnh Hemophilia A GC. Gần đây, kỹ thuật I - PCR (Invesion - PCR) được<br /> đã được xác định; phổ biến nhất là đột biến điểm như ứng dụng nhiều trong xác định đột biến đảo đoạn intron<br /> đột biến thay thế nucleotid, đột biến vô nghĩa (nonsense 1 và intron 22 gen F8, kỹ thuật này có ưu điểm là độ<br /> mutation), đột biến thêm nucleotid và mất nucleotid, chính xác cao, dễ tiến hành, sản phẩm PCR có kích<br /> chiếm tỷ lệ khoảng 45 - 50%; tiếp theo là đột biến đảo thước ngắn (487 và 559 bp) nên dễ khuếch đại [6; 7; 8;<br /> đoạn intron 1 và intron 22 chiếm tỉ lệ khoảng 30 - 35%, 9; 10; 11]. Với đột biến xóa đoạn, người ta thường dùng<br /> gặp chủ yếu ở bệnh nhân hemophillia A thể nặng, trong kỹ thuật PCR để xác định đột biến [5].<br /> đó đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm tỉ lệ cao hơn Tại Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu về<br /> (khoảng 30 - 33%); còn lại là đột biến xóa đoạn chiếm lâm sàng và điều trị bệnh hemophilia A, tuy nhiên chưa<br /> tỉ lệ 10 - 15% [2; 3; 4]. Tùy vào kiểu và vị trí đột biến sẽ có công trình công bố toàn diện các loại đột biến trên<br /> gây ra các thể bệnh nặng và nhẹ khác nhau [2]. gen F8 gây bệnh Hemophilia A. Vì vậy, nghiên cứu này<br /> Để xác định toàn diện các dạng đột biến gen F8, cần được tiến hành với mục tiêu: Xác định các dạng đột<br /> phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau tùy vào từng biến trên gen F8 ở một số bệnh nhân hemophilia A tại<br /> dạng đột biến [5]. Đối với đột biến điểm, kỹ thuật giải Việt Nam.<br /> trình tự thường được sử dụng để xác định đột biến,<br /> tuy nhiên do đột biến nằm rải rác khắp chiều dài gen II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> F8 nên cần phải giải trình tự toàn bộ gen F8 mới có<br /> thể phát hiện được đột biến. Đối với đột biến đảo đoạn, 1. Đối tượng<br /> - Nhóm chứng: 5 người nam bình thường, tiền sử gia<br /> đình không có người mắc bệnh di truyền.<br /> h n h Tr n n h nh Tr ng t Ngh n n-<br /> - Nhóm nghiên cứu: 30 bệnh nhân được chẩn đoán mắc<br /> Pr t n trư ng h YH N<br /> bệnh hemophilia A dựa vào triệu chứng lâm sàng và<br /> n h nh h<br /> định lượng protein yếu tố VIII trong huyết tương tại viện<br /> Ng nh n 22 2014<br /> <br /> 13<br /> TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> Nhi Trung ương và viện Huyết học - Truyền máu Trung đoạn intron 1): trong phản ứng int1h - 1, mồi 9F và mồi<br /> ương; gồm: 22 bệnh nhân thể nặng, 5 bệnh nhân thể 9cR bắt cặp với nhau khuếch đại 1 đoạn gen có kích<br /> trung bình và 3 bệnh nhân thể nhẹ. thước 1908 bp và trong phản ứng int1h - 2, mồi int1h<br /> 2. Phương pháp - 2F và mồi int1h - 2R bắt cặp với nhau khuếch đại 1<br /> Quy trình nghiên cứu được thực hiện theo các bước đoạn gen có kích thước 1191 bp. Người bị đảo đoạn<br /> sau: intron1, mồi 9F và mồi int1h2R nhân đoạn gen tái tổ<br /> - Xác định đột biến đảo đoạn intron 22 và intron 1 ở hợp giữa exon 1 và trình tự int1h có kích thước 1776<br /> những bệnh nhân hemophilia A thể nặng. bp, mồi 9F và int1h2R nhân đoạn gen tái tổ hợp giữa<br /> - Các bệnh nhân thể nặng không phát hiện có đột biến exon 2 và trình tự int1h, có kích thước 1323 bp. Như<br /> đảo đoạn cùng với những bệnh nhân còn lại được vậy, hình ảnh điện di sản phẩm PCR của DNA người<br /> khuếch đại 26 exon của gen F8, giải trình tự gen và so bình thường có 2 băng ứng với kích thước 1908 bp và<br /> sánh với trình tự gen F8 trên GenBank để phát hiện đột 1191 bp, của DNA bệnh nhân đảo đoạn intron 1 có 2<br /> biến điểm, đột biến mất hoặc đột biến thêm các exon. băng ứng với kích thước 1323 bp và 1776 bp.<br /> 2.1. Kỹ thuật tách chiết DNA 2.4. Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp<br /> - DNA được tách chiết từ máu ngoại vi của bệnh nhân 26 exon của gen F8 được giải trình tự với 38 cặp mồi<br /> hemophilia A, sử dụng QIAGEN Kit. theo quy trình:<br /> - Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA được tách - Khuếch đại các exon bằng kỹ thuật PCR với những<br /> chiết bằng phương pháp đo quang trên máy NanoDrop: cặp mồi tương ứng.<br /> nồng độ DNA 300 - 380ng/ml; đánh giá độ tinh sạch - Chạy PCR sequencing bằng cặp mồi xuôi và ngược.<br /> bằng tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0. - Giải trình tự trên máy ABI sequencer.<br /> 2.2. Kỹ thuật Inversion – PCR xác định đột biến - So sánh kết quả thu được với trình tự gen F8 trên<br /> đảo đoạn intron 22 của gen F8 Genbank (NG_011403).<br /> Quy trình kỹ thuật gồm 3 bước của Rosetti và cộng 3. Đạo đức nghiên cứu<br /> sự [3] :(1) Cắt DNA bằng enzym BclI, (2) Nối DNA bằng Bệnh nhân và người nhà hoàn toàn tự nguyện tham<br /> T4 ligate, (3) Khuếch đại DNA bằng phản ứng multiplex- gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân hoàn toàn có quyền rút<br /> PCR với cặp mồi trong gen F8 (IU và ID) và cặp mồi lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia<br /> ngoài gen F8 (IU và ED) . Hình ảnh điện di sản phẩm vào nghiên cứu. Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân<br /> PCR của DNA người bình thường có 1 băng kích thước sẽ được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để giúp<br /> 487 bp, của DNA bệnh nhân có đột biến đảo đoạn intron cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ<br /> 22 cho 1 băng kích thước 559 bp. điều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm<br /> 2.3. Kỹ thuật PCR xác định đột biến đảo đoạn bảo bí mật.<br /> intron 1 của gen F8<br /> Theo quy trình chuẩn của Tizzano và cộng sự [11]: III. KẾT QUẢ<br /> DNA được khuếch đại bằng hai phản ứng multiplex -<br /> PCR cho 2 đoạn int1h - 1 và int1h - 2 với các mồi tương 1. Kết quả xác định đột biến đảo đoạn intron 22 và<br /> ứng: 9F, 9cR, int1h - 2F và int1h 2F, int1h - 2R, 9F. intron 1 của gen F8<br /> Với DNA người bình thường (không có đột biến đảo Đột biến đảo đoạn intron 22:<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex - PCR của DNA bệnh nhân xác định đảo đoạn intron 22 gen F8<br /> <br /> 22 bệnh nhân hemophilia A thể nặng được xét nghiệm phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 gen F8 bằng phương<br /> pháp Inversion-PCR.<br /> M: Marker kích thước 100bp<br /> <br /> 14<br />  TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> 1: Người bình thường<br /> 3, 7: đột biến đảo đoạn int22<br /> 2, 4, 5, 6, 8: không có đảo đoạn<br /> Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex - PCR gen F8 cho thấy: mẫu DNA ở giếng 1 của người bình thường, mẫu<br /> DNA ở các giếng 2, 4, 5, 6, 8 là của những bệnh nhân không bị đảo đoạn intron 22, mẫu DNA ở giếng 3 và giếng 7<br /> là của những bệnh nhân có đột biến đảo đoạn intron 22.<br /> Kết quả 9/22 bệnh nhân bị đột biến đảo đoạn intron 22, chiếm tỉ lệ 41%.<br /> Xác định đột biến đảo đoạn intron 1:<br /> 13/22 bệnh nhân thể nặng không bị đột biến đảo đoạn intron 22 tiếp tục được xét nghiệm phân tích gen tìm đột<br /> biến đảo đoạn intron 1.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex - PCR của DNA của bệnh nhân hemophilia A<br /> xác định đảo đoạn intron 1 gen F8.<br /> <br /> M: Marker kích thước 1kb; giếng 1 - 2, 3 - 4, 5 - 6 và Kết quả 13 bệnh nhân thể nặng không có đột biến đảo<br /> 7 - 8 ứng với mẫu DNA của bốn bệnh nhân. Giếng 2, đoạn intron 1<br /> 4, 6, 8: băng điện di kích thước 1191 bp trong phản ứng 2. Kết quả phát hiện đột biến gen F8 của bệnh nhân<br /> int1h - 2 giếng 1, 3, 5, 7: băng điện di kích thước 1908 hemophilia A bằng giải trình tự gen<br /> bp trong phản ứng int1h - 1 . 13 bệnh nhân thể nặng được xác định không có đột<br /> Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của DNA bốn bệnh biến đảo đoạn intron 22 và intron 1, 5 bệnh nhân thể<br /> nhân với các phản ứng int1h - 1 và int1h - 2 xuất hiện trung bình và 3 bênh nhân thể nhẹ (tổng cộng số bệnh<br /> các băng ứng với các đoạn DNA kích thước 1908 bp và nhân là 21/30) được giải trình tự toàn bộ gen F8 để phát<br /> 1191 bp, như vậy DNA của bốn bệnh nhân không có đột hiện đột biến điểm.<br /> biến đảo đoạn intron 1.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Hình ảnh giải trình tự gen F8 của bệnh nhân mã số HE05<br /> Kết quả cho thấy exon 23 bệnh nhân mã số HE05 có đột biến thay thế nucleotid G>A tại vị trí 108900 trên gen F8.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 15<br /> TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> Hình ảnh giải trình tự cho thấy bệnh nhân mã số là c.6545 G > A, dẫn đến acid amin tại vị trí p. 2182 của<br /> HE05 có đột biến thay thế nucleotid G thành nucleotid A protein yếu tố VIII từ Arginin thành Histidin (Hình 3B).<br /> (G > A) tại vị trí 108900 trên exon 23 của gen F8 (Hình Như vậy bệnh nhân có đột biến exon 23 của gen F8 tại<br /> 3A). Phần mềm CLC xác định thay đổi này trên exon 23 vị trí c.6545 G > A (p.Arg2182His).<br /> <br /> <br /> Bảng 1. Kết quả giải trình tự phát hiện các dạng đột biến gen F8 của 21 bệnh nhân<br /> <br /> Mã số bệnh nhân Exon Thay đổi nucleotid Thay đổi acid amin Thể bệnh<br /> HE 16 1 c.65 G > T p.Arg22Ile Nặng<br /> HE 02 2 c.223 G > T p.Asp75Tyr Trung bình<br /> HE 30 3 c.301 G > C p.Asn101His Nặng<br /> HE 06 3 c.386 A > T p.GLu129Val Nhẹ<br /> HE 12 4 c.446 C > T p.Pro149Leu Nặng<br /> HE 28 8 c.1268 insG p.Asp366Gly*Stop Nặng<br /> HE 25 12 c.1801 A > C p.Asn601His Nặng<br /> HE 03 14 c.2777 - 8 insC p.Ser927Lys Nặng<br /> HE 17 14 c.2185 delG p.Ser729Ile Trung bình<br /> HE 01 14 c.3388 delA p.Arg1130Gly*fs Trung bình<br /> HE 18 14 c.3637 insA p.Ile1213Asn*fs Nặng<br /> HE 11 14 c.5093 T > C p.Ile1698Thr Nhẹ<br /> HE 04 14 c.5144 - 6 delCTC p.Phe1672del Nặng<br /> HE 07 14 c.5177 G > A p.Trp1726Stopl Nặng<br /> HE 13 18 c.5953 C > T p.Arg1985Stop Nặng<br /> HE 09 22 c.6374 G > C pSer2125Thr Nặng<br /> HE 14 23 c.6545 C > T p.Arg2182Cys Trung bình<br /> HE 05 23 c.6545 G > A p.Arg2182His Trung bình<br /> HE 29 chưa phát hiện được đột biến Nặng<br /> HE 26 chưa phát hiện được đột biến Nặng<br /> HE 08 chưa phát hiện được đột biến Nhẹ<br /> <br /> Giải trình tự các exon của gen F8 ở 21 bênh nhân đã IV. BÀN LUẬN<br /> phát hiện 17 bệnh nhân bị đột biến điểm, 1 bệnh nhân<br /> bị đột biến mất 3 nucleotid, 3 bệnh nhân không phát Hiện nay việc chẩn đoán hemophilia A được thực<br /> hiện được đột biến, các đột biến này đã được công bố hiện ở một số phòng thí nghiệm bằng cách sử dụng<br /> là gây nên bệnh. các phương pháp gián tiếp như khai thác tiền sử, định<br /> Trong 30 bệnh nhân hemophilia A được phân tích lượng nồng độ các yếu tố máu chảy - máu đông và<br /> gen F8 đã phát hiện: 9 bệnh nhân thể nặng bị đột biến nồng độ của yếu tố VIII trong huyết tương. Các phương<br /> đảo intron 22, 17 bệnh nhân bị đột biến điểm (11 bệnh pháp này bộc lộ nhiều hạn chế, khó chẩn đoán được<br /> nhân thể nặng, 4 bệnh nhân thể trung bình, 2 bệnh nhân những trường hợp không đủ thông tin từ phả hệ của gia<br /> thể nhẹ), 1 bệnh nhân thể trung bình bị đột biến mất 3 đình hoặc những trường hợp hemophilia A mới mắc.<br /> nucleotid và 3 bệnh nhân chưa phát hiện được đột biến Bởi vậy, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử<br /> (2 bệnh nhân thể nặng và 1 bệnh nhân thể nhẹ). để phân tích gen đã cho phép xác định vị trí đột biến<br /> <br /> 16<br />  TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> trên gen F8 gây bệnh hemophilia A với độ tin cậy và F8 tại vị trí c.6545 G > A (p.Arg2182His) và đột biến này<br /> chính xác cao. Các nhà nghiên cứu đã đưa ra nhiều là nguyên nhân gây bệnh hemophilia A ở bệnh nhân<br /> dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A. Đột biến trên. Các bệnh nhân khác có các vị trí đột biến ở bảng 1<br /> đảo đoạn intron 22 hoặc intron 1, đột biến xóa đoạn đều đã được công bố trên bộ cơ sở dữ liệu HAMSTeRS<br /> và thêm đoạn lớn dẫn đến bất hoạt hoặc làm đứt gãy hoặc CDC là những trang quản lý thông tin về bệnh<br /> gen F8 mã hóa sự tổng hợp protein yếu tố VIII và gây hemophilia A của Anh và Mỹ. Có 3/21 bệnh nhân không<br /> bệnh hemophilia A thể nặng. Các đột biến điểm thay phát hiện được đột biến, chiếm tỷ lệ 10%.<br /> thế một nucleotid, đột biến vô nghĩa (nonsense) tạo mã Như vậy, 27/30 bệnh nhân đã phát hiện được vị trí<br /> kết thúc hoặc đột biến gây lệch khung dịch mã dẫn đến đột biến trên gen F8, chiếm tỉ lệ 90%, Anne Goodeve và<br /> không tổng hợp hoặc tổng hợp protein không có chức cộng sự đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để<br /> năng; những dạng đột biến này là cơ chế chính gây xác định các đột biến trên toàn bộ gen F8 tại các exon,<br /> bệnh hemophilia A thể vừa và nhẹ. Các nghiên cứu về các intron và vùng khởi động promoter và tỷ lệ không<br /> mối quan hệ giữa vị trí đột biến trên gen F8 gây bệnh phát hiện được đột biến là 2 ÷ 7% [14]. Tỷ lệ không<br /> hemophilia A và kháng thể kháng yếu tố VIII có thể cải phát hiện được đột biến trong nghiên cứu này cao hơn<br /> thiện việc điều trị bằng yếu tố VIII tái tổ hợp và trong liệu so với Anne Goodeve nhưng phù hợp với công bố của<br /> pháp điều trị gen [12]. Maurizio Margaglione nghiên cứu trên 1296 bệnh nhân<br /> Bệnh nhân hemophilia A thể nặng chiếm tỉ lệ cao Hemophilia A ở Italia là 11% [15].<br /> và thường bị đột biến đảo đoạn intron 22 hoặc intron 1<br /> trên gen F8, trong đó đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm V. KẾT LUẬN<br /> 30 - 35% và đột biến đảo đoạn intron 1 chiếm khoảng 1<br /> - 2% [2]. Do đó, việc làm trước tiên là phân tích gen tìm Với các kỹ thuật xác định đảo đoạn intron 22, intron<br /> đột biến đảo đoạn intron 22 và intron 1. Nghiên cứu này 1 và giải trình tự toàn bộ 26 exon của gen F8, nghiên<br /> đã sử dụng phương pháp Inversion PCR của Rosetti và cứu đã phân tích gen của 30 bệnh nhân hemophilia A<br /> cộng sự phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22. Kết quả và phát hiện được 9 bệnh nhân thể nặng bị đột biến đảo<br /> 9/22 bệnh nhân được chẩn đoán hemophilia A thể nặng intron 22, 17 bệnh nhân bị đột biến điểm (11 bệnh nhân<br /> bị đột biến đảo đoạn intron 22, chiếm 41% và phù hợp thể nặng, 4 bệnh nhân thể trung bình, 2 bệnh nhân<br /> với nghiên cứu của nhiều tác giả trước đây đã công bố. thể nhẹ), 1 bệnh nhân thể trung bình bị đột biến mất 3<br /> Áp dụng kỹ thuật của Tizzano và cộng sự, nghiên cứu nucleotid và 3 bệnh nhân chưa phát hiện được đột biến<br /> không phát hiện trường hợp nào có đột biến đảo đoạn (2 bệnh nhân thể nặng và 1 bệnh nhân thể nhẹ).<br /> intron 1, kết quả này có thể do cỡ mẫu nghiên cứu nhỏ.<br /> Một nghiên cứu gần đây đưa ra tỷ lệ đột biến intron 1 Lời cảm ơn<br /> là 1% [10; 11].<br /> 13 bệnh nhân hemophilia A thể nặng không phát Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí<br /> hiện có đột biến đảo đoạn intron, 5 bệnh nhân thể trung bởi Đề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật<br /> bình, 3 bệnh nhân thể nhẹ được khuếch đại 26 exon sinh học phân tử phát hiện đột biến gen yếu tố VIII gây<br /> gen F8 và giải trình tự để tìm những đột biến khác. Có bệnh hemophilia A” nhóm nghiên cứu xin tran trọng sự<br /> 17 bệnh nhân (11 bệnh nhân thể nặng, 4 bệnh nhân giúp đỡ của các cán bộ của trung tâm Nghiên cứu Gen<br /> thể trung bình, 2 bệnh nhân thể nhẹ) đã tìm thấy bị đột - Protein, bộ môn Hoá sinh, trường Đại học Y Hà Nội.<br /> biến thay thế một nucleotid. Hình 3 minh họa kết quả<br /> xác định đột biến điểm gen F8 của một bệnh nhân bằng TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> phương pháp giải trình tự gen. Bệnh nhân mã số HE 05<br /> có đột biến thay thế nucleotid G thành nucleotid A (G > 1. Miao Liang Liu, Michael EP, Murphy, et al (1998).<br /> A) tại vị trí 108900 trên exon 23. Để kiểm tra khả năng A domain mutations in 65 haemophilia A families and<br /> làm thay đổi acid amin và xác định vị trí trên mRNA và molecular modelling of dysfunctional factor VIII proteins.<br /> trên chuỗi polypeptid bất thường ở bệnh nhân, nghiên rt h rn H t g 103, 1051 - 1060<br /> cứu đã sử dụng phần mềm CLC và so sánh trên NBCI. 2. Shin YL, Yi NS, Chia CH, et al (2008). Mutation<br /> Phần mềm CLC xác định vị trí nucleotid thay đổi trên spectrum of 122 hemophilia A families from Taiwanese<br /> exon 23 là c.6545 G > A, dẫn đến protein yếu tố VIII population by LD-PCR, DHPLC, multiplex PCR and<br /> tại vị trí p.2182 từ Arginin thành Histidin. Như vậy bất evaluating the clinical application of HRM.<br /> thường này là đột biến gây bệnh và đột biến này đã n t 9 (53), 205 - 220<br /> được Tuddenham công bố năm 1994 [5]. Từ đây có thể 3. Dezsö D,Célia V, Isabel M, et al (2006). The spectrum<br /> kết luận bệnh nhân HE 05 có đột biến exon 23 của gen of mutations and molecular pathogenesis of hemophilia<br /> <br /> 17<br /> TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> A in 181 Portuguese patients.H t g 91, 840 10. Rossetti LC, Radic CP, Larripa IB, De Brasi CD<br /> - 843 (2005). Genotyping the Hemophilia Inversion Hotspot<br /> 4. Zhihui H, Juan C , Shiyan X, et al (2013). A Strategy by Use of Inverse PCR. H t n Thr<br /> for the Molecular Diagnosis in Hemophilia A in Chinese 154 – 158.<br /> Population. C h h 65, 463 – 472 11. Tizzano EF, Cornet M, Baiget M. (2003). Inversion<br /> 5. Tuddenham EG, Cooper DN. (1994). Haemophilia of intron 1 of the factor VIII gene for direct molecular<br /> A: database of nucleotide substitutions, deletions, diagnosis of hemophilia A. H t g 88(1), 118<br /> insertions and rearrangements of the factor VIII gene, - 120.<br /> second edition. N 22, 3511 - 3516. 12. Kaufman RJ, Pipe SW. (1998). Can we improve on<br /> 6. Liu Q, Nozari G, Sommer S. (1998). Single-tube nature? Super molecules of factor VIII. H h 4,<br /> polymerase chain reaction for rapid diagnosis of the 370 - 379.<br /> inversion hotspot of mutation in haemophilia A. 13. Repesse Y, Slaoui M, Ferrandiz D. (2007).<br /> 92, 1458 – 1459. Factor VIII (FVIII) gene mutations in 120 patients with<br /> 7. Tizzano EF, Domenech M, Baiget M. (1995). hemophilia A: detection of 26 novel mutations and<br /> Inversion of intron 22 in isolated cases of severe correlation with FVIII inhibitor development. Thr<br /> hemophilia Thr H t 73, 6 – 9 H t 5, 1469 – 1476.<br /> 8. Bowen DJ, Keeney S. (2003). Unleashing the long- 14. Anne Goodeve. (2008). Molecular genetic testing<br /> distance PCR for detection of the intron 22 inversion of of Hemophilia A. Thr n H t 34, 491<br /> the factor VIII gene in severe haemophilia Thr - 501.<br /> H t 89, 201 – 202. 15. Maurizio Margaglione, Giancarlo Castaman,<br /> 9. Antonarakis SE, Rossiter JP, Young M, et al (1995). Massimo Morfini, et al (2008). The Italian AICE -<br /> Factor - VIII gene inversions in severe hemophilia - A: Genetics Hemophilia A database: results and correlation<br /> results of an international consortium study. 86, with clinical phenotype. H t g 93(5), 722 - 728<br /> 2206 - 2212<br /> <br /> <br /> Summary<br /> MUTATION ANALYSIS OF F8 GENE IN HEMOPHILIA A PATIENTS<br /> Hemophilia A is an inherited recessive X-linked disease caused by mutation of gene F8 with an incident rate of<br /> one in 5,000 males. So far, many studies on gene mutations have been reported worldwide, but a study with all types<br /> of mutation has not been published in Vietnam. The aim of this study is to detect mutation of gene F8 in Viet Nam<br /> Hemophilia A patient. 30 Hemophilia A patients were selected for this study. Inversion-PCR, multiplex PCR and direct<br /> sequencing were used to detect mutation in F8 gene. The results showed that 9 patients were found to have intron<br /> 22 inversion, 17 patients had point mutation, 1 had small deletion, 3 remaining patients were not detected for any<br /> mutation in F8 gene.<br /> <br /> Keywords: Hemophilia A, F8 gene mutation.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 18<br />