Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Đánh giá nguồn gen và phân tích chỉ thị phân tử liên quan tính trạng năng suất trứng ở giống gà Liên Minh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:175

Thêm vào BST

Báo xấu

55
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án ứng dụng công nghệ sinh học và các công cụ tin sinh học để phân tích đa dạng di truyền gà Liên Minh, phục vụ công tác bảo tồn, khai thác và phát triển giống gà Liên Minh. Xác định được các gen mục tiêu, phục vụ công tác chọn lọc giống gà Liên Minh có năng suất trứng cao.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Đánh giá nguồn gen và phân tích chỉ thị phân tử liên quan tính trạng năng suất trứng ở giống gà Liên Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ BÌNH NGUYÊN ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN VÀ PHÂN TÍCH CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN QUAN TÍNH TRẠNG NĂNG SUẤT TRỨNG Ở GIỐNG GÀ LIÊN MINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ BÌNH NGUYÊN ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN VÀ PHÂN TÍCH CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN QUAN TÍNH TRẠNG NĂNG SUẤT TRỨNG Ở GIỐNG GÀ LIÊN MINH Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1: TS. Nguyễn Thị Diệu Thúy 2: TS. Nguyễn Hữu Đức Hà Nội, 2019
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi dưới sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô và sự giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu thuộc Phòng Công nghệ Gen động vật - Viện Công nghệ Sinh học. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án này là trung thực, khách quan. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 04 tháng 01 năm 2019 Tác giả luận án Trần Thị Bình Nguyên i
LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thiện luận án ngoài sự nổ lực của bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự đồng hành, quan tâm và hỗ trợ từ các cá nhân và tổ chức. Trước tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Thị Diệu Thúy và TS. Nguyễn Hữu Đức là cô, thầy hướng dẫn đã tạo điều kiện, hỗ trợ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, các thầy cô giáo và các cán bộ Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam; Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Viện Di truyền Nông nghiệp đã hướng dẫn, tạo điều kiện và hỗ trợ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo, các cán bộ và đồng nghiệp phòng Công nghệ gen động vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam; Khoa Công nghệ sinh học; bộ môn Di truyền giống - Khoa Chăn nuôi - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điệu kiện giúp đỡ về kiến thức và trang thiết bị để tôi hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn ThS. Vũ Công Quý, Hoàng Thị Yến và các cán bộ tại Trung tâm ứng dụng tiến bộ Khoa học và Công nghệ, Sở Khoa học và Công nghệ TP Hải Phòng đã giúp tôi rất nhiều về cơ sở vật chất, trang thiết bị thí nghiệm trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã hỗ trợ kinh phí và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được tập trung hoàn thiện luận án. Tôi xin cảm ơn nguồn kinh phí tài trợ từ đề tài hợp tác KHCN với địa phương mã số VAST.NĐP.01/15-16 - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; đề tài cấp cơ sở mã số: T2018 - 12 - 83 - Học Viện Nông Nông nghiệp Việt Nam và hỗ trợ từ nhiệm vụ quỹ gen "Khai thác và phát triển giống gà Liên Minh tại Hải Phòng" mã số NVQG-2013/14. Cuối cùng tối xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và các bạn sinh viên đã luôn đồng hành, hỗ trợ và động viên tôi hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Nghiên cứu sinh Trần Thị Bình Nguyên i
MỤC LỤC Lời cam đoan .................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ i Mục lục ............................................................................................................................ ii Danh mục bảng .............................................................................................................. iv Danh mục hình ............................................................................................................... vi Danh mục các từ viết tắt.............................................................................................. viii Mở đầu ............................................................................................................................ 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 2 4. Những đóng góp mới của đề tài.......................................................................... 2 5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài ...................................................... 3 Chương i. Tổng quan tài liệu ......................................................................................... 4 1.1. Đánh giá nguồn gen gà ....................................................................................... 4 1.1.1. Sơ lược về vị trí phân loại của gà nhà ................................................................ 4 1.1.2. Đại cương về phân loại học ................................................................................ 4 1.1.3. Cấu trúc hệ gen ty thể gà .................................................................................... 6 1.2. Mối liên quan giữa đa hình các gen ứng viên và khả năng sinh sản ................ 18 1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng tới sản lượng trứng ở gà ............................................... 18 1.2.2. Phân tích đa hình gen ứng viên và mối liên quan với khả năng sản xuất trứng ở gà .......................................................................................................... 21 1.2.3. Nghiên cứu đa hình các gen ứng viên liên quan đến các tính trạng sinh sản ở gà trên thế giới......................................................................................... 24 1.2.4. Tình hình nghiên cứu đa hình các gen ứng viên trên gà tại Việt Nam ............. 34 1.3. Gà liên minh ..................................................................................................... 35 1.3.1. Giới thiệu về gà Liên Minh .............................................................................. 35 1.3.2. Các nghiên cứu về gà Liên Minh ...................................................................... 36 Chương ii. Vật liệu và phương pháp ........................................................................... 38 2.1. Vật liệu ............................................................................................................. 38 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 38 ii
2.1.2. Các hóa chất...................................................................................................... 41 2.1.3. Máy móc thiết bị sử dụng ................................................................................. 42 2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 42 2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 42 2.3.1. Phương pháp thu mẫu máu ............................................................................... 42 2.3.2. Phương pháp tách ADN hệ gen từ máu ............................................................ 43 2.3.3. Phương pháp nhân đoạn ADN bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) ........ 43 2.3.4. Phương pháp tinh sạch PCR và giải trình tự gen .............................................. 43 2.3.5. Phương pháp phân tích đa hình gen ứng viên .................................................. 43 2.3.6. Đánh giá các chỉ tiêu liên quan tính trạng sinh sản ở gà .................................. 44 2.3.7. Khối lượng cơ thể ............................................................................................. 45 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 45 Chương iii. Kết quả và thảo luận ................................................................................ 46 3.1. Kết quả phân tích đa dạng nguồn gen gà Liên Minh ........................................ 46 3.1.1. Tách chiết ADN hệ gen .................................................................................... 46 3.1.2. Khuếch đại vùng D-loop ADN ty thể bằng phản ứng PCR.............................. 47 3.1.3. Giải trình tự nucleotide vùng D-loop................................................................ 47 3.1.4. Phân tích đa hình nucleotide vùng D-loop của gà Liên Minh và một số gà bản địa có mã số trên Genbank ......................................................................... 48 3.2. Phân tích chỉ thị phân tử liên quan tính trạng năng suất trứng ở giống gà Liên Minh ......................................................................................................... 68 3.2.1. Theo dõi 5 chỉ tiêu liên quan tính trạng năng suất trứng của 90 cá thể gà Liên Minh ......................................................................................................... 68 3.2.2. Tần số alen/kiểu gen các đa hình gen PRL, PRLR, VIP, VIPR1, NPY, GH và GHR; phân tích mối liên quan với tính trạng năng suất trứng ở gà Liên Minh.................................................................................................................. 72 Kết luận và kiến nghị .................................................................................................. 106 1. Kết luận........................................................................................................... 106 2. Kiến nghị ........................................................................................................ 107 Danh mục công trình công bố liên quan đến luận án .............................................. 108 Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... a iii
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Đa dạng di truyền các giống gà dựa trên trình tự nucleotide D-loop ty thể ........................................................................................................... 13 Bảng 1.2. Nghiên cứu đa hình di truyền các gen liên quan tính trạng sinh sản ở gà........ 25 Bảng 2.1. Thông tin về trình tự nucleotide vùng D-loop các giống gà sử dụng trong phân tích đa dạng nguồn gen ............................................................ 38 Bảng 2.2. Thông tin mồi sử dụng trong phân tích trình tự nucleotide ....................... 40 Bảng 2.3. Thông tin mồi sử dụng trong phân tích gen ứng viên ................................ 40 Bảng 2.4. Thông tin về phản ứng enzyme cắt hạn chế (RE) ...................................... 41 Bảng 3.1. Kết quả đo quang phổ ADN hệ gen ........................................................... 46 Bảng 3.2. Chỉ số đa dạng di truyền vùng D-loop gà Liên Minh (1050 bp) và một số giống gà bản địa ............................................................................ 49 Bảng 3.3. Kết quả phân bố của gà Liên Minh trong các haplotype (1050 bp) ........... 61 Bảng 3.4. Kết quả phân bố của gà Liên Minh trong các haplotype (455 bp) ............. 62 Bảng 3.5. Theo dõi các chỉ tiêu sinh sản của 90 cá thể gà Liên Minh ....................... 68 Bảng 3.6. Các chỉ tiêu chất lượng trứng (n=90) ......................................................... 71 Bảng 3.7. Phân tích tần số alen/kiểu gen tại ba đa hình gen PRL .............................. 76 Bảng 3.8. Tần số alen/ kiểu gen PRL/2402 của gà Liên Minh và một số giống gà bản địa ................................................................................................... 78 Bảng 3.9. Mối liên quan giữa kiểu gen PRL24 và tính trạng năng suất trứng ở giống gà Liên Minh .................................................................................... 79 Bảng 3.10. Mối liên quan giữa kiểu gen PRL2402 và tính trạng năng suất trứng ở giống gà Liên Minh .................................................................................... 80 Bảng 3.11. Mối liên quan giữa kiểu gen PRL2161 và tính trạng năng suất trứng ở giống gà Liên Minh .................................................................................... 81 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của đa hình PRL24 và PRL/2402 đến các tính trạng năng suất trứng ở gà Liên Minh .......................................................................... 82 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của hai đa hình PRL24 và PRL/2161 đến các chỉ tiêu liên quan tính trạng năng suất trứng ở gà Liên Minh ........................................ 83 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của hai đa hình PRL/2402 và PRL/2161 đến các chỉ tiêu liên quan tính trạng năng suất trứng ở gà Liên Minh ................................. 83 Bảng 3.15. Tần số alen/kiểu gen hai đa hình gen VIP .................................................. 87 Bảng 3.16. Mối liên quan giữa kiểu gen VIP/513892 và tính trạng năng suất trứng ở giống gà Liên Minh ....................................................................... 88 iv
Bảng 3.17. Mối liên quan giữa kiểu gen VIP/338 và tính trạng năng suất trứng ở giống gà Liên Minh .................................................................................... 89 Bảng 3.18. Tần số alen/kiểu gen hai đa hình gen VIPR1 ............................................. 92 Bảng 3.19. Mối liên quan giữa kiểu gen VIPR1/1715301 và tính trạng năng suất trứng ở giống gà Liên Minh ....................................................................... 93 Bảng 3.20. Mối liên quan giữa kiểu gen VIPR1/1704887 và tính trạng năng suất trứng ở giống gà Liên Minh ....................................................................... 93 Bảng 3.21. Ảnh hưởng của đa hình VIPR1/1715301và VIPR1/1704887 đến các tính trạng năng suất trứng ở gà Liên Minh. ............................................... 94 Bảng 3.22. Kết quả phân tích tần số alen/kiểu gen tại hai vị trí đa hình gen NPY ...... 97 Bảng 3.23. So sánh tần số alen/kiểu gen trong phân tích đa hình gen NPY/3139135 ở một số giống gà trên thế giới ........................................... 98 Bảng 3.24. Mối liên quan giữa kiểu gen NPY/3139135 và tính trạng năng suất trứng ở giống gà Liên Minh ....................................................................... 99 Bảng 3.25. Mối liên quan giữa kiểu gen NPY/31394761 và tính trạng năng suất trứng ở giống gà Liên Minh ..................................................................... 100 Bảng 3.26. Ảnh hưởng của đa hình NPY/3139135 và NPY/31394761 đến các tính trạng năng suất trứng ở gà Liên Minh. ............................................. 101 Bảng 3.27. Tần số phân bố alen/kiểu gen của đa hình gen mã hóa GH, GHR gà Liên Minh ................................................................................................. 104 Bảng 3.28. Mối liên quan giữa kiểu gen GHRi5 và tính trạng sản xuất trứng ở giống gà Liên Minh .................................................................................. 105 v
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc gen ty thể gà ......................................................................... 7 Hình 1.2. Cây phả hệ di truyền gà bản địa (dựa trên trình tự nucleotide vùng D-loop kích thước 455 bp) ......................................................................... 10 Hình 1.3. Cây phả hệ di truyền gà bản địa (dựa trên trình tự nucleotide vùng D- loop kích thước 1231 bp) ........................................................................... 11 Hình 1.4. Cây phân loại di truyền gà bản địa thế giới (dựa trên trình tự nucleotide toàn bộ mtDNA) ....................................................................... 12 Hình 1.5. Phân bố haplotypes các giống gà bản địa Việt Nam (dựa trên trình tự nucleotide vùng D-loop kích thước 455bp) ............................................... 17 Hình 1.6. Bản đồ QTL: các vùng gen trên NST liên quan đến tính trạng năng suất trứng ở gà ............................................................................................ 22 Hình 1.7. Bản đồ QTL: Các vùng gen trên NST liên quan đến tính trạng khối lượng trứng ở gà ......................................................................................... 23 Hình 1.8. Bản đồ QTL trên NST gà, NST giới tính ♂ (ZZ), ♀ (WZ) ....................... 24 Hình 1.9. Vị trí gen PRL trên nhiễm sắc thể số 2 ở gà .............................................. 28 Hình 1.10. Vị trí gen VIP trên nhiễm sắc thể số 3 ở gà ............................................... 30 Hình 1.11. Vị trí gen VIPR1 trên nhiễm sắc thể số 2 ở gà ........................................... 31 Hình 1.12. Vị trí gen NPY trên nhiễm sắc thể số 2 ở gà .............................................. 32 Hình 1.13. Vị trí gen GHR trên nhiễm sắc thể số Z ở gà ............................................. 34 Hình 1.14. Gà trống, gà mái Liên Minh trưởng thành (24 tuần tuổi) .......................... 36 Hình 3.1. Hình đại diện kết quả điện di ADN hệ gen trên gel agarose 1% ............... 46 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% .................................. 47 Hình 3.3. Kết quả so sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide gà Liên Minh với các giống gà trên GenBank .................................................................. 48 Hình 3.4. So sánh tương đồng trình tự nucleotide vùng D-loop (455 bp) giữa gà Liên Minh và các giống gà bản địa Việt Nam ........................................... 54 Hình 3.5. So sánh sự tương đồng trình tự nucleotide đoạn D-loop (1050 bp) giữa gà Liên Minh và một số gà nhà trên GenBank ................................. 56 Hình 3.6. Kết quả phân tích hệ số tương đồng nucleotide vùng D-loop (455 bp) của gà Liên Minh và các phân nhóm giống gà bản địa Việt Nam ............ 58 Hình 3.7. Kết quả phân tích hệ số tương đồng nucleotide vùng D-loop (1050 bp) của gà Liên Minh và các gà nhà trên thế giới ..................................... 60 vi
Hình 3.8. Kết quả so sánh đa hình nucleotide (1050 bp) vùng D-loop giữa các haplotype gà Liên Minh ............................................................................ 62 Hình 3.9. Kết quả so sánh đa hình nucleotide (455bp) vùng D-loop giữa các haplotype gà Liên Minh ............................................................................. 63 Hình 3.10. Cây phân loại di truyền gà Liên Minh và các giống gà bản địa Việt Nam ............................................................................................................ 65 Hình 3.11. Cây phân loại di truyền của gà Liên Minh, gà Đông Tảo, gà Nhiều Ngón và các gà nhà trên thế giới ................................................................ 67 Hình 3.12. Hình đại diện sản phẩm điện di ADN hệ gen gà Liên Minh ...................... 72 Hình 3.13. Hình đại diện kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP các đa hình gen PRL trên gel agarose (điện di sản phẩm PCR trên gel 1%, sản phẩm cắt trên gel 2%, 2,5%) ................................................................................ 73 Hình 3.14. Kết quả giải trình tự gen tại vị trí đa hình PRL24 ...................................... 75 Hình 3.15. Kết quả giải trình tự gen tại vị trí đa hình PRL/2402 ................................. 75 Hình 3.16. Kết quả giải trình tự gen tại vị trí đa hình PRL/2161 ................................. 76 Hình 3.17. Hình đại diện kết quả PCR-RFLP các đa hình gen VIP............................. 85 Hình 3.18. Kết quả giải trình tự gen tại vị trí đa hình VIP/5138982............................ 86 Hình 3.19. Kết quả giải trình tự gen tại vị trí đa hình VIP/338.................................... 86 Hình 3.20. Hình đại diện kết quả PCR-RFLP đa hình gen VIPR1 .............................. 90 Hình 3.21. Kết quả giải trình tự gen tại vị trí đa hình VIPR1/1715301 ....................... 90 Hình 3.22. Kết quả giải trình tự gen tại vị trí đa hình VIPR1/1704887 ....................... 91 Hình 3.23. Hình đại diện kết quả PCR-RFLP đa hình gen NPY .................................. 96 Hình 3.24. Kết quả giải trình tự gen tại vị trí đa hình NPY/3139135 .......................... 96 Hình 3.25. Kết quả giải trình tự gen tại vị trí đa hình NPY/31394761 ........................ 97 Hình 3.26. Kết quả PCR-RFLP gen GH, GHR .......................................................... 102 Hình 3.27. Kết quả giải trình tự gen tại vị trí đa hình GH ......................................... 103 Hình 3.28. Kết quả giải trình tự gen tại vị trí đa hình GHRi5.................................... 103 Hình 3.29. Kết quả giải trình tự gen tại vị trí đa hình GHRi2.................................... 104 vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết Giải thích thuật ngữ tiếng Anh Giải thích thuật ngữ tiếng Việt tắt A Adenine Nucleotide Nuclêôtit Adenine ADN Deoxyribonucleic acid Axit đêôxiribônuclêic ADP Adenosine diphosphate - ARN Ribonucleic Acid Axit ribônuclêic ATP Adenosine triphosphate - Bp Base pair Cặp bazơ C Cytosine Nucleotide Nuclêôtit Cytosin Cs - Cộng sự CJF Gallus lafayetti Gà rừng Sri Lanka D-loop Displacement loop Vùng điều khiển ADN ty thể Deoxynuclêôtit (dGTP, dATP, dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate dTTP và dCTP) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid - G Guanine Nucleotide Nuclêôtit Guanin Gallus Gray Junglefowl GJF Gà rừng màu xám GH Growth Hormone gene Gen mã hóa hooc môn sinh trưởng Gen mã hóa thụ thể hooc môn sinh GHR Growth Hormone Receptor gene trưởng GLM - Gà Liên Minh GNN - Gà Nhiều Ngón GrJF Gallus Green Junglefowl Gà rừng màu xanh F Forward Mồi xuôi Kb Kilo base pair 1000 cặp bazơ kDa Kilodalton - mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể viii
NADH Nicotinamide adenine dinucleotide - NPY Neuropeptide Y - NST - Nhiễm sắc thể OD Optical density Mật độ quang PBS Phosphate – buffer saline Đệm phốt phát PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PRL Prolactin Prolactin QTL Quantitative Trait Loci Cụm gen tính trạng số lượng R Reverse Mồi ngược RE Restriction Enzyme Enzym cắt giới hạn Restristion Fragment Length Đa hình chiều dài đoạn phân cắt RFLP Polymorphisms giới hạn RJF Gallus Red Junglefowl Gà Rừng Đỏ SDS Sodium Dodecyl Sulfate - SNPs Single-nucleotide polymorphism Đa hình nuclêôtit đơn T Thymine Nucleotide Nuclêôtit Thymin TBE Tris – boric acid – EDTA - TE Tris – Ethylen Diamin Tetra Acetic - Tm Melting Temperature Nhiệt độ nóng chảy Indel Insertions or Deletions Đoạn thêm/bớt mARN Messenger RNA ARN thông tin tARN Transfer RNA ARN vận chuyển rARN Ribosome RNA ARN ribôxôm National Center for Biotechnology Trung tâm thông tin Công nghệ NCBI Information Sinh học quốc gia SD Standard deviation Độ lệch chuẩn P Probability value Giá trị xác suất ix
MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Gà Liên Minh là giống gà bản địa của huyện đảo Cát Hải, thành phố Hải Phòng, Việt Nam. Gà Liên Minh thích hợp với nuôi chăn thả, chịu đựng tốt điều kiện thức ăn nghèo dinh dưỡng, khả năng đề kháng rất cao. Nhu cầu của thị trường về con giống và sản phẩm thịt gà Liên Minh rất lớn. Tuy nhiên, khả năng sinh sản của gà Liên Minh khá thấp, nghiên cứu trên 30 hộ tại xã Trân Châu, huyện Cát Hải, thành phố Hải Phòng đã chỉ ra rằng gà Liên Minh nuôi tại hộ theo phương thức chăn thả đẻ trứng ở 197,5 ngày tuổi tương ứng với khối lượng cơ thể 2,25 kg/con, năng suất trứng 75,6 quả/mái/năm, khối lượng trứng trung bình 49,8 g (Doan BH et al, 2016). Trong lúc đó sản lượng trứng ở gà Ri hoa mơ tại 38 tuần tuổi đạt 58,99 quả/mái (Ngô Thị Kim Cúc và cs, 2014). Vì vậy, vấn đề cải thiện năng suất trứng ở gà Liên Minh là cấp thiết nhằm bảo tồn, khai thác và phát triển giống gà Liên Minh. Sản lượng trứng ở gà là kết quả tác động từ các yếu tố: Di truyền, dinh dưỡng, ánh sáng, chế độ chăm sóc thú y. Hiện nay, các đa hình gen đang được nghiên cứu nhằm cải thiện các đặc điểm kinh tế ở gà bản địa. Các đa hình gen PRL (Prolactin), VIP (Vasoactive Intestinal Peptide), VIPR1 (Vasoactive Intestinal Peptide Receptor 1), NPY (Neuropeptide Y), GH (Growth hormone) và GHR (Growth hormone receptor), đã được xác định liên quan đến khả năng sinh sản ở một số giống gà bản địa trên thế giới. Một số đa hình gen có thể ứng dụng như những chỉ thị ADN, nhằm cải thiện năng suất trứng ở gà bản địa. Mặt khác, chưa có một nghiên cứu nào đánh giá về đa dạng nguồn gen dựa trên trình tự nucleotide vùng D-loop gen ty thể ở gà Liên Minh. Kết quả của nghiên cứu này có thể sử dụng nhằm cung cấp thông tin về đa dạng di truyền, hỗ trợ cho việc đăng ký bản quyền giống gà Liên Minh, đồng thời góp phần xây dựng bức tranh toàn cảnh về mức độ đa dạng di truyền của các giống gà bản địa. Vì vậy, Đánh giá nguồn gen và phân tích chỉ thị phân tử liên quan tính trạng năng suất trứng ở giống gà Liên Minh nhằm cung cấp thông tin di truyền vùng D-loop gen ty thể và các gen ứng viên có thể cải thiện khả năng sản xuất trứng, hỗ trợ công tác bảo tồn khai thác và phát triển giống gà Liên Minh. 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Đánh giá được sự đa dạng di truyền gà Liên Minh sử dụng trình tự nucleotide D-loop ADN ty thể và xác định mối quan hệ di truyền, xuất xứ của gà Liên Minh. - Xác định được mối liên quan di truyền giữa các gen ứng viên (PRL, VIP, VIPR1, NPY, GH, GHR) với tính trạng năng suất trứng ở gà Liên Minh. 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 3.1. Ý nghĩa khoa học Cung cấp thông tin đầu tiên về trình tự nucleotide vùng D-loop gen ty thể ở giống gà Liên Minh. Tài liệu khoa học đầu tiên nghiên cứu tần số xuất hiện alen/kiểu gen tại các đa hình gen PRL, VIP, VIPR1, NPY, GH, GHR trên đối tượng gà Liên Minh; bước đầu đánh giá mối liên quan giữa đa hình gen PRL, VIP, VIPR1, NPY, GH, GHR với tuổi đẻ quả trứng đầu, sản lượng trứng, khối lượng trứng trung bình và chỉ số hình dạng trứng ở gà Liên Minh từ 25 đến 44 tuần tuổi. Kết quả nghiên cứu về tính đa hình gen ứng viên với tính trạng sản lượng trứng là cơ sở khoa học trong nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử hỗ trợ chọn lọc gà Liên Minh có năng suất trứng cao, đồng thời cung cấp thông tin về gà Liên Minh cho các nhà chọn giống, tài liệu tham khảo cho các nhà nghiên cứu, sinh viên và những người quan tâm về gà bản địa. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Cung cấp cơ sở khoa học góp phần xây dựng thương hiệu gà Liên Minh. Cung cấp thông tin có căn cứ khoa học để quảng bá và phát triển thị trường tiêu thụ sản phẩm đặc sản gà Liên Minh. Cung cấp thông tin để Trung tâm ứng dụng tiến bộ Khoa học và Công nghệ Hải phòng, các công ty, cơ sở chăn nuôi hỗ trợ chọn lọc các đàn gà Liên Minh hạt nhân cải thiện sản lượng trứng. 4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Đánh giá được nguồn gen gà Liên Minh: Phân tích được trình tự nucleotide vùng D-loop gen ty thể gà Liên Minh để đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen. - Xác định được tần số alen/kiểu gen gà Liên Minh: Đã xác định được tần số alen/kiểu gen PRL, VIP, VIPR1, NPY, GH, GHR của gà Liên Minh. - Đánh giá được mối liên quan giữa đa hình gen và tính trạng năng suất 2
trứng: Nghiên cứu đầu tiên trên giống gà Liên Minh về mối liên quan giữa đa hình gen PRL, VIP, VIPR1, NPY, GH, GHR với khả năng sản xuất trứng. 5. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 5.1. Đối tượng nghiên cứu Gà bản địa Liên Minh thuộc Thôn Liên Minh - Xã Trân Châu - Huyện Cát Hải - Thành phố Hải Phòng. 5.2. Phạm vi nghiên cứu Đề tài ứng dụng công nghệ sinh học và các công cụ tin sinh học để phân tích đa dạng di truyền gà Liên Minh, phục vụ công tác bảo tồn, khai thác và phát triển giống gà Liên Minh. Đề tài tập trung nghiên cứu các gen ứng viên liên quan đến khả năng sản xuất trứng, từ đó có thể xác định được các gen mục tiêu, phục vụ công tác chọn lọc giống gà Liên Minh có năng suất trứng cao. 3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN GÀ 1.1.1. Sơ lược về vị trí phân loại của gà nhà Hiện nay, gà là một trong những vật nuôi phổ biến và được nuôi ở nhiều vùng trên toàn thế giới. Nguồn gốc của gà nuôi thương phẩm chưa được thống nhất và vẫn đang được tranh cãi, tuy nhiên thuyết đơn nguyên hiện vẫn đang được công nhận rộng rãi. Thuyết đơn nguyên được khởi xướng dựa trên các nghiên cứu của Darwin (1868), cho rằng gà nhà có nguồn gốc từ Gallus. Trong hệ thống phân loại, chi Gallus gồm 4 loài gà rừng khác nhau: Gà rừng đỏ G. gallus (Red junglefowl - RJF) thường gặp ở Đông Dương, Ấn Độ, Myanmar, Malaysia; G. lafayetti (Lafayette's JF) ở vùng Sri Lanka, loài này còn có tên gọi là gà rừng Ceylon (Cyelon junglefowl - CJF); G. varius (Green junglefowl - GrJF) là gà rừng màu xanh phổ biến ở vùng Java nên còn gọi là gà rừng Java; G. sonneratii (Grey junglefowl - GJF) còn được gọi là gà rừng màu xám, thường gặp ở vùng rừng núi Ấn Độ. Gà rừng lông đỏ (G. Gallus) là loài phổ biến nhất trong bốn loài trên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng gà được nuôi thương mại chủ yếu có nguồn gốc từ gà rừng đỏ (Crawford, 1990; Sullivan, 1991; Siegel et al, 1992; Fumihito et al, 1994; Romanov và Weigend, 2001; Hillel et al, 2003; Vaisanen et al, 2005). Cho đến nay, loài này gồm 5 phân loài: G. g. gallus (Southeast Asian Red junglefowl - SE Asian RJF), G. g. spadiceus, G. g. bankiva, G. g. murghi (Indian RJF) và G. g. jabuoillei. Việt Nam có ba phân loài gà rừng đỏ với số lượng còn tương đối nhiều: G. gallus gallus (phân bố từ tỉnh Hà Tĩnh vào đến Nam Bộ), G. gallus jabouilei (phân bố ở vùng Đông Bắc Việt Nam ), G. gallus spadiceus (phân bố ở vùng Tây Bắc Việt Nam). 1.1.2. Đại cương về phân loại học 1.1.2.1. Phân loại học truyền thống Phân loại học truyền thống là sự phân biệt giữa các loài hoặc trong cùng loài về các đặc điểm hình thái, tập tính và sinh sản. 4
Phân loại truyền thống chủ yếu dựa vào đặc điểm ngoại hình và vị trí địa lý. Ở gà, phân loại học truyền thống thường dựa theo những đặc điểm sinh dục thứ cấp như màu sắc lông, da, kiểu mào, chân. Những đặc điểm này được thể hiện dựa trên sự biểu hiện của nhiều gen vì vậy dễ bị tác động bởi môi trường sống, vị trí địa lý, nguồn dinh dưỡng, phương thức chăn nuôi và có thể biến đổi nhanh chóng qua các thế hệ. Do đó, nếu phân loại gà chỉ căn cứ vào những đặc điểm ngoại hình và vị trí địa lý để xác định mối liên hệ di truyền trong tiến hóa giữa các loài có thể thiếu chính xác. Chính vì vậy, để hỗ trợ có hiệu quả cho các phương pháp phân loại học truyền thống, hiện nay các nhà khoa học đã phối hợp thêm phương pháp phân loại học phân tử. 1.1.2.2. Phân loại học phân tử Phân loại học phân tử (Molecular systematics) là sự phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài hoặc trong cùng loài. a. Cơ sở khoa học của phân loại học phân tử Theo lý thuyết, mỗi sinh vật sống đều có thể mang các phân tử ADN, ARN và protein, các sinh vật có họ hàng gần gũi sẽ có mức độ tương đồng nucleotide cao, ngược lại những sinh vật có họ hàng càng xa nhau sẽ có mức độ tương đồng nucleotide càng thấp hơn. Các nhà nghiên cứu có thể sử dụng trình tự nucleotide bất kì để đánh giá và phân loại, ví dụ như: Trình tự nucleotide một gen, trình tự nucleotide vùng điều khiển, trình tự nucleotide vùng mã hóa (exon) hay các trình tự nucleotide không mã hóa (intron). Tuy nhiên, tùy vào mực đích nghiên cứu để lựa chọn trình tự nucleotide phù hợp nhằm phát hiện được sự đa hình giữa các đơn vị phân loại (taxon). Trình tự nucleotide sử dụng để phân tích mối quan hệ tiến hóa phải có tính đặc trưng cho loài, có tốc độ biến đổi đủ nhanh để phân biệt giữa các cá thể phân tích. Hiện nay, những nghiên cứu so sánh các trình tự nucleotide mã hóa ribosome, cytochrome c, gen ty thể, gen mã hóa ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase (RuBisCO) đang được sử dụng trong nhận diện và phân loại các cá thể trong cùng một loài hay giữa các loài. Tùy vào mục đích nghiên cứu cụ thể để sử dụng các công cụ phân tử khác nhau (các gen trong hệ gen nhân hay trong hệ gen của các bào quan (ty thể và lục lạp) hoặc các sản phẩm gen (protein, enzyme). Hiện nay, các phân tử có tích lũy đột biến theo thời gian như ADN ty thể, ADN lục lạp đang được sử dụng nhiều nhất cho phân loại. 5
b. Các phương pháp thường dùng trong phân loại học phân tử - Chỉ thị protein – enzyme: Phân tích isozyme Isozyme là những dạng khác nhau của một enzyme, có cùng hoạt tính đặc hiệu cơ chất nhưng khác biệt về cấu trúc bậc I của phân tử enzyme và do các locus gen khác nhau quy định. Sự khác biệt này được thể hiện khi điện di trên gel agarose, tinh bột hay polyacrylamide. - Chỉ thị ADN Các chỉ thị ADN dựa trên cơ sở đa hình trình tự nucleotide, chủ yếu sử dụng kỹ thuật khuếch đại đoạn gen (PCR). Có thể chia các chỉ thị ADN thành ba loại chính: Chỉ thị dựa trên các trình tự nucleotide ngẫu nhiên: Đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD – Random Amplified Polymorphic ADNs) do Williams và cộng sự (1992) phát minh. Chỉ thị dựa trên các trình tự nucleotide đơn lặp lại nhiều lần: Các trình tự lặp lại đơn giản (SSR – Simple Sequence Repeats) (Litt và Luty, 1989). Chỉ thị dựa trên các trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn, gồm có: Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP- Restriction Fragment Length Polymorphism) (Botstein et al, 1980) sử dụng để lập bản đồ các gen có liên quan đến bệnh ở người. Đa hình độ dài các đoạn được khuếch đại (AFLP – Amplified Fragment Length Polymorphism) đã được Vos và cộng sự (1995) nghiên cứu. Một số nghiên cứu đã đánh giá đa dạng di truyền các giống gà sử dụng chỉ thị ADN ty thể (Fumihito et al, 1996; Harpending et al, 1998; Marle-Koster và Casey, 2001; Kanginakudru et al, 2008; Mwacharo et al, 2011; Miao et al, 2013; Englund et al, 2014; Kawabe et al, 2014; Maria et al, 2017; Zhang et al, 2017; Piyanat et al, 2018) và chỉ thị microsatellite (Hillel et al, 2003; Muchadeyi et al, 2007; Chen et al, 2008; Bodzsar et al, 2009; và Cuc et al, 2011). 1.1.3. Cấu trúc hệ gen ty thể gà Trong tế bào động vật, ADN ty thể (mtADN) chiếm từ 1 – 5% ADN của tế bào. ADN ty thể là sợi xoắn kép có cấu trúc vòng, gồm một chuỗi nặng (chuỗi H – Heavy strand) giàu Guanine và một chuỗi nhẹ (chuỗi L – light strand) giàu Cytosine, có chiều dài chừng 5 µm. ADN ty thể có các đặc điểm: Không liên kết với protein histone, tự tái bản theo kiểu bán bảo thủ nhờ hệ ADN polymerase có trong chất nền ty thể và xảy ra ở kỳ trung gian của chu kỳ tế 6
bào. ADN ty thể có thể xảy ra chèn đoạn, mất đoạn và lặp đoạn nucleotide, vì vậy ở các loài động vật khác nhau có kích thước phân tử khác nhau chứa khoảng 16 – 17 kb. Trình tự hệ gen ty thể gà lần đầu tiên được công bố bởi Desjardins và Morais (1990) trên đối tượng gà Leghorn trắng. Hệ gen ty thể gà bao gồm: Vùng mã hóa và vùng điều khiển (D-loop), trong đó vùng điều khiển chiếm khoảng 7% mtADN. Vùng điều khiển chứa điểm khởi đầu sao chép, vùng sao chép phiên mã của chuỗi nặng (OH, PH) và các vùng điều khiển phiên mã của chuỗi nhẹ (PL). Vùng mã hóa của mtADN mã hóa cho 13 polypeptide, 2 ARN thông tin và 22 ARN vận chuyển, trong đó, chuỗi nặng chứa phần lớn các gen, cụ thể là: 12 gen mã hóa polypeptide, 14 gen mã hóa tARN và 2 gen mã hóa rARN (12S và 16S). Sơ đồ chi tiết của hệ gen ty thể gà được trình bày ở hình 1.1. Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc gen ty thể gà ND (NADH dehydrogenase); cytochrome b (Cyt b); D-loop; L (light strand- chuỗi nhẹ); H (Heavy strand- chuỗi nặng); CO (cytochrome oxidase); 16S (loại ADN 16S); và 12S (loại ADN 12S) (Nguồn: https://www.researchgate.net/publication/12918504_Primers_for_a_PCR Based_Approach_to_Mitochondrial_Genome_Sequencing_in_Birds_and_Other_Vertebrates) 7
ADN ty thể gà có trật tự các gen khác với động vật có xương sống khác như: Thứ tự các gen trên chuỗi nhẹ được xếp theo chiều 5’ – 3’ ở gà là: NADH dehydrogenase 5 (ND5), cytochrome b (Cyt b), tARNThr, tARNPro, ND6, tARNGlu và vùng điều khiển, trong khi đó, ở các động vật khác, gen Cyt b nằm gần vùng điều khiển hơn. Ở các động vật có xương sống đã được giải trình tự hệ gen ty thể cho thấy rằng, mỗi điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tương đương với trình tự nằm giữa hai gen tARNCys và tARNAsn, nhưng ở gà không có đặc điểm này. Gen cytochrome oxidase I (COI) ở các động vật khác có mã mở đầu là GTG còn ở gà là ATG (Desjardins và Morais, 1990). 1.1.3.1. Đặc điểm hệ gen ty thể gà ADN ty thể có các đặc điểm: Tồn tại ở dạng đơn bội và hầu như không có hiện tượng tái tổ hợp, không có intron, ADN dạng vòng, có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 5-10 lần so với các gen nhân. Mỗi tế bào chứa rất nhiều ty thể và mỗi ty thể có từ 2 đến 10 bản sao của ADN, vì vậy số lượng ADN ty thể là rất lớn. Đặc biệt, ADN ty thể được di truyền theo dòng mẹ thông qua tế bào chất của noãn bào (Berlin và Ellegren, 2001). Vì trong quá trình thụ tinh, phần đầu của một tinh trùng đầu tiên chui qua màng của trứng và màng trứng lập tức khép lại cắt đứt phần đuôi ở ngoài, phần đuôi của tinh trùng chứa nhiều ty thể. Chính vì vậy, tinh trùng chủ yếu đóng góp hệ gen nhân và gần như không cung cấp tế bào chất, mtADN để tạo nên hợp tử. 1.1.3.2. Đa hình trình tự nucleotide vùng D-loop và khả năng ứng dụng trong phân loại, đánh giá đa dạng di truyền gà Các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại và cơ sở dữ liệu trên GenBank có thể giúp các nhà khoa học cải thiện tính chính xác và hiệu quả trong việc phân tích quan hệ tiến hoá và phát sinh chủng loại ở các loài. ADN ty thể và đặc biệt là trình tự nucleotide vùng D-loop đã được chọn làm đối tượng nghiên cứu. Ở gà nhà, vùng này có kích thước phân tử khoảng 1300 bp, nó chứa điểm khởi đầu sao chép và các promoter cho quá trình phiên mã của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (Fumihito et al, 1994). D-loop được cấu tạo bởi ba vùng chính là: Vùng I, II và III (Buehler và Backer, 2003). Trong đó vùng II bảo thủ nhất, có kích thước phân tử khoảng 500 bp, chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không thay đổi ngay cả ở bậc phân loại họ (Rnoknen et al, 2002). Ngược lại, vùng I, III là vùng 8