SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:51

Thêm vào BST

Báo xấu

207
lượt xem 52
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ngày nay với tốc độ phát triển nhƣ vũ bão của khoa học và công nghệ đã kéo theo hàng loạt những thay đổi trong đời sống xã hội của con ngƣời: kinh tế, chính trị, xã hội,… rồi đến đời sống vật chất, tinh thần,… Thông qua đó đặt ra một vấn đề hết sức cấp thiết làm sao giải quyết tốt vấn đề lƣơng thực thực phẩm cho con ngƣời. Thực tế cho thấy việc áp dụng thành công trong khoa học – công nghệ vào sản xuất nông nghịêp nhằm nâng cao năng xuất cây trồng đã...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TRẦN NHƢ NGỌC SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI LUẬN VĂN: KĨ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI LUẬN VĂN: KĨ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC KHÓA: 28 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ***000*** RFLP ANALYSIS OF POLYMORPHISMS IN Metarrhizium anisopliae AND Beauveria bassiana ACCOSIATED WITH INSECT GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY PROFESSOR STUDEN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC TERM: 28 HCMC 9/2006
LỜI CẢM TẠ Xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:  Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Ban chủ nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi.  ThS. Võ Thị Thu Oanh đã hƣớng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực tập và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  TS. Bùi Minh Trí –Trƣởng trung tâm phân tích Hóa – Sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Phòng thí nghiệm Hóa – Sinh thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm.  Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh, đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Hƣng đã hết lòng giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.  Các bạn sinh viên thực tập tại phòng 105 – khu Phƣợng Vĩ Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi.  Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iii
TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu:“ sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana” ký sinh trên côn trùng gây hại ” đƣợc thực hiện từ ngày 20 tháng 2 năm 2005 đến ngày 15 tháng 8 năm 2005 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài do Trần Nhƣ Ngọc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Võ Thị Thu Oanh Đối tƣợng nghiên cứu là nấm Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana ký sinh trên côn trùng gây hại. Nấm này có tác dụng tiết ra độc tố làm ngừng hoạt động của ruột, phá vở các hoạt động bình thƣờng của côn trùng dẫn đến côn trùng bị chết khô Mục đích đề tài nhằm xác định đoạn gen gây độc Pr1 của những dòng nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana giúp chọn lọc đúng những dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana có tính độc đảm bảo hoạt tính diệt côn trùng lâu dài và hiệu quả nhằm phục vụ cho sản xuất nông nghiệp . Các nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Phục hồi các chủng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassian trên một số côn trùng gây hại . 2. Dùng kỹ thuật PCR phát hiện gen protease (Pr1) và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 liên quan đến tính độc của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana.. 3. Sau khi thöïc hieän phaûn öùng PCR ta söû duïng kỹ thuật RFLP thực hiện phaûn öùng enzyme caét giôùi haïn ñeå phaùt hieän söï ña hình trong phaïm vi vuøng IST1-5.8S-IST2 cuûa naám Beauveria bassiana vaø vuøng Pr1 cuûa naám Metarrhizium anisopliae 4. Giải trình tự đoạn gen Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 so sánh trình tự này với các mẫu trên ngân hàng gen thế giới (genbank). Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 1.Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trên môi PGA:
Sau quá trình phục hồi các nguồn nấm trên môi trƣờng PGA(Potato-Glucose- Agar),kết quả chúng tôi đã thu đƣợc một số dòng nấm sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy : RNBT1.7 ,DONG 3.1, BXĐTG6, RMTĐ3 ,PULQ2, NNPT7, SR, BRVT6 ,BHBD6 ,SCLLLA1, BDTN4 ,BDQ96 . 2.Nhân sinh khối các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trong môi trƣờng lỏng Czapek – Dox trong khoảng thời gian từ 3-5 ngày , thu đƣợc sinh khối nấm ,rửa lại với nƣớc cất rồi phơi khô , nghiền trong nitơ lỏng ,cuối cùng chúng tôi đƣợc nấm ở dạng khô và chúng tôi bảo quản nấm -800C cho đến khi sử dụng . 3.Tiến hành ly trích nấm đã bảo quản ở trên bằng dịch ly trích ,kết quả trích đƣợc DNA của 12 dòng nấm Metarrhizium và Beauveria ,sau đó là tinh sạch DNA của các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria nhằm tạo sản phẩm sạch ,ít tạp trong sản phẩm PCR.Sau tinh sạch vẫn giữ đƣợc DNA của 12 mẫu nấm. 4.Thực hiện phản ứng PCR trên các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria , kết quả thu đƣợc sản phẩm PCR của 6 dòng nấm Beauveria 5.Phân tích RFLP , thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn trên 6 dòng nấm Beauveria ,enzyme cắt Alu I, Hae III trên các sản phẩm PCR .kếtquả chƣa nhận thấy rõ sự đa dạng di truyền của các dòng nấm do mức độ tƣơng đồng giữa các dòng nấm khá cao .Tuy nhiên thu đƣợc kích thƣớc các band trên gel so với Ladder là hoàn toàn trùng khớp với kích thƣớc band DNA chuẩn của các dòng nấm Beauveria .
MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ..................................................................................................................... iii Tóm tắt ........................................................................................................................... iv Mụclục ............................................................................................................................ vi Danh sách chữ viết tắt .................................................................................................... ix Danh sách các bảng ......................................................................................................... x Danh sách các hình ........................................................................................................ xi 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 1.1.Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 1.2.Mục đích và yêu cầu đề tài ................................................................................... 1 1.2.1.Mục đích ...................................................................................................... 1 1.2.2.Mục tiêu ...................................................................................................... 2 1.3.Yêu cầu nghiên cứu ............................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 3 2.1.Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học.............................................................. 3 2.2.Giới thiệu về nấm ký sinh...................................................................................... 4 2.2.1.Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae .............................................. 5 2.2.2.Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana vuille............................................. 6 2.3.Hiệu quả phòng trừ bằng chế phẩm nấm ............................................................... 8 2.4.Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm...................................................................... 9 2.5.Hoạt tính sinh học ................................................................................................ 11 2.6.Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................................................. 11 2.6.1.Nghiên cứu trong nƣớc ............................................................................. 11 2.6.2.Nghiên cứu ngoài nƣớc ............................................................................ 12 2.7.Vai trò của protease Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 ........................................ 14 2.8.Phản ứng PCR ..................................................................................................... 14 2.8.1.Giới thiệu chung về PCR .......................................................................... 14 2.8.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả PCR ................................................... 15 2.8.3.Các ứng dụng của phƣơng pháp PCR ...................................................... 16 2.8.4. Những hạn chế của phƣơng pháp PCR ................................................... 16 2.9. Đọc trình tự bằng máy đọc tự động .................................................................. 17 2.10.Phân tích RFLP................................................................................................. 17 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................. 19 3.1.Thời gian và địa điểm ........................................................................................ 19 3.1.1.Thời gian .................................................................................................. 19 3.1.2.Địa điểm .................................................................................................. 19 3.2. Vật liệu và hóa chất .......................................................................................... 19 3.2.1.Vật liệu ..................................................................................................... 19 3.2.1.1.Mẫu thí nghiệm............................................................................. 19 3.2.1.2.Các Primer dùng trong thí nghịêm ............................................... 19 3.2.2.Hóa chất và môi trƣờng ........................................................................... 19
3.2.2.1.Các hóa chất dùng chiết tách DNA từ khối sợi nấm ................... 19 3.2.2.2. Các hóa chất dùng trong điện di .................................................. 20 3.2.2.3. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR ..................................... 20 3.2.2.4.Môi trƣờng ................................................................................... 20 3.2.3.Các thiết bị chính ...................................................................................... 21 3.3.Nôi dung nghiên cứu ......................................................................................... 21 3.4.Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 21 3.4.1.Phục hồi các chủng nấm ........................................................................... 21 3.4.2.Chủân bị môi trƣờng lỏng ....................................................................... 22 3.4.3.Phƣơng pháp ly trích DNA ....................................................................... 22 3.4.4.Phƣơng pháp tinh sạch DNA .................................................................... 23 3.4.5.Thực hiên phản ứng PCR ......................................................................... 24 3.4.5.1.Nấm Metarrhizium anisopliae..................................................... 24 3.4.5.2.Nấm Beauveria bassiana vuille ................................................... 25 3.4.6.Điện di và đọc kết quả ............................................................................. 26 3.4.6.1.Điện di trên gel agarose .............................................................. 26 3.4.6.2.Đọc kết quả điện di .................................................................... 26 3.4.7.Thành phần phản ứng đọc trình tự .......................................................... 27 3.4.7.1.Tinh sạch sản phẩm PCR............................................................ 27 3.4.7.2.Thành phần phản ứng đọc trình tự ............................................ 27 3.4.8.Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự.............................................................. 28 3.4.9.Điện di và ghi nhân kết quả ..................................................................... 29 3.4.10. Phân tích RFLP ..................................................................................... 29 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................................. 30 4.1. Kết quả phục hồi và nhân sinh khối nấm .......................................................... 30 4.2. Kết quả ly trích DNA ....................................................................................... 30 4.3. Kết quả tinh sạch DNA .................................................................................... 32 4.4. Kết quả PCR ..................................................................................................... 33 4.5. Kết quả phân tích RFLP ................................................................................... 34 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 36 5.1.Kết luận............................................................................................................... 36 5.2.Đề nghị .............................................................................................................. 36 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 37
DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria và Metarrhizium ...................... 9 Hình 2.2 Nấm Beauveria bassiana vuille ký sinh trên ong .......................... 13 Hình 4.1 Nấm Beauveria và Metarrhizium ...................................................... 30 Hình 4.2 Kết quả ly trích ................................................................................... 31 Hình 4.3 Kết quả tinh sạch ................................................................................ 32 Hình 4.4:Kết quả PCR ....................................................................................... 34 Hình 4.5:Kết quả phân tích RFLP ..................................................................... 35
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BDQ96 : Bọ dừa Quận 9 6 BDTN4 : Bọ dừa Tây Ninh 4 SCLLLA1 : Sâu cuốn lá lúa Long An 1 RNBT1.7 : Rầy nâu Bến Tre 1.7 DONG3.1 : Dòng 3.1 BXĐTG6 : Bọ xít đen Tiền Giang 6 RMTĐ3 : Rầy mềm Thủ Đức 3 PULQ2 : Rệp vải mềm nâu tím Quận 2 SR : Sâu róm BRVT6 : Bọ rầy Vũng Tàu 6 BHBD6 : Bọ hà Bình Dƣơng 6 PM : pico mol Ng : nano gram nm : nano mol g : micro gram m : micro mol M : micro mol/lít l : micro lít TE : tris EDTA dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate TAE : tris acetic EDTA UI : unit international bp : base pair Kb : kilo base CZA : Czapek – Dox SDS : Sodium dodecyl sulphate PGA : Potato glucose agar SDA : Soduim dedocyl sulphate RFLP : Restriction Fragment Lengh Polymorphism RAPD : Random Amlification of Polymorphic DNA Tm : melting temperature PCR : Polymerase Chains Reaction RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism EDTA : Ethylene Diamine Tetracetic Acid ITS : Intenal Transcribed Spacer Taq : Thermus aquaticus TAE : Tricacetic ethylene diamine tetra acetat TE : Tris ethylene diamine tetra acetate ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1:Thành phần phản ứng PCR ở nấm Metarrhizium ................................ 24 Bảng 3.2:Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ở nấm Metarrhizium .............................. 25 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR ở nấm Beauveria .................................... 25 Bảng 3.4:Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ở nấm Beauveria .................................... 26 Bảng 3.5:Thành phần phản ứng đọc trình tự ....................................................... 28 Bảng 3.6:Quy trình chung phản ứng cắt .............................................................. 29
1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay với tốc độ phát triển nhƣ vũ bão của khoa học và công nghệ đã kéo theo hàng loạt những thay đổi trong đời sống xã hội của con ngƣời: kinh tế, chính trị, xã hội,… rồi đến đời sống vật chất, tinh thần,… Thông qua đó đặt ra một vấn đề hết sức cấp thiết làm sao giải quyết tốt vấn đề lƣơng thực thực phẩm cho con ngƣời. Thực tế cho thấy việc áp dụng thành công trong khoa học – công nghệ vào sản xuất nông nghịêp nhằm nâng cao năng xuất cây trồng đã đƣợc ứng dụng từ nhiều năm nay và đã đem lại nhiều kết quả đáng kể nhƣ: tạo giống bƣởi không hạt, bƣởi da xanh có chất lƣợng tốt, mùi vị ngon, ngọt và không xử lý hóa chất (Viện Cây Ăn Quả Miền Nam); hay tạo giống lúa ngắn ngày có khả năng chống chịu tốt, hạt gạo mềm, dẻo, thơm, đặc biệt là năng suất tăng so với nhiều giống trƣớc đó bằng việc xử lý yếu tố di truyền trong gen (Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long )….Đây chính là những thành tựu trong lĩnh vực Bảo Vệ Thực Vật nói chung và của Công nghệ Sinh học nói riêng . Chính vì tính chất quan trọng của ngành Bảo Vệ Thực Vật (cũng nhƣ Công Nghệ Sinh Hoc) trong Nông Nghiệp và đời sống, nên chúng tôi đã thực hiện đề tài “Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria basiana ký sinh trên côn trùng gây hại”. Từ việc xác định chính xác trình tự của nucleotide trên gen phát sinh độc tố của nấm ký sinh trên côn trùng gây hại cho hoa màu, ta có thể chủ động hơn trong quá trình tác động lên gen gây độc, nhằm diệt nấm đạt hiệu quả cao nhất, giảm thiệt hại do côn trùng phá hoại, nâng cao năng suất cây trồng, tạo sản phẩm sạch, an toàn và thân thiện với môi trƣờng. 1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài 1.2.1. Mục đích Làm cơ sở khoa học cho việc xác định đa dạng di truyền và xác định gen gây độc nhằm tạo ra đƣợc thuốc trừ sâu sinh học có hoạt tính ổn định và hiệu quả đối với từng loại cây trồng, đáp ứng nhu cầu trong công tác bảo vệ thực vật hiện nay.
2 1.2.2. Mục tiêu Bằng kỹ thuật RFLP và đọc trình tự cho phép xác định gen Pr1 và vùng gen ITS1 - 5.8S - ITS2 sau đó tìm sự khác biệt trong trình tự nucleotide của đoạn gen Pr1 giữa các dòng nấm Metarrhizium anisopliae, và trình tự nucleotide của vùng gen ITS1- 5.8S -ITS2 giữa các dòng nấm Beauveria bassiana. 1.2.3. Yêu cầu nghiên cứu Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana từ nhiều cây trồng khác nhau. Phát hiện gen gây độc Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana bằng phƣơng pháp PCR. Sử dụng kỹ thuật RFLP thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn để phát hiện sự đa hình trong phạm vi vùng gen độc Pr1 của các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và ITS1 – 5.8S – ITS2 của các dòng nấm Beauveria bassiana. Xác định trình tự nucleotide của vùng gen gây độc Pr1 và ITS1 – 5.8S – ITS2 trên hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria basisiana. 1.3. Đối tƣợng nghiên cứu Một số loài thuộc hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana vuille thu thập ở các tỉnh thành khác nhau nhƣ: Long An, Trà Vinh, Tây Ninh, Tiền Giang, Bến Tre, Quận 2 thành phố Hồ Chí Minh, Quận 9 thành phố Hồ Chí Minh gây hại cho côn trùng trên các đối tƣợng cây trồng khác nhau.
3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học trong bảo vệ thực vật hiện nay Dƣới áp lực tạo ra nguồn sản phẩm nông nghiệp với sản lƣợng cao, chất lƣợng tốt, giảm giá thành và giảm ảnh hƣởng đến môi trƣờng, chúng ta phải tăng cƣờng sử dụng biện pháp sinh học một cách có hệ thống. Quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) trên cây trồng nông lâm nghiệp theo định hƣớng tăng cƣờng sử dụng các tác nhân sinh học và chế phẩm có nguồn gốc thảo mộc là một hƣớng nghiên cứu ứng dụng mới mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, bảo vệ môi trƣờng và cân bằng sinh thái. Có nhiều cách để sử dụng biện pháp sinh học, bao gồm: Sử dụng ký sinh thiên địch chuyên tính, thƣờng là ký sinh. Sử dụng ký sinh thiên địch không chuyên tính, thƣờng là các loài ăn thịt sâu hại. Biện pháp dòng hoá đực làm cho sâu hại không thể sinh sản đƣợc. Sử dụng vi sinh vật có ích. Biện pháp dẫn dụ giới tính để phòng trừ sâu hại. Biện pháp sinh học trong IPM giúp cho việc loại bỏ một số nhƣợc điểm của các biện pháp hoá học thƣờng dùng trƣớc đây. Ƣu điểm của biện pháp vi sinh vật gồm: Ngăn chặn sự phát triển tính kháng trong quần thể sâu bệnh và cỏ dại. Giảm bớt hoặc giảm hoàn toàn sử dụng thuốc hoá học, giữ đƣợc quần thể sâu hại phát triển ở mức thấp nhất, tránh bộc phát thành dịch. Bảo vệ đƣợc côn trùng có ích và các vi sinh vật có ích khác, hạn chế sâu bệnh thứ cấp trở thành sâu bệnh chính. Bảo vệ đƣợc sức khỏe con ngƣời và tránh ô nhiễm môi trƣờng. (Trần Văn Mão, 2004). 2.2. Giới thiệu về nấm ký sinh trên côn trùng Cũng nhƣ vi khuẩn, nhiều nấm liên quan với côn trùng nhƣ sinh vật cộng sinh hoặc hoại sinh, nhƣng có nhiều loài nấm thực sự là ký sinh, gây hiện tƣợng bệnh lý và dẫn đến sự chết của côn trùng. Theo Steinhaus (1949) (trích dẫn Nguyễn Lân Dũng,
4 1981) nấm ký sinh côn trùng trong tự nhiên có thể gây chết thƣờng xuyên với tỷ lệ cao cho nhiều loài côn trùng gây hại và là những tác nhân điều hoà quần thể vi sinh vật trong tự nhiên rất hiệu quả. Côn trùng chết do nấm rất dễ nhận biết bằng mắt thƣờng, vì các sợi nấm mọc qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể côn trùng. Cơ thể côn trùng chết do nấm không bị tan rã, mà thƣờng giữ nguyên hình dạng ban đầu, toàn bộ bên trong cơ thể chứa đầy sợi nấm (Nguyễn Lân Dũng, 1981).Nấm gây bệnh cho côn trùng thuộc nhiều nhóm nấm khác nhau: từ nhóm nấm nguyên thủy sống dƣới nƣớc đến nhóm nấm bậc cao sống trên cạn. Nấm gây bệnh cho côn trùng có mặt ở trong cả 4 lớp nấm: nấm bậc thấp Phycomycetes, nấm túi Ascomycetes, nấm đảm Basidiomycetes và nấm bất toàn Deurteromycetes. - Lớp nấm bậc thấp Phycomycetes: trong lớp nấm này, các loài ký sinh trên côn trùng tập trung ở ba bộ: Chytridiales, Blastocladiales và Entomophthorales. Đặc biệt có những họ nấm gồm tất cả các loài đều là ký sinh trên côn trùng nhƣ Entomophthoraceae và Coelomomycetaceae. - Lớp nấm túi Ascomycetes: trong lớp nấm túi có bộ Laboubiniades là những nấm ngoại ký sinh côn trùng có chuyên tính cao, còn các loài nấm túi khác đều là nội ký sinh của côn trùng. Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho côn trùng là: Cordyceps, Aschersonia (bộ Hypocreales). - Lớp nấm đảm Basidiomycetes: trong lớp nấm đảm chỉ ở hai giống có các loài gây bệnh trên côn trùng, đó là giống Septobasidium và Uredinella. - Lớp côn trùng đều thuộc bộ Moniliades. Những giống Beauveria, Spicana, Metarrhizium, Cephalosporium và Sorosporella chứa các loài nấm khi xâm nhiễm vào côn trùng đã tạo thành độc tố và gây chết vật chủ trong khoảng thời gian nhất định. 2.2.1. Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae. Metschinikov đã phát hiện nấm này đầu tiên vào năm 1878 trên bọ hung hại lúa mì,Chúng gây bệnh cho côn trùng sống trong đất. Bào tử của nấm sau 24 giờ tiếp xúc với bề mặt cơ thể côn trùng thì bắt đầu mọc mầm và xâm nhập vào bên trong các bộ phận nội quan. Sau khi vật chủ chết, sợi nấm mọc ra ngoài cơ thể côn trùng tạo thành lớp nấm màu trắng hơi hồng nhạt. Trên đó tạo thành các khuẩn lạc màu xanh xám. Quá trình phát triển của bệnh trong cơ thể côn trùng là 4 – 6 ngày tùy thuộc vào loài và tuổi vật chủ cũng nhƣ nguồn bệnh ban đầu. Vào giai đoạn cuối cùng của quá trình phát triển bệnh lý thì côn trùng chết
5 - Nấm Metarrhizium anisopliae có 2 dạng: M. anisopliae var. major có bào tử dài với kích thƣớc bào tử túi 10,0 – 14,0 (18,0) m và M. anisopliae var. anisopliae có bào tử ngắn với kích thƣớc bào tử túi là 3,5 – 9.0(thƣờng 5,0 – 8,0) m. Nấm xanh (nấm Metarrhizium anisopliae) sinh ra các độc tố destruxin A và B (Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000). - Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên 200 loài côn trùng thuộc các bộ: Orthoptera (11 loài), Dermaptera (1 loài), Hemiptera (21 loài), Lepidoptera (27 loài), Diptera (4 loài), Hymenoptera (6 loài) và Coloptera (134 loài). Nấm xanh có thể nuôi cấy trên môi trƣờng thức ăn nhân tạo. - Metarrhizium anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất cho côn trùng thuộc bộ Coleoptera. Hơn 204 loài côn trùng thuộc họ Elaleridae và Curculionidae bị nhiễm bệnh bởi Metarrhizium anisopliae (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Ngoài ra Metarrhizium anisopliae còn gây bệnh trên ấu trùng muỗi Aedes aegypti, Anopheles stephensi và Clex pipiens thuộc Diptera, côn trùng hại lúa Scotinophara coarctata thuộc họ Heminoptera, châu chấu Schistocera gragaria thuộc họ Testigolidae, loài mối Nasutitermes exitiosus thuộc họ Termitidae. Nấm này phân bố rộng trong tự nhiên. - M. anisopliae với bào tử dạng trụ và khuẩn lạc xanh đen hoặc đôi khi màu tối hoặc hồng vỏ quế. Khuẩn lạc mọc chậm, trên môi trƣờng PGA sau 10 ngày nuôi cấy ở 20oC có đƣờng kính 2 cm. Đã có nhiều nghiên cứu về sự phân bố của chúng: Nepal, New Zealand, New Caledonia, Bahamas, Mỹ, Canada, Bắc Ireland, Italia, Turkey, Liên Xô (cũ). Ở những nơi không có côn trùng cũng phân lập đƣợc Metarrhizium anisopliae: nang của Nematod (Heterodenas chachatii và Globodera rostochensis), các hạt ngoài đồng và trong đất trồng ở Canada, đất trồng chuối ở Honduras, đất trồng dâu ở Braril, đất trồng cỏ ở New Zealand. Ngay ở những nơi có thời tiết khắc nghiệt của nƣớc Đức, ở đất rừng sau khi đốt cháy, trong chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm), trầm tích cửa sông, đất đầm lầy trồng cây đƣớc, tổ của một số loài chim và rễ của dâu tây cũng đều phân lập đƣợc Metarrhizium anisopliae. * Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm Metarrhizium anisopliae: Không thể sinh trƣởng tốt trên nền cơ chất không có chitin.
6 Sống đƣợc ở nhiệt độ thấp (8oC), biên độ của độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy nhiều CO2 và O2 chúng có thể sống sót tới 445 ngày. Khi hoại sinh trong đất, bào tử dính bị ức chế nảy mầm bởi khu hệ nấm đất, trong đó có chủng Aeromonas (thí nghiệm in vitro). Ở dƣới 10oC và trên 35oC thì sự hình thành bào tử không thể xảy ra. Nhiệt độ tốt nhất cho sự nảy mầm bào tử là 25 – 30oC và chết ở 49oC trong 10 phút. Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trƣởng là 25oC và pH 3,3 – 8,5. Metarrhizium anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, cellulose và kitin (lông và da côn trùng). (Trần Văn Mão, 2004). 2.2.2 Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana vuille - Nấm Beauveria bassiana cũng nhƣ Metarrhizium anisopliae là nấm thiên địch ký sinh trên côn trùng gây hại, bào tử nấm thƣờng có kích thƣớc thƣờng dài hơn 3µmdạng bào tử túi.Nấm Beauveria bassiana thuộc lớp: Deuteromycetes, họ Moniliacea, bộ Moniliales, Giống: Beauveria. Giống Beauveria thƣờng đƣợc chia thành 3 loài: Beauveria bassiana, Beauveria brongniarti, Beauveria alba, trong đó 2 loài đầu là tác nhân gây bệnh côn trùng (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997)là nấm trắng thƣờng gây bệnh cho:rầy nâu, sâu cuốn lá, sâu dục thân,bọ xích hại lúa, bọ xích đen,….Nó hủy hoại các mô mềm và dịch cơ thể ký chủ, chúng phát triển bên ngoài rồi mọc đầy trên cơ thể ký chủ, hút hết dƣỡng chất cho đến khi ký chủ chết, khi ký chủ chết nó hình thành bào tử và phát tán bào tử trong không khí nhờ nƣớc và gió.Tuy nhiên để phát tán nó đòi hỏi cần phải có ẩm độ kéo dài để bào tử có thể lan đi nhờ gió và nƣớc. - Bào tử trần hình cầu (đƣờng kính 1 - 4 m) đến hình trứng (1,5-5,5 x 1,3 m). Sợi nấm có chiều ngang khoảng 3 - 5 m phát triển dày đặt trên môi trƣờng, mang nhiều cuống sinh bào tử và bào tử. Mặt khuẩn lạc nấm dạng phấn trắng, Nấm khi mọc trên côn trùng thƣờng có màu trắng hoặc vàng nhạt, đôi khi hơi sẫm, bề mặt trơn và có nhiều bột, hiếm khi tập hợp thành bó sợi( Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Nhiệt độ tối ƣu cho nấm phát triển là khỏang trên dƣới 250C tốt nhất từ 250C- 300C trong trƣờng PDA (Potato-Dextrose-Agar), trong khỏang 3-6 ngày nuôi cấy
7 nấm phát trịển mạnh lúc này nấm có màu vàng nhạt hoặc màu trắng, đƣờng viền đôi khi có màu kem hoặc hơi đỏ. Bào tử thƣờng có hình cầu, hình trứng, có khi chiều dài lên tới 20 m với 1 m chiều rộng. Có khỏang 9 lòai Beauveria bassiana đƣợc phân lập, sử dụng trong nghiên cứu trong kỹ thuật rRNA Sequencing. Theo Veliska (1967), giá trị pH môi trƣờng từ 3 - 9 không ảnh hƣởng tới sự phát triển tạo sinh khối của nấm Beauveria bassiana và theo Goral(1970) nấm Beauveria bassiana thuộc vi sinh vật có khả năng điều chỉnh pH môi trƣờng, pH thuận lợi cho sự phát triển là 5,7 - 6,0. Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu cho rằng khả năng phát triển tốt nhất của nấm Beauveria bassiana là 6,2 - 6,4 (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng khắp. Giống nhƣ hầu hết các loại nấm diệt sâu khác, khi rơi vào một nơi nào đó, chúng đều có khả năng trở thành thành viên trong sinh quần nơi đó và tự sinh sôi nảy nở tăng lên. Vì là vật ký sinh chuyên hóa rộng nên nấm này có khả năng tồn tại khi thiếu vật chủ chính. Khả năng nhiễm thành công của nấm với côn trùng là khá lớn vì chúng có nhiều cách xâm nhiễm khác nhau: qua lớp cutin, qua đƣờng tiêu hóa, qua đƣờng hô hấp và qua lỗ của thân. Ngoài ra, nấm Beauveria bassiana còn có khả năng tồn tại trong điều kiện môi trƣờng không thuận lợi dƣới dạng giả hạch nấm (các sợi nấm dinh dƣỡng kết lại thành một thể rắn chắc).Có thể sử dụng rộng rãi nấm Beauveria bassiana trong thực tiễn nông nghiệp vì: chúng có thể phát triển trên môi trƣờng dinh dƣỡng, có thể đƣợc chế tạo ở dạng chế phẩm sinh học, và tiêu diệt một lƣợng không nhiều các côn trùng có ích (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Chất diệt côn trùng của nấm Beauveria bassiana là chất chúng tiết ra khi bào tử nảy mầm. Tên thông thƣờng của độc tố là beauverixin, công thức hóa học C45H57O9N3 - ciclo (N - metyl - L - phenylalanin - D - - hydroxyizovalery)3 . Đó là một loại depxipeptit vòng có điểm sôi 93 - 94oC (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Vì tính chất quan trọng của nấm trong vai trò điều khiển cân bằng sinh học trong tự nhiên nói chung và trong bảo vệ thực vật nói riêng nên hiện nay nhiều nghiên cứu trên thế giới về nấm đƣợc áp dụng, một số kỹ thụât đƣợc áp dụng trong
8 nhận diện nấm Beauveria bassiana vuille những nghiên cứu gần đây là :sử dụng Isozymes (St Legent et al ., 1992;Poprawski et al .,1998), rRNA Sequences (Rakotonirainy et al .,1991), phân tích RFLP (Kosir,Macpherson và Khatchatourians.,1991 ; Maurer et al .,1997). Trong đó vịêc áp dụng kỹ thuật RFLP kết hợp với PCR cho kết quả khả quan hơn cả . 2.3. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm Nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana đƣợc nghiên cứu sản xuất để trừ một số sâu hại quan trọng trong nông nghiệp. Hiệu quả của chế phẩm đã thử đối với rầy nâu, sâu đo đay, châu chấu xanh, châu chấu ở điều kiện trong phòng thí nghịêm và ở nhà lƣới. Chế phẩm có tác dụng giảm tỷ lệ rầy nâu 55,2 – 58,8%, rầy lƣng trắng 64 – 92%, rầy xanh 75 – 96% và sâu đo xanh hại đay 43,9 – 64,2%. Hiệu lực diệt các loài rầy hại lúa trên đồng ruộng của nấm Beauveria bassiana biến động từ 33 – 75% tùy theo vụ và năm khác nhau. Hiệu lực của nấm kéo dài 3- 4 tuần sau khi phun nấm, vì vậy chỉ cần phun nấm một lần trong một vụ là đủ để quản lý các loài rầy hại lúa trong vụ. Dùng nấm B. bassiana vuille để quản lý các loài rầy hại lúa đã làm tăng năng suất từ đối chứng (tùy theo từng vụ và từng năm). Nấm B. bassiana không gây ảnh hƣởng gì cho lúa và cũng không gây hại đối với các thiên địch sâu, gầy hại lúa (Trần Văn Mão, 2004). Nấm M. anisopliae có khả năng gây bệnh làm chết 84,6% châu chấu Nomadacris succincta sau 10 ngày xử lý và nấm M. flavoviride gây chết 100% châu chấu thí nghiệm sau 7 ngày. Chế phẩm nấm diệt châu chấu đƣợc tiến hành ở Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai cho kết quả tƣơng đối tốt nhƣng không đều (Trần Văn Mão, 2004). Nghiên cứu gần đây của Hệ Thống Nghiên Cứu Nông Nghiệp Hội Đồng Khoa Học Công nghệ Việt Nam cho kết quả nhƣ sau:nấm Beauveria bassiana ký sinh trên sâu róm hại thông có khả năng trừ sâu là đến 93.6%. Còn tác dụng khi sử dụng kết hợp hai lọai nấm Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae trong vịêc trừ hại cho bọ dừa đạt hiệu quả từ 56%-97% (www.vnast .gov.vn/index .asp……) Ở Bolivia, các nhà nghiên cứu thuộc công ty PROBIOMA đã sản xuất thành công nhiều chế phẩm sinh học từ nhiều loài nấm thiên dịch khác, trong đó có hai loài nấm phổ biến là Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae và chế phẩm trên thị trƣờng là: ProbioBass, ProbioMet