Luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học: Xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng và nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:165

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu chung của đề tài nghiên cứu là xác định được chỉ thị phân tử DNA (mã vạch DNA) phục vụ định danh loài Xáo tam phân (P. trimera); xây dựng được quy trình nhân giống in vitro loài Xáo tam phân. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học: Xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng và nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phí Thị Cẩm Miện XÂY DỰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ NHẬN DẠNG VÀ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG BẢO TỒN LOÀI XÁO TAM PHÂN (Paramignya trimera) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI, 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phí Thị Cẩm Miện Xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng và nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Chu Hoàng Hà Hà Nội, 2021
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Chu Hoàng Hà. Các kết quả thu được trong luận án Hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Phí Thị Cẩm Miện
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án, tôi xin trân trọng cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Chu Hoàng Hà, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Các Thầy Cô giáo, các anh chị và các bạn đồng nghiệp tại Viện Công nghệ sinh học; Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, sinh hoạt chuyên môn và thực hiện Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn đến Học Viện Khoa học và Công Nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Chương trình dự án Việt Bỉ (AI Programe-VNUA, 2014-2019) đã hỗ trợ kinh phí cho đề tài “A study of phylogenetics and biopharmaceutical properties of the Vietnamese traditional medicinal plants belonging to the genus Paramignya for the development of hepatoprotective nutraceuticals” giai đoạn 2018-2019 để giúp tôi có nguồn kinh phí thực hiện các nội dung nghiên cứu của Luận án. Sau cùng, từ tận đáy lòng, tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành Luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Phí Thị Cẩm Miện
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. ix MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu.........................................................................................2 2.1. Mục tiêu tổng quát ...........................................................................................2 2.2. Mục tiêu cụ thể .................................................................................................2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .........................................................................2 3.1. Ý nghĩa khoa học .............................................................................................2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..............................................................................................3 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài ...................................................3 4.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................3 4.2. Phạm vi nghiên cứu ..........................................................................................3 5. Những đóng góp mới của luận án ....................................................................4 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................5 1.1. Giới thiệu chung về chi Paramignya ...............................................................5 1.1.1. Đặc điểm sinh học của chi Paramignya ...........................................................5 1.1.2. Một số thành phần hóa học và hoạtt tính sinh học chi Paramignya .................8 1.2. Cây Xáo tam phân (P. trimera), phân loại, đặc điểm sinh học và hoạt chất sinh học ...................................................................................................11 1.2.1. Nguồn gốc, phân bố, vị trí phân loại Xáo tam phân ......................................11 1.2.2. Đặc điểm thực vật học của cây Xáo tam phân tại Việt Nam .........................11 1.2.3. Nghiên cứu về hoạt tính sinh dược học của cây Xáo tam phân .....................16 1.3. Các phương pháp trong nghiên cứu phân loại ở thực vật ..............................20 1.3.1. Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật ......................................................................20
iv 1.3.2. DNA barcode và ứng dụng của DNA barcode để nhận dạng và phân biệt loài ...........................................................................................................25 1.3.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong xác định quan hệ tiến hóa ............................31 1.3.4. Đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật ............................................34 1.3.5. Các nghiên cứu về hệ thống học, DNA barcodes của các loài thuộc chi Paramignya và loài P. trimera ........................................................................36 1.4. Nhân giống loài Xáo tam phân ......................................................................37 1.4.2. Nhân giống Xáo tam phân trong tự nhiên ......................................................49 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......52 2.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................52 2.1.1. Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại và quan hệ phát sinh của các mẫu thu thập ...................................................................................................52 2.1.2. Vật liệu cho nghiên cứu nhân nhanh in vitro mẫu Xáo tam phân..................52 2.1.3. Các chỉ thị phân tử DNA................................................................................53 2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................57 2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................57 2.3.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu và xây dựng bản đồ phân bố ................57 2.3.2. Phương pháp mô tả hình thái .........................................................................58 2.3.3. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số ............................................................58 2.3.4. PCR nhân các vùng microsatellite bằng các chỉ thị SSR ...............................58 2.3.5. PCR nhân các vùng chỉ thị phân tử ................................................................59 2.3.6. Giải trình tự và đăng ký trình tự.....................................................................59 2.3.7. Phương pháp phân tích dữ liệu trình tự..........................................................60 2.4. Phương pháp nhân giống in vitro cây Xáo tam phân .....................................66 2.4.1. Phương pháp tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân .........66 2.4.2. Ảnh hưởng của nền môi trường tới khả năng sinh trưởng Xáo tam phân trong điều kiện in vitro ...................................................................................67 2.4.3. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân............................................67 2.4.4. Ảnh hưởng của nhóm cytokinins và auxin tới khả năng nhân nhanh Xáo tam phân .........................................................................................................68 2.4.5. Ảnh hưởng của nhóm auxin tới khả năng hình thành rễ Xáo tam phân ........68 2.4.6. Phương pháp bố trí và xử lý thí nghiệm ........................................................69
v CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................70 3.1. Khảo sát sự phân bố và đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc chi Paramignya tại Khánh Hòa và Lâm Đồng ....................................................70 3.1.1. Khảo sát thành phần loài và sự phân bố của các mẫu nghiên cứu .................70 3.1.2. Đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc chi Paramignya ................................75 3.2. Tách chiết DNA tổng số, nhận dạng loài thông qua chỉ thị barcode .............81 3.3. Xác định đa dạng di truyền của các mẫu Xáo tam phân dựa vào chỉ thị SSR .....81 3.4. Nghiên cứu chỉ thị DNA và nhận dạng loài ...................................................86 3.4.1. PCR và xác định trình tự các vùng chỉ thị DNA .............................................86 3.4.2. Nhận dạng loài dựa vào công cụ MEGABLAST ..........................................88 3.5. Xây dựng chỉ thị DNA để nhận dạng Xáo tam phân P. trimera ....................95 3.5.1. Khảo sát dữ liệu DNA mã vạch của các loài thuộc chi Paramignya .............95 3.5.2. Xây dựng cơ sở dữ liệu các trình tự thuộc chi Paramignya ...........................95 3.5.3. So sánh các trình tự để nhận dạng và phân biệt Xáo tam phân .....................97 3.5.4. Xây dựng cây tiến hóa giữa các loài ..............................................................97 3.5.5. Xây dựng chỉ thị phân tử để nhận dạng Xáo tam phân .................................103 3.5.6. Đánh giá chỉ thị phân tử dựa vào phân tích khoảng cách mã vạch ..............108 3.6. Nhân giống in vitro Xáo tam phân ...............................................................112 3.6.1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân ..........112 3.6.2. Nghiên cứu xác định môi trường nền phù hợp với nhân nhanh in vitro Xáo tam phân ...............................................................................................115 3.6.3. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân..........................................116 3.6.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinins tới khả năng nhân nhanh Xáo tam phân ...............................................................................................119 KẾT LUẬN .............................................................................................................129 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................131 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ...............................................132 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................133 PHỤ LỤC ................................................................................................................141
vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABDG : Automatic Barcode Gap Discovery AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism BAP : 6-benzylaminopurine hoặc benzyladenine BI : Bayesia interference CSDL : Cơ sở dữ liệu CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide CV : Coefficient of Variation DNA : Deoxyribonucleic acid IAA : Acid indoleacetic IBA : 3-Indolebutyric acid ITS : Internal transcribed spacer ITS : Internal transcribed spacer KC : Knudson C medium LSD : Least significant differential LSD0.05 : Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 0.05 matK : Maturase K MS : Murashige & Skoog medium MSA : Multiple sequence alignment NCBI : National Center for Biotechnology Information P. trimera : Paramignya trimera PCR : Polemerase Chain Reaction RAPD : Random Amplified Polymorphic rbcL : Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SSR : Simple sequence Repeat STS : Silver thiosulfate TDZ : Thidiazuron WPM : Woody Plant Medium-Lloyd G, Mc Cown B, 1980 α - NAA : Axit α-naphtyl axetic 2.4 D : 2.4-Dichlorophenoxyacetic
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Tổng hợp các chỉ thị phân tử sử dụng đối với genome lục lạp .............30 Bảng 2.1. Bảng mẫu sử dụng tách chiết DNA, phân tích quan hệ phát sinh ........52 Bảng 2.2. Trình tự mồi SSR sử dụng ....................................................................53 Bảng 2.3. Trình tự mồi ITS, matK và rbcL ...........................................................56 Bảng 3.1. Tổng hợp vị trí thu thập các mẫu tại Khánh Hòa và Lâm Đồng ...........70 Bảng 3.2. Số allen và hệ số PIC của 31 cặp mồi SSR ...........................................83 Bảng 3.3. Tổng hợp thông tin về DNA barcode của các loài thuộc chi Paramignya trong hệ thống BOLD .......................................................95 Bảng 3.4. Tổng hợp các dữ liệu trình tự của các loài thuộc chi Paramignya .......96 Bảng 3.5. Tổng hợp các vùng trình tự ITS, matK và rbcL của các trình tự ........107 Bảng 3.6. Khoảng cách trong loài và giữa loài của các dữ liệu trình tự .............108 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của dung dịch nano bạc tới khả năng tạo mẫu sạch Xáo tam phân ......................................................................................112 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của dung dịch Johnson tới khả năng tạo mẫu sạch Xáo tam phân ......................................................................................113 Bảng 3.9. Ảnh hưởng sự kết hợp của dung dịch Johnson và nano bạc tới khả năng khử trùng tạo mẫu sạch Xáo tam phân ................................114 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của môi trường nền tới sự sinh trưởng, nhân nhanh Xáo tam phân ......................................................................................116 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của TDZ, IBA và 2.4 D tới khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân ..............................................................................................117 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa TDZ, IBA và 2.4D tới sự phát sinh mô sẹo IBA Xáo tam phân ..........................................................118 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của BA tới khả năng phát sinh chồi Xáo tam phân .........119 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của TDZ tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân ..................120 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhóm sự kết hợp giữa BA và TDZ tới khả năng phát sinh chồi Xáo tam phân ...............................................................121 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA và α-NAA tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân ..............................................................................122 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA và IBA tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân ......................................................................................123
viii Bảng 3.18. Ảnh hưởng của IBA và α-NAA tới khả năng hình thành rễ Xáo tam phân in vitro .................................................................................124 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của một số loại giá thể tới khả năng sống của cây con in vitro .................................................................................................125
ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc các hợp chất coumarin từ chi Paramignya ...............................9 Hình 1.2. Hình ảnh cây Xáo tam phân trồng tại khu thí nghiệm Khoa CNSH, Học viện Nông nghiệp Việt Nam .............................................12 Hình 1.3. Hình ảnh lá Xáo tam phân tại Khánh Hòa, Việt Nam ..........................13 Hình 1.4. Hình ảnh thân, rễ Xáo tam phân tại Khánh Hòa, Việt Nam .................14 Hình 1.5. Hình ảnh cụm hoa cây Xáo tam phân tại xã Ninh Vân, Khánh Hòa ........................................................................................................14 Hình 1.6. Cấu tạo hình thái lá, hoa Xáo tam phân ................................................15 Hình 1.7. Hình ảnh quả cây Xáo tam phân thu được tại Khánh Hòa, Việt Nam .......................................................................................................16 Hình 1.8. Các phương pháp xây dựng cây tiến hóa ..............................................33 Hình 2.1a. Sơ đồ xây dựng chỉ thị DNA đặc thù ....................................................61 Hình 2.1b. Sơ đồ xây dựng CSDL DNA barcode ...................................................62 Hình 2.2. Quy trình xác định chỉ thị phân tử DNA barcode .................................63 Hình 3.1. Bản đồ địa bàn nghiên cứu vị trí thu thập mẫu và tình trạng phân bố các loài P. trimera và một số loài khác thuộc chi Paramignya .......73 Hình 3.2. Bản đồ địa bàn nghiên cứu gồm vị trí điểm lấy mẫu và phân bố của các loài Xáo tam phân Paramignya trimera ..................................74 Hình 3.3. Bản đồ địa bàn nghiên cứu gồm vị trí điểm lấy mẫu và phân bố của các loài ............................................................................................75 Hình 3.4. Đặc điểm hình thái của Paramignya trimera (Oliv.) Burkill ...............76 Hình 3.5. Đa dạng về hình thái lá của cây Xáo tam phân P. trimera (Oliv.) Burkill ...................................................................................................77 Hình 3.6. Đặc điểm lá và cành của P. armata var. andamanica King thu thập tại Khánh Hòa, Việt Nam ..............................................................78 Hình 3.7. Đặc điểm hình thái của P. monophylla (Lour.) Tanaka ........................79 Hình 3.8. Đặc điểm hình thái thân, lá của P. scandens.........................................80 Hình 3.9. Đặc điểm lá của P. rectispinosa thu thập tại Cát Tiên, Lâm Đồng ......80 Hình 3.10. DNA tổng số của các mẫu P.trimera và 4 loài thuộc chi Paramignya ...........................................................................................81
x Hình 3.11. Kết quả phân tích đa hình các mẫu Paramignya bằng chỉ thị SSR của một số cặp mồi điển hình................................................................82 Hình 3.12. Mối quan hệ di truyền của các loài thuộc chi Paramignya ..................84 Hình 3.13. Ma trận khoảng cách giữa các mẫu phân tích .......................................85 Hình 3.14. Kết quả nhân vùng ITS, matK và rbcL ở các mẫu Paramignya ...........87 Hình 3.15. Kết quả Megablast sử dụng trình tự truy vấn ITS của P. trimera X1 ..........................................................................................................88 Hình 3.16. Cây quan hệ tiến hóa của P. trimera với các loài họ hàng ...................90 Hình 3.17. Kết quả Megablast sử dụng trình tự truy vấn matK của P. trimera X1 ..................................................................................91 Hình 3.18. Cây quan hệ tiến hóa của P. trimera với các loài họ hàng phân tích bằng trình tự matK .........................................................................92 Hình 3.19. Kết quả Megablast với trình tự truy vấn rbcL của P. trimera X1 ........93 Hình 3.20. Cây quan hệ tiến hóa của P. trimera với các loài họ hàng phân tích bằng trình tự rbcL ..........................................................................94 Hình 3.21a. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự ITS sử dụng thuật toán ML của chương trình MegaX ..........................................................................................98 Hình 3.21b. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự ITS sử dụng chương trình BEAST .....................99 Hình 3.22a. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự matK sử dụng thuật toán ML của chương trình MegaX ........................................................................................100 Hình 3.22b. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự matK sử dụng chương trình BEAST ...............101 Hình 3.23a. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự rbcL sử dụng chương trình MegaX .................102 Hình 3.23b. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự rbcL sử dụng chương trình BEAST ................103 Hình 3.24. Phân tích các vùng/vị trí nucleotide khác biệt đặc trưng cho P. trimera trong chuỗi trình tự ITS ..........................................................105
xi Hình 3.25. Phân tích các vùng/vị trí nucleotide khác biệt đặc trưng cho P. trimera trong chuỗi trình tự matK............................................106 Hình 3.26. Phân tích các vùng/vị trí nucleotide khác biệt đặc trưng cho P. trimera trong chuỗi trình tự rbcL ............................................107 Hình 3.27. Biểu đồ khoảng cách Histogram và ranked pairwise giữa các trình tự bằng chương trình ABGD ......................................................109 Hình 3.28. Hình ảnh mẫu Xáo tam phân sau khử trùng........................................113 Hình 3.29. Kết quả khử trùng bằng dung dịch nano bạc và Johnson 2,5% tới khả năng tạo mẫu sạch Xáo tam phân .................................................115 Hình 3.30. Ảnh hưởng của môi trường nền tới sự sinh trưởng và nhân nhanh in vitro Xáo tam phân sau 5 tuần ........................................................116 Hình 3.31. Mô sẹo được hình thành trong các môi trường khác nhau sau 12 tuần nuôi cấy .......................................................................................118 Hình 3.32. Ảnh hưởng của BA và TDZ tới khả năng phát sinh chồi từ đoạn thân Xáo tam phân sau 8 tuần nuôi cấy ..............................................121 Hình 3.33. Ảnh hưởng của BA và TDZ tới khả năng phát sinh chồi từ hạt Xáo tam phân sau 4 tuần nuôi cấy ......................................................122 Hình 3.34. Ảnh hưởng của BA và IBA tới khả năng phát sinh chồi từ đoạn thân in vitro sau 8 tuần nuôi cấy .........................................................124 Hình 3.35. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng hình thành rễ Xáo tam phân in vitro sau 12 tuần nuôi cấy ..............................................................125 Hình 3.36. Hình ảnh cây con in vitro Xáo tam phân sau ra ngôi 4 tuần trên giá thể đất : cát vàng ...........................................................................126
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Loài Xáo tam phân có tên khoa học là Paramignya trimera (oliv.) Guill., thuộc họ Cam (Rutaceae), phân bố chủ yếu ở tỉnh Khánh Hòa và tỉnh Ninh Thuận. Theo các tài liệu đã công bố, ở Việt Nam có 7 loài thuộc chi Paramignya, trong đó P. trimera là cây thân gỗ nhỏ, dạng dây trườn, mọc hoang, phân bố ở vùng núi đá có độ cao trên 200 m, nơi có khí hậu khô cằn, lớp đất mặt mỏng. Xáo tam phân đã được sử dụng nhiều trong đông y và dân gian như là một loài thảo dược để chữa nhiều bệnh về gan, huyết áp và ung thư. Gần đây nhiều nghiên cứu cho thấy rễ Xáo tam phân chứa nhiều alkaloid, saponin, courmarin và triterpenoid có tác dụng ức chế viêm gan cấp, gây độc đối với một số dòng tế bào ung thư. Đặc biệt, dịch chiết Xáo tam phân lại an toàn cho sử dụng trong thời gian dài. Rễ Xáo tam phân có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư, do vậy giá rễ Xáo tam phân hiện nay rất cao, dẫn đến việc khai thác gần như cạn kiệt ngoài tự nhiên. Bên cạnh đó, khả năng giao phấn và tần suất đột biến ngẫu nhiên của loài này cao, kết hợp với hiện tượng sinh sản vô phối và đa bội nên kiểu hình của cây Xáo tam phân trong tự nhiên rất đa dạng, mang nhiều đặc điểm giống với các loài cây khác trong chi Paramignya. Sự tồn tại của các dạng lai có kiểu hình tương tự dẫn đến khó phân biệt và dễ nhầm lẫn nếu chỉ dựa vào hình thái. Cũng chính vì sự tồn tại của nhiều kiểu cây như các dạng lai xa giữa các loài gần gũi thuộc chi Paramignya nên khó nhận biết một cách chính xác để lưu giữ, bảo tồn và nhân giống loài cây này, nhằm mục đích phát triển khu vực trồng Xáo tam phân làm dược liệu. Do đó, yêu cầu xác định chính xác loài Xáo tam phân là cần thiết, tạo cơ sở khoa học để nhận diện loài chính xác, đồng thời bảo tồn nguồn gen và nhân giống cây Xáo tam phân. Xuất phát từ những vấn đề khoa học và thực tiễn, nghiên cứu “Xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng và nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera)” hướng tới mục tiêu xây dựng được chỉ thị phân tử để nhận dạng chính xác loài Xáo tam phân và nhân giống nhằm bảo tồn và khai thác hiệu quả giá trị dược liệu của loài này.
2 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu tổng quát Xác định được chỉ thị phân tử DNA (mã vạch DNA) phục vụ định danh loài Xáo tam phân (P. trimera); Xây dựng được quy trình nhân giống in vitro loài Xáo tam phân. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Đánh giá sự phân bố đặc điểm hình thái, xây dựng được bản đồ phân bố quần thể Xáo tam phân và một số loài thuộc chi Paramignya. - Xác định được mối quan hệ di truyền của quần thể Xáo tam phân bằng chỉ thị SSR. - Xác định được chỉ thị phân tử DNA để nhận dạng được loài Xáo tam phân P. Trimera. - Xây dựng được quy trình nhân giống Xáo tam phân P. trimera in vitro thu thập tại Khánh Hòa. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học - Xây dựng được bản đồ phân bố tự nhiên của một số quần thể Xáo tam phân và một số loài thuộc chi Paramignya trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa và Lâm Đồng. - Cung cấp thêm dữ liệu trình tự nucleotide của các đoạn gen ITS, matK và rbcL của loài Xáo tam phân và một số loài thuộc chi Paramignya và đăng ký vào ngân hàng GenBank (NCBI), qua đó góp phần tạo CSDL để xây dựng DNA mã vạch nhận dạng và phân biệt loài Xáo tam phân với các loài có quan hệ gần gũi trong chi Paramignya và họ cam (Rutaceae). - Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm hình thái, sự đa dạng về kiểu gen và kiểu hình của các quần thể Xáo tam phân trong tự nhiên ở tỉnh Khánh Hòa và Lâm Đồng. - Xác định được mối quan hệ di truyền của loài Xáo tam phân với một số loài thuộc chi Paramignya, trên cơ sở đó đã xác định được chỉ thị phân tử cho phép nhận dạng các loài thuộc chi Paramignya, đồng thời nhận dạng được loài Xáo tam phân bằng chỉ thị matK. Cung cấp thông tin khoa học về nhân giống loài Xáo tam phân in vitro.
3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Thông qua việc xây dựng được bản đồ phân bố tự nhiên của loài Xáo tam phân giúp cho việc quy hoạch, định hướng, phát triển nguồn gen loài Xáo tam phân hiệu quả. - Từ dữ liệu về mối quan hệ di truyền và các chỉ thị về DNA barcode cho nhận dạng loài Xáo tam phân là cơ sở cho công tác chọn tạo giống mới loài Xáo tam phân. - Đã xây dựng thành công quy trình nhân nhanh giống in vitro cho loài Xáo tam phân góp phần sản xuất số lượng lớn cây giống Xáo tam phân chất lượng tốt phục vụ phát triển vùng dược liệu Xáo tam phân tập trung. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tượng nghiên cứu - Loài Xáo tam phân thu thập tại xã Ninh Vân, Ninh Hòa và Diên Khánh thuộc tỉnh Khánh Hòa; loài Xáo tam phân chuẩn được cung cấp bởi viện dược liệu phối hợp trồng bảo tồn tại công ty TNHH Bá Ninh và một số loài thuộc chi Paramignya thu thập tại tỉnh Khánh Hòa và Lâm Đồng. - Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, xác định DNA mã vạch của các loài thuộc chi Paramignya, đối tượng nghiên cứu là tập hợp các cá thể chi Paramignya phân bố tự nhiên ở Khánh Hòa và Lâm Đồng, Việt Nam. - Trong nghiên cứu nhân nhanh in vitro Xáo tam phân, đối tượng nghiên cứu là loài Xáo tam phân do Viện dược liệu và công ty TNHH Bá Ninh, Khánh Hòa cung cấp. 4.2. Phạm vi nghiên cứu Phạm vi chuyên môn: Phạm vi nghiên cứu chuyên môn của luận án là: (1) Thu thập các quần thể Xáo tam phân tại Khánh Hòa (Xã Ninh Hòa, Ninh Vân, Diên Khánh, Khánh Hòa và một số loài thuộc chi Paramignya tại tỉnh Lâm Đồng); (2) Tiến hành phân loại, đánh giá đa dạng di truyền quần thể P. trimera và một số loài thuộc chi Paramignya (SSR); (3) Xây dựng bộ chỉ thị DNA barcode để nhận dạng loài Xáo tam phân có giá trị dược liệu; (4) Xây dựng quy trình nhân giống in vitro phục vụ công tác bảo tồn loài Xáo tam phân Khánh Hòa.
4 Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu, điều tra và thu thập mẫu thực địa được tiến hành ở các vùng có phân bố các loài thuộc chi Paramignya tại Khánh Hòa, Lâm Đồng, Việt Nam. Nghiên cứu về chỉ thị phân tử, xây dựng bộ nhận dạng loài Xáo tam phân được thực hiện tại các phòng thí nghiệm công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn loài Xáo tam phân được thực hiện tại Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 01/12/2017 đến hết tháng 11/2020. 5. Những đóng góp mới của luận án - Bổ sung dữ liệu khoa học để nhận dạng đặc điểm hình thái và phân loại loài Xáo tam phân trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa - Đã xây dựng được CSDL về trình tự DNA cho loài Xáo tam phân và đăng ký ở ngân hàng gen thế giới, đồng thời bước đầu phát triển chỉ thị DNA làm nền tảng để phát triển DNA mã vạch. Góp phần tạo cơ sở khoa học để nhận dạng và bảo tồn nguồn gen loài Xáo tam phân P. trimera. - Xây dựng thành công quy trình nhân nhanh in vitro Xáo tam phân.
5 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về chi Paramignya 1.1.1. Đặc điểm sinh học của chi Paramignya 1.1.1.1. Sự phân bố và thành phần loài của chi Paramignya trên thế giới và Việt Nam Chi Paramignya thuộc họ Cam (Rutaceae) gồm khoảng 15 loài cây thân gỗ nhỏ, dạng dây leo có nguồn gốc từ phía Nam, đông nam châu Á và ở miền bắc nước Úc. Theo phân loại thực vật học trên cơ sở dữ liệu thực vật học (theplantlist.org), chi Paramignya bao gồm 30 loài. Trong số 30 loài, hiện chỉ có hai loài được chấp nhận tên khoa học là P. confertifolia Swingle và P. rectispinosa W. G.Craib. Cho đến nay, có bốn loài được nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh dược học (P. monophylla, P. griffithii, P. trimera, P. scandens), và 22 loài khác chưa được chấp nhận tên khoa học trên cơ sở dữ liệu này. Theo các dữ liệu thực vật học do nhiều tổ chức nghiên cứu và các nhà thực vật của vườn Thực vật Hoàng gia Kew (Anh Quốc) và vườn Thực vật Missouri (Hoa Kỳ), tính đến năm 2013 có 30 loài được cho là thuộc chi Paramignya đã được đề cập đến trong các tài liệu khác nhau [1] gồm: Paramignya andamanica Tanaka Paramignya angulata Kurz Paramignya armata Oliv. Paramignya beddomei Tanaka Paramignya blumei Hassk. Paramignya brassii C.T.White Paramignya citrifolia Hook.F. Paramignya citrifolia Oliv. Paramignya confertifolia Swingle Paramignya cuspidata (Ridl.) Burkill Paramignya dubia Koord. & Valeton ex Moll & Janssonius Paramignya glabra Tanaka Paramignya grandiflora Oliv. Paramignya griffithii Hook.F.
6 Paramignya hainanensis Swingle Paramignya hispida Pierre ex Guillaumin Paramignya littoralis Miq. Paramignya lobata Burkill Paramignya longipedunculata Merr. Paramignya longispina Hook.F. Paramignya micrantha Kurz Paramignya mindanaensis Merr. Paramignya missionis (Oliv.) Burkill Paramignya monophylla Wight Paramignya petelotii Guillaumin Paramignya rectispinosa Craib Paramignya ridleyi Burkill Paramignya scandens Craib Paramignya surasiana Craib Paramignya trimera (Oliv.) Burkill Thực tế, tình trạng phân loại chi Paramignya chưa được thống nhất giữa các nhà phân loại học thực vật. Gần đây, Zhang D. X. (2008) cho rằng chi Paramignya có khoảng 15 loài và phân bố ở Nam Á, Đông Nam Á và miền Bắc nước Úc [1]. 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái chung của các loài thuộc chi Paramignya ở Việt Nam Ở Việt Nam, theo các tài liệu đã công bố cho thấy có 7 loài thuộc chi Paramignya [2], bao gồm: - Paramignya armata Oliv. var. andamanica King, 1874 [3] - Cựa gà, Quýt gai. Mọc ở Đà Nẵng, Khánh Hòa và được trồng ở Nam bộ. Đây là loại cây leo, cao khoảng 1 - 4 m, có nhánh vàng nhạt, lá có gai ngắn ở nách, cong ra phía sau, dài 6 - 12 mm. Lá dạng màng, dai, nguyên, hình bầu dục hay thuôn tròn ở gốc, tận cùng là một mũi nhọn hình tam giác nhọn, nhẵn, dài 7,5 - 12,5 cm, rộng 3,5 - 4,5 cm, có cuống ngắn. Hoa xếp 1 - 2 hoa ở nách các lá. Quả đen hay vàng, hình cầu, mang bởi một cuống dài 3 - 3,5 cm và có 6 thùy. Mọc thành bụi hoặc gỗ leo, cao 1 - 10 m. Ra hoa tháng 8, quả có thể ăn được. Lá và quả đun sôi uống chữa viêm phế quản, ho [4].
7 - Paramignya griffithii Hook. F, 1875 [5] - Xáo Griffith, phân bố ở Lâm Đồng, Khánh Hòa. Là dạng cây tiểu mộc leo, có gai cong, cành mảnh. Lá có phiến bầu dục kích thước 6 x 3 cm, rộng ở nửa trên, mỏng. Hai mặt nâu nhạt lúc khô, gân phụ có 5 - 7 cặp. Cuống dài từ 6 - 10 mm. Hoa có từ 1 - 3 hoa ở nách lá, dài 5 mm, cọng mảnh; đài 10 hình đĩa, tiểu nhụy 6 - 10, rời nhau chỉ ngắn hơn bao phấn; noãn sào có lông. Trái xanh tròn to 1 cm, thịt quả nhớt. - Paramignya hispida Pierre ex Guillaum [5, 6] - Cựa gà nhám, phân bố ở Nghệ An, Quảng Trị, Đồng Nai. Là dạng cây tiểu mộc leo, có gai cong xuống, dài khoảng 1 cm; nhánh mảnh, lúc non có lông. Lá có phiến to dài x rộng từ 6 - 10 x 2 - 4 cm, xoan tròn dài, đáy hình tim; gân phụ không rõ, tuyến nhỏ, nhiều; cuống có lông, dài 2 cm. Hoa đơn, cọng dài 5 - 6 mm; lá đài 5, có lông mặt ngoài; cánh hoa cao 1 cm; tiểu nhụy 10, rời nhau; đĩa mật làm thành thư đài; noãn sào tròn, không lông, buồng 5, 2 noãn [7]. - Paramignya monophylla Wight, 1840 [3] - Xáo một hoa, phân bố ở Hà Nội (Ba Vì cũ). Là cây tiểu mộc leo, có gai cong. Lá thon, to, có kích thước dài x rộng từ 6 - 7 x 2,5 cm, đầu thon, đáy tù, gân rất mảnh, có tuyến thấy rõ ở mặt dưới; cuống dài 1 cm, hoa 1 - 2 ở nách lá, cọng ngắn; đài 4 mm, cánh hoa dài 13 mm, bầu dục hẹp [5]. - Paramignya petelotii Guillaum, 1944 [3] - Xáo petelot, mọc ở Hòa Bình (Mai Châu). Là dạng cây tiểu mộc leo; cành già xám, bì khẩu nhỏ, nhiều, màu trắng; gai nhỏ, cong. Lá có phiến bầu dục tròn dài, to với kích thước 10 x 5 cm, mỏng, lục tươi lúc khô, gân phụ mảnh, vào 10 cặp, cuống 5 - 10 mm. Hoa ở nách lá, dài 15 mm; đài cao 5-6mm; cánh hoa hẹp; tiểu nhụy 10, dài bằng cánh hoa; dĩa mật; noãn sào có lông, 5 buồng [5]. - Paramignya scandens (Griff.) Craib, 1926 [3] - Xáo leo, phân bố ở Hà Nam, Quảng Trị, Lâm Đồng. Là dạng cây tiểu mộc leo; cánh non có lông mịn, nâu; gai nhỏ cong, có lông. Lá có phiến bầu dục, vào 7 x 3,5 cm, đầu tà hay có đuôi ngắn, đáy tròn, gân phụ từ 9 - 11 cặp; cuống dài từ 4 - 6 mm, có lông mịn. Hoa thường 1 ở nách lá, cọng 1 cm; lá dài nhỏ, rìa lông; cánh hoa dài 7 mm; tiểu nhụy 10, bằng nhau, chi có lông; noãn sào có lông. Trái không lông, xoan, dài đến 1,5 cm [5]. - Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum., 1946 [3] - Xáo tam phân, mọc ở núi Gò vấp. Là dạng cây có gai dài, hơi cong xuống; cành không có lông. Lá có phiến