Tóm tắt luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học: Xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng và nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

39
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là đánh giá sự phân bố đặc điểm hình thái, xây dựng được bản đồ phân bố quần thể Xáo tam phân và một số loài thuộc chi Paramignya; xác định được mối quan hệ di truyền của quần thể Xáo tam phân bằng chỉ thị SSR; xác định được chỉ thị phân tử DNA để nhận dạng được loài Xáo tam phân P. trimera; xây dựng được quy trình nhân giống Xáo tam phân P. trimera in vitro thu thập tại Khánh Hòa.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học: Xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng và nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phí Thị Cẩm Miện Xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng và nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội, năm 2021
Công trình được hoàn thành tại: - Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Hà Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ...’, ngày … tháng … năm 202…. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Cây Xáo tam phân có tên khoa học là Paramignya trimera (Oliv.) Guill., thuộc họ Cam Rutaceae, phân bố chủ yếu ở tỉnh Khánh Hòa và tỉnh Ninh Thuận. Theo các tài liệu đã công bố, ở Việt Nam có 7 loài thuộc chi Paramignya, trong đó P. trimera là cây thân gỗ nhỏ, dạng dây trườn, mọc hoang, phân bố ở vùng núi đá ở độ cao trên 200 m, nơi có khí hậu khô cằn, lớp đất mặt mỏng. Xáo tam phân đã được sử dụng nhiều trong đông y và dân gian như là một loài thảo dược để chữa nhiều bệnh về gan, huyết áp và ung thư. Gần đây nhiều nghiên cứu cho thấy rễ Xáo tam phân chứa nhiều alkaloid, saponin, courmarin và triterpenoid, có tác dụng ức chế viêm gan cấp, gây độc đối với một số dòng tế bào ung thư. Đặc biệt, dịch chiết Xáo tam phân lại an toàn cho sử dụng. Do rễ Xáo tam phân có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư nên giá của rễ cây này rất cao, dẫn đến việc khai thác đến mức gần như cạn kiệt. Bên cạnh đó, do khả năng giao phấn và tần suất đột biến ngẫu nhiên cao, kết hợp với hiện tượng sinh sản vô phối và đa bội nên kiểu hình của cây Xáo tam phân trong tự nhiên rất đa dạng, mang nhiều đặc điểm giống với các loài cây khác trong chi Paramignya. Chính sự tồn tại của các dạng lai như vậy dẫn đến khó phân biệt và rất dễ nhầm lẫn nếu chỉ dựa vào hình thái. Cũng chính vì sự tồn tại của nhiều kiểu cây như các dạng lai xa giữa các loài gần gũi thuộc chi Paramignya nên khó nhận biết một cách chính xác để lưu giữ, bảo tồn và nhân giống loài cây này nhằm phát triển khu vực trồng Xáo tam phân làm dược liệu. Do đó, yêu cầu xác định chính xác loài Xáo tam phân là cần thiết, tạo cơ sở khoa học để nhận diện loài chính xác, đồng thời bảo tồn nguồn gen và nhân giống cây Xáo tam phân. Xuất phát từ những vấn đề khoa học và thực tiễn, nghiên cứu “Xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng và nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera)” hướng tới mục tiêu xây dựng được chỉ thị phân tử để nhận dạng chính xác loài Xáo tam phân và nhân giống loài cây này nhằm bảo tồn và khai thác hiệu quả loài cây có giá trị dược liệu cao này. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Đánh giá sự phân bố đặc điểm hình thái, xây dựng được bản đồ phân bố quần thể Xáo tam phân và một số loài thuộc chi Paramignya - Xác định được mối quan hệ di truyền của quần thể Xáo tam phân bằng chỉ thị SSR - Xác định được chỉ thị phân tử DNA để nhận dạng được loài Xáo tam phân P. trimera - Xây dựng được quy trình nhân giống Xáo tam phân P. trimera in vitro thu thập tại Khánh Hòa 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án - Điều tra, thu thập và xây dựng bản đồ phân bố quần thể Xáo tam phân - Đánh giá đa dạng di truyền của quần thể Xáo tam phân và một số loài thuộc chi Paramignya bằng chỉ thị SSR - Nghiên cứu xây dựng chỉ thị phân tử DNA barcodes dùng trong nhận dạng loài Xáo tam phân - Xây dựng quy trình nhân giống in vitro phục vụ bảo tồn loài Xáo tam phân 4. Những đóng góp mới của luận án - Bổ sung dữ liệu khoa học để nhận dạng đặc điểm hình thái và phân loại loài Xáo tam phân trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa - Đã xây dựng được CSDL về trình tự DNA cho loài Xáo tam phân và đăng ký ở ngân hàng gen thế giới, đồng thời bước đầu phát triển chỉ thị DNA làm nền tảng để phát triển DNA mã vạch. Góp phần tạo cơ sở khoa học để nhận dạng và bảo tồn nguồn gen loài Xáo tam phân P. trimera - Xây dựng thành công quy trình nhân nhanh in vitro Xáo tam phân.
2 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5.1. Ý nghĩa khoa học - Xây dựng được bản đồ phân bố tự nhiên của một số quần thể Xáo tam phân và một số loài thuộc chi Paramignya trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa và Lâm Đồng - Cung cấp thêm dữ liệu trình tự nucleotide của các đoạn gen ITS, matK và rbcL của loài Xáo tam phân và một số loài thuộc chi Paramignya và đăng ký vào ngân hàng GenBank (NCBI), qua đó góp phần tạo CSDL để xây dựng DNA mã vạch nhận dạng và phân biệt loài Xáo tam phân với các loài có quan hệ gần gũi trong chi Paramignya và họ cam (Rutaceae). - Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm hình thái, sự đa dạng về kiểu gen và kiểu hình của các quần thể Xáo tam phân trong tự nhiên ở tỉnh Khánh Hòa và Lâm Đồng. - Xác định được mối quan hệ di truyền của loài Xáo tam phân với một số loài thuộc chi Paramignya, trên cơ sở đó đã xác định được chỉ thị phân tử cho phép nhận dạng các loài thuộc chi Paramignya, đồng thời nhận dạng được loài Xáo tam phân bằng chỉ thị matK. Cung cấp thông tin khoa học về nhân giống loài Xáo tam phân in vitro. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn - Thông qua việc xây dựng được bản đồ phân bố tự nhiên của loài Xáo tam phân giúp cho việc quy hoạch, định hướng, phát triển nguồn gen loài Xáo tam phân hiệu quả - Từ dữ liệu về mối quan hệ di truyền và các chỉ thị về DNA barcode cho nhận dạng loài Xáo tam phân là cơ sở cho công tác chọn tạo giống mới loài Xáo tam phân - Đã xây dựng thành công quy trình nhân nhanh giống in vitro cho loài Xáo tam phân góp phần sản xuất số lượng lớn cây giống Xáo tam phân chất lượng tốt phục vụ phát triển vùng dược liệu Xáo tam phân tập trung CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Chi Paramignya thuộc họ Cam (Rutaceae) gồm khoảng 15 loài cây thân gỗ nhỏ, dạng dây leo có nguồn gốc từ phía nam và đông nam châu Á và ở miền bắc nước Úc. Theo phân loại thực vật học trên cơ sở dữ liệu thực vật học (theplantlist.org), chi Paramignya bao gồm 30 loài. Trong số 30 loài, hiện chỉ có hai loài được chấp nhận tên khoa học là P. confertifolia Swingle và P. rectispinosa W. G.Craib. Xáo tam phân là một trong 30 loài xáo thuộc chi Paramignya, thuộc họ Rutaceace, phân bố chủ yếu ở vùng Nam Á, Đông Nam Á và miền Bắc nước Úc, Ấn Độ, Indonexia, Philippin, Đông Timor, Australia. Ở Việt Nam phát hiện được ở Tây Ninh, Khánh Hòa (Ninh Hòa), Ninh Thuận, Phú Yên. Hiện nay, mới có 4 loài được nghiên cứu về thành phần hóa học ở các mức độ khác nhau. Trong đó, có 01 loài thu ở Sri Lanka (P. monophylla), 01 loài ở Thái Lan (P. griffithii) và 02 loài ở Việt Nam (P. trimera, P. scandens). Các lớp chất chính thuộc chi này gồm chủ yếu gồm coumarin, triterpene, alkaloid và các dẫn xuất glycoside. Cho đến nay có khoảng 85 hợp chất tự nhiên đã được phân lập ra từ chi Paramignya, bao gồm 18 coumarin, 15 loại tirucallan và saponin tirucallan, 9 ankaloid, 11 flavanon và một số hợp chất khác. Các hoạt chất sinh học này có tác dụng chống oxi hoá, ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư. Xáo tam phân là cây dược liệu bản địa có tác dụng điều trị các bệnh lý về gan như viêm gan, xơ gan và ung thư gan. Do tác dụng dược lý hiệu quả trong điều trị nhiều bệnh nên Xáo tam phân bị khai thác để lấy rễ gần như cạn kiệt. Bên cạnh đó, tại Khánh Hòa xuất hiện nhiều mẫu rễ giả, mẫu cây có hình dạng lá và gai tương đối khác nhưng vẫn được người dân gọi chung là Xáo tam phân. Trong khi đó, ở Việt Nam chưa có bất kỳ công bố nào về đặc điểm hình thái và phân tử của loài cây này. Do đó, nghiên cứu giúp nhận dạng về mặt hình thái và phân tử loài Xáo tam phân là nghiên cứu cần thiết, giúp cung cấp cơ sở dữ liệu về loài dược liệu quý này. Bên cạnh đó, việc nghiên cứu nhân giống in vitro giúp xây dựng vườn bảo tồn loài Xáo tam phân đặc hữu của Khánh Hòa.
3 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại và quan hệ phát sinh của các mẫu Xáo tam phân thu thập và một số loài thuộc chi Paramignya Các mẫu Xáo tam phân P. trimera gồm 5 quần thể ký hiệu từ X1 đến X5 dựa trên cơ sở sự sai khác về kiểu hình. Các mẫu của 4 loài thuộc chi Paramignya bao gồm P. armata, P. monophylla, P. scandens, P. rectispinosa. 2.1.2. Vật liệu cho nghiên cứu nhân nhanh in vitro Xáo tam phân Vật liệu được sử dụng cho nghiên cứu nhân nhanh in vitro là thân mang mắt ngủ, mô sẹo và hạt Xáo tam phân thu thập tại công ty TNHH Bá Ninh, Ninh Vân, Khánh Hòa 2.1.3. Mồi SSR, ITS, matK, rbcL Trong nghiên cứu này 50 mồi SSR được sử dụng và mô tả bởi Froelicher và đồng tác giả năm 2008, Corazza-Nunes và đồng tác giả năm 2002, Barkley và đồng tác giả năm 2006 do hãng Bioneer cung cấp. Bảng 2.2. Trình tự mồi ITS, matK và rbcL Tên Kích thước Trình tự (5'-3') Nguồn cặp mồi mồi (bp) MatK (F) TAATTTACRATCAATTCATTCAATATTTCC Kyndt et al., 850 bp MatK (R) GARGAYCCRCTRTRATAATGAGAAAGATTT 2005 ITS (F) AGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCC Sun et al., ITS (R) GATATGCTTAAACTCAGCGGGTC 850 bp 1994 RbcL (F) ATGTCACCA CAAACAGAGACTAA 500 bp RbcL(R) TTCGGCACAAAATACGAAACGATCTCTC CBOL, 2009 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu và xây dựng bản đồ phân bố Việc điều tra, thu mẫu tiến hành theo phương pháp nghiên cứu thưc ̣ vâṭ của Klein và Klein (1970) và Nguyễn Nghĩa Thìn (2007). Khảo sát các khu vực tại Khánh Hòa và Lâm Đồng đã phát hiện quần thể ban đầu và những khu vực lân cận nhằm xác định thêm các khu phân bố khác của loài nghiên cứu. Dựa vào điều kiện phân bố đã phát hiện quần thể ban đầu, xác định các khu vực có cùng đai độ cao và kiểu rừng trong vòng bán kính 50 km. Với các khu vực xác định được, tiến hành lập các tuyến điều tra trên bản đồ (trên bản đồ phóng lớn thành bản đồ địa hình tỷ lệ 1:5.000.Tại những khu vực phát hiện có sự phân bố của loài nghiên cứu, tiến hành ghi nhận các đặc điểm về điều kiện sinh cảnh thông qua mô tả, hình ảnh và dữ liệu tọa độ từ thiết bị định vị GPS Map 60 CSX. Đánh dấu vị trí khu vực phát hiện có sự phân bố của loài nghiên cứu trên bản đồ tuyến. Bản đồ được lập trong phần mềm ArcGIS 10.30, sử dụng các công cụ phân nhóm và hiển thị mầu tích hợp sẵn trong phần mềm. 2.2.2. Phương pháp mô tả hình thái Các mẫu Xáo tam phân Khánh Hòa được xác định tên khoa học bằng phương pháp so sánh hình thái, đối chiếu với khóa phân loại trong các bộ thực vật chí (Phạm Hoàng Hộ, 1999; Nguyễn Nghĩa Thìn, 2007) tại bộ môn Thực vật, khoa Nông học, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam. 2.2.3. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Doyle (1990) có cải tiến. Mẫu mô sau khi nghiền sẽ được phá thành tế bào trong dung dịch đệm chiết CTAB (1,4 M NaCl; 0,1 M Tris- HCl pH 8; 20 mM EDTA pH 8; 2% CTAB) trong 2h ở 65°C. Dung dịch sau đó được ly tâm loại cặn tế bào và chiết với chloroform: isoamyl alcohol (24:1). Dung dịch chiết được xử lý với RNase và tủa DNA sử dụng 2 lần thể tích EtOH 100%; 0,3 M CH3COONa trong 3h ở -20°C. Kết tủa DNA được rửa bằng EtOH 70%, làm khô và hòa tan trong nước khử ion vô trùng.
4 Chất lượng DNA được kiểm tra bằng phương pháp điện di trong agarose 1% và định lượng bằng Nanodrop (Eppendorf, USA). 2.2.4. PCR nhân các vùng microsatellite bằng các chỉ thị SSR Sản phẩm PCR với 50 cặp mồi SSR đặc trưng cho họ cam (Rutaceae). Nhiệt độ và thời gian gắn mồi của các cặp mồi được hiệu chỉnh bằng thực nghiệm để thu được các băng đặc hiệu và ổn định. Sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel polyacrylamid (SDS-PAGE) nồng độ 8% và nhuộm bằng ethyl bromide theo mô tả của Halima Benbouza và cộng sự (Halima Benbouza, 2006). Thang chuẩn (Thermo Scientific™ O'GeneRuler DNA Ladder, Ready-to- Use 50-1000 bp) của hãng G-BIOSCIENCES. 2.2.5. PCR nhân các vùng chỉ thị phân tử DNA tổng số sau tách chiết được sử dụng làm khuôn cho PCR với các cặp mồi ITS, matK và rbcL. Thành phần phản ứng PCR được tiến hành với thể tích 20 µL gồm: 1X DreamTaq Buffer; 1 mM dNTPs; 2,5 μM mỗi mồi; 0,75 unit DreamTaq DNA polymerase; 50 ng DNA tổng số. PCR được thực hiện với chu trình nhiệt như sau: 94˚C/ 4 phút; (94˚C/ 30 giây; 53-57˚C/ 30 giây; 72˚C/ 45 giây x 30 chu kì, 72˚C/ 7 phút, sau đó giữ ở 15˚C. Nhiệt độ và thời gian gắn mồi được hiệu chỉnh bằng thực nghiệm để thu được sản phẩm PCR đặc hiệu. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Các chỉ thị phân tử ITS, matK, rbcL sau khi nhân PCR bằng các cặp mồi tương ứng được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose 1% với thang chuẩn (Thermo Scientific™ GeneRuler 1 kb DNA Ladder, ready-to-use 2.2.6. Giải trình tự và đăng ký trình tự Sản phẩm PCR tinh sạch được gửi đi giải trình tự trực tiếp theo cả hai chiều bởi công ty Macrogen, Hàn Quốc. Trình tự DNA sau khi giải trình tự được hiệu chỉnh và loại bỏ các tín hiệu nhiễu với sự trợ giúp của phần mềm ChromasPro2.1.6 (Technelysium, 2013) được so sánh với các trình tự trên Genbank. Các trình tự được căn (align) bằng phần mềm Bioedit v7.0.5.2 (Hall, 1999). Các mẫu bị nhiễu với các đỉnh không rõ nét được tiến hành PCR và đọc lại cho tới khi thu được tín hiệu rõ nét. Các trình tự được công bố trên ngân hàng Genbank bằng công cụ BankIt của NCBI. 2.2.7. Phương pháp phân tích dữ liệu trình tự 2.2.7.1. Phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR Phân tích các chỉ thị SSR được thực hiện bằn phần mềm Power Marker 3.25 để xuất dữ liệu ở định dạng nhị phân (có mặt của allen = “1” và sự vắng mặt của allen = “0”). Dữ liệu dạng nhị phân được sử dụng để phân tích tiếp theo với chương trình NTSYS-pc phiên bản 2.1. Ma trận tương tự (similarity) giữa các mẫu phân tích được tính toán với chương trình con “Simqual” bằng cách sử dụng hệ số DICE, tiếp theo là phân tích cụm với chương trình con SAHN sử dụng phương pháp phân nhóm UPGMA bằng NTSYS-pc. Xử lý thống kê bao gồm số lượng allen trên mỗi locus, tần số allen, các allen đa hình, giá trị PIC. Khoảng cách di truyền được tính bằng công thức của "Nei 1983" (Nei, 1983) 2.2.7.2. Phương pháp phân tích Maximum-Likelihood (ML) Các cây tiến hóa được xây dựng dựa vào căn nhiều trình tự sử dụng chương trình MEGA-X (Phiên bản 10.1.7) áp dụng mô hình Kimura-2 (K2P). Tốc độ biến đổi các nucleotide trong chuỗi trình tự được tính toán đồng đều ở tất cả các vị trí. Các cây tiến hóa xây dựng dựa vào phân tích ký tự (character based) sử dụng thuật toán khả năng tối đa (maximum likelihood/ML) với giá trị bootstrap 1000. Cây tiến hóa với khả năng cao nhất gồm các đơn vị taxon được nhóm cụm với nhau được lựa chọn và thể hiện giá trị % ở các nhánh. Các khoảng trống (gap) và dữ liệu khuyết (missing data) được lựa chọn với ngưỡng giá trị 95%. 2.2.7.3. Phương pháp phân tích Bayesia interference Chương trình BEAST v2.6.3 (chạy trên nền Mac) sử dụng thuật toán Bayesian inference (BI) để xây dựng cây tiến hóa tương ứng với cùng bộ dữ liệu. File căn trình tự định dạng
5 Nexus được sử dụng làm số liệu đầu vào cho chương trình BEAUTi 2 với các tham số Site model (Gamma site model), Clock model (Strick clock) và Prior (Coalescant Bayesian Skyline). File được tạo ra dưới định dạng *.xmL được sử dụng làm file đầu vào cho BEAST v2.6.3 với thư viện BEAGLE. Chương trình FigTree.v1.4.4 được dùng để hiển thị cây. 2.2.7.4. Phương pháp xây dựng chỉ thị phân tử DNA barcode - Trên cơ sở các nghiên cứu của Tanzeem Fatima và Cheng-Hong Yang quá trình xây dựng DNA barcode nhằm nhận dạng loài Xáo tam phân được thực hiện theo các bước cơ bản sau: - Thu thập mẫu Xáo tam phân và một số loài xáo thuộc chi Paramignya và xác định chính xác loài dựa vào khoá phân loại hình thái - Tách chiết DNA từ các mẫu nghiên cứu và lựa chọn chỉ thị để nhân vùng DNA bằng PCR và xác định trình tự nucleotide. Trong nghiên cứu này, các trình tự ITS, MatK và rbcL được lựa chọn bằng cách sử dụng mồi phổ biến cho các loài thuộc họ cam quýt (Rutaceae). - Sử dụng công cụ Megablast để nhận dạng loài dựa vào các trình tự tham chiếu có trong GenBank. - Kiểm định khả năng phân biệt loài của các vùng trình tự đã lựa chọn bằng cách phân tích cây tiến hoá. Cây tiến hoá được xây dựng dựa vào phương pháp phân tích ký tự (character based method) trong đó 2 chương trình MegaX (sử dụng thuật toán Maximum likelihood (ML) với mô hình tiến hoá K2P) và chương trình BEAST (sử dụng thuật toán Bayesian inference và mô hình Prior Coalescant Bayesian Skyline). Các vùng trình tự tạo ra các nhánh tách biệt trong cây tiến hoá sẽ được lựa chọn làm trình tự mã vạch để nhận dạng loài. - Sử dụng công cụ căn nhiều trình tự cùng để xác định các vùng trình tự đặc thù loài và có khả năng phân biệt loài để xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng loài. Phân tích xác định vùng trình tự chung (consensus) giữa các trình tự lựa chọn để xác định các vị trí khác biệt và đặc trưng của Xáo tam phân P. trimera với các loài gần thuộc chi Paramignya. 2.2.7.5. Xác định trình tự chung (consensus) và trình tự đặc thù của loài Xáo tam phân Trình tự chung (consensus) là trình tự mang tính phổ biến của tất cả các trình tự được phân tích. Trình tự chung được suy diễn dựa vào kết quả căn nhiều trình tự. Công cụ Mega Align Pro của chương trình DNAStar Version: 17.1.1 (120) được sử dụng thuật toán MUSCLE và Clustal Omega 2.2.7.6. Xác định khoảng cách mã vạch Xác định khoảng cách DNA mã vạch (barcoding gap) giữa các loài được phân tích là phương pháp để thẩm định khả năng phát triển DNA mã vạch để phân biệt các loài. Khoảng cách DNA mã vạch được xác định bằng chương trình ExcaliBAR dựa vào ma trận khoảng cách được tính toán trước đó sử dụng phần mềm Mega-X. Khoảng cách của các DNA barcode được tính toán dựa vào mức độ chênh lệch giữa sự khác biệt giữa khoảng cách lớn nhất bên trong cùng một loài (maximum intraspecific distance) và khoảng cách nhỏ nhất giữa các loài khác nhau. Chương trình ABGD được có thể truy cập theo điạ chỉ http://wwwabi.snv.jussieu.fr/public/abgd/abgdweb.htmL) được sử dụng để tạo ra biểu đồ khoảng cách (distance histograms) và xếp hạng khoảng cách (distance ranks) với 2 giá trị X về độ rộng tương đối giữa khoảng cách của các DNA barcode (1,0 và 1,5) và khoảng cách được tính theo mô hình K2P. Các giá trị mặc định được sử dụng cho tất cả các thông số khác, xác suất biến độ giữa các loài P (prior intraspecific divergence) được đặt biến động trong khoảng từ 0,001 đến 0,1 trong khi giá trị Steps được đặt mặc định 10, và Nb bins (để tính toán phân bố khoảng cách) được đặt là 20. 2.3. Phương pháp nhân giống in vitro cây Xáo tam phân 2.3.1. Phương pháp tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân Vật liệu vào mẫu từ đoạn thân: Các đoạn thân có kích thước 40 cm (tính từ ngọn) được thu để vào mẫu. Cành Xáo tam phân được rửa sạch dưới vòi nước chảy và rửa bằng xà phòng 10 phút, tráng lại 3 - 4 lần bằng nước cất vô trùng và đưa vào tủ cấy vô trùng. Vào tủ cấy vô
6 trùng, mẫu cành được cắt thành nhiều đoạn nhỏ và được khử trùng bằng nano bạc, Johnson 2,5% trong các khoảng thời gian khác nhau để tạo mẫu sạch từ đoạn thân. Vật liệu vào mẫu từ quả Xáo tam phân: Quả Xáo tam phân sau thu hái, rửa sạch bằng xà phòng trong 10 phút, tráng lại 2 - 3 lần bằng nước cất, tráng lại trong cồn 30 giây và đưa vào tủ cấy vô trùng. Quả Xáo tam phân được khử trùng bằng nano bạc, jonhson 2,5%. Tách vỏ lấy hạt, hạt sau khi tách được lắc trong dung dịch Johnson 1% trong 3 phút, tráng lại 1- 2 lần bằng nước cất vô trùng và cấy vào môi trường MS để tạo mẫu sạch từ quả. 2.3.2. Ảnh hưởng của nền môi trường tới khả năng sinh trưởng Xáo tam phân trong điề kiện in vitro Ba loại môi trường cơ bản MS, WPM và Knudson được sử dụng để xác định nền môi trường phù hợp nhất cho sự sinh trưởng và nhân nhanh P. trimera; pH môi trường 5,6. Tất cả các thí nghiệm được bổ sung 7 g/l agar, hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Kết quả thí nghiệm được đánh giá sau 4 tuần. 2.3.3. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân Nguồn mẫu sử dụng tạo mô sẹo là lá mầm từ hạt Xáo tam phân sau khử trùng. Các lá mầm sau khử trùng được cắt nhỏ và cấy vào môi trường có bổ sung auxin (IAA, IBA, 2.4D và TDZ) với các nồng độ khác nhau (từ 0,1 - 3,0 mg/l), sucrose (20 g/l), pH 5.8, tất cả các thí nghiệm được bổ sung 7 g/l agar, hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Kết quả thí nghiệm được đánh giá sau 4 - 6 tuần. 2.3.4. Ảnh hưởng của nhóm cytokinins, và auxin tới khả năng nhân nhanh Xáo tam phân Các nguồn vật liệu được sử dụng cho nghiên cứu phát sinh chồi. Nghiên cứu nhân nhanh Xáo tam phân được thực hiện trong môi trường bổ sung cytokinin như BA (1,0 - 5,0 mg/l), TDZ (0 - 0,5 mg/l) và phối hợp giữa hai loại phytohormon với các nồng độ khác nhau (từ 0.1 - 3.0 mg/l), sucrose (20 g/l), pH 5.8, tất cả các thí nghiệm được bổ sung 7 g/l agar, hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút. 2.3.5. Ảnh hưởng của nhóm auxin tới khả năng hình thành rễ Xáo tam phân Rễ Xáo tam phân được cảm ứng trong môi trường bổ sung auxin (IBA, α-NAA) với các nồng độ khác nhau (từ 0,1 - 3,0 mg/l), sucrose (20 g/l), pH 5.8, tất cả các thí nghiệm được bổ sung 7 g/l agar, hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Kết quả thí nghiệm được đánh giá sau 8 tuần. 2.3.6. Phương pháp bố trí và xử lý thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí hòan toàn ngẫu nhiên, ba lần lặp lại, mỗi lần 10 mẫu. Các mẫu được nuôi trong bình thuỷ tinh 250 ml. Số liệu được thu thập hàng tuần bao gồm tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu phát sinh mô sẹo, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi, tỷ lệ mẫu tạo rễ. Các đặc điểm chồi, số lượng chồi, chất lượng chồi, đặc điểm rễ, chất lượng rễ và chất lượng mô sẹo được ghi nhận. Các số liệu được xử lý bằng phần mềm excel, kiểm định Duncan và IRRISTAT 5.0. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KHẢO SÁT SỰ PHÂN BỐ VÀ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA CÁC MẪU THUỘC CHI PARAMIGNYA TẠI KHÁNH HÒA VÀ LÂM ĐỒNG 3.1.1. Khảo sát thành phần loài và sự phân bố của các mẫu nghiên cứu Kết quả khảo sát khu vực Khánh Hòa và Lâm Đồng thu được nhiều cá thể thuộc loài P. trimera và một số cá thể thuộc 4 loài P. armata, P. scandens, P. monophylla và P. rectispionisa. Sau khi khảo sát, thu thập, mô tả và đánh dấu vị trí phân bố, các mẫu được phân loại thành 5 nhóm cá thể lớn bao gồm nhóm Xáo tam phân P. trimera (X1, X2, X3, X4, X5) và 4 nhóm còn lại thuộc 4 loài thuộc chi Paramignya bao gồm P. armata, P. monophylla, P. scandens và P. rectispinosa (Hình 3.3 - 3.8). Các mẫu sau thu thập được đánh dấu và ghi dữ liệu bao gồm số lượng mẫu thu thập, tọa độ, tần suất phát hiện mẫu ở xung quanh điểm phát
7 hiện mẫu, nguồn gốc và địa chỉ của mẫu thu. Tổng số lượng mẫu thu thập của 9 nhóm cá thể gồm 50 mẫu. Trong đó có 29 cá thể mẫu thuộc loài P. trimera chia thành 5 nhóm đánh dấu X1 đến X5 dựa vào sự khác biệt về mặt hình thái (Hình 3.4), 5 cá thể thuộc loài P. armata, 6 cá thể thuộc loài P. monophylla, 5 cá thể P. scandens và 5 mẫu thuộc P. rectispinosa. A B Hình 3.1/3.2/3.3. Bản đồ địa bàn nghiên cứu vị trí thu thập mẫu và tình trạng phân bố (A) và vị trí lấy mẫu (B) các loài P. trimera và một số loài khác thuộc chi Paramignya 3.1.2. Đặc điểm hình thái của các mẫu thu thậpthuộc chi Paramignya Hình 3.4. Đặc điểm hình thái của Paramignya trimera (Oliv.) Burkill (A) Cây gỗ bụi cao từ 1-4 mét hoặc cao hơn; (B): Cây đang nở hoa; (C): Cấu trúc hoa điển hình; (D): Quả xanh; (E): Quả chín. (F): Giải phẫu cấu tạo của quả có 2 hạt được bao bọc bởi màng nhày. Hình 3.5. Đa dạng về hình thái lá của cây Xáo tam phân P. trimera (Oliv.) Burkill (A): Sự đa dạng về hình dạng lá của 5 nhóm cá thể Xáo tam phân thu thập ở các khu vực Ninh Vân, Ninh Hòa, Diên Khánh ký hiệu là P. trimera X1 đến X5. (B): các dạng lá khác nhau trên cùng một cây như một dạng thể ghép. (C): Các dạng lá khác nhau: (i) dạng kéo dài (oblong) với đầu lá được vuốt dài, (ii) là với các dạng khác nhau, dạng phình ra ở giữa và thắt lại ở 2 đầu (obovate), dạng hình trứng (ovate), dạng oval, dạng hình elip dạng hơi tròn, đỉnh lá tròn hoặc xẻ thuỳ ở đỉnh. (D): Dãy các hình thái khác nhau của các mẫu Xáo tam phân
8 Hình 3.6-3.9 Đặc điểm hình thái của bốn loài P. armata var. andamanica King; P. monophylla (Lour.) Tanaka; P. scandens; P. rectispinosa 3.6 3.7 3.8 3.9 3.2. Tách DNA, nhân các vùng chỉ thị DNA và nhận dạng loài 3.2.1. Tách chiết, tinh sạch và xác định hàm lượng của DNA Kết quả đã tách được DNA của tất cả các mẫu thu thập bao gồm P. trimera, P. monophylla, P. armata, P. scandens và P. rectispinosa. DNA tổng số của các mẫu được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (hình 3.10). Hình 3.10. DNA tổng số của các mẫu P.trimera và 4 loài thuộc chi Paramignya Chú thích: 1 - 5: Các mẫu P. trimera X1 - X5; 6 - 8: Các mẫu P. monophylla; 9 - 11: Các mẫu P. scandens; 12 - 13: Các mẫu P. rectispinosa; 14 - 17: Các mẫu P. armata. DNA tổng số sau khi kiểm tra trên gel agarose được tinh sạch bằng cách sử dụng bộ kít tinh lọc DNA genome của hãng Thermo Scientific GeneJET (# K0722) và định lượng bằng Nanodrop (Eppendorf, USA) để làm cơ sở xác định nồng độ DNA khuôn cho các phản ứng PCR sau đó. 3.2. Xác định đa dạng di truyền của các mẫu Xáo tam phân dựa vào chỉ thị SSR Trong tổng số 50 chỉ thị đặc trưng cho họ cam được khảo sát, có 31 chỉ thị nhân được thành công và có độ lặp lại với 115 băng (allen) được khuếch đại, trong đó có 40 băng đa hình. Một số hình ảnh phân tích bằng chỉ thị SSR được trình bày ở hình 3.11. Hình 3.11. Kết quả phân tích đa hình các mẫu Paramignya bằng chỉ thị SSR Mức độ đa hình trong quần thể của các loài thuộc chi Paramignya khá thấp, trung bình có 2,88 allen/chỉ thị. Hàm lượng thông tin đa hình (PIC) của các chỉ thị dao động từ 0,117 đến 0,63. Riêng loài P. armata có sự khác biệt rõ rệt với các loài phân tích trong chi Paramignya khi phân tích bằng các cặp mồi Ci01A07, Ci02A04, Ci02B07, Ci02B10, mCrCIR01D06a. Trong 31 cặp mồi có 11 cặp mồi cho tính đa hình cao với giá trị PIC > 0,5. Kết quả phân tích được tổng hợp ở bảng 3.2.
9 Bảng 3.2. Số allen và hệ số PIC của 31 cặp mồi SSR Tên mồi Trình tự lặp (motif) Tổng số allen Số alen đa hình PIC Ci01A07 (CT)9 2 1 0,113 Ci01C07 (CT)10 3 1 0,117 Ci01D11 (CT)15 3 2 0,269 Ci01D12 (CT)15 2 1 0,198 Ci01G11 (TGC) 11 1 0 0,009 Ci02A04 (GA)9 4 1 0,493 Ci02F07 (GT)7 4 1 0,235 Ci06A05b (GA)15 4 1 0,471 Ci07C09 (GT)15AT(GT)2 6 2 0,518 Ci07E06 (GA)9G(GA)2 4 2 0,531 Ci07D10 (GA)9G(GA)2 1 0 0,007 Ci07G07 (GA)19 2 1 0,198 Ci08C05 (GA)14 2 1 0,169 mCrCIR01B10 (TC)9CC(TC)2 4 1 0,549 mCrCIR01F04a (CA)12 4 2 0,447 mCrCIR01F04a (CT)13CC(CT)7 4 1 0,332 mCrCIR06A02 (GT)7 2 1 0,294 mCrCIR06A03 (GA)13 4 2 0,517 mCrCIR06A08 (GA)4A2(GA)2 A2(GA)9 4 1 0,352 Pr34 (AG)21 4 2 0,428 Pr35 (AG)21 2 1 0,198 Pr36 (GA)9 4 1 0,367 Pr37 (CT)12 2 1 0,238 Pr38 (CAC)23 4 1 0,457 Pr39 (AGT)14 4 1 0,523 Pr40 (ATC)9 1 0 0,008 Pr41 (AG)14 4 1 0,535 Pr44 (ATC)9 4 1 0,617 Pr43 (CAG)20 6 2 0,63 Pr45 (GT)23 4 1 0,398 Pr46 (CT)23 1 0 0,007 Pr47 (CT)19 1 0 0,008 Pr48 (CT)21 4 1 0,602 Pr49 (AG)14 4 2 0,608 Pr50 (GT)8 6 3 0,509 Tổng 115 40 Quan hệ di truyền giữa các loài thuộc chi Paramignya được phân tích bằng phần mềm NTSYS 2.1, từ đó xác định hệ số tương đồng di truyền và cây di truyền của các loài phân tích (Hình 3.12 và 3.13). Kết quả cho thấy, dạng cây cladogram thể hiện 2 nhánh rõ rệt của các loài thuộc chi Paramignya, trong đó nhánh thứ nhất gồm các loài P. trimera, P. monophylla, P. scandens và P. rectispinosa, nhánh thứ 2 gồm P. armata. Đối với nhánh thứ nhất chia thành 3 nhánh phụ, trong đó loài P. monophylla có mối quan hệ gần gũi với các loài P. trimera (X1- X4) với khoảng cách di truyền rất nhỏ từ 0,001 đến 0,009 (hình 3.12). Hình 3.12. Mối quan hệ di truyền của các loài thuộc chi Paramignya
10 Kết quả phân tích ma trận cho thấy khoảng cách di truyền giữa các mẫu phân tích rất nhỏ, dao động từ 0,001 đến 0,09 (Hình 3.13). Hình 3.13. Ma trận khoảng cách giữa các mẫu phân tích Khoảng cách giữa các loài thuộc chi Paramignya rất nhỏ và có đan xen giữa các loài khác nhau trong cùng một nhánh. Đây cũng là một trong những nguyên nhân dẫn đến hiện tượng giống nhau về mặt hình thái quan sát trong tự nhiên, có thể dẫn đến khả năng giao phấn hoặc lai xa khác loài có thể xảy ra ở các loài khác nhau trong cùng chi Paramignya. 3.3. PCR và xác định trình tự các vùng chỉ thị DNA và nhận dạng loài 3.3.1. PCR và xác định trình tự các vùng chỉ thị DNA Trong nghiên cứu này, các mẫu Paramignya được nhân lên bằng PCR sử dụng các cặp mồi phổ biến bao gồm ITS, matK và rbcL. Kết quả cho thấy, sản phẩm PCR vùng ITS, matK và rbcL có chiều dài tương ứng khoảng 900, 900 và 620 nucleotide. Kết quả PCR nhân các vùng trình tự ITS, matK và rbcL của một số mẫu đại diện được trình bày ở hình 3.14. Hình 3.14. Kết quả nhân vùng ITS, matK và rbcL ở các mẫu Paramignya Ghi chú: Ghi chú: A: Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS các mẫu P. trimera X1 - X5 và P. armata, P. monophylla, P. scandens và P. rectispinosa tương ứng với các giếng từ 1 - 9; B: Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi matK các mẫu P.trimera X1 - X3, P. armata, P. monophylla, P. scandens và P. rectispinosa, tương ứng các giếng từ 1 - 7; C: Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi matK các mẫu P. trimera X1, P. trimera X2, P. armata, P. monophylla, P. scandens và P. rectispinosa, tương ứng các giếng từ 1 - 6. M: Thang chuẩn 1kb DNA ladder (điện di trên gel agarose 1%). 3.3.2. Nhận dạng loài dựa vào công cụ MEGABLAST 3.3.2.1. Nhận dạng loài dựa vào trình tự ITS Kết quả Megablast vùng trình tự ITS có chiều dài 715 nucleotide cho kết quả bắt cặp tốt nhất với 2 trình tự của loài P. trimera (KM111544.1) có nguồn gốc tại Vĩnh Phương, Khánh Hòa) và trình tự của loài P. confertifolia (HG004846.1) có nguồn gốc từ Yunnan, Mensong, Trung Quốc. Kết quả cho thấy các trình tự truy vấn ITS của các mẫu thuộc chi Paramignya đã
11 bắt cặp ở mức độ giống nhau cao (similarity) > 84,35%, độ che phủ (query coverage) từ 93-98% với các loài thuộc các chi P. armata, P. trimera, Severinia buxifolia, P. confertifolia, Citrus trifolia, Citrus sinnesis, Citrus reticulata và dòng lai giữa Citrus và tangelo (Hình 3.15). Hình 3.15. Kết quả Megablast sử dụng trình tự truy vấn ITS của P. trimera X1 Ghi chú: Các trình tự theo thứ tự từ 1-3 và từ 4-6 là trình tự ITS được đăng ký trong GenBank của nghiên cứu này Như vậy, bằng cách sử dụng cặp mồi ITS trong nghiên cứu này để nhân vùng trình tự ITS và vùng trình tự này có khả năng làm chỉ thị phân tử để nhận dạng được chi Paramignya với các chi khác. 3.3.2.2. Nhận dạng loài dựa vào trình tự matK của P. trimera X1 Kết quả Megablast cho kết quả bắt cặp trước hết với các loài thuộc chi Paramignya, điển hình như loài P. confertifolia (HG004970.1) nguồn gốc ở Yunnan, Trung Quốc ở mức 99,48% và trình tự của loài P. lobata (AB762387.1) ở mức tương tự 99,48%. Trình tự matK của một loài thuộc P. lobata với số truy cập có chiều dài 1402 nucleotide với mức độ giống nhau tới 99,48% và độ che phủ (query cover) đạt 99% (Hình 3.17). Kết quả cho thấy, các trình tự P. trimera (đại diện là P. trimera X1) nằm trong một nhánh riêng và có quan hệ rất gần gũi với P. confertiforlia và P. lobata, đồng thời là một nhánh trong 1 nhóm lớn gồm 4 loài (polyphyletic group). Như vậy, chỉ thị matK có thể nhận dạng và phân biệt loài P. trimera so với các loài thuộc chi Paramignya khác bao gồm P. confertifolia, P. lobata. Hình 3.17. Kết quả Megablast sử dụng trình tự truy vấn matK của P. trimera X1 3.3.2.3. Nhận dạng loài dựa vào trình tự rbcL Kết quả Megablast sử dụng các trình tự rbcL cho kết quả bắt cặp với trình tự của loài Murrays paniculata, P. confertifolia, Atalantia kwangtungensis và một số loài thuộc chi Citrus (Hình 3.19). Trong đó các thông số kết quả Megablast đối với loài M. paniculata (số truy cập MT747442.1) với Max score và Total score (974), mức độ che phủ của trình tự truy vấn (91%) và mức độ giống nhau đạt 98,55%. Đối với loài P. confertifolia với Max score và Total score (970), độ che phủ đối với trình tự truy vấn 88%, và mức độ giống nhau đạt
12 99,26%. Do trình tự rbcL của loài P. trimera hiện nay chưa có trình tự tham chiếu trong NCBI cho nên kết quả này gợi ý rằng với chỉ thị rbcL, P. trimera có mối quan hệ gần với các loài thuộc loài P. confertifolia, Murraya paniculata, Citrus polytrifolia. Hình 3.19. Kết quả Megablast với trình tự truy vấn rbcL của P. trimera X1 Theo kết quả thu được, các vùng vùng DNA ITS, matK và rbcL cho phép phân biệt ở mức độ chi Paramignya. Điều này nghĩa là có thể nhận dạng và phân biệt được các loài ở mức độ chi Paramignya. 3.4. Xây dựng chỉ thị DNA để nhận dạng Xáo tam phân 3.4.1. Khảo sát dữ liệu DNA mã vạch của các loài thuộc chi Paramignya Tại thời điểm nghiên cứu (9/2020), trong hệ thống BOLD chỉ thu được 10 bản ghi gồm 4 loài: P.cf. scandens, P. mindanaensis, P. lobata và P. confertifolia. Trong đó, các dữ liệu DNA mã vạch được công bố chính thức nằm trong vùng các gen matK và rbcL. Thông tin chi tiết được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Tổng hợp thông tin về DNA barcode của các loài thuộc chi Paramignya trong hệ thống BOLD DNA barcodes STT Tên loài Ký hiệu Taxonomy ID Vị trí thu thập Kích thước (bp) MatK rbcL 1 P. cf. scandens CRCZ1945-16 Rutaceae, Paramignya KR1943 Jambi, Indonesia 629 579 2 P. cf. scandens CRCZ1946-16 Rutaceae, Paramignya KR1944 Jambi, Indonesia 609 552 3 P. cf. scandens CRCZ1947-16 Rutaceae, Paramignya KR4713 Jambi, Indonesia - - 4 P. mindanaensis CRCZ4713-16 Rutaceae, Paramignya KR4711 Jambi, Indonesia - - 5 P. mindanaensis CRCZ4714-16 Rutaceae, Paramignya KR4712 Indonesia, Jambi - - 6 P. mindanaensis CRCZ4715-16 Rutaceae, Paramignya KR4713 Indonesia, Jambi - - 7 P. lobata GBVK1148-11 Rutaceae, Paramignya AB505913 GenBank, NCBI - 1680 8 P. confertifolia GBVP2397-14 Rutaceae, Paramignya HG004970 GenBank, NCBI 807 - 9 P. lobata GBVR1595-13 Rutaceae, Paramignya AB762387 GenBank, NCBI 1527 - 10 P. confertifolia GBVY3119-14 Rutaceae, Paramignya KF181542 China, Yunnan, - 660 Mengsong Ghi chú: (-): Không có thông tin 3.4.2. Xây dựng cơ sở dữ liệu các trình tự thuộc chi Paramignya Trong CSDL nucleotide, số lượng các trình tự DNA tham chiếu thuộc các vùng gen ITS, MatK, rbcL chỉ có khoảng 30 trình tự được đăng ký trong GenBank. Để phát triển chỉ thị phân tử DNA nhằm nhận dạng và phân biệt được loài Xáo tam phân với các loài thuộc chi Paramignya, tập hợp CSDL riêng cho chi Paramignya đã được xây dựng dựa trên kết quả sàng lọc trình tự liên quan đến các loài thuộc chi Paramignya có mặt trong GenBank. Các
13 trình tự có mức độ giống nhau cao với các trình tự truy vấn thuộc về chi Paramignya từ GenBank sẽ được lưu lại để tạo cơ sở dữ liệu. Tập hợp các trình tự ITS, matK và rbcL từ nghiên cứu này được tóm tắt trong bảng 3.4. Bảng 3.4. Tổng hợp các dữ liệu trình tự của các loài thuộc chi Paramignya Thông tin trình tự và số truy cập trong GenBank Tên loài Vị trí Kích Kích Kích Ghi chú ITS matK rbcL thước thước thước P. armata var. Ninh Vân, MT193825.1 767 MT215526 831 MT215536 604 Nghiên andamanica Khánh Hòa cứu này King P. scandens Di Linh MT193832.1 772 MT215519 831 MT215530 604 Nghiên Lâm Đồng cứu này P. Cát Tiên, MT193830.1 776 MT215518 831 MT215535 604 Nghiên rectispinosa Lâm Đồng cứu này Craib Paramignya Ninh Vân, MT193826.1 767 MT215522 831 MT215529 604 Nghiên trimera (Oliv.) Khánh Hòa MT193827.1 MT215524 MT215528 cứu này Burkill (X1-X2) Ninh Hòa, MT193831.1 767 MT215523 831 MT215533 604 Nghiên Khánh Hòa MT193833.1 MT215525 MT215532 cứu này (X3-X4) Diên Khánh, MT193834.1 767 MT215521 831 MT215534 604 Nghiên Khánh Hòa cứu này (X5) P. monophylla Đơn Dưong, MT193828.1 778 MT215517 831 MT215527 604 Nghiên Wright Lâm Đồng cứu này Paramignya GBVR1595- - - AB762387 1527 - 1680 BOLD/Ge lobata 13/BOLD nBank system Paramignya GBVP2397- - - HG004970 807 - - BOLD/Ge confertifolia 14/BOLD nBank system Paramignya CRCZ1946- - - KR1944 609 - 552 BOLD cf. scandens 16/BOLD system Paramignya CRCZ1945- - - KR1944 629 - 579 BOLD cf. scandens 16/BOLD system Paramignya GBVY3119- - - - - KF181542 660 BOLD/Ge confertifolia 14 nBank 3.4.3. So sánh các trình tự để nhận dạng và phân biệt Xáo tam phân Khi so sánh trình tự vùng gen ITS, matK và rbcL của các mẫu nghiên cứu trong cùng 1 loài thuộc mỗi nhóm P. armata, P. rectispinosa, P. scandens và P. monophylla cho thấy không có sự khác biệt về trình tự nucleotide. Điều này chứng tỏ các mẫu thu thập có tính đồng nhất và thuộc cùng 1 loài. Tuy nhiên khi so sánh trình tự của các mẫu Xáo tam phân thuộc các nhóm X1-X5 mặc dù có sự giống nhau rất cao nhưng vẫn có một số vị trí sai khác trong chuỗi trình tư. Do đó, các trình tự ITS, matK và rbcL tương ứng với 5 mẫu đại diện cho Xáo tam phân (ký hiệu P. trimera X1-X5) và 4 mẫu đại diện cho 4 loài P. trimera, P. rectispinosa, P. scandens và P. monophylla được lựa chọn để thực hiện căn nhiều trình tự bằn công cụ Clustal Omega của của EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).
14 Kết quả căn nhiều trình tự cho thấy, đối với trình tự ITS, trong tổng số 715 nucleotide, kết quả căn nhiều trình tự cho thấy có 320 nucleotide giống nhau hòan toàn (*) chiếm 44,75%. Đối với trình tự matK, trong tổng số 774 nucleotide có 131 nucleotide giống nhau hòan toàn chiếm 16,92%. Tương tự, kết quả căn nhiều trình tự đối với vùng rbcL cho thấy, trong tổng số 570 nucleotide có 161 nucleotide giống nhau Hòan toàn chiếm 28,25%. 3.4.4. Xây dựng cây tiến hoá giữa các loài 3.4.4.1. Xây dựng cây tiến hoá từ trình tự ITS Cây tiến hoá được xây dựng từ trình tự ITS bằng thuật toán ML cho thấy có sự đan xen giữa các mẫu trong chi Paramignya. Trong đó, các trình tự thuộc nhóm P. trimera X1, X3 nằm cùng 1 nhánh với loài P. trimera có số truy cập KM111544.1 thu thập ở Vĩnh Phương, Khánh Hòa của nhóm nghiên cứu Thien, V.H., Khanh, N.D. và Nam, T.N đã công bố vào năm 2014. Các mẫu còn lại P. trimera X2, X4 và X5 mặc dù nằm trong cùng 1 nhánh nhưng có mối quan hệ rất gần với 2 loài P. monophylla, P. rectispinosa và P. scandens. Nhánh này chia sẻ tổ tiên chung với loài P. confertifolia (HG004846.1) có nguồn gốc từ Yunna Mensong, Trung Quốc (Hình 3.21a). Hình 3.21a. Mối quan hệ tiến hoá giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự ITS sử dụng thuật toán ML của chương trình MegaX và chương trìh BEAST (b) Đối với chương trình BEAST sử dụng thuật toán thống kê Bayesian inference cho thấy, vẫn có sự đan xen giữa các mẫu trong chi Paramignya. Trong đó, các trình tự của các mẫu nhóm P. trimera X3, X4 và X5 nằm cùng 1 nhánh riêng, các trình tự của các mẫu trong nhóm P. trimera X1 và X2 nằm chung trong cùng 1 nhóm với P. monophylla và P. confertifolia (HG004846.1) có nguồn gốc ở Yunnan, Mensong, Trung Quốc, trong khi 1 nhánh riêng gồm 3 loài P. rectispinosa, P. armata, P. scandens và P. trimera (KM111544.1) có nguồn gốc ở Vĩnh Phương, Khánh Hòa (Hình 3.21b). Như vậy, đối với trình tự ITS khi sử dụng cả 2 chương trình MegaX và BEAST vẫn thể hiện sự đan xen giữa các mẫu P. trimera với các loài khác thuộc chi Paramignya. Điều này cho thấy, khả năng sử dụng trình tự ITS làm chỉ thị để nhận dạng loài Xáo tam phân P. trimera vẫn có nguy cơ bị nhầm lẫn với một số loài gần gũi thuộc chi này, chẳng hạn như P. monophylla hoặc P. Confertifolia. 3.4.4.2. Xây dựng cây tiến hoá từ trình tự matK Kết quả xây dựng cây tiến hóa từ trình tự matK bằng thuật toán ML cho thấy có sự tách biệt rõ ràng giữa các mẫu P. trimera với các loài khác thuộc chi Paramignya. Trong đó, các trình tự thuộc nhóm P. trimera X1 - X5 nằm trong cùng 1 nhóm (monophyletic group). Các loài với loài P. monophylla, P. rectispinosa, P. scandens và P. armata nằm trong cùng 1 nhóm (polyphyletic group) chia thành 2 nhánh nhỏ (clade). Hai loài P. confertifolia
15 (HG004970.1) có nguồn gốc ở Yunna Mengsong, Trung Quốc và P. scandens (EF138912.1) có nguồn gốc từ Australia nằm trong cùng 1 nhóm (Hình 3.22a). Hình 3.22a/b . Mối quan hệ tiến hoá giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự matK sử dụng thuật toán ML của chương trình MegaX (a) và sử dụng chương trình BEAST (b) Đối với chương trình BEAST sử dụng thuật toán thống kê Bayesian inference cho thấy các trình tự của các mẫu nhóm P. trimera X1 - X5 nhóm thành 1 nhóm lớn (polyphyletic group) tách riêng khỏi các loài còn lại thuộc chi Paramignya. Trong nhóm lớn này, các mẫu P. trimera X1 - X4 nằm trong một nhóm riêng (monophyletic group), mẫu P. trimera X5 tách riêng thành một nhánh nhưng cùng chia sẻ tổ tiên chung. Các loài P. monophylla, P. rectispinosa, P. scandens và P. armata cùng với P. confertifolia (HG004970.1) có nguồn gốc từ Yunnan, Mengsong, Trung Quốc) nằm trong 1 nhóm lớn (polyphyletic group). Riêng loài P. scandens có nguồn gốc từ Australia tách riêng thành 1 nhóm ngoại (out group) (Hình 3.22b). Như vậy, đối với trình tự matK khi sử dụng cả 2 chương trình MegaX và BEAST cho kết quả tương tự nhau, trong đó các loài P. trimera nằm trong cùng 1 nhóm tách biệt khỏi các loài còn lại trong chi Paramignya. Kết quả nghiên cứu cho thấy, trình tự matK có thể sử dụng làm chỉ thị để nhận dạng loài Xáo tam phân P. trimera với các loài khác trong chi Paramignya. 3.4.4.3. Xây dựng cây tiến hoá bằng trình tự rbcL Tương tự, kết quả xây dựng cây tiến hoá từ trình tự rbcL bằng thuật toán ML cho thấy có sự đan xen giữa các mẫu P. trimera X1, X2 và X4 với các mẫu P. scandens và P. armata. Điều này chứng tỏ trình tự rbcL có mức độ giống nhau cao giữa các loài này. Các loài P. rectispinosa và P. confertifolia (KF18542.1) ở Yunna Mensong, Trung Quốc đã tách riêng thành 2 nhánh trong 1 cụm (polyphyletic group). Riêng 4 loài Severinia buxifolia (AB505912.1) ở Nhật Bản và 3 loài P. monophylla (AF320881.1), P. scandens (EF126562.1) và P. monophylla (AF320881.1.) ở Australia phân bố trong 1 nhánh lớn (polyphyletic group). Rõ ràng Severinia buxifolia (AB505912.1) ở Nhật Bản là một loài thuộc chi Severinia nên đã tách riêng rẽ thành một nhánh. Điều này cũng phù hợp với vị trí phân loại của chi này trong họ Rutaceae (Hình 3.23a).
16 Hình 3.23a/b. Mối quan hệ tiến hoá giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự rbcL sử dụng chương trình MegaX (a) và chương trình BEAST (b) Đối với chương trình BEAST sử dụng thuật toán thống kê Bayesian inference (Hình 2.23b) cho thấy các trình tự của các mẫu nhóm P. trimera X1, X3, X5 phân bố trong cùng 1 nhánh với P. scandens và P. monophylla (AF320881.1) có nguồn gốc ở Australia. Hai mẫu P. trimera X2 và X4 nằm trong 1 nhánh lớn (polyphyletic group) gồm 9 loài, trong đó 1 nhánh (monophyletic group) gồm 2 loài Severinia buxifolia (AB505912.1) có nguồn gốc từ Nhật Bản và P. monophyla, 1 nhánh (monophyletic group) gồm 2 loài P. armata và P. rectispinosa, một nhánh (polyphyletic group) gồm 4 loài gồm P. trimera X2, X4 với 3 loài P. lobata (EF126561.1) và P. scandens (EF126562.1) có nguồn gốc từ Australia và P. confertifolia (KF182542.1) từ Yunnan, Mensong, Trung Quốc (Hình 3.23b). Như vậy, đối với trình tự rbcL khi sử dụng cả 2 chương trình MegaX và BEAST đều cho thấy có sự đan xen giữa các mẫu P. trimera với các loài khác thuộc chi Paramignya. Điều này cho thấy, khả năng sử dụng trình tự rbcL làm chỉ thị để nhận dạng loài Xáo tam phân P. trimera vẫn có khả năng bị lẫn với một số loài gần gũi thuộc cùng chi như P. monophylla hoặc P. scandens. 3.4.5. Xây dựng chỉ thị phân tử để nhận dạng Xáo tam phân 3.4.5.1. Phân tích trình tự ITS Kết quả phân tích vùng trình tự ITS gồm 715 nucleotide của các loài thuộc chi Paramignya đưa ra vùng trình tự chung (consensus) được tính toán dựa vào tần xuất xuất hiện của các nucleotide ở từng vị trí chung của tất cả các trình tự. Khi rà soát toàn bộ chuỗi, có 4 vị trí nucleotide khác biệt đặc trưng riêng cho trình tự ITS bao gồm 2 vị trí 109 và 110 đã xuất hiện 2 nucleotide chèn thêm là CT (109_110insCT), tại vị trí 130 chèn thêm nuceotide C (130insC), tại vi trí 231 chèn thêm C hoặc G (231insC/G) và vị trí 266 chèn thêm C (266 insC). Kết quả các vùng nucleotide khác biệt đặc trưng cho loài P. trimera được trình bày ở Hình 3.24. Kết quả phân tích trình tự ITS cho thấy, vẫn còn sự đan xen về trình tự giữa các loài Xáo tam phân P. trimera với P. monophylla ở vị trí 109 và 110 cùng có 2 nucleotide chèn thêm là CT và ở vị trí nucleotide 266 cùng xuất hiện nucleotide C với loài P. amarta, P. trimera X1, X2, X4. Do đó gen ITS chưa đủ tin cậy để làm DNA mã vạch để nhận diện loài P. trimera.
17 Hình 3.24. Phân tích các vùng/vị trí nucleotide khác biệt đặc trưng cho P. trimera trong chuỗi trình tự ITS 3.4.5.2. Phân tích trình tự matK Tương tự, kết quả phân tích vùng trình tự matK gồm 774 nucleotide của các loài thuộc chi Paramignya đưa ra vùng trình tự chung. Khi rà soát toàn bộ chuỗi, có 3 vị trí nucleotide khác biệt đặc trưng riêng cho trình tự matK bao gồm vị trí 703 và 704 sai khác mất 2 nucleotide AA (703_704delAA), vị trí 717 và 718 sai khác mất 2 nucleotide CC (717_718delCC) và vị trí 873 sai khác mất nucleotide T (873delT). Lưu ý vị trí 873 là vị trí sau khi căn nhiều trình tự (các vị trí trống/gap) được chèn vào (tương ứng với vị trí 733 của trình tự trước khi căn) (Hình 3.25). Hình 3.25. Phân tích các vùng/vị trí nucleotide khác biệt đặc trưng cho P. trimera trong chuỗi trình tự matK
18 Kết quả phân tích trình tự (Hình 3.25) cho thấy, gen matK có sự đồng nhất giữa các loài P. trimera khi phân tích chi tiết trình tự. Do đó, gen matK có thể sử dụng để nhận diện loài P. trimera với các loài khác trong cùng chi Paramignya. 3.4.5.3. Phân tích trình tự rbcL Tương tự, kết quả phân tích vùng trình tự rbcL gồm 570 nucleotide của các loài thuộc chi Paramignya đưa ra vùng trình tự chung. Tuy nhiên, trên toàn bộ chuỗi không phát hiện được vùng trình tự đặc thù riêng cho P. trimera. Kết quả được minh hoạ ở hình 3.26. Như vậy, không xác định được trình tự đặc thù để phát triển chỉ thị nhận dạng Xáo tam phân đối với trình tự rbcL. Hình 3.26. Phân tích các vùng/vị trí nucleotide khác biệt đặc trưng cho P. trimera trong chuỗi trình tự rbcL Bảng 3.5. Tổng hợp các vùng trình tự ITS, matK và rbcL của các trình tự Kích thước chưa Vị trí khác biệt so với các loài phân tích STT Chỉ thị căn trình tự (nt) (sau khi căn nhiều trình tự) 1 ITS 715 109_110insCT; 130insC; 231insC/G; 266 insC 2 matK 774 703_704delAA; 717_718delCC; 873delT 3.4.6. Đánh giá chỉ thị phân tử dựa vào phân tích khoảng cách mã vạch Để xác định khả năng phát triển chỉ thị phân tử DNA làm vùng trình tự mã vạch, phân tích sâu hơn bằng chương trình ExcaliBAR được thực hiện nhằm xác định khoảng cách loài giữa các mẫu nghiên cứu khi phân tích bằng mỗi vùng trình tự lựa chọn, ITS, matK hoặc rbcL và trình tự ghép nối (tổ hợp cả 3 vùng trình tự kể trên thành một trình tự). Kết quả cho thấy khoảng cách trong loài (intraspecific distance) và khoảng cách giữa các loài (interspecific distance) tương ứng với các trình tự ITS, matK, rbcL và trình tự ghép nối cả 3 trình tự ITS+matK+rbcL (concatenated sequence) lần lượt là 0,11 ± 0,01, 0,29 ± 0,02, rbcL 0,48 ± 0,05 và 0,05 ± 0,0001 (Bảng 3.6). Sự chồng lấp khoảng cách xảy ra khi 2 khoảng giá trị trong loài và giữa các loài giao nhau. Khoảng cách tối thiểu giữa các trình tự đã quan sát được trong các trường hợp ITS, rbcL và các trình tự ghép nối (Bảng 3.6). Trong trường hợp matK, khoảng cách mã rõ rệt giữa 2 khoảng giá trị trong loài và giữa các loài với giá trị khoảng cách trong loài cao nhất (maximum intraspecific distance) là 0,0028 và khoảng cách giữa các loài nhỏ nhất (minimum