Tác động của chiết xuất từ hạt nhân trên khả năng sống, di chuyển và tăng trưởng của tế bào dây chằng nha chu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> TÁC ĐỘNG CỦA CHIẾT XUẤT TỪ HẠT NHÃN TRÊN KHẢ NĂNG SỐNG,<br /> DI CHUYỂN VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO DÂY CHẰNG NHA CHU<br /> Nguyễn Thu Thuỷ*, Aree Wanasuntronwong**, Rudee Surarit**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Các loại thuốc cổ truyền có nguồn gốc từ cây cỏ đã trở thành một hướng quan trọng trong điều trị<br /> bệnh vùng miệng bao gồm viêm nướu và viêm nha chu. Chiết xuất từ hạt nhãn (CXHN) đã được nghiên cứu về<br /> khả năng ứng dụng trong điều trị nhiều bệnh lí, tuy nhiên chưa có trong lĩnh vực này.<br /> Mục tiêu: Nghiên cứu tác động của CXHN trên khả năng sống, di chuyển và tăng trưởng của tế bào dây<br /> chằng nha chu (TBDCNC) bằng các kĩ thuật cơ bản.<br /> Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Thử nghiệm MTT được dùng để đánh giá khả năng sống và tăng<br /> trưởng của TBDCNC trong nuôi cấy; khả năng di chuyển được đánh giá bằng chương trình Image Pro Plus<br /> Program và đếm tế bào trong vùng đánh dấu.<br /> Kết quả: Nồng độ ức chế 50% (IC50) của CXHN trên TBDCNC là 1,47 mg/ml sau 24 giờ và 0,15 mg/ml<br /> sau 48 giờ. CXHN nồng độ 1 mg/ml ức chế sự di chuyển của tế bào nhưng tác động này giảm khi liều lượng<br /> giảm. Cả hai nông độ đều có vẻ ức chế sự tăng trưởng của TBDCNC.<br /> Kết luận: CXHN ảnh hưởng trên khả năng sống, di chuyển và tăng trưởng của TBDCNC, tác động giảm<br /> khi nồng độ giảm. Với khả năng kháng viêm, đây là một chất tiềm năng trong điều trị bệnh nha chu, tuy nhiên<br /> cần các nghiên cứu khác với các nồng độ khác nhau để đi đến kết luận.<br /> Từ khoá: chiết xuất từ hạt nhãn, tế bào dây chằng nha chu, khả năng sống, di chuyển, tăng trưởng.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> EFFECTS OF LONGAN SEED EXTRACT ON SURVIVAL, MIGRATION AND PROLIFERATION OF<br /> PERIODONTAL LIGAMENT CELLS<br /> Nguyen Thu Thuy, Aree Wanasuntronwong, Rudee Surarit<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 19 - Supplement of No 2 - 2015: 1 - 5<br /> Background: Traditional herbal medicine has become an important orientation in treatment of oral diseases<br /> including gingivitis and periodontitis. The Longan seed extract (LSE) has been studied for their potential<br /> application in numerous diseases, but not yet in this field.<br /> Objectives: The aim of this study was to investigate the effects of LSE on the viability, the migration and the<br /> proliferation of periodontal ligament cells (PDLCs) by using basic techniques.<br /> Materials and methods: The MTT assay was used to assess the cytotoxicity and the proliferation of PDLCs<br /> in culture; the cell migration was estimated by using Image Pro Plus Program and by counting the number of<br /> cells in the migration area.<br /> Results: The IC50 of LSE on PDLCs was approximately 1.47 mg/ml after 24 hours and 0.15 mg/ml after 48<br /> hours of incubation. The LSE at 1 mg/ml inhibited the migration of PDLCs but the effect was reduced with lower<br /> dose. The LSE both at 1 mg/ml and 0.05 mg/ml seemed to be inhibitive on the proliferation of PDLCs.<br /> Conclusion: The LSE has effect on the survival, migration and proliferation of PDLCs. In considering its<br /> * Bộ môn Nha chu, Khoa Răng Hàm Mặt- Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> **<br /> <br /> Bộ môn Sinh học miệng, Khoa Nha, Đại học Mahidol, Thái Lan<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Thu Thuỷ<br /> ĐT: 01208505265 Email: ngthuthuy20@yahoo.com<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> 1<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015<br /> <br /> anti-inflammatory effect and paying attention to the concentration in use, other studies are in need to explore the<br /> application potential of this extract in treatment of periodontal diseases based on inexpensive natural products.<br /> Key words: Longan seed extract, periodontal ligament cells, survival, migration, proliferation.<br /> kháng sinh. Cấy chuyển khi mật độ tế bào dày<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> đặc, các tế bào kết dính với nhau.<br /> Tại Việt Nam, nghiên cứu cho thấy tình<br /> Chuẩn bị dung dịch CXHN<br /> trạng vệ sinh răng miệng ở nhóm tuổi 35 – 44<br /> CXHN do Phòng thí nghiệm Đại học<br /> kém với nhiều vôi răng, mảng bám; hầu hết các<br /> Chulalongkorn, Thái Lan cung cấp, sau đó được<br /> đối tượng có ít nhất một vị trí có mất bám dính ≥<br /> pha loãng với Dimethyl sulfoxide (DMSO) để tạo<br /> 2 mm. Ở Thái Lan, tỉ lệ viêm nha chu nhẹ, trung<br /> (10)<br /> thành dung djch CXHN với nồng độ khác nhau.<br /> bình và nặng lần lượt là 30,5, 53,6 và 15,9 . Ở cả<br /> hai nước, các loại thuốc cổ truyền có nguồn gốc<br /> từ cây cỏ đã trở thành một hướng trong nỗ lực<br /> quốc gia nhằm tăng cường sức khoẻ cộng đồng ở<br /> vùng nông thôn, trong đó bao gồm sức khoẻ<br /> răng miệng nói chung và mô nha chu nói<br /> riêng(12,9).<br /> Chiết xuất từ hạt nhãn (CXHN) chứa<br /> polysaccharides có tác động kháng oxy hoá in<br /> vitro phụ thuộc vào nồng độ(3). Liều khẩn cấp và<br /> liều lập lại của CXHN dùng theo đường uống đã<br /> được kết luận là không gây độc, từ đó có thể sử<br /> dụng an toàn dưới kiểm soát trong các nghiên<br /> cứu độc tính dài hạn và/hoặc thử nghiệm lâm<br /> sàng(13). CXHN hiện đang được nghiên cứu về<br /> khả năng chống ung thư(5,6), kháng nấm(7), chống<br /> mệt mỏi(15), nhưng chưa từng được tìm hiểu về<br /> khả năng ứng dụng trong điều trị bệnh vùng<br /> miệng. Mặt khác, các tác động của CXHN in vitro<br /> trên tế bào nuôi cấy, đặc biệt là trên tế bào dây<br /> chằng nha chu (TBDCNC), cũng chưa được<br /> đánh giá đầy đủ. Do đó, mục tiêu của nghiên<br /> cứu này nhằm tìm hiểu tác động của CXHN trên<br /> khả năng sống, di chuyển và tăng trưởng của<br /> TBDCNC bằng các thử nghiệm cơ bản.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> Nuôi cấy tế bào<br /> TBDCNC của Đơn vị cung cấp tế bào nuôi<br /> cấy Hoa Kỳ (American Type Culture Collection,<br /> ATCC), được nuôi trong môi trường Dulbecco<br /> biến đổi (Dulbecco’s Modified Eagle Medum,<br /> DMEM) chứa 90% DMEM, 10% huyết thanh<br /> phôi thai bò (Fetal Bovine Sreum, FBS), 1%<br /> <br /> 2<br /> <br /> Tác động của CXHN trên khả năng sống<br /> của TBDCNC<br /> TBDCNC được gieo vào bảng mẫu siêu nhỏ<br /> (microtiter plates, 96 well plates) với mật độ<br /> 20.000 tế bào/well. Đếm tế bào bằng buồng đếm<br /> hematocytometer (Improve Neubauer®). Các<br /> bảng mẫu sau đó được ủ ấm trong máy ủ CO2<br /> (37o C, 5% CO2, độ ẩm 100%) trong 24 giờ để đạt<br /> mức bão hoà. Dung dịch CXHN với nồng độ 5<br /> mg/ml, 1 mg/ml, 0,1 mg/ml và 0,01 mg/ml được<br /> cho vào well (4 well cho mỗi nồng độ). Dung<br /> dịch đệm phosphate saline (Phosphate buffer<br /> saline, PBS) được đặt vào well trắng.<br /> Chlorhexidine 0,12% được dùng làm chứng<br /> dương và môi trường nuôi dưỡng dùng để làm<br /> chứng âm. Tiếp tục đặt bảng mẫu vào tủ ủ trong<br /> 24 giờ và 48 giờ. Khả năng sống của tế bào được<br /> xác định bằng thử nghiệm MTT. Đọc kết quả với<br /> quang phổ kế ở bước sóng 540 nm. Lập lại thử<br /> nghiệm 2 lần với kết quả không khác biệt có ý<br /> nghĩa thống kê. Kết quả chỉ được chấp nhận khi<br /> hệ số biến thiên dưới 15%.<br /> <br /> Tác động của CXHN trên khả năng di<br /> chuyển của TBDCNC<br /> TBDCNC được cấy vào bảng mẫu 24 well<br /> (24 well plates) với mật độ 50.000 tế bào/well,<br /> ủ trong tủ ủ CO2 trong 48 giờ để đạt mức bão<br /> hoà. Sau đó, dùng đầu pipette 1000 μl vạch<br /> một đường ngang qua trung tâm đáy well.<br /> Kiểm tra dưới kính hiển vi cho thấy không còn<br /> tế bào trong vùng vạch. Thêm 500 μl dung<br /> dịch CXHN với nồng độ 1 mg/ml và 0,05<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015<br /> mg/ml vào các well (4 well cho mỗi nồng độ).<br /> Theo dõi sự di chuyển tế bào sau 3, 6 và 24<br /> giờ. Sau 24 giờ, rửa tế bào với PBS 1X, cố định<br /> với methanol trong 2 phút, rửa lại 2 lần trước<br /> khi nhuộm với xanh toludine (toludine blue<br /> 0,25%). Chụp hình dưới kính hiển vi. Đo vùng<br /> tế bào di chuyển với chương trình Image Pro<br /> Plus Program, sau đó đếm tế bào trong vùng<br /> xác định bằng đường vạch đầu pipette.<br /> <br /> Tác động của CXHN trên sự tăng trưởng<br /> TBDCNC<br /> Cấy TBDCNC vào bảng mẫu 96 well với mật<br /> độ 2.000 tế bào/well. Sau khi ủ 24 giờ, cho dung<br /> dịch CXHN nồng độ 1 mg/ml và 0,05 mg/ml vào<br /> các well (4 well cho mỗi nồng độ). Chlorhexidine<br /> 0,12% dược dùng làm chứng âm và yếu tố tăng<br /> trưởng cho nguyên bào sợi của người (human<br /> fibroblast growth factor, hFGF basic/FGF2) 0,2<br /> μg/ml được dùng làm chứng dương. Ủ bảng<br /> mẫu trong tủ ủ và thực hiện thử nghiệm MTT<br /> sau 1, 3, 6, 7 ngày. Đọc kết quả với quang phổ kế<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> với bước sóng 540 nm. Lập lại thử nghiệm 2 lần<br /> với kết quả không khác biệt có ý nghĩa thống kê.<br /> Kết quả chỉ được chấp nhận khi hệ số biến thiên<br /> dưới 15%.<br /> <br /> Phân tích số liệu<br /> Xác địnhh kiểu phân phối số liệu bằng test<br /> Kolmogorov Smirnov. Sử dụng test one-way<br /> ANOVA và test one-way Kruskal-Wallis trong<br /> chương trình SigmaStat version 3.5 để phân tích<br /> thống kê. Giá trị p ≤ 0,05 được xem là có ý nghĩa<br /> thống kê.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Tác động của CXHN trên khả năng sống<br /> của TBDCNC<br /> Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory<br /> concentration 50%, IC50) là nồng độ của một mẫu<br /> có thể ức chế sự sống của 50% số lượng tế bào<br /> trong những điều kiện xác định. IC50 của dung<br /> dịch CXHN sau 24 giờ và 48 giờ lần lượt là 1,47<br /> mg/ml và 0,15 mg/ml.<br /> <br /> Tác động của CXHN trên khả năng di chuyển của TBDCNC<br /> Bảng 1. Diện tích vùng di chuyển của TBDCNC sau 24 giờ ủ với các dung dịch<br /> Dung dịch<br /> <br /> Nồng độ<br /> (mg/ml)<br /> <br /> Dung dịch dinh dưỡng (DMEM + 10% FBS + 1%<br /> kháng sinh) (Chứng âm)<br /> hFGF basic/FGF2 (Chứng dương)<br /> CXHN<br /> <br /> Diện tích vùng di chuyển<br /> 2<br /> Trung bình  sai số chuẩn (mm )<br /> <br /> P<br /> <br /> 0,25  0,05<br /> 0,0002<br /> 1,00<br /> 0,05<br /> <br /> 0,31  0,03<br /> 0,06  0,01<br /> 0,19  0,03<br /> <br /> *<br /> <br /> p