Xác định chỉ thị phân tử cho đậu đỗ

Chia sẻ: Nguyen Lan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:22

Thêm vào BST

Báo xấu

81
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Về nguyên lý, kỹ thuật RFLP dựa trên thực tế của sự biến dị và tái tổ hợp tự nhiên trong bộ gen ADN là nguyên nhân vài vị trí enzyme cắt giới hạn bị mất, được tạo ra hay được sắp xếp lại(6). Điều này dẩn đến khi sợi ADN bị cắt thành nhiều đoạn nhỏ bởi các enzym hạn chế thì giữa các giống/loài sẽ có những phân đoạn khác nhau về kích thước hay chiều dài.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xác định chỉ thị phân tử cho đậu đỗ

ViÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam ViÖn c«ng nghÖ sinh häc B¸o c¸o kÕt qu¶ nghiªn cøu 2001-2004 ®Ò tµi nh¸nh X¸c ®Þnh chØ thÞ ph©n tö cho ®Ëu ®ç Thuéc ®Ò tµi KC.04.08 Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh: TS. TrÇn ThÞ Ph−¬ng Liªn C¬ quan thùc hiÖn: ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam Hµ Néi 2004 1
B¸o c¸o tæng kÕt 2001-2004 ®Ò tµi nh¸nh: “x¸c ®Þnh chØ thÞ ph©n tñ cho ®Ëu ®ç” Tªn ®Ò tµi :”Nghiªn cøu sö dông c«ng nghÖ tÕ bµo vµ kü thuËt chØ thÞ ph©n tö phôc vô chän t¹o gièng c©y trång “ M· sè : KC 04-08. Chñ nhiÖm : psg.tskh. Lª ThÞ Muéi C¬ quan thùc hiÖn: ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam Tªn ®Ò tµi nh¸nh : X¸c ®Þnh chØ thÞ ph©n tö cho ®Ëu ®ç Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh: TS. TrÇn ThÞ Ph−¬ng Liªn C¬ quan thùc hiÖn : ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam 2. C¸n bé tham gia: - TS N«ng V¨n H¶i - ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc - TS TrÇn ThÞ Ph−¬ng Liªn- ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc - ThS Huúnh ThÞ Thu HuÖ – ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc - CN L−¬ng ThÞ Thu H−êng- ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc vµ ctv. 3. Thêi gian thùc hiÖn: Tõ 11-2001 ®Õn 2004 2
1. Môc ®Ých : ThiÕt lËp c¸c chØ thÞ ph©n tö h÷u hiÖu ®Ó chän t¹o c¸c dßng ®Ëu ®ç cã n¨ng suÊt cao, phÈm chÊt tèt, chèng chÞu s©u bÖnh vµ ®iÒu kiÖn bÊt lîi. 2. Néi dung ®¨ng ký nghiªn cøu: - Khai th¸c c¸c chØ thÞ ph©n tö liªn quan ®Õn tÝnh kh¸ng bÖnh rØ s¾t, chÞu h¹n tõ c¸c ng©n hµng gen quèc tÕ nh− EMBL/Genbank/DDBJ. - ThiÕt kÕ c¸c måi ngÉu nhiªn RAPD vµ SSR ®Ó t×m kiÕm c¸c dßng gièng kh¸ng bÖnh trong tËp ®oµn ®Ëu tu¬ng ViÖt Nam. - §¸nh gi¸ tuyÓn chän c¸c tæ hîp lai theo ®Þnh h−íng tÝnh kh¸ng bÖnh vµ chÞu h¹n. §¸nh gi¸ sím tÝnh chÞu h¹n vµ kh¸ng bÖnh ë c¸c thÕ hÖ F2,F3 b»ng chØ thÞ ph©n tö. 3
3. §Æt vÊn ®Ò: §Ëu t−¬ng lµ c©y trång truyÒn thèng l©u ®êi ë n−íc ta. Do nhu cÇu sö dông ®Ëu t−¬ng còng nh− c¸c s¶n phÈm cña chóng ngµy cµng t¨ng nªn viÖc chän gièng vµ s¶n xuÊt ®Ëu t−¬ng trªn thÕ giíi còng nh− ë n−íc ta ®· ®−îc thóc ®Èy m¹nh mÏ (Ng« ThÕ D©n et al., 2000). Thµnh tùu gÇn ®©y nhÊt lµ viÖc thiÕt lËp ®−îc b¶n ®å liªn kÕt gen ë ®Ëu t−¬ng trªn c¬ së kÕt hîp c¸c tÝnh tr¹ng h×nh th¸i sinh lý truyÒn thèng vµ ®Æc biÖt lµ c¸c chØ thÞ ph©n tö (RFLP-Restriction fragment length polymorphism, RAPD- Random amplified polymorphism DNA, AFLP- Amplified fragment length polymorohism, SSR- simple sequence repeat…) (Cregan et al., 1999). NhiÒu QTL (quantitative trait loci - locus tÝnh tr¹ng sè l−îng) ®· ®−îc nghiªn cøu dùa trªn b¶n ®å nµy. Mét trong nh÷ng chØ thÞ ph©n tö thµnh c«ng nhÊt ë ®Ëu t−¬ng lµ chØ thÞ SSR (simple sequence repeats – tr×nh tù lÆp l¹i ®¬n gi¶n). SSR lµ ®o¹n DNA ë genome hoÆc lôc l¹p, mµ trong ®ã, tr×nh tù tõ 1-6 bp lÆp l¹i víi tÇn sè tõ 10-60 lÇn vµ tÇn sè nµy ®−îc di truyÒn theo Mendel nh− tÝnh tr¹ng ®ång tréi. Nhê cã c¸c tr×nh tù b¶o thñ giíi h¹n ë hai ®Çu cña ®o¹n tr×nh tù lÆp l¹i nµy mµ chóng ®−îc nh©n lªn b»ng PCR vµ x¸c ®Þnh trªn ®iÖn di c¸c allele SSR. Ngµy nay, c¸c nhµ khoa häc ®· ph¸t hiÖn ®−îc trªn 600 chØ thÞ SSR trong 20 nhãm liªn kÕt ë ®Ëu t−¬ng. ChØ thÞ SSR cho ®é ®a h×nh rÊt cao ë ®Ëu t−¬ng nªn ®−îc sö dông ®Ó nghiªn cøu ®a d¹ng sinh häc, sù liªn kÕt c¸c tÝnh tr¹ng sè l−îng nh− chÞu h¹n, phÈm chÊt h¹t,… nh»m môc ®Ých chän gièng c©y trång. Nghiªn cøu chän t¹o gièng ®−îc tiÕn hµnh nhiÒu n¨m nay. Tuy nhiªn vÊn ®Ò chän t¹o bé gièng ®Ëu t−¬ng phï hîp víi c¸c vïng sinh th¸i n−íc ta lµ rÊt cÊp b¸ch. NhÊt lµ khi n−íc ta kh«ng chØ cã nhiÒu vïng ®Þa h×nh khÝ hËu kh¸c nhau mµ cßn hay s¶y ra b·o lôt, giã mïa, nãng, h¹n kÐo dµi. ViÖc chän gièng dùa trªn c¸c chØ tiªu sinh lý n«ng häc th−êng ®ßi hái thêi gian gÇn 10 n¨m mµ c¸c gièng vÉn kh«ng biÕt ®−îc t−êng tËn vÒ b¶n chÊt di truyÒn. V× vËy, xuÊt ph¸t tõ yªu cÇu thùc tÕ, chóng t«i kÕt hîp víi Trung t©m nghiªn cøu vµ thùc nghiÖm ®Ëu ®ç, tiÕn hµnh mét nhµnh trong ®Ò tµi KC04.08: “X¸c ®Þnh 4
chØ thÞ ph©n tö cho ®Ëu ®ç” víi môc ®Ých chän läc vµ thiÕt lËp ®−îc c¸c chØ thÞ ph©n tö cho c¸c tÝnh tr¹ng cÇn thiÕt nh− chÞu h¹n… ®Ó t¹o gièng ®Ëu t−¬ng cã n¨ng xuÊt cao, phÈm chÊt tèt chèng chÞu s©u bÖnh … thÝch hîp víi vóng ®Þa h×nh khÝ hËu kh¸c nhau ë n−íc ta. 4. nguyªn liÖu vµ ph−¬ng ph¸p: Nguyªn liÖu: Nguyªn liÖu bao gåm c¸c gièng ®Ëu t−¬ng vµ c¸c tæ hîp lai do Trung t©m Nghiªn cøu vµ Thùc nghiÖm ®Ëu ®ç (TTNCvµ TN §Ëu ®ç) cung cÊp theo tiÕn ®é cïng thùc hiÖn ®Ò tµi KC04-08. (§Ò tµi nh¸nh cña ®Ò tµi KC04.08 do TS TrÇn ThÞ Tr−êng chñ nhiÖm) §ã lµ b¶y gièng ®Ëu t−¬ng : Cóc Vµng, §T12, §T80, §T2000, VX91, V74, CM60 ®−îc chän lµm nguyªn liÖu khëi ®Çu ®Ó t¹o gièng chÞu h¹n, kh¸ng bÖnh gØ s¾t ®ång thêi cã n¨ng suÊt cao. Trong ®ã, c¸c gièng vô hÌ: gièng ®Þa ph−¬ng Cóc Vµng (cßn gäi lµ Cóc Lôc Ng¹n, Cóc Hµ B¾c); §T80 (gièng lai gi÷a Vµng Méc Ch©u vµ V70) ; §T12 (cßn gäi lµ TN12- gièng nhËp néi tõ Trung Quèc, chèng chÞu s©u bÖnh kh¸). Gièng kh¸ng bÖnh gØ s¾t: §T2000 (gièng nhËp néi tõ AVDC) vµ VX91. Gièng n¨ng suÊt cao: CM60 vµ §T2000. Gièng mÉn c¶m víi bÖnh gØ s¾t: V74. B¶y gièng trong c¸c tæ hîp lai cña ba gièng bè mÑ lµ Cóc Vµng, M103, V74 ®−îc chän ®Ó nghiªn cøu b¶n chÊt di truyÒn ë c¸c gièng lai ®· ®−îc thuÇn hãa vµ khu vùc hãa chóng t«i nghiªn cøu b»ng chØ thÞ ph©n tö SSR. §ã lµ c¸c gièng ®Ëu t−¬ng M103, V74, MV1, MV4, MV1-C; Cóc Vµng, §T93. Trong ®ã, tæ hîp lai M103♀ X V74♂ vµ 2 gièng lai MV1, MV4; tæ hîp MV1 X Cóc Vµng vµ gièng lai MV1-C; gièng §T93 lµ gièng lai gi÷a giång 821 cã hÖ gen Cóc Vµng vµ gièng 134 cña NhËt B¶n. Tæ hîp lai §T2000 X Cóc Vµng: gièng mÑ lµ gièng §T2000 cã n¨ng suÊt cao, kh¸ng bÖnh gØ s¾t, nhËp néi tõ Trung t©m Rau MÇu Ch©u ¸ -AVRDC (§µi 5
Loan); gièng bè lµ gièng ®Þa ph−¬ng Cóc Vµng (cßn gäi lµ Cóc Lôc Ng¹n, Cóc Hµ B¾c) thÝch hîp víi vô HÌ vµ 10 dßng lai F3 cña chóng: §C1(§C21.2- Ký hiÖu dßng lai t¹i TTNC&TN §Ëu ®ç); §C2 (§C42.1); §C3 (§C43.4); §C4 (§C51.4); §C5 (§C72.1); §C6 (§C72.2); §C7 (§C79.2); §C8 (§C90.1); §C9 (§C92.2); §C10 (§C98.1) H×nh 1: B¶y gièng ®Ëu t−¬ng lµm nguyªn liÖu khëi ®Çu Tæ hîp lai §T2000 vµ §T12 (TN12): gièng mÑ lµ §T2000, gièng bè lµ §T12 vµ 10 dßng lai F3: §T1 (§T147.3- Ký hiÖu dßng lai t¹i TTNC&TN §Ëu ®ç): §T2 (199.1); §T3 (203.1); §T4 (213.4); §T5 (213.5); §T6 (283.1); §T7 (320.2); §T8 (328.1); §T9 (340.1); §T10 (§T356.1). C¸c gièng ®Ëu t−¬ng cã kh¶ n¨ng kh¸ng bÖnh gØ s¾t kh¸c nhau: G1,G2,G3 lµ c¸c gièng mÉn c¶m víi bÖnh gØ s¾t; G4,G7 - kh¸ng bÖnh ë møc trung b×nh; G8,G9,G10 - kh¸ng bÖnh gØ s¾t tèt. Trong ®ã, G1- V74(tªn gièng t¹i TTNC&TN §Ëu ®ç); G2- §H4; G3- AGS332; G4- §T2000; G7-GC 104.28; G8- GC58; G9- GC8586; G10-8600.49. 6
H×nh 2: Tæ hîp lai §T2000- Cóc Vµng H×nh 3: C¸c gièng ®Ëu t−¬ng víi tÝnh kh¸ng bÖnh gØ s¾t kh¸c nhau 7
Ph−¬ng ph¸p: T¸ch chiÕt DNA tæng sè tõ l¸ non cña c¸c gièng ®Ëu t−¬ng theo ph−¬ng ph¸p CTAB (Keim et al., 1988) víi mét sè c¶i tiÕn nhá cho phï hîp víi ®iÒu kiÖn phßng thÝ nghiÖm. Ph−¬ng ph¸p PCR sö dông c¸c cÆp måi SSR ®−îc tiÕn hµnh trong thÓ tÝch 25µl. Ph¶n øng bao gåm: 20ng DNA; 10pmole måi tæng sè; 1,6mM MgCl2; 250µM dNTP; 10mM Tris-HCl pH 8,8; 50 mM KCl; 0,08% Nonidet P40; 1 ®¬n vÞ Taq DNA polymerase. Chu tr×nh nhiÖt cña ph¶n øng: 95°C: 8 phót, 35 chu kú gåm ba b−íc 95°C: 45 gi©y, 50°C(tu50°C -55°C phô thuéc vµo c¸c SSR kh¸c nhau): 45 gi©y, 72°C: 60 gi©y; sau ®ã 72°C: 8 phót vµ kÕt thóc ë 4°C trªn m¸y PCT-100TM (MJ Research, Inc.) KÕt qu¶ PCR ®−îc kiÓm tra trªn gel agarose 1,5% vµ ®é ®a d¹ng ®−îc theo dâi trªn gel agarose tõ 2,4-3%, vµ 12% polyacrylamide nhuém b»ng ethidium bromide vµ ph¸t hiÖn b¨ng DNA trªn ®Ìn UV. C¸c enzyme vµ ho¸ chÊt chuyªn dông ®−îc mua tõ c¸c h·ng Fermentas, Sigma, Merk. C¸c cÆp måi SSR ®−îc ®Æt tæng hîp t¹i h·ng Invitrogen. Sè liÖu ®−îc xö lý b»ng ch−¬ng tr×nh NTSYS 2.0 vµ ph©n tÝch b»ng c¸ch tÝnh hÖ sè ®a d¹ng di truyÒn – genetic diversity index (Nei,1987) cho mçi chØ thÞ ph©n tö: H=1- Σ Pi2 (Pi lµ tÇn xuÊt gÆp allele thø i cña mçi chØ thÞ ph©n tö) 8
5. KÕt qu¶ nghiªn cøu: 5.1. Nghiªn cøu chän mét sè måi RAPD vµ c¸c cÆp måi SSR: §Ëu t−¬ng lµ c©y trång ®−îc tËp trung nghiªn cøu cã hÖ thèng t¹i Mü. GÇn ®©y ®Ëu t−¬ng cßn ®−îc chó träng nghiªn cøu t¹i Trung Quèc, Australia, Th¸i Lan… Dù ¸n nghiªn cøu ®Ëu t−¬ng lín nhÊt t¹i Bé n«ng nghiÖp Mü ®· ®Çu t− thu thËp tËp ®oµn gièng ®Ëu t−¬ng kh¾p thÕ giíi lµm nguyªn liÖu chän t¹o vµ gi÷ nguån gen quý cña ®Ëu t−¬ng. T¹i ®©y còng tiÕn hµnh x¸c ®Þnh, ®Þnh vÞ sù liªn kÕt c¸c tÝnh tr¹ng víi c¸c tÝnh tr¹ng sè l−îng liªn quan ®Õn phÈm chÊt vµ n¨ng suÊt h¹t, kh¶ n¨ng chèng chÞu víi c¸c ®iÒu kiÖn ngo¹i c¶nh bÊt lîi nh−: h¹n, nãng… - Nghiªn cøu chän mét sè cÆp måi RADP: Mét sè nghiªn cóu trªn ®Ëu t−¬ng cho thÊy sö dông mét sè måi RAPD cã thÓ ph¸t hiÖn ®−îc sù ®a dang gi÷a c¸c gièng ®Ëu t−¬ng khi bÞ t¸c ®éng cña m«i tr−êng (Shatter at al, 1995). Trªn c¬ së ®ã chóng t«i chän 10 måi 10 nucleotide vµ 2 cÆp måi 20 nucleotide. Nghiªn cøu víi 10 cÆp måi RAPD cho thÊy kh¶ n¨ng sö dông kh«ng cao, kh¶ n¨ng lÆp l¹i yÕu, l−îng mÉu h¹t cña c¸c dßng lai l¹i th−êng rÊt Ýt kh«ng ®ñ cho nh÷ng thÝ nghiÖm nµy. - Nghiªn cøu chän mét sè cÆp måi SSR: ViÖc quan träng ®Çu tiªn lµ t×m ®−îc c¸c cÆp måi SSR thÝch hîp trong sè trªn 600 chØ thÞ SSR ®Ó nghiªn cøu sù ®a d¹ng cña nh÷ng gièng ®Ëu t−¬ng sö dông lµm nguyªn liÖu khëi ®Çu víi môc ®Ých chän dßng chÞu h¹n vµ chän dßng kh¸ng bÖnh gØ s¾t. TÝnh chÞu h¹n lµ tÝnh tr¹ng ®−îc nghiªn cøu rÊt s©u ®Ó chän gièng ®Ëu t−¬ng cã kh¶ n¨ng chèng chÞu víi ®iÒu kiÖn bÊt lîi cña m«i tr−êng. §©y lµ tÝnh tr¹ng do nhiÒu gen quyÕt ®Þnh theo c¸c h−íng nh− tr¸nh h¹n, tr¸nh mÊt n−íc vµ chÞu mÊt n−íc. Specht vµ céng sù (2001) ®· ph©n tÝch QTL cña tÝnh chÞu h¹n ë ®Ëu t−¬ng trªn c¬ së thÝ nghiÖm vÒ chÕ ®é t−íi n−íc kh¸c nhau, kiÓm tra sù chuyÓn ho¸ carbon vµ cuèi cïng lµ ®¸nh gi¸ n¨ng suÊt, khèi l−îng vµ phÈm chÊt h¹t khi sö 9
dông 665 chØ thÞ ph©n tö (RFLP, SSR) nghiªn cøu tæ hîp lai gåm cã 265 dßng lai trªn 20 nhãm liªn kÕt. C¸c t¸c gi¶ ®· t×m thÊy c¸c chØ thÞ ph©n tö SSR vµ RFLP cã QTL biÓu thÞ râ nhÊt ®èi víi tÝnh chÞu h¹n ë c¸c nhãm liªn kÕt: C2, L, M. Trªn c¬ së ®ã, chóng t«i ®· chän ra 5 cÆp måi SSR trong vïng m¹nh nhÊt cña c¸c nhãm liªn kÕt kÓ trªn ®èi víi tÝnh chÞu h¹n, tr×nh tù cña chóng ®−îc liÖt kª trªn b¶ng 1. KÝch th−íc allele ®−îc tÝnh lµ kÝch th−íc ®o¹n SSR cña gièng ®Ëu t−¬ng Williams (Mü). Ký hiÖu Satt dïng ®Ó chØ SSR cã ®o¹n nucleotit lÆp l¹i lµ (ATT)n. B¶ng 1: ChØ thÞ SSR liªn quan ®Õn tÝnh chÞu h¹n Stt SSR Tr×nh tù måi xu«i (F) ng−îc (R) Nhãm KÝch th−íc Tõ ®Çu 5’ ®Õn 3’ liªn kÕt allele 1 Satt557 207 bp F- GCgGGATCCACCATGTAATATGTG C2 R- Gcgcactaaccctttattgaa 2 Satt 489 C2 261 bp F- cgtgtgcttgcttctcttagactgact R-gcgtactacttaccctgtttgtctaaaa 3 Satt373 L 248 bp F- tccgcagataattcgtaaaat R-ggccagatacccaagttgtacttgt 4 Satt567 M 113 bp F-ggctaacccgctctatgt R- gggccatgcacctgctact 5 Satt150 M 201 bp F-aagcttgaggttattcgaaaatgac R-tgccatcaggttgtgtaagtgt V× chØ thÞ ph©n tö liªn quan ®Õn tÝnh kh¸ng bÖnh gØ s¾t ch−a ®−îc nghiªn cøu nªn chóng t«i t×m hiÓu c¸c chØ thÞ ph©n tö liªn quan ®Õn tÝnh ®a d¹ng ®Ó kÕt hîp bæ sung chän nguyªn liÖu khëi ®Çu cho h−íng nµy. SSR sö dông ®Ó nghiªn cøu ®a d¹ng sinh häc ë c¸c tËp ®oµn ®Ëu t−¬ng t¹i Mü, NhËt B¶n, Trung Quèc…: Narvel vµ céng sù (2000) ph¸t hiÖn thÊy 397 allele khi nghiªn cøu 79 gièng ®Ëu t−¬ng ë 10
Mü trªn 74 locus SSR. Nh− vËy, mçi locus SSR cã tõ 2 ®Õn 11 allele kh¸c nhau. Trong khi ®ã, sö dông chØ thÞ ph©n tö kh¸c hoÆc chi thÞ isozyme cho sù ®a d¹ng Ýt h¬n h¼n (vÝ dô: RFLP chØ cho 2 allele cho mçi locus). Abe vµ céng sù (2003), ®· chØ ra sù ®a d¹ng khi nghiªn cøu 131 gièng tõ 14 n−íc ch©u ¸ b»ng 20 chØ thÞ SSR. Trung b×nh mçi locus SSR cho 11,9 allele víi hÖ sè ®a d¹ng gen lµ 0,772 vµ cho thÊy r»ng c¸c tËp ®oµn gièng ®Ëu t−¬ng Trung Quèc vµ NhËt B¶n cã nguån gèc kh¸c nhau. Dùa vµo nh÷ng ph©n tÝch trªn, 7 cÆp måi SSR cho tÝnh ®a d¹ng trªn c¸c nhãm liªn kÕt vµ cã tr×nh tù trªn b¶ng 2 ®· ®−îc chän ®Ó thiÕt kÕ. B¶ng 2: ChØ thÞ SSR liªn quan ®Õn tÝnh ®a d¹ng Stt SSR Tr×nh tù måi xu«i (F) ng−îc (R) Nhãm KÝch th−íc Tõ ®Çu 5’ ®Õn 3’ liªn kÕt allele 1 Satt 042 172 bp F- GACTTAATTGCTTGCTAT A1 R- gtggtgcacactcactt 2 Satt 005 D1b 141 bp F- TATCCTAGAGAAGAACTAAAAAA R- gtcgattaggcttgaaata 3 Satt146 F 287 bp F-aagggatccctcaactgactg R-gtggtggtggtgaaaactattagaa 4 Satt175 M 163 bp F-GACCTCGCTCTCTGTTTCTCA R- ggtgaccacccctattccttat 5 Satt173 O 198 bp F-TGCGCCATTTATTCTTCA R-aagcgaaatcacctcctct 6 Satt009 F- CCA ACT TGA AAT TAC TAG AGA AA 158 bp N R- CTT ACT AGC GTA TTA ACC CTT (Att)14 7 Satt 431 F- GCG TGG CAC CCT TGA TAA ATA A J 230 bp R- GCG CAC GAA AGT TTT TCT GTA A (Att)21 11
§©y lµ nh÷ng chØ thÞ SSR cã hÖ sè ®a d¹ng di truyÒn cao. Nh− vËy, viÖc ph¸t hiÖn ra kh¶ n¨ng di truyÒn c¸c tÝnh tr¹ng liªn kÕt cïng c¸c chØ thÞ nµy dÔ dµng h¬n. - Sù ®a d¹ng di truyÒn cña nguyªn liÖu khëi ®Çu: B¶y gièng ®Ëu t−¬ng : Cóc Vµng, §T12, §T80, §T2000, VX91, V74, CM60 ®−îc chän lµm nguyªn liÖu khëi ®Çu ®Ó t¹o gièng chÞu h¹n, kh¸ng bÖnh rØ s¾t ®ång thêi cã n¨ng suÊt cao. Trong ®ã, c¸c gièng vô hÌ: gièng ®Þa ph−¬ng Cóc Vµng (cßn gäi lµ Cóc Lôc Ng¹n, Cóc Hµ B¾c); §T80 (gièng lai gi÷a Vµng Méc Ch©u vµ V70); §T12 (cßn gäi lµ TN12- gièng nhËp néi tõ Trung Quèc, chèng chÞu s©u bÖnh kh¸). Gièng kh¸ng bÖnh gØ s¾t: §T2000 (gièng nhËp néi tõ AVDC) vµ VX91. Gièng n¨ng suÊt cao: CM60 vµ §T2000. Gièng mÉn c¶m víi bÖnh gØ s¾t: V74. §· ph¸t hiÖn ®−îc 38 allele trong sè c¸c kiÓu gen ®−îc nghiªn cøu. TÊt c¶ c¸c cÆp måi ®Òu cho sù ®a h×nh gi÷a c¸c gièng ®Ëu t−¬ng kÓ trªn. Nh− vËy, trung b×nh 3,7 allele cho mçi locus vµ hÖ sè ®a d¹ng di truyÒn trung b×nh lµ 0,6326. PhÇn mÒm NTSYS 2.0 ®−îc sö dông ®Ó nghiªn cøu kho¶ng c¸ch di truyÒn gi÷a c¸c gièng. KÕt qu¶ cho thÊy b¶y gièng ®Ëu t−¬ng trªn chia thµnh 3 nhãm: Cóc Vµng t¸ch riªng mét nhãm, hai gièng ®Ëu t−¬ng §T12 vµ VX91 còng t¸ch thµnh nhãm riªng so víi 4 gièng cßn l¹i- §T2000, V74, §T80, CM60. Nh− vËy, víi môc ®Ých chän gièng ®Ó lai víi gièng ®Ëu t−¬ng §T2000 (gièng cã n¨ng suÊt cao, cã kh¶ n¨ng kh¸ng bÖnh gØ s¾t) theo h−íng chÞu nãng, h¹n cho vô hÌ, chóng t«i nhËn thÊy hai gièng ®Ëu t−¬ng vô hÌ – Cóc Vµng vµ §T12 - cã kho¶ng c¸ch di truyÒn xa §T2000 so víi c¸c gièng kh¸c vµ cã thÓ chän ®Ó lai t¹o gièng nh− mong muèn (h×nh 1, h×nh 2). Nh− vËy, cã thÓ chän 2 cÆp lai lµ §T2000 X Cóc vµng vµ §T2000 X §T12 (hay cßn ký hiÖu lµ TN12). 12
H×nh 4: Phæ ®iÖn di s¶n phÈm PCR sö dông c¸c cÆp måi SSR liªn quan ®Õn tÝnh ®a d¹ng cña c¸c gièng ®Ëu t−¬ng: 1- Cóc Vµng; 2- §T80; 3- §T12; 4- V74; 5- VX91; 6- §T2000; 7- CM60 13
B¶ng 3: KÕt qu¶ ph©n tÝch sù ®a d¹ng sö dông c¸c SSR Stt SSR D¹ng SSR Sè allele HÖ sè ®a d¹ng (H) 1 Satt 042 (Att)27 3 0,6531 2 Satt 005 (Att)19 3 0,5715 3 Satt146 (Att)17 4 0,6939 4 Satt175 (Att)16 5 0,7347 5 Satt173 (Att)18 4 0,7348 6 Satt 557 (Att)17GAT 2 0,4897 7 Satt 489 (Att)23GTT 4 0,6938 8 Satt373 (Att)21 5 0,7756 9 Satt567 (Att)13 2 0,245 10 Satt150 (Att)20 5 0,7347 CV §T80 V74 §T2000 CM60 §T12 VX91 0.54 0.60 0.66 0.72 0.78 Coefficient H×nh 5: Sù ®a d¹ng cña c¸c gièng ®Ëu t−¬ng ®−îc chän lµm nguyªn liÖu khëi ®Çu. 14
- Nghiªn cøu c¸c gièng lai ®· ®−îc thuÇn hãa vµ khu vùc hãa: Qua ph©n tÝch th¨m dß ba gièng bè mÑ lµ Cóc vµng, M103, V74 b»ng SSR cho thÊy chóng cã sù ®a d¹ng, v× vËy chóng t«i ®· nghiªn cøu 7 gièng trong c¸c tæ hîp lai cña chóng: M103, V74, MV1, MV4, MV1-C; Cóc Vµng, §T93. Trong ®ã, tæ hîp lai M103♀X V74♂ vµ 2 gièng lai MV1, MV4; tæ hîp MV1 X Cóc Vµng vµ gièng lai MV1-C; gièng §T93 lµ gièng lai gi÷a giång 821 cã hÖ gen Cóc vµng vµ gièng 134 cña NhËt B¶n. ViÖc nghiªn cøu b¶n chÊt di truyÒn vµ sù æn ®Þnh c¸c tÝnh tr¹ng quý ®−îc di truyÒn tõ bè mÑ ë c¸c gièng lai sau nhiÒu n¨m thuÇn hãa vµ khu vùc hãa lµ ®iÒu rÊt cÇn thiÕt. KÕt qu¶ cho thÊy trong 12 cÆp måi SSR, cã 9 cÆp cßn l¹i cho ®a h×nh râ rÖt. Ph¸t hiÖn tæng sè 25 allele trªn 9 cÆp måi nµy (trung b×nh lµ 2,7 allele/locus). §T93 mang nhiÒu −u diÓm cña Cóc Vµng, MV1 vµ MV4 mang ®Æc ®iÓm cña M103- gièng ®ét biÕn chÞu nãng, h¹t to, n¨ng suÊt cao. MV1-C trung gian, cã ®ång thêi ®Æc ®iÓm cña bè vµ mÑ. §©y lµ gièng cã thÓ sö dông gieo trång tÊt c¶ c¸c vô trong n¨m (h×nh3). §T93 CV MV1_C M103 MV1 MV4 V74 0.27 0.44 0.61 0.78 0.95 Coefficient H×nh 3: S¬ ®å h×nh c©y vÒ ®é t−¬ng ®ång di truyÒn gi÷a c¸c gièng ®Ëu t−¬ng 15
- Sù ph©n ly c¸c chØ thÞ SSR trong c¸c tæ hîp lai §T2000 X Cóc Vµng vµ tæ hîp §T2000 X §T12: Kh¶o s¸t c¸c dßng F3 trong tæ hîp lai §T2000 X Cóc Vµng b»ng 12 cÆp måi SSR cho thÊy chÝn cÆp måi cho sù ®a d¹ng gi÷a c¸c dßng F3, c¸c dßng ®Òu mang tÝnh tr¹ng cña bè vµ mÑ ë c¸c møc ®é kh¸c nhau. C¸c dßng lai mang c¸c chØ thÞ di truyÒn cña Cóc Vµng vµ §T2000 cã thÓ chia thµnh hai nhãm: Cóc Vµng vµ c¸c dßng lai §C5, §C6, §C8 thuéc nhãm 1; §T2000 vµ c¸c dßng lai §C4, §C7, §C10 thuéc nhãm 2. Kh¶o s¸t mét sè locus SSR liªn quan ®Õn QTL (quantitative trait loci - locus tÝnh tr¹ng sè l−îng) vÒ tÝnh chÞu h¹n cho thÊy c¸c dßng lai §C4, §C7, §C10 mang c¸c allele SSR nµy cña §T2000. Nghiªn cøu c¸c SSR liªn quan ®Õn tÝnh ®a d¹ng cßn cho thÊy c¸c dßng §C4, §C5, §C7, §C10 mang tÝnh di truyÒn cña c¶ Cóc Vµng. Nh− vËy, c¸c dßng §C4, §C5, §C7, §C10 cã thÓ ®−îc chän ®Ó theo dâi tiÕp vÒ sù æn ®Þnh di truyÒn trong c¸c thÕ hÖ sau (h×nh 6, h×nh 7). H×nh 4: Phæ ®iÖn di s¶n phÈm PCR sö dông c¸c cÆp måi SSR cña c¸c gièng ®Ëu t−¬ng. Cóc Vµng(1), §T2000(8), vµ c¸c dßng lai F3: 2- §C4; 3-§C5; 4-§C6; 5-§C7; 6-§C8; 7-§C10. 16
CV §C5 §C6 §C8 §C4 §C10 §C7 §T2000 0.35 0.50 0.65 0.80 0.94 Coefficient H×nh 5: Kho¶ng c¸ch di truyÒn cña c¸c dßng ®Ëu t−¬ng F3 so víi bè mÑ. Trong tæ hîp lai §T2000- §T12, c¸c dßng ®Òu mang tÝnh di truyÒn cña c¶ gièng bè mÑ. Kªt qu¶ ph©n tÝch b»ng ch−¬ng tr×nh NTSYS cho thÊy chóng chia thµnh 2 nhãm: nhãm 1 gåm cã §T12 vµ c¸c dßng lai §T2, §T6 vµ §T8; nhãm 2 gåm cã §T2000 vµ c¸c dßng cßn l¹i: §T1, §T3, §T4, §T5, §T7, §T9, §T10. Trong nhãm 2, §T10 cã tÝnh di truyÒn gÇn víi §T2000 nhÊt, sau ®ã ®Õn §T3, §T9; cßn bèn dßng §T1,4,5,7 t¸ch thµnh nhãm riªng, cã kho¶ng c¸ch xa h¬n. C¸c dßng §T1, §T4, §T5, §T7 ®Òu cÇn l−u ý ®Ó nghiªn cøu tiÕp. - Nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn gi÷a mét sè gièng ®Ëu t−¬ng cã kh¶ n¨ng kh¸ng bÖnh gØ s¾t kh¸c nhau: G1,G2,G3 lµ c¸c gièng mÉn c¶m víi bÖnh gØ s¾t; G4,G7 – kh¸ng bÖnh ë møc trung b×nh; G8,G9,G10 – kh¸ng bÖnh gØ s¾t tèt. Sö dông 12 chØ thÞ SSR ®Ó kh¶o s¸t sù kh¸c nhau gi÷a c¸c gièng nµy ®· cho kÕt qu¶ b−íc ®Çu: t¸m gièng nghiªn cøu cã thÓ chia thµnh 2 nhãm: nhãm 1: gåm c¸c gièng ®Ëu t−¬ng G1, G2, G3; nhãm 2: G4, G7, G8, G9, G10 vµ §t2000. Trong nhãm 2 l¹i cã thÓ chia thµnh 2 nhãm: G8,G9 t¸ch riªng so víi 4 gièng ®Ëu t−¬ng cßn l¹i. Gen kh¸ng bÖnh gØ s¾t ë ®Ëu t−¬ng ch−a ®−îc nghiªn cøu kü, ch−a ®Þnh vÞ trªn 17
genom, v× vËy nh÷ng kÕt qu¶ nµy b−íc ®Çu gãp phÇn t×m kiÕm c¸c chØ thÞ ph©n tö liªn quan ®Õn tÝnh tr¹ng nµy (h×nh 6, h×nh 7) §T2000 §T10 §T3 §T9 §T1 §T7 §T4 §T5 §T2 TN12 §T6 §T8 0.27 0.45 0.63 0.82 1.00 Coefficient H×nh 5: Kho¶ng c¸ch di truyÒn cña c¸c dßng ®Ëu t−¬ng F3 so víi bè mÑ. KÕt luËn: - Chän ®−îc c¸c chØ thÞ ph©n tö SSR ®Ó nghiªn cøu tÝnh ®a d¹ng vµ liªn quan ®Õn tÝnh chÞu h¹n: Satt005, Satt042, Satt146, Satt175, Satt173, Satt 009; Satt431, Satt150; Satt373; Satt489, Satt557, Satt567. - C¸c chØ thÞ ph©n tö: Satt489, Satt373, Satt150 cã thÓ sö dông ®Ó chän dßng cã kh¶ n¨ng chÞu h¹n. - C¸c chØ thÞ Satt042, Satt173 cã thÓ cã liªn quan ®Õn gen kh¸ng bÖnh gØ s¾t vµ cã thÓ chän ®Ó nghien cøu ®Þnh vÞ gen nµy trong bé gen. - Nghiªn cøu tÝnh ®a dang di truyÒn cña 7 nguyªn liÖu khëi ®Çu ®· t×m ra c¸c gièng cã kho¶ng c¸ch di truyÒn xa h¬n c¸c gièng kh¸c ®Ó sö dông trong lai t¹o: tæ hîp §T2000 vµ Cóc vµng; tæ hîp §T2000 vµ §T12. - Nghiªn cøu sù ph©n ly vµ di truyÒn c¸c chØ thÞ SSR trong tæ hîp lai §T2000 vµ Cóc Vµng cã thÓ dù ®o¸n c¸c dßng §C4, §C5, §C7 §C10 cã triÓn väng ®Ó nghiªn cøu theo dâi tiÕp; cßn tæ hîp lai §T2000 vµ §T12 cã thÓ l−u ý ®Õn c¸c dßng §T1, §T4, §T5, §T7. 18
H×nh6: Phæ ®iÖn di SSR cña c¸c gièng ®Ëu t−¬ng víi kh¶ n¨ng kh¸ng bÖnh gØ s¾t kh¸c nhau. 19
G1 G2 G3 G4 DT2000 G10 G7 G8 G9 0.5 0.6 0.7 0.7 0.8 Coefficient H×nh 7: §a d¹ng di truyÒn mét sè gièng ®Ëu t−¬ng kh¸ng bÖnh rØ s¾t. ý nghÜa khoa häc, thùc tiÔn vµ triÓn väng: SSR lµ chØ thÞ ph©n tö ®−îc nghiªn cøu sö dông rÊt hiÖu qu¶ ë ®Ëu t−¬ng. 12 chØ thÞ ph©n tö SSR trªn t¸m nhãm liªn kÕt gen trong sè 600 chØ thÞ ph©n tö SSR cña ®Ëu t−¬ng lµ mét con sè rÊt khiªm tèn, nh−ng nã cho phÐp chóng t«i ®¸nh gi¸ s¬ bé møc ®é ®a d¹ng di truyÒn cña c¸c gièng ®Ëu t−¬ng víi nh÷ng môc ®Ých nghiªn cøu kh¸c nhau nh− sö dông lµm nguyªn liÖu khëi ®Çu cho lai t¹o, nghiªn cøu bÖnh gØ s¾t…, ®¸nh gi¸ sù ph©n ly c¸c SSR trong c¸c thÕ hÖ tiÕp theo. Trªn c¬ së ®ã cho phÐp dù ®o¸n kh¶ n¨ng chän gièng lai t¹o, chän dßng lai cã triÓn väng ®Ó theo dâi tiÕp trong c¸c thÕ hÖ sau ®Ó t¹o gièng æn ®Þnh vÒ di truyÒn. 5. §µo t¹o: ®· tham gia ®µo t¹o 01 cö nh©n n¨m 2003 : §Ò tµi kho¸ luËn: Nghiªn cøu sö dông chØ thÞ ph©n tö SSR ®Ó chän dßng chÞu nãng, chÞu h¹n ë ®Ëu t−¬ng. 20