Phát hiện đột biến mất đoạn gen gây bệnh loạn dưỡng cơ duchenne và becker bằng kỹ thuật MLPA

Chia sẻ: Trần Thị Hạnh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

84
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tình hình nghiên cứu và mục tiêu của đề tài đề cập về: Bệnh DMD và BMD là bệnh di truyền thần kinh cơ do đột biến gen DMD. Hơn 65% trường hợp là đột biến mất hoặc lập đoạn gen. Kỹ thuật MLPA gần đây được cho là chẩn đoán mất đoạn gen rất hiệu quả. Mục tiêu nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến mất đoạn gen DMD.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phát hiện đột biến mất đoạn gen gây bệnh loạn dưỡng cơ duchenne và becker bằng kỹ thuật MLPA

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN GEN GÂY BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE VÀ BECKER BẰNG KỸ THUẬT MLPA Nguyễn Khắc Hân Hoan*, Quách Thị Hoàng Oanh*, Phạm Ngọc Khôi**, Nguyễn Thị Phương Mai***, Ngô Diễm Ngọc***, Trần Vân Khánh**** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Bệnh DMD và BMD là bệnh di truyền thần kinh cơ do đột biến gen DMD. Hơn 65% trường hợp là đột biến mất hoặc lập đoạn gen. Kỹ thuật MLPA gần đây được cho là chẩn đoán mất đoạn gen rất hiệu quả. Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến mất đoạn gen DMD. Phương pháp: 18 mẫu DNA của bệnh nhân nam đã chẩn đoán lâm sàng là bệnh DMD/BMD và đã phát hiện đột biến mất đoạn gen bằng multiplex PCR. Được khảo sát 79 exon trên gen DMD bằng kit Salsa MLPA P034A2 và P035A2, điện di mao quản bằng CEQ 8000 và phân tích tự động bằng phần mềm Gene Marker. Kết quả: MLPA cho phép xác định chính xác kích thước của đoạn DNA bị đột biến,khảo sát được hết 79 exon của gen DMD, kỹ thuật phân tích dễ dàng, trực quan, nhanh và có độ lặp lại cao. Mọi exon của gen DMD bị mất đều được khẳng định trên biểu đồ. Bộ 3 multiplex PCR chỉ khảo sát được 25 exon và có những exon không được phát hiện. Kết luận: Kỹ thuật MLPA giúp phát hiện nhanh chóng, toàn diện các đột biến mất đoạn gen DMD và ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex PCR. Từ khóa: Bệnh loạn dưỡng cơ, Duchenne, Becker, bệnh di truyền, đột biến gen, exon, kỹ thuật PCR, kỹ thuật MLPA. ABSTRACT MLPA IN DETECTION OF DELETION MUTATIONS CAUSING DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY Nguyen Khac Han Hoan, Quach Thi Hoang Oanh, Pham Ngoc Khoi, Nguyen Thi Phuong Mai, Ngo Diem Ngoc, Tran Van Khanh* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 4 - 2010: 53 - 60 Background: DMD and BMD are genetic disorders caused by DMD mutations. More than 65% of cases are deletion or duplication mutation. Recently, MLPA is described as an effective method to dectect these mutations. Objective: Evaluate the effectiveness of MLPA in detecting DMD gene deletion mutations. Method: 15 DNA samples of male affected with DMD/BMD detected with deletion mutations by multiplex PCR are tested for 79 exons with Salsa MLPA P034A2 và P035A2 kit, capillary electrophoresed with CEQ 8000 and automated analysis with Gene Marker software. Results: MLPA allows to detect the size of DNA fragment lost, the technique is easy, visual, rapid and reproducible. All 79 deleted exons are present in electropherograms. Set of 3 multiplex PCR only detects 25 exons and some exons cannot be found by this set. Conclusion: MLPA helps to rapid detection all deletions of DMD gene and is prominent to multiplex PCR. * Khoa Di truyền y học – Bệnh viện Từ Dũ, ** Bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Nông Lâm TPHCM, *** Khoa Di truyền Tế bào và Phân tử – Bệnh viện Nhi Trung Ương, **** Đại học Y Hà nội Tác giả liên lạc: BS Quách Thị Hoàng Oanh, ĐT: 084-913833666, Email: oanhqch@yahoo.com Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 1 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Nghiên cứu Y học Key word: Muscular dystrophy, Duchenne, Becker, genetic disorder, mutation, exon, PCR, MLPA. với khả năng khuếch đại cùng lúc đến 45 vị trí ĐẶT VẤN ĐỀ DNA đích khác nhau trong một phản ứng(18,19). Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) và Mỗi probe MLPA gồm 2 đoạn oligonucleotide bệnh loạn dưỡng cơ Becker (BMD) là bệnh di lai với trình tự DNA đích tại vị trí liền kề với truyền thần kinh cơ phổ biến nhất, với xuất độ nhau, dài 22-43 nucleotide và một PCR primer khoảng 1/3.500 trẻ trai sinh sống(7). Bệnh do đột xuôi hoặc ngược giống nhau ở tất cả các probe. biến gen dystrophin (gen DMD) gây ra. Đây là Để phân biệt sản phẩm khuyếch đại, các probe gen lớn nhất ở người nằm dài 2400kb ở vị trí còn chứa một đoạn DNA gắn chèn không tham Xp21.2, gồm 79 exon mã hóa 14 kb mRNA(1,8,15). gia vào lai có kích thước thay đổi (19–364 nt). Thông tin chi tiết về gen được phổ biến tại Sau khi lai qua đêm với trình tự DNA đích, 2 www.dmd.nl. đoạn oligonucleotide của mỗi probe sẽ nối ghép Bệnh nhân DMD thường bị nhược cơ xuất (ligation) với nhau. Sản phẩm nối có cả primer hiện sớm từ 2 – 3 tuổi, tiến triển nhanh, mất khả xuôi và ngược và được khuếch đại bằng PCR. Số năng đi lại và chết ở lứa tuổi 20 do vì tổn thương lượng tương đối của mỗi sản phẩm PCR sẽ tỉ lệ cơ tim và rối loạn hô hấp. Bệnh nhân BMD biểu với số bản sao của trình tự đích trong mẫu khảo hiện bệnh nhẹ hơn, tiến triển chậm và có cuộc sát. Kích thước khác nhau của các sản phẩm sẽ sống kéo dài. Tuy nhiên chất lượng cuộc sống được nhận biết bằng hệ thống giải trình mao thường kém(7). quản tự động và đỉnh của mỗi sản phẩm sẽ được Hơn 65% trường hợp bệnh DMD và BMD định lượng(18,19). là do đột biến mất đoạn gen hoặc lập đoạn gen Kỹ thuật đã được ứng dụng vào chẩn đoán dystrophin gây ra(2,10,17). Các loại đột biến khác đột biến mất đoạn gây DMD/BMD rất hiệu gồm có mất vài nucleotid, đột biến điểm và quả(18). Tuy nhiên đến nay Việt Nam vẫn chưa có chuyển đoạn. Hầu hết các đột biến mất đoạn nghiên cứu nào về kỹ thuật này. Vì thế, chúng tập trung chủ yếu ở hai vùng nóng (hot spot) ở tôi thực hiện thử nghiệm xác định đột biến mất đầu 5’ (exon 3-20) và vùng trung tâm (exon 44đoạn gen DMD bằng kỹ thuật MLPA và so sánh 55)(3,4,7). Tuy nhiên không có sự tương quan hiệu quả với kỹ thuật multiplex PCR. giữa kích thước của đoạn gen bị mất với mức Mục tiêu nghiên cứu độ biểu hiện bệnh. Đánh giá hiệu quả phát hiện đột biến mất Phát hiện đột biến gen gây bệnh có ý nghĩa đoạn gen DMD bằng kỹ thuật MLPA và so sánh rất lớn nếu áp dụng vào giai đoạn trước sinh. với kỹ thuật multiplex PCR trên các bệnh nhân Trước đây kỹ thuật thường được sử dụng là loạn dưỡng cơ Duchenne và Becker tại Bệnh Southern blot. Tuy nhiên đây là kỹ thuật đòi hỏi viện Từ Dũ. tốn rất nhiều công và thời gian. Để thể phát hiện 79 exon phải lai các hỗn hợp probe 7 – 8 lần. Về sau kỹ thuật multiplex PCR được Chamberlain phát triển thành phương tiện chẩn đoán nhanh hơn(2). Kỹ thuật realtime PCR gần đây cũng được phát triển, tuy nhiên còn nhiều hạn chế(11). Tại Việt Nam, phát hiện các đột biến mất đoạn thường được dựa vào kỹ thuật đơn PCR(12,13) hoặc kỹ thuật multiplex PCR(14). Gần đây, kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ra đời VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu bệnh phẩm: Bệnh phẩm là 3ml máu tĩnh mạch ngoại vi chống đông bằng EDTA. Đối tượng là 15 bệnh nhân nam được chẩn đoán lâm sàng là bệnh DMD/BMD. Ly trích DNA từ mẫu bệnh phẩm: DNA được ly trích từ tế bào bạch cầu máu ngoại vi bằng phương pháp kết tủa và ly tâm qua cột lọc với bộ QiaAmp DNA blood mini kit (Qiagen). DNA sau khi cô lập được hòa tan trong dung dịch 2Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Nghiên cứu Y học Tris-HCl 10mM (pH 9,0). Các mẫu DNA đều được xác định nồng độ và độ tinh sạch bằng máy Biophotometter plus (Eppendorf) ở bước sóng 260/280nm và lưu trữ ở 4oC trước khi chẩn đoán và -300C sau khi phân tích. Kỹ thuật multiplex PCR phát hiện đột biến mất đoạn. Kỹ thuật multiplex PCR được thực hiện tại Bệnh viện Nhi Trung Ương. Ba bộ multiplex PCR A, B và C được sử dụng để phát hiện mất đoạn của 25 exon đặc hiệu tập trung ở vùng hot spot của gen với trình tự mồi, điều kiện phản ứng và kích thước sản phẩm khuếch đại được thiết kế theo Chamberlain và cộng sự (bảng 1)(2). Sản phẩm PCR được điện di trên gel Nussieve agarose 3% trong dung dịch đệm TBE 1x bằng máy điện di Mupid Exu với điện thế 120V trong 30’, nhuộm với dung dịch ethidium bromide 0,5ug/ml trong 20’ và chụp hình bằng tia UV với máy Gel Doc XR (BioRad) (hình 1). Các phản ứng PCR luôn kèm theo đối chứng dương tính, âm tính (wild type) song song với mẫu cần chẩn đoán. Bảng 1: Kích thước (bp) của các 25 exon được khuếch đại trong 3 bộ multiplex PCR (2)). Multiplex A Multiplex B Mutiplex C Exon Kích thước Exon Kích thước Exon Kích thước 45 547 Pm 535 49 439 48 506 3 410 Pb 332 19 459 43 357 16 290 17 416 50 271 41 270 51 388 13 238 32 253 8 360 6 202 42 195 12 331 47 181 34 171 44 268 60 139 4 196 52 113 Hình 1: Kết quả phát hiện đột biến mất đoạn bằng 3 bộ multiplex A, B và C với thang 100bp. Wt và m là chứng wildtype và người nam bị đột biến. 29 là mẫu 08029 bị mất các exon: 3,4,6,8,12,13. 30 là mẫu 08030 bị mất các exon: 47, 48, 49, 50, 51, 52. 31 là mẫu 08031 bị mất các exon 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17, 19, 32, 34. Kỹ thuật MLPA. Chúng tôi sử dụng bộ kit Salsa MLPA do MRC-Holland, Amsterdam, Hà Lan sản xuất có chứa 80 đoạn dò cho 79 exon đích và exon DP427c (5,6). 80 probe này đưa chia đều vào 2 hỗn hợp probe P034A2 và P035A2. Ngoài ra, mỗi kit còn chứa 5 đoạn dò kiểm chứng (bảng 2). Kỹ thuật MLPA được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 50 – 200ng DNA của mẫu khảo sát pha loãng trong 5ul TE được biến tính ở 98°C x 5’, làm lạnh trên đá rồi trộn với 3ul hỗn hợp probe và MLPA buffer. Hỗn hợp DNA và probe này sau đó được ủ lai ở 95°C x 1’ và 60°C x 16 giờ hoặc qua đêm. Phản ứng nối ghép sau lai được thực hiện với 32ul hỗn hợp Ligase-65 và buffer ở 54°C x 15’ và bất hoạt ở 98°C x 5’. Bảng 2: Kích thước đoạn dò (bp) đặc hiệu các exon của kit Salsa MLPA P034 và P035. Kích thước DMD exon ñoạn dò 482* Exon DP427c 138* Exon 1 170* Exon 2 210 Exon 3 242 Exon 4 282 Exon 5 314 Exon 6 354 Exon 7 386 Exon 8 Trình tự 20 nucleotid Kích thước DMD exon quanh vị trí ligation ñoạn dò CAGTAATAGA-ATGCTTTCAG 218 Exon 43 CCCCCTACAG-GACTCAGATC 250 Exon 44 CAAAAGAAAA-CATTCACAAA 290 Exon 45 CTCTTCAGTG-ACCTACAGGA 322 Exon 46 CCCTGAACAA-TGTCAACAAG 362 Exon 47 AGATGGAAAT-CATAAACTGA 394 Exon 48 CCAACAGTGA-AAAGATTCTC 434 Exon 49 GGAATAGTGT-GGTTTGCCAG 466 Exon 50 146 Exon 51 TTGAAGCCAT-CCAGGAAGTG Trình tự 20 nucleotid quanh vị trí ligation ATTGCAAAGT-GCAACGCCTG ACAGTTTCTC-AGAAAGACAC AGATGCCAGT-ATTCTACAGG CATTGCTAGT-ATCCCACTTG TCAAACAATT-AAATGAAACT GTTAAATCAT-CTGCTGCTGT AAGAGATTTT-GTCTAAAGGG TAAACCGTTT-ACTTCAAGAG TCTGGCAGAT-TTCAACCGGG Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 3 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Kích thước DMD exon ñoạn dò 426 Exon 9 458 Exon 10 138 Exon 11 170 Exon 12 210 Exon 13 242 Exon 14 282 Exon 15 314 Exon 16 354 Exon 17 386 Exon 18 426 Exon 19 458 Exon 20 154 Exon 21 186 Exon 22 226 Exon 23 258 Exon 24 298 Exon 25 330 Exon 26 370 Exon 27 402 Exon 28 442 Exon 29 474 Exon 30 154 Exon 31 186 Exon 32 226 Exon 33 258 Exon 34 298 Exon 35 330 Exon 36 370* Exon 37 402 Exon 38 442 474 146 178 Exon 39 Exon 40 Exon 41 Exon 42 Nghiên cứu Y học Trình tự 20 nucleotid Kích thước DMD exon Trình tự 20 nucleotid quanh vị trí ligation ñoạn dò quanh vị trí ligation 178* Exon 52 AGCCTCTTGA-TTGCTGGTCT ACAGGGATAT-GAGAGAACTT 218 Exon 53 GAGCAGGTCT-TAGGACAGGC AGACAAGTCA-TTTGGCAGTT TTGACAGCCC-ATCAGGGCCG 250 Exon 54 GCAGACAAAT-GTAGATGTGG AGCCTCTTGG-ACCTGATCTT 290 Exon 55 ACTCATAGAT-TACTGCAACA GGTAGTTGAT-GAATCTAGTG 322 Exon 56 TCCTGTTACA-AAGACGTTTG GGGCAAACAT-CTGTAGATGG 362 Exon 57 GAAAGATGAT-GAATTAAGCC TGGCTTTCAG-AAAAAGAAGA 394 Exon 58 AGACTGTACG-AATATTTCTG GCAATCCATG-GGCAAACTGT 434 Exon 59 GATGAGACCC-TTGAAAGACT AACAGATCCT-GGTAAAGCAT 466 Exon 60 GCCTCTGAAA-GAGAACGTGA AAGCTGTGTT-GCAGAGTCCT 162 Exon 61 GCAGCTGCAT-GAAGCCCAC AAGCTGAGAA-GTTCAGAAAA 194 Exon 62 TCCCTGGGAG-AGAGCCATCT GTGGATCGAA-TTCTGCCAGT 234* Exon 63 AAACAACTTG-CTGGGACCAT AAGGACAAGG-ACCCATGTTC 266* Exon 64 CTGCAGTCTT-CGGAGTTTCA AGGAGACCAT-GAGTGCCATC 306 Exon 65 GCTGCATGTG-ATGCCTTGGA GGCCTATACT-ATCTCAGCAC 338 Exon 66 CTGTCTTTTA-AAACTGGCAT GGCCTGCCCT-TGGGGATTCA 378* Exon 67 ACACTTGGCT-CAATGTTACT CAGAAGATAA-AGAATGAAGC 410 Exon 68 GACTGGATGA-GACTGGAACC GTAAGCCTCC-AGAAAGATCT 450 Exon 69 TTTTTTTCTG-GTCGAGTTGC TGAGTCTGTA-AATAGTGTCA 482 Exon 70 CCCCGAATGG-GCTACCTGCC 162* Exon 71 TCTGATCAAC-TTCTGGCCAG GGCATGAGTT-ATTGTCATAC 194 Exon 72 CCTCAGCTTT-CACACGATGA ACAGACCCTA-ACAGATGGCG 234* Exon 73 TATCATTTAG-ATAAGATCCA AAGTTGCTTG-AACAGAGCAT GGAGGCTGCC-CAAAGAGTCC 266 Exon 74 CCAGATCTTG-ATTTCCTTAG CTGCATTGGA-AACAAAGAGT 306 Exon 75 TGAGCTCATT-GCTGAGGCCA TCTGAAGTGG-AAATGGTGAT 338 Exon 76 ACCTCTCTAC-AGAGGTCCGA GAAAGGAAAT-GAATGTCTTG 378 Exon 77 CCAGGACACA-AGCACAGGGT CCTGAAGAGT-ATCACAGAGG 410* Exon 78 TGGAAAGCCA-ATGAGAGAGG ATCACAAAGT-GGATCATTCA 450 Exon 79 CCACATGGCA-GATGATTTGG TGGCTGCAAA-TCGATGGTTG 64-70-76-82 Chứng ñịnh lượng DNA, xuất hiện DNA < 100 ng CTGAAATTCA-GCAGGGGGTG 88-92-96 Chứng DNA, tín hiệu thấp khi biến tính không hoàn toàn TGCAAAGAGG-AGACAACTTA 100 Chứng ñặc hiệu nhiễm sắc thể X AAGGCTCTAG-AAATTTCTCA 105 Chứng ñặc hiệu nhiễm sắc thể Y GGGCTTGTCT-GAGGATGGG 118 Chứng ñặc hiệu nhiễm sắc thể Y, chỉ có ở P034 CGATGATGGT-GATGACTGAA * là các probe đặc hiệu trình tự chuỗi DNA ngược hoặc có một phần trình tự intron. Chữ đứng là kit P034, chữ in nghiêng là kit P035. Cả 2 kit đều có đoạn dò chứng. 10µl sản phẩm nối ghép được trộn kỹ với 30µl PCR buffer và đặt vào máy luân nhiệt ở 60°C. Liền ngay sau đó 10ul hỗn hợp phản ứng có chứa dNTPs, Taq polymerase và primer (primer xuôi: 5’-Cy5GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3’, primer ngược: 5’-GTGCCAGCAAGATCCAATC TAGA-3’). được thêm vào. PCR được thực hiện ở điều kiện luân nhiệt: (950C x 30” + 600C x 30” + 720C x 60”) x 35 chu kỳ + 720C x 20’ và giữ ở 40C trên máy Master Cycler ProS (Eppendorf). Các đoạn dò nếu không được ghép nối với nhau thì chỉ mang một primer cho nên không được khuếch đại. Sản phẩm sau khuếch đại được điện di phân tách đoạn trên hệ thống CEQ 8000 (Beckman Coulter) ở điều kiện: 2ul PCR + 0,5ul Beckman size standard 600 + 32ul sample loading solution; nhiệt độ mao quản 500C, biến tính 900C x 20’’; điện thế bơm mẫu vào 2kV x 30’’ và điện thế phân tách đoạn 4,8kV x 60’. Kích thước của mỗi 4Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 peak được xác định nhờ so sánh với thang kích thước và so sánh với mẫu chứng. Sau điện di, kết quả được xuất dưới dạng file.esd, rồi được phân tích tự động tìm đột biến bằng phần mềm Gene Marker version 1.85 (SoftGenetics). Kết quả phân tích được biểu thị dưới dạng biểu đồ sóng (electropherogram) và dưới dạng bảng. Các vị trí gen bị mất đoạn ở cá thể nam (1 nhiễm sắc thể X) sẽ không có đỉnh tín hiệu xuất hiện. Hình 3 minh họa kết quả chẩn đoán mẫu 08029. Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ Từ ngày 1/3/2009 đến 31/5/2009 chúng tôi đã thực hiện chẩn đoán cho 15 mẫu và tất cả đều được phát hiện là mất đoạn bằng cả hai kỹ thuật. Số exon được phát hiện bị mất trong các mẫu rất đa dạng. Sử dụng kỹ thuật bộ 3 multiplex PCR, có 2 mẫu không phát hiện được mất đoạn, và mẫu mất nhiều nhất là 25 exon. Các band đặc hiệu cho exon khảo sát đều rõ. Với kỹ thuật MLPA, số lượng exon bị đột biến mất đoạn cũng rất thay đổi, ít nhất là 1 exon, nhiều nhất toàn bộ 79 exon của gen DMD. Kết quả phát hiện đột biến được nêu trong bảng 3. Bảng 3: Số exon được phát hiện bị mất trong 15 mẫu khảo sát. Mã số MLPA Multiplex PCR 08024 08026 08029 08030 08031 8 – 12 3–7 2 – 13 46 – 52 3 – 34 Exon phát hiện ñược 8, 12 3, 4, 6 3, 4, 6, 8, 12, 13 47, 48, 49, 50, 51, 52 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17, 19, 32, 34 07025 06058 05020 05060 3–7 48 – 50 45 – 52 3 – 29 3, 4, 6 48, 49, 50 45, 47, 48, 49, 50, 51,52 32, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19 07009 07047 10013 10016 10017 10021 31 – 40 3 – 17 45-53 52 61-67 1-79 32, 34, 41, 42, 43 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17 45, 47, 48, 49, 50,52 52 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17, 19, 32, 34,41,42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 51,52, 60 Exon không khảo sát 9, 10, 11 5, 7 2, 5, 7, 9, 10, 11, 46, 5, 7, 9, 10, 11, 14, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 21, 33 5, 7 46 5, 7, 9, 10, 11, 14, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40 5, 7, 9, 10, 11, 14, 15 46, 51, 53 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 Các exon còn lại Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 5