intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Tạp chí Khoa học – Công nghệ thủy sản: Số 2/2020

Chia sẻ: Caygaocaolon6 Caygaocaolon6 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:132

Thêm vào BST
Báo xấu
75
lượt xem 5
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tạp chí Khoa học – Công nghệ thủy sản: Số 2/2020 thông tin đến quý độc giả các bài viết ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian đến quá trình thủy phân sụn cá mập (Carcharhinus dussumieri); giáp xác, sán dây và giun tròn ký sinh ở cá diếc (Carassius auratus auratus (Linnaeus, 1758)) thu tại Phú Yên; kết quả nghiên cứu xây dựng giải pháp chuyển đổi nghề lưới kéo của huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh khai thác thuỷ sản tại vùng biển ven bờ sang nghề nuôi biển; nghiên cứu thực trạng nghề lưới kéo hoạt động khai thác thuỷ sản tại vùng biển ven bờ huyện Vân Đồn tỉnh Quảng Ninh...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tạp chí Khoa học – Công nghệ thủy sản: Số 2/2020

  1. ISSN 1859 - 2252 Số 2 - 2020 NHA TRANG UNIVERSITY TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
  2. TAÏP CHÍ KHOA HOÏC - COÂNG NGHEÄ THUÛY SAÛN ISSN 1859 - 2252 TỔNG BIÊN TẬP TS. TRẦN DOÃN HÙNG PHÓ TỔNG BIÊN TẬP TS. VŨ KẾ NGHIỆP BAN BIÊN TẬP PGS.TS. Nguyễn Thị Kim Anh PGS. TS. Lê Phước Lượng Trường Đại học Nha Trang Trường Đại học Nha Trang GS. TS. Augustine Arukwe PGS. TS. Nguyễn Đình Mão Norwegian University of Science and Technology, Trondheim, Trường Đại học Nha Trang Norway TS. Mai Thị Tuyết Nga PGS. TS. Vũ Ngọc Bội Trường Đại học Nha Trang Trường Đại học Nha Trang PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa TS. Phan Thị Dung Trường Đại học Nha Trang Trường Đại học Nha Trang PGS. TS. Nguyễn Văn Nhận TS. Nguyễn Hữu Dũng Trường Đại học Nha Trang Trường Đại học Nha Trang PGS. TS. Nguyễn Hữu Ninh PGS. TS. Nguyễn Tiến Dũng Viện Nghiên cứu NTTS I - Bộ NNPTNT Trường ĐH Kinh tế Luật- ĐHQG Tp HCM PGS. TS. Mai Thanh Phong PGS. TS. Nguyễn Văn Duy Trường ĐH Bách khoa - ĐHQG Tp. HCM Trường Đại học Nha Trang GS. TS. Nguyễn Thanh Phương PGS.TS. Nông Văn Hải Đại học Cần Thơ Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam PGS. TS. Trần Gia Thái PGS. TS. Lê Văn Hảo Trường Đại học Nha Trang Trường Đại học Nha Trang GS. TS. Trương Bá Thanh TS. Nguyễn Thị Hiển Đại học Đà Nẵng Trường Đại học Nha Trang PGS. TS. Phạm Hùng Thắng TS. Nguyễn Văn Hòa Trường Đại học Nha Trang Trường Đại học Nha Trang TS. Khổng Trung Thắng GS. TS. Hoàng Đình Hòa Trường Đại học Nha Trang Trường ĐH Bách khoa Hà Nội TS. Hoàng Văn Tính GS. TS. Nguyễn Trọng Hoài Trường Đại học Nha Trang Trường ĐH Kinh tế Tp. HCM GS. TS. Toshiaki Ohshima PGS. TS. Lê Minh Hoàng Tokyo University of Marine Science and Technology, Trường Đại học Nha Trang Japan TS. Hoàng Hoa Hồng PGS. TS. Trang Sĩ Trung Trường Đại học Nha Trang Trường Đại học Nha Trang PGS. TS. Lại Văn Hùng PGS. TS. Nguyễn Anh Tuấn Trường Đại học Nha Trang Trường Đại học Nha Trang GS. TS. Nguyễn Ngọc Lâm GS. TS. Nguyễn Kế Tuấn Viện Hải dương học - Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam Trường Đại học Kinh tế quốc dân Hà Nội GS. TS. Yew-Hu Chien PGS. TS. Đỗ Thị Thanh Vinh National Taiwan Ocean University, Taiwan Trường Đại học Nha Trang BAN THƯ KÝ ThS. Trần Nhật Tân - ThS. Lương Đình Duy • Toøa soaïn : Tröôøng Ñaïi hoïc Nha Trang, soá 02 Nguyeãn Ñình Chieåu, TP. Nha Trang - Khaùnh Hoøa • Ñieän thoaïi : 0258.2220767 • Fax : 0258.3831147 • E-mail : tapchidhnt@ntu.edu.vn • Giaáy pheùp xuaát baûn : 292/GP-BTTTT ngaøy 3/6/2016 • Cheá baûn taïi : Phoøng Khoa hoïc vaø Coâng ngheä - Tröôøng Ñaïi hoïc Nha Trang • In taïi : Coâng ty coå phaàn In vaø Thöông maïi Khaùnh Hoøa, soá 08 Leâ Thaùnh Toân - Nha Trang
  3. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 MUÏC LUÏC Ghi nhận mới và mối quan hệ tiến hóa của Epiphyte (Melanothamnus thailandicus) trên 2 rong sụn (Kappaphycus alvarezii) tại Khánh Hòa Đặng Thúy Bình, Khúc Thị An, Văn Hồng Cầm, Trần Văn Tuấn Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian đến quá trình thủy phân sụn cá mập 10 (Carcharhinus dussumieri) Đinh Hữu Đông, Vũ Ngọc Bội, Nguyễn Thị Mỹ Trang Nghiên cứu đặc điểm sinh học tinh sào cá khế vằn (Gnathanodon speciosus) 19 Hứa Thị Ngọc Dung, Đào Thị Đoan Trang, Phạm Quốc Hùng Giáp xác, sán dây và giun tròn ký sinh ở cá diếc (Carassius auratus auratus (Linnaeus, 26 1758)) thu tại Phú Yên Võ Thế Dũng, Võ Thị Dung, Nguyễn Nhất Duy Tiềm năng, thực trạng và giải pháp phát triển nuôi tôm trên cát ở tỉnh Hà Tĩnh 34 Trương Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Hữu Nghĩa, Nguyễn Thị Nguyện, Tống Trần Huy, Chu Chí Thiết, Lê Thị Mây và Phan Thị Vân Ảnh hưởng của nước thải từ ương tôm giống tới tỷ lệ sống, sinh trưởng và sinh sản của 40 Artemia Nguyễn Đình Huy, Trương Thị Bích Hồng, Lư Thị Ngọc Nhanh Kết quả nghiên cứu xây dựng giải pháp chuyển đổi nghề lưới kéo của huyện Vân Đồn, tỉnh 49 Quảng Ninh khai thác thuỷ sản tại vùng biển ven bờ sang nghề nuôi biển Phan Trọng Huyến, Đỗ Đình Minh, Hoàng Văn Tính Thành phần hoá học cơ bản và một số tính chất vật lý của cá ngừ đại dương đánh bắt tại 59 Việt Nam Mai Thị Tuyết Nga, Lê Thiên Sa, Lương Đức Vũ, Lê Văn Luân Nghiên cứu thực trạng nghề lưới kéo hoạt động khai thác thuỷ sản tại vùng biển ven bờ 68 huyện Vân Đồn tỉnh Quảng Ninh Đỗ Đình Minh, Hoàng Văn Tính, Phan Trọng Huyến Thành phần loài và các loại nghề khai thác cá ở đầm Đông Hồ, Hà Tiên tỉnh Kiên Giang 79 Lê Thị Thu Thảo, Nguyễn Phi Uy Vũ Ảnh hưởng của tần suất cho ăn đến cá bè đưng (G. Speciosus forsskål, 1775) ở giai đoạn 90 đầu nuôi thương phẩm Võ Thế Dũng, Võ Thị Dung Đa dạng thành phần loài cá ở hạ lưu sông Cái, Nha Trang 97 Trần Công Thịnh, Võ Văn Phú, Nguyễn Phi Uy Vũ, Bùi Đức Lỉnh Nghiên cứu thiết kế, chế tạo thiết bị đo áp suất phun nhiên liệu trên đường ống cao áp để 112 chẩn đoán trạng thái kỹ thuật của động cơ diesel máy chính tàu cá Hồ Đức Tuấn, Đoàn Phước Thọ VẤN ĐỀ TRAO ĐỔI Một vài khía cạnh quản lý môi trường đối với hoạt động nuôi trồng thủy sản 119 Nguyễn Văn Quỳnh Bôi, Lục Minh Diệp
  4. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 GHI NHẬN MỚI VÀ MỐI QUAN HỆ TIẾN HÓA CỦA EPIPHYTE (Melanothamnus thailandicus) TRÊN RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii) TẠI KHÁNH HÒA NEW RECORD AND THE MOLECULAR PHYLOGENY OF EPIPHYTE (Melanothamnus thailandicus) ON RED ALGAE (Kappaphycus alvarezii) IN KHANH HOA Đặng Thúy Bình¹, Khúc Thị An¹, Văn Hồng Cầm¹, Trần Văn Tuấn¹ ¹Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang Tác giả liên hệ: Đặng Thúy Bình (Email: binhdt@ntu.edu.vn) Ngày nhận bài: 25/03/2020; Ngày phản biện thông qua: 21/05/2020; Ngày duyệt đăng: 17/06/2020 TÓM TẮT Rong sụn (Kappaphycus alvarezii Doty) là loài rong có giá trị kinh tế cao, phân bố ở vùng biển Châu Á Thái Bình Dương, trong đó có Việt Nam. Trong những năm gần đây, nghề nuôi rong sụn phát triển ở các tỉnh Miền Trung góp phần xóa đói giảm nghèo. Tuy nhiên, bệnh do rong phụ sinh (epiphyte) ảnh hưởng đến sản lượng và chất lượng rong sụn. Mẫu rong sụn nhiễm epiphyte được thu tại vịnh Cam Ranh và Vân Phong, Khánh Hòa. Epiphyte được khảo sát và định loại dựa trên đặc điểm hình thái, kiểm chứng phân loại và khảo sát mối quan hệ tiến hóa bằng chỉ thị rbcL của DNA lục lạp. Nghiên cứu phát hiện dạng true epiphyte (u lồi dạng sợi), định loại và ghi nhận mới Melanothamnus thailandicus, ở Việt Nam và trên song sụn. Trình tự rbcL của epiphyte thể hiện sự tương đồng cao (99,98%) với loài M. thailandicus phân bố ở Thái Lan. Cây phát sinh loài cho thấy M. thailandicus ở Khánh Hòa và Thái Lan sắp xếp cùng nhánh, và cùng với các loài thuộc giống Melanothamnus tạo thành nhánh đồng dạng. Nghiên cứu định loại chính xác epiphyte, khảo sát mối quan hệ phát sinh loài, bổ sung thành phần loài rong của Việt Nam, và góp phần phát hiện sớm tác nhân gây bệnh trong nghề nuôi rong sụn. Từ khóa: Rong sụn, Epiphyte, Kappaphycus alvarezii, Melanothamnus, Khánh Hòa ABSTRACT Kappaphycus alvarezii Doty is a species of red algae with high economic value, distributed in Asia Pacific waters, including Vietnam. In recent years, seaweed farming has rapidly developed in the Central Provinces, contributing to poverty reduction. However, parasitic epiphyte affects the yield and quality of K. alvarezii. Samples of epiphyte infected K. alvarezii were collected in Cam Ranh and Van Phong Bays, Khanh Hoa. Epiphyte was investigated and identified based on morphological characteristics. Taxonomic verification and molecular phylogeny were examined by rbcL gene of Chloroplast DNA. The study discovered a true epiphyte, identified as Melanothamnus thailandicus, a new record in Vietnam, and on K. alvarezii. The rbcL sequence of M. thailandicus exhibits a high similarity (99.98%) with this species distributed in Thailand. Phylogenetic tree showed that M. thailandicus in Khanh Hoa and Thailand were clustered in the same clade, and together with species of the genus Melanothamnus formed monophyletic lineage. Curent research identified parasitic epiphyte on K. alvarezii, examined the molecular phylogeny, contributing to update list of seeweed species in Vietnam, as well as early pathogen detection for seaweed aquaculture. Key words: Red algae, Epiphyte, Kappaphycus alvarezii, Melanothamnus, Khanh Hoa I. ĐẶT VẤN ĐỀ sụn có giá trị kinh tế cao, dùng để chế biến Rong sụn (Kappaphycus alvarezii Doty) carrageenan, một chế phẩm được ứng dụng sinh trưởng tự nhiên ở vùng biển Châu Á Thái rộng rãi trong các ngành công nghiệp chế biến Bình Dương, nhất là vùng Đông Nam Á. Rong thực phẩm, y dược, mỹ phẩm. Nghề trồng rong 2 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
  5. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 sụn hiện nay đem lại lợi ích kinh tế khá lớn quan trọng trong hệ sinh thái biển [6]. Đối cho nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các với nghề nuôi rong sụn, bệnh trắng lũn thân nước Đông Nam Á như Philippines, Malaysia, (ice-ice disease) đã ảnh hưởng đến sự sinh Indonesia và Việt Nam với tổng sản lượng lên trưởng và phát triển của rong sụn [1,4]. Tuy đến 95% tổng sản lượng rong sụn khô tiêu thụ nhiên, các nghiên cứu về bệnh do epiphyte trên toàn thế giới, ước chừng khoảng 160.000 vẫn còn hạn chế. tấn khô/ năm [3,12]. Trong những thập kỷ gầm đây, chỉ thị Khánh Hòa với lợi thế đường bờ biển dài phân tử được sử dụng rộng rãi trong phân loại 200 km, với hơn 200 hòn đảo lớn nhỏ, nhiều sinh vật. Đối với thực vật, chỉ thị Ribulose vũng, vịnh lớn (Vân Phong, Nha Trang, Cam bisphosphate carboxylase large subunit (rbcL) Ranh), có khí hậu ôn hòa là điều kiện thuận lợi của DNA lục lạp chứng tỏ là công cụ hữu hiệu để nuôi trồng rong sụn [2,3]. Tuy nhiên, hiện trong định loại và khảo sát mối quan hệ phát nay nghề trồng rong sụn đang phải đối mặt với sinh loài, đặc biệt đối với rong biển [16], trong rất nhiều khó khăn và thách thức như nguồn đó có rong phụ sinh [9,15]. giống và chất lượng giống không đảm bảo, Nghiên cứu hiện tại định loại và khảo sát năng suất và chất lượng rong giảm, đặc biệt khí mối quan hệ tiến hóa với ghi nhận mới loài hậu thay đổi phức tạp (cường độ ánh sáng tăng, rong nâu dạng sợi sống phụ sinh trên rong sụn độ mặn nước biển cao, mực nước biển dâng) do dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền. Phát ảnh hưởng của biến đổi khí hậu toàn cầu làm hiện này bổ sung dữ liệu về thành phần rong dễ dẫn đến bùng phát các dịch bệnh như bệnh phụ sinh trên rong sụn, góp phần phát hiện sớm ice-ice (bệnh trắng lũn thân) và bệnh epiphyte mầm bệnh trong phát triển nghề nuôi rong. (rong tảo phụ sinh) trên rong nuôi [4]. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các nghiên cứu trên thế giới về bệnh NGHIÊN CƯU epiphyte cho thấy epiphyte gây ảnh hưởng rất 1. Địa điểm và phương pháp thu mẫu lớn đến năng suất và chất lượng của rong sụn Mẫu rong sụn được thu tại các vị trí khác [8,17]. Các công bố đã chỉ ra mùa vụ là nhân tố nhau, trải đều trên diện tích nuôi trồng của chính ảnh hưởng đến việc bùng phát dịch bệnh các hộ nuôi tại Cam Phúc Bắc (11º58’7’’N, do epiphyte và gây nhiễm khuẩn thứ cấp ở rong 109º12’8’’E), Cam Ranh - Khánh Hòa (50 sụn [13,20,22]. mẫu) và Vịnh Vân Phong (12º39’38”N, Ở Việt Nam các nghiên cứu chủ yếu tập 109º20’47”E), Vạn Ninh, Khánh Hòa (50 mẫu) trung vào các kỹ thuật nuôi trồng và chiết suất từ tháng 6 năm 2017 đến tháng 9 năm 2018 carrageenan từ rong sụn [2,3,5]. Epiphyte (Hình 1). hiện diện thường xuyên và là một thành phần Hình 1. Bản đồ thu mẫu (a) rong sụn nhiễm epiphyte (b) tại Khánh Hòa. Khung hình vuông màu xanh chỉ khu vực thu mẫu (Địa điểm được chi tiết tại vịnh Vân Phong và Cam Ranh). TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 3
  6. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 Các mẫu rong sau khi thu được bao bọc TAT GCT AAA ATG GG-3' và R1381-5'ATC bằng giấy báo, sau đó vận chuyển về phòng thí TTT CCA TAG ATC TAA AGC-3' [10]. Phản nghiệm trong các thùng xốp được làm ẩm (nhiệt ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích độ 22 ± 2ºC) bằng nước biển. Mẫu rong sau đó 25 μL gồm: 5 μl Green Gotaq® Flexi Buffer được lưu giữ trong các bể kính (80/50/30 cm) (Promega) 5X, 3 μl MgCl2 25mM, 1 μl dNTPs chứa nước biển, chiếu sáng tự nhiên, và sục khí. 10mM, 1 μl mỗi mồi (10 mM), 0,2 μl GoTaq Mẫu rong được được rửa sạch lần nữa bằng bàn polymerase (5 U/μl), 5 μl ADN và nước cho chải mềm và bảo quản trong formalin 5% (đệm đủ thể tích. Thành phần phản ứng được hiệu nước biển, pH 7.8, độ mặn 30 ppt) [20]. chỉnh bằng cách cho thêm PEG 10% và bột 2. Định loại epiphyte bằng phương pháp Skim Milk 0.,% (W/v) (mỗi loại 0,5 μl) để hình thái và di truyền tăng độ nhạy của phản ứng [7]. Phản ứng 2.1. Định loại epiphyte bằng đặc điểm hình thái được chạy trên máy luân nhiệt C1000 Touch Sử dụng dao lam cắt những lát cắt mỏng (Bio-Rad) theo chu trình nhiệt độ như sau:
  7. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 genbank được trình bày ở Bảng 1. Phân tích BT) là 1000 sử dụng phần mềm Mega 7.0 [18]. được tiến hành dựa trên thuật toán Neighbour Spyridiocolax capixaba và Spyridia clavata Joining (NJ), với giá trị tin cậy (Bootstrap – (Spyridiaceae) được sử dụng làm nhóm ngoại. Bảng 1. Thông tin về trình tự, địa điểm thu mẫu và mã số Genbank của các loài epiphyte. Tên loài được liệt kê theo Genbank. Tên loài cập nhật được mô tả ở hình 6. Địa điểm thu STT Loài Mã số Genbank Nguồn mẫu 1 Melanothamnus thailandicus Việt Nam MT499883 Nghiên cứu hiện tại 2 Neosiphonia thailandica Thái Lan KM502785-87 Muangmai (2014) 3 Neosiphonia yongpilii Hàn Quốc KT964453 Kim và Kim (2016) 4 Neosiphonia yendoi Hàn Quốc KX265484 Kim et al. (2016) 5 Neosiphonia sphaerocarpa Hàn Quốc KX265479 Kim et al. (2016) 6 Neosiphonia japonica Nhật Bản KX265440 Kim et al. (2016) Mamoozadeh và Freshwater 7 Neosiphonia tongatensis Panama HM573570 (2012) 8 Neosiphonia harlandii Hàn Quốc DQ787485 Kim và Yang (2006) 9 Neosiphonia decumbens Hàn Quốc DQ787480 Kim và Yang (2006) 10 N.teradomariensis Hàn Quốc KX265441 Kim et al. (2016) 11 Neosiphonia flavimarina Hàn Quốc KX265439 Kim et al. (2016) 12 Melanothamnus harveyi Úc MF101437 Díaz-Tapia et al. (2017) 13 Polysiphonia pacifica Canada MF120858 Savoie và Saunders (2019) 14 Polysiphonia stricta Canada EU492916 Stuercke (2006) 15 Polysiphonia adamsiae Úc MH101825 Díaz-Tapia et al. (2008) 16 Polysiphonia atlantica Tây Ban Nha JX828142 Bárbara et al. (2013) 17 Spyridiocolax capixaba Brazil MH884603 Chen et al. (2019) 18 Spyridia clavata Panama KU756119 Won et al. (2019) III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO epiphyte hình thành các đốm đen li ti, chưa có LUẬN hình dạng rõ ràng, xung quanh các đốm đen có 1. Định loại dựa trên đặc điểm hình thái dấu hiệu của sự tổn thương cấu trúc mô, sau đó, Sau khi quan sát các lát cắt, kết hợp với tạo thành các u lồi (Hình 2a), có thể chỉ là các u quan sát hình thái từng mẫu epiphyte dưới kính lồi có đỉnh đen, ngay tâm hình thành nên dạng hiển vi quang học, đối chiếu với các tài liệu sợi, ban đầu chỉ là sợi nhỏ, nhưng dần dần hình về phân loại, nghiên cứu định loại và ghi nhận thành dạng sợi lớn (Hình 2b,c) rồi sau đó có mới 1 loài epiphyte trên rong sụn dựa trên đặc khả năng phân nhánh tạo dạng cây (Hình 2d). điểm hình thái. Đặc điểm hình thái: Kích thước chiều dài Melanothamnus thailandicus (N. Muangmai từ 0,3 - 2 cm, trung bình 1,5 ±0,05 (n=30) có & C.Kaewsuralikhit) Díaz-Tapia & Maggs, màu nâu đỏ khi quan sát dưới kính hiển vi, thân 2017 chia thành các đốt theo chiều dọc, phân nhánh Địa điểm thu mẫu: Vịnh Cam Ranh và Vịnh ở gốc, dạng chữ Y (Hình 3b,c), có 4 tế bào Vân Phong, Khánh Hòa quanh tế bào trung tâm ở mỗi đốt (Hình 3b), Vật chủ: Gracilaria fisher (Thái Lan), nhánh mang bào tử chỉ có 3 tế bào (Hình 3d). Kappaphycus alvarezii (Việt Nam, ghi nhận mới) Đỉnh sinh trưởng chia thành 3 thùy, 1 thùy lớn Dạng Epiphyte (true epiphyte): Đầu tiên, ở giữa, 2 thùy nhỏ 2 bên (Hình 3a). TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 5
  8. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 Hình 2. Các dạng của epiphyte dưới kính hiển vi Hình 3. Hình thái ngoài của M. thailandicus. soi nổi. a) Dạng u lồi; b và c) Dạng u lồi mọc sợi, a) Đỉnh sinh trưởng. b) Phân nhánh chữ Y. d) Dạng sợi. c) Phân nhánh ở gốc. d) Nhánh mang bào tử. 2. Kiểm chứng định loại epiphyte bằng rửa giả thứ hai - E2) (Hình 4). Để đảm bảo chất phương pháp sinh học phân tử lượng DNA cho phản ứng PCR, nghiên cứu sử 2.1. Tách chiết DNA và khuếch đại gen rbcL dụng DNA tách chiết từ mẫu rửa giải E2 để của DNA lục lạp khuếch đại đoạn gen rbcL. Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ Sử dụng DNA tổng số đã tách chiết làm mẫu epiphyte là 1 băng rõ nét nhưng có vệt khuôn, cặp mồi F57 và R1381 [10], sản phẩm sáng kéo dài (lần rửa giải thứ nhất - E1) do có PCR của gen rbcL thu được cho kết quả phù hợp nhiều DNA bị đứt gãy, và 1 băng cho dải sáng với tính toán lý thuyết. Các mẫu đều có băng với mờ hơn nhưng không có vệt sáng kéo dài (lầm kích thước tương ứng 1324 bp (Hình 4). Hình 4: Hình ảnh điện di DNA tổng số và sản phẩm PCR gen rbcL của loài Melanothamnus thailandicus M: Thang chuẩn DNA 100 bp, E1, E2: DNA tổng số ở lần rửa giải 1 và 2, M1, M2: sản phẩm PCR của M. thailandicus, N: mẫu đối chứng âm. 2.2. Kiểm chứng định loại bằng chỉ thị phân tử tính năng Blast, và so sánh trình tự khác Sản phẩm khuếch đại gen rbcL của loài biệt, trình tự loài M. thailandicus thể hiện M. thailandicus được giải trình tự và dóng sự tương đồng 99,98% (1 sai khác nuceotide hàng, thu được trình tự dài 1120 bp. Sử dụng tại vị trí 683 trên 1120 bp). Sự khác biệt di 6 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
  9. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 truyền là 0,02 % khi so sánh với các trình tự Đặc trưng hình thái cơ bản là các nhánh bào của loài này trên Genbank (Hình 5). tử có 3 tế bào xung quanh. Phân tích mối quan M. thailandicus được mô tả bởi Muangmai hệ phát sinh loài cho thấy M. thailandicus sắp et al (2014) [15] với tên loài Neosiphonia xếp chung nhánh với các loài Neosiphonia, và thailandica ở cảng Sri Racha, Vịnh Thái Lan. gần gũi với loài N. sphaerocarpa và P. forfex. Tên loài 665 675 685 695 705 715 M.thailandica CATAGAATAT AGAAATCTTT CTTTCCAGCG CATAAAAGGC TGCGAATTAA TGTTTTCATC M.thKM502785 CATAGAATAT AGAAATCTTT CTTTCCAACG CATAAAAGGC TGCGAATTAA TGTTTTCATC M.thKM502787 CATAGAATAT AGAAATCTTT CTTTCCAACG CATAAAAGGC TGCGAATTAA TGTTTTCATC M.thKM502786 CATAGAATAT AGAAATCTTT CTTTCCAACG CATAAAAGGC TGCGAATTAA TGTTTTCATC Hình 5: Vị trí khác biệt Nucleotide (vị trí 683, in đậm) của trình tự rbcL loài M. thailandicus so với các trình tự trên Genbank. Nghiên cứu hiện tại cho thấy sự tương đồng đầu tiên loài này được ghi nhận trên rong sụn. về mặt hình thái (phân nhánh gốc chữ Y, đỉnh 2.3. Khảo sát mối quan hệ phát sinh loài sinh trưởng có 3 tế bào), và di truyền (tương Melanothamnus thailandicus đồng là 99,98% dựa trên chỉ thị rbcL của DNA Dựa trên trình tự loài M. thailandicus từ lục lạp) có thể định loại chính xác loài này là nghiên cứu hiện tại, và các trình tự có sẵn trên Melanothamnus thailandicus. Theo Muangmai Genbank (Bảng 1), phân tích mối quan hệ phát et al (2014) [15], M. thailandicus được tìm sinh loài với giá trị BT trên các nhánh được thấy trên Gracilaria fisher, vì vậy đây là lần biểu hiện ở Hình 6. Hình 6: Cây phát sinh loài (phương pháp NJ, phần mềm Mega) của các loài Melanothamnus. Giá trị tin cậy (Boostraps) được biểu hiện trên các nhánh. Hình chữ nhật là loài trong nghiên cứu hiện tại. Tên mới được cập nhật theo Díaz-tapia et al. (2017) [9] TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 7
  10. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 Trên Hình 6, Loài M. thailandicus (tên cũ là 75,7 - 95,78 triệu năm trước. Mặc dù phát Neosiphonia thailandica) được xếp chung một sinh trong kỷ Phấn trắng, Melanothamnus nhánh riêng biệt với các loài này thu từ Thái là một giống chủ yếu ở Ấn Độ - Thái Bình Lan (BT 100%), giúp khẳng định sự định loại Dương, do đó sự vắng mặt của giống này ở chính xác và vị trí phân loại của loài. Loài M. phía đông bắc Đại Tây Dương hiện vẫn chưa thailandicus cùng với các loài cùng giống tạo thể giải thích [9]. thành một nhánh đồng dạng với giá trị BT cao IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: (100%). Các loài Melanothamnus spp. thể hiện Nghiên cứu ghi nhận mới epiphyte trên mối quan hệ gần gũi với các loài thuộc giống rong sụn. Dựa trên đặc điểm hình thái và di Polysiphonia. truyền, nghiên cứu định loại chính xác loài Theo Muangmai et al. (2014) [15], N. Melanothamnus thailandicus và khảo sát mối thailandica có quan hệ gần gữi với loài quan hệ tiến hóa. Cần có nghiên cứu chuyên N. sphaerocarpa và Polysiphonia forfex. sâu và trên diện rộng các dạng/loài epiphyte Díaz-tapia et al. (2017) [9] đề xuất giống trên rong sụn nhằm bổ sung thành phần loài, Melanothamnus (bao gồm các loài của giống tác nhân gây bệnh góp phần phát hiện sớm và Fernandosiphonia và Neosiphonia, và xếp có biện pháp phòng, trừ bệnh thích hợp. 3 loài trên vào giống Melanothamnus. Giống Melanothamnus (gồm 46 loài) đặc trưng bởi LỜI CẢM TẠ: Nhóm tác giả xin gửi lời cảm đỉnh sinh trưởng có 3 tế bào. Nguồn gốc tiến ơn đến Ths. Trương Thị Oanh, và Ths. Trần hóa của giống Melanothamnus được ước tính Quang Sáng đã hỗ trợ xử lý hình ảnh và số liệu di truyền. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Đình Lâm, Định Thị Ngọc Mai, Nguyễn Lâm Anh, Hoàng Thị Lan, Đinh Thị Thu Hằng, Trần Thị Hồng Hà, Lê Mai Hương, Đặng Diễm Hồng (2010), “Đa dạng sinh học của các loài vi sinh vật cơ hội gây bệnh trắng nhũn thân (ice – ice disease) trên Rong Sụn (Kappaphycus alvarezii, K. striatum) ở miền trung Việt Nam”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ. 48, Tr. 311–319. 2. Đinh Thị Hải Yến, (2005) “Thử nghiệm trồng rong sụn (Kappapphycus alvarezii Doty) tại Đàm Bấy, Nha Trang, Khánh Hòa”, Kỷ yếu Hội Nghị Khoa Học Toàn Quốc về Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật Lần Thứ 6. Tr. 1828–1833. 3. Huỳnh Quang Năng (2006), “Hoạch định vùng phát triển trồng rong sụn (Kappaphycus alvarezii) ven biển phía Nam Việt Nam”. Báo cáo khoa học, Tr. 25-28. 4. Lê Mai Hương, Trần Mai Đức (2010), “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh trong phòng bệnh nhũn thân (ice-ice disease) ở rong sụn Việt Nam”, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học chương trình CNSH thủy sản. 5. Ngô Thị Thu Thảo, Huỳnh Hàn Châu, Trần Ngọc Hải (2010), “Ảnh hưởng của việc nuôi kết hợp các mật độ rong sụn (Kappaphycus alvarezii) với tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei)”. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 16a, Tr. 100–110. 6. Nguyễn Hữu Đại (1999), “Rong biển phụ sinh (Epiphyte) trên cỏ biển ở Khánh Hòa”. Tuyển tập Nghiên cứu biển IX, Tr. 196–204. Tiếng Anh 7. Arbeli, Z., Fuentes, C.L., (2007), "Improved purification and PCR amplification of DNA from environmental samples". FEMS Microbiology Letters 272, pp. 269–275. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2007.00764.x. 8 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
  11. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 8. Borlongan, I.A.G., Luhan, M.R.J., Padilla, P.I.P., Hurtado, A.Q., (2016), "Photosynthetic responses of ‘Neosiphonia sp . epiphyte-infected’ and healthy Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta) to irradiance, salinity and pH variations", Journal of Applied Phycology. 28, pp. 2891–2902 https://doi.org/10.1007/s10811-016-0833-4. 9. Díaz-tapia, P., Mcivor, L., Freshwater, D.W., Verbruggen, H., Wynne, M.J., Maggs, C.A., Gray, V.S.F., (2017). "The genera Melanothamnus Bornet & Falkenberg and Vertebrata S . F . Gray constitute well-defined clades of the red algal tribe Polysiphonieae". European Journal of Phycology 52, 1–30. https://doi.org/10.108 0/09670262.2016.1256436. 10. Freshwater, D.W., Ueness, J., (1994). "Phylogenetic relationships of some European Gelidium (Gelidiales, Rhodophyta) species, based on rbcL nucleotide sequence analysis". Phycologia 33. 11. Hall, T.A., (1999). "BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows95/98/NT". Nucleic Acids Symposium Series. 41, pp. 95–98. 12. Hayashi, L., Anicia., Hurtado, Msuya, F., Bleicher-Lhonneur, G., Critchley, Alan, (2010). "A Review of Kappaphycus Farming: Prospects and Constraints, in: Seaweeds and Their Role in Globally Changing Environments". Springer Dordrecht Heidelberg, London, pp. 254–283. https://doi.org/10.1007/978-90-481-8569-6. 13. Hurtado, A.., Critchley, A.., (2006). "Seaweed industry of the Phillipines and the problem of epiphytism in Kappaphycus farming, in: &, Critchley, Ang, P.O. (Eds.)", Advances in Seaweed Cultivation and Utilisation in Asia. University of Malaya, Kuala Lumpur, pp. 21–28. 14. Kearse, M., Moir, R., Wilson, A., Stones-Havas, S., Cheung, M., Sturrock, S., Buxton, S., Cooper, A., Markowitz, S., Duran, C., Thierer, T., Ashton, B., Meintjes, P., Drummond, A., (2012). "Geneious Basic: An integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data". Bioinformatics 28, pp. 1647–1649. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts199 15. Muangmai, N., Yamagishi, Y., Maneekat, S., Kaewsuralikhit, C., (2014). "The new species Neosiphonia thailandica sp. nov. (Rhodomelaceae, Rhodophyta) from the Gulf of Thailand". Botanica Marina. 57, pp. 459–467. https://doi.org/10.1515/bot-2014-0042 16. Nguyen, X., Nguyen, T., Dao, V., Liao, L., (2019). "New record of Grateloupia taiwanensis S . -M . Lin et H . -Y . Liang in Vietnam : Evidence of morphological observation and rbc L sequence analysis". Biodiverstas 20, 688–695. https://doi.org/10.13057/biodiv/d200311 17. Rantetondok, Alexander., Latama, G., (2017). "Epiphytic and Ice-ice Diseases of Seaweed, Kappaphycus alvarezii and its Effect on Growth Rate and Carrageenan Qualit". International Journal of Aquaculture 7, pp. 134–138. https://doi.org/doi: 10.5376/ija.2017.07.0021. 18. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S., (2013). "MEGA6: Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0". Moecular Biology and Evoluion 30, pp. 2725–2729. https://doi.org/10.1093/ molbev/mst197. 19. Trono, C., (1999). "Seaweeds, in: Carpenter, K.E. and Niem, V.H. (Ed.)", The Living Marine Resources of the Western Central Pacific, Vol. 1. FAO Species Identification Guide for Fishery Purposes. . FAO, Rome, pp. 19–99. 20. Vairappan, C., Chung, CS., Matsunaga, S., (2014). "Effect of epiphyte infection on physical and chemical properties of carrageenan produced by Kappaphycus alvarezii Doty (Soliericeae, Gigartinales, Rhodophyta)". Journal of Applied Phycolog 26, pp. 923–931. https://doi.org/10.1007/s10811-013-0126-0. 21. Vairappan, C.S., (2006). "Seasonal occurrences of epiphytic algae on the commercially cultivated red alga Kappaphycus alvarezii (Solieriaceae, Gigartinales, Rhodophyta)". Journal of Applied Phycolog 18 (3,. pp. 611–617. https://doi.org/10.1007/s10811-006-9062-6 22. Vairappan, C.S., Chung, C.S., Lhonneur, G.B., Critchley, A., (2007). "Distribution and symptoms of epiphyte infection in major carrageenophyte-producing farms". Journal of Applied Phycolog. https://doi. org/10.1007/s10811-007-9299-8. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 9
  12. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ENZYME VÀ THỜI GIAN ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP (Carcharhinus dussumieri) EFFECTS OF THE ENZYME CONCENTRATION AND HYDROLYSIS TIME TO THE PROCESS OF SHARK CARTILAGE (Carcharhinus dussumieri) HYDROLYSIS Đinh Hữu Đông1, Vũ Ngọc Bội2, Nguyễn Thị Mỹ Trang2 1 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm Tp. HCM 2 Khoa Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang Tác giả liên hệ: Vũ Ngọc Bội (Email: boivn@ntu.edu.vn) Ngày nhận bài: 06/05/2020; Ngày phản biện thông qua: 18/05/2020; Ngày duyệt đăng: 12/06/2020 TÓM TẮT Bài báo này công bố kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân sụn cá mập (Carcharhinus dussumieri) bằng hỗn hợp enzyme alcalase-papain. Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ enzyme và thời gian thủy phân có ảnh hưởng mạnh đến hàm lượng protein hòa tan, peptid, Naa, chondroitin sulphate và NNH3 tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp enzyme alcalase-papain. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập là 0,3%. Sau 10h thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp enzyme alcalase-papain với nồng độ enzyme 0,3%, nhiệt độ thủy phân 50ºC, thủy phân ở pH tự nhiên (6,8), khối lượng mẫu 2kg và tỷ lệ nước bổ sung 2 lít, dịch thủy phân có hàm lượng protein hòa tan, peptid, Naa, chondroitin sulphate và NNH3 cao gấp 7,06 lần, 3,68 lần, 9,01 lần, 83,42 lần và 1,27 lần so với ban đầu. Từ khóa: hỗn hợp alcalase - papain, protein, peptide, Naa, NNH3, chodroitin sulphate, sụn cá mập, thủy phân. ABSTRACT This paper focused on the research to determine the effect of the enzyme concentration on hydrolyzing shark cartilage (Carcharhinus dussumieri) by the alcalase-papain enzyme mixture. The results showed that the enzyme concentration and hydrolysis time strongly affected the content of soluble proteins, peptides, Naa, chondroitin sulphate, and NNH3 formed in shark cartilage hydrolyzate. The results also indicated that the alcalase-papain enzyme mixture concentration of 0.3% was suitable for shark cartilage hydrolysis. After 10 hours of shark cartilage hydrolysis by alcalase-papain enzyme mixture at concentration of 0.3%, temperature of 50ºC, natural pH (6.8), sample weight of 2 kilograms and the additional water ratio of 2 liters, the hydrolyzate had the content of protein, peptide, Naa, chondroitin sulphate, and NNH3 higher than 7.06 times, 3.68 times, 9.01 times, 83.42 times and 1.27 times higher than that in the original. Key words: mixture of alcalase-papain enzyme, protein, peptide, Naa, NNH3, chodroitin sulphate, shark cartilage, hydrolysis. I. MỞ ĐẦU thành các loại thực phẩm chức năng hỗ trợ điều Từ xưa người ta đã biết sụn cá mập có khả trị các bệnh về xương khớp và mắt [6]. Tuy năng làm sáng mắt, khả năng ức chế sự hình vậy, mô sụn nói chung và sụn cá mập nói riêng thành các vi mao mạch tân sinh nên có thể hạn thường được cấu trúc bởi các protein không tan chế các khối u, có khả năng ức chế hệ miễn dịch trong nước nên con người rất khó hấp thụ các nên giúp giảm nhẹ các chứng miễn dịch như chất từ mô sụn [3, 5, 6, 7, 10]. Chúng tôi tiến đau nhức xương, vẩy nến, ... [5]. Sụn cá mập có hành nghiên cứu thu nhận các chất tự nhiên từ chứa chondroitin sulfat là thành phần chiếm tỷ sụn cá mập bằng phương pháo thủy phân sụn lệ chính tạo nên cấu trúc của mô sụn, hoạt dịch cá mập tươi bằng phương pháp thủy phân sử bao quanh khớp, giúp bôi trơn sụn khớp [6]. dụng enzyme protease và thu dịch thủy phân Do vậy, sụn cá mập còn thường được điều chế định hướng cho việc sử dụng làm thực phẩm 10 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
  13. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 hỗ trợ phòng chống thoái hóa sụn khớp. Trong (Muller & Henle, 1839)) được thu mua nguyên bài báo này, chúng tôi tiếp tục công bố nghiên con tại các tầu khai thác tại vùng biển Khánh cứu về ảnh hưởng nồng độ hỗn hợp enzyme Hòa. Cá tươi có trọng lượng trung bình 40- alcalase - papain và thời gian thủy phân đến 60kg/con. Cá mập được khai thác trong thời quá trình thủy phân sụn cá mập. gian từ tháng 3÷7 và tháng 9÷12 hàng năm. II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG Sau thu mua, thu toàn bộ vây cá, sụn cá và vận chuyển về phòng thí nghiệm. Tại phòng thí PHÁP NGHIÊN CỨU nghiệm, tiến hành xử lý loại bỏ thịt, mô liên 1. Nguyên vật liệu kết, làm sạch, cấp đông và bảo quản đông ở 1.1. Sụn cá mập: -20ºC để dùng trong suốt quá trình nghiên cứu. Cá mập trắng (Carcharhinus dussumieri Hình 1. Hình ảnh về sụn cá mập (Carcharhinus dussumieri) đã xử lý. 1.2. Enzym alcalase 2. Phương pháp nghiên cứu Enzym alcalase 2.4L là chế phẩm protease 2.1. Các phương pháp phân tích: thương mại do hãng Novozyme - Đan Mạch * Định lượng Nitơ axit amin (Naa): theo cung cấp. Alcalase thuộc nhóm enzyme serine TCVN 3708-1990 Thủy sản- Phương pháp xác endopeptidase có các đặc tính kỹ thuật như định hàm lượng Nitơ amin. sau: pH thích hợp trong khoảng 6 - 8, nhiệt độ * Định lượng Nitơ ammoniac (NNH3): theo thích hợp 30 - 65ºC, hoạt tính 2,4AU/g được TCVN 3706-1990 Thủy sản – Phương pháp bảo quản ở 0 - 5ºC. xác định hàm lượng Nitơ ammoniac. 1.3. Enzym papain: Papain thương mại có hoạt * Xác định hoạt độ protease theo phương tính ≥2,0 mAnsonU/mg (cơ chất hemoglobine, pháp Anson [1, 2, 9] pH 6, nhiệt độ 35,5ºC) do Merck - Đức sản Nguyên tắc của phương pháp: dùng protein xuất. Papain là một enzyme chịu được nhiệt độ casein làm cơ chất xác định hoạt độ thủy phân tương đối cao. Ở dạng nhựa khô, papain không protein của enzyme protease trên cơ sở định bị biến tính trong 3 giờ ở 100ºC, còn ở dạng lượng sản phẩm được tạo thành trong phản dung dịch, papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin - ở 82,5ºC. Papain có pH thích hợp 4,5 - 8,5, dễ Ciocalteau. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine để bị biến tính ở pH12. định lượng tương ứng với lượng sản phẩm tạo TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 11
  14. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 thành dưới tác dụng của enzyme. 1ml dung dịch TCA 10% + 5ml Na2CO3 0,4 - Định lượng protein hòa tan theo phương M + 1ml folin để 20 phút đem so màu. Tính pháp Lowry [1, 9]: kết quả: dựa vào đường chuẩn để tính lượng Nguyên tắc của phương pháp là các axit tysosin tương ứng. amin có vòng thơm, Tyr và Trp có mặt trong Hàm lượng peptid được tính theo công thức: protein sẽ phản ứng với thuốc thử Folin- Ciocalteau tạo thành phức chất màu xanh đen có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 650nm. Dựa 2.2. Phương pháp định lượng chondroitin vào đường chuẩn protein người ta có thể định sulfate (CS) bằng phương pháp so mầu theo lượng hàm lượng protein. Farndale và cộng sự [8] - Xác định hàm lượng peptid [1]: hàm Nguyên lý: Dựa trên sự thay đổi trong lượng peptid được định lượng dựa vào đường quang phổ hấp thụ của DMMB (1,9 chuẩn tyrosine. Lấy 1g mẫu thủy phân, cho Dimethylmethylene) khi tác dụng với thêm 9ml nước cất sau đó khuấy đều trong chondroitin sulfate (glycosaminoglycan sulfate) khoảng 5 ÷10 phút rồi ly tâm lấy dịch trong ở bước sóng 525nm. Dựa vào đường chuẩn của để xác định hàm lượng peptid như sau: lấy 2 chondroitin sulfate A (gốc sulfate gắn ở vị trí ống nghiệm sạch 1 ống thí nghiệm và một ống C-4 (chondroitin-4-sulfate), CS4) với DMMB đối chứng. Ống thí nghiệm: hút chính xác 2ml để xác định hàm lượng chondroitin sulfate. dung dịch lọc ở trên cộng với 2ml Trichloacetic Phương pháp này có độ nhạy cao, có thể định acid (TCA) 20% để 30 phút rồi lọc qua giấy tính và định lựợng hàm lượng CS ở mức μg. lọc thu dịch lọc. Lấy một ống nghiệm sạch cho 2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm vào 1ml dịch lọc + 5ml dung dịch Na2CO3 0,4 Bố trí thí nghiệm để xác định nồng độ hỗn M lắc đều, rồi cho vào 1ml Folin để 20 phút so hợp enzyme alcalase - papain thủy phân sụn cá màu ở bước sóng 660 nm. Ống đối chứng: lấy mập được trình bày ở hình 2. Hình 2. Sơ đồ thí nghiệm xác định nồng độ hỗn hợp alcalase-papain thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập. 12 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
  15. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 Vi sụn cá mập đã xử lý, được rã đông, rửa, tốc độ cao HERMLE Z36HK - Đức, Hệ thống xay nhỏ bằng máy xay và được sử dụng để làm phân tích hàm lượng nitơ/protein theo phương nguyên liệu nghiên cứu thủy phân bằng hỗn pháp Dumas (Đức), Bồn nước điều nhiệt hợp enzyme alcalase - papain. Tiến hành 5 mẫu Memmert WNB22 (Đức), nồi thủy phân dung thí nghiệm thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp tích 30 lít (Việt Nam),… enzyme alcalase-papain với nồng độ của hỗn - Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm hợp enzyme khác nhau: mẫu 1: 0,1%, mẫu 2: đều là hoá chất tinh khiết do hãng Merck - Đức 0,2%, …, mẫu 5: 0,5%. Các mẫu thủy phân đều cung cấp. sử dụng 2kg hỗn hợp sụn cá mập, tỷ lệ alcalase/ 2.5. Phương pháp xử lý số liệu papain trong hỗn hợp 60/40, lượng nước bổ Mỗi thí nghiệm đều tiến hành lặp lại 3 lần sung là 2 lít, thủy phân ở pH tự nhiên của hỗn độc lập và số liệu là kết quả trung bình của các hợp sụn cá mập (pH 6,8) và nhiệt độ thủy phân lần thí nghiệm. Kiểm tra sự khác biệt giữa các 50ºC. Sau các khoảng thời gian: 0h, 2h, 4h, 6h, số liệu thống kê bằng phần mềm Statgraphics 8h và 10 giờ thủy phân, tiến hành lấy mẫu dịch Centurion XVII trial. thủy phân để đánh giá hàm lượng protein hòa III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa, NNH3 và LUẬN hàm lượng chondroitin sulphate tạo thành. Kết 1. Ảnh hưởng thời gian thủy phân và nồng quả đánh giá là cơ sở để lựa chọn nồng độ hỗn độ hỗn hợp alcalase-papain tới hàm lượng hợp enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân protein hòa tan sụn cá mập. Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn 2.4. Thiết bị và hóa chất cá mập bằng hỗn hợp enzym alcalase - papain - Thiết bị: sử dụng các thiết bị hiện có tại với nồng độ khác nhau: 0,1%, 0,2%, 0,3%, Trung tâm Thí nghiệm Thực hành – Trường 0,4% và 0,5%. Sau các khoảng thời gian: 0h, Đại học Nha Trang và Trường Đại học Công 2h, 4h, 6h, 8h và 10 giờ thủy phân, tiến hành nghiệp Thực phẩm - TP. HCM: Máy so mầu lấy mẫu dịch thủy phân để đánh giá hàm lượng UV-VIS DR6000 - Hach (Mỹ); Bể ổn nhiệt protein hòa tan. Kết quả được thể hiện trên MEMMERT WNB14 - Đức, Máy ly tâm lạnh hình 3. Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian thủy phân đến hàm lượng protein tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 13
  16. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 Từ kết quả phân tích ở hình 3 cho thấy theo phân cơ thịt cá mối là 0,3% và nồng độ enzyme thời gian thủy phân hàm lượng protein hòa tan protease từ B. subtilis S5 thích hợp cho quá tạo thành trong tất cả các mẫu thủy phân thủy trình thủy phân cá cơm trong sản xuất nước phân sụn cá mập bằng hỗn hợp alcalase-papain mắm là 0,2% [1]. Năm 2010, Trần Cảnh Đình đều tăng theo sự tăng nồng độ enzyme và thời tiến hành thủy phân hỗn hợp sụn cá mập khô và gian thủy phân nhưng mức độ tăng khác nhau tươi bằng enzyme protease cho rằng nồng độ tùy thuộc vào nồng độ enzyme. Cụ thể, sau enzyme protease thích hợp là 0,2% [3]. 2 giờ thủy phân, hàm lượng protein hòa tan Từ những phân tích ở trên cho thấy khi xét của dịch thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp theo khía cạnh hàm lượng protein hòa tan thì enzyme alcalase-papain ở nồng độ enzyme sử dụng hỗn hợp enzyme alcalase - papain với 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% và 0,5% là 4,45 g/kg, nồng độ 0,3% là phù hợp cho quá trình thủy 5,37g/kg, 6,24g/kg, 6,34g/kg và 6,46g/kg, cao phân sụn cá mập. gấp 2,23 lần, 2,69 lần, 3,12 lần, 3,17 lần và 3,23 2. Ảnh hưởng thời gian thủy phân và nồng lần so với ban đầu. Sau 10 giờ thủy phân, hàm độ hỗn hợp alcalase-papain tới hàm lượng lượng protein hòa tan của dịch thủy phân sụn peptid tạo thành cá mập với nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase- Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn papain sử dụng 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% và cá mập bằng hỗn hợp enzym alcalase - papain 0,5% là 10,16 g/kg, 12,98g/kg, 14,12g/kg, với nồng độ khác nhau: 0,1%, 0,2%, 0,3%, 14,67g/kg và 14,89g/kg, cao gấp tương ứng so 0,4% và 0,5%. Sau các khoảng thời gian: 0h, với ban đầu là 5,08 lần, 6,49 lần, 7,06 lần, 7,34 2h, 4h, 6h, 8h và 10 giờ thủy phân, lấy mẫu lần và 7,45. Kết quả này cho thấy khi tăng nồng dịch thủy phân để đánh giá hàm lượng peptid. độ hỗn hợp enzyme alcalase - papain từ 0,1% Kết quả được thể hiện trên hình 4. ÷0,3% thì hàm lượng protein hòa tan tạo thành Từ kết quả phân tích ở hình 4 cho thấy trong dịch thủy phân tăng mạnh theo thời gian cũng giống như hàm lượng protein, hàm và tăng mạnh theo chiều tăng nồng độ enzyme. lượng peptid tạo thành trong tất cả các mẫu Tuy vậy, khi tăng nồng độ hỗn hợp enzyme thủy phân thủy phân sụn cá mập bằng hỗn alcalase - papain > 0,3% thì hàm lượng protein hợp enzyme alcalase-papain đều tăng theo hòa tan tạo thành trong dịch thủy phân lại có nồng độ enzyme và thời gian thủy phân nhưng xu thế tăng chậm lại và không tương xứng với mức độ tăng khác nhau tùy thuộc vào nồng mức độ tăng nồng độ enzyme. Mặt khác, kết độ hỗn hợp enzyme sử dụng. Cụ thể, ở thời quả đánh giá cũng cho thấy sự khác biệt về điểm sau 2 giờ thủy phân, hàm lượng peptid hàm lượng protein hòa tan tạo thành trong dịch tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập thủy phân ở các mẫu bổ sung 0,3%, 0,4% và bằng hỗn hợp enzyme alcalase-papain tương 0,5% không đáng kể, không có ý nghĩa thống ứng với nồng độ enzyme 0,1%, 0,2%, 0,3%, kê. Như vậy, khi tăng nồng độ hỗn hợp enzyme 0,4% và 0,5% là 0,015146mg/mL, 0,01748 alcalase - papain > 0,3% thì không làm tăng mg/mL, 0,020139mg/mL, 0,020561mg/mL đáng kể hàm lượng protein hòa tan trong dịch và 0,020773mg/mL, cao gấp tương ứng 2,16 thủy phân dẫn tới nếu tăng nồng độ hỗn hợp lần, 2,50 lần, 2,88 lần, 2,94 lần và 2,97 lần enzyme alcalase - papain > 0,3% sẽ dẫn tới so với ban đầu. Ở thời điểm sau 10 giờ thủy lãng phí enzyme. phân, hàm lượng peptid tạo thành trong dịch Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng có thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp enzyme nét tương đồng với một số nghiên cứu đã công alcalase-papain tương ứng với nồng độ enzyme bố trước đây. Cụ thể, năm 2004, Vũ Ngọc Bội 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% và 0,5% là 0,019327 khi nghiên cứu về quá trình thủy phân protein mg/mL, 0,02228mg/mL, 0,025735mg/mL, cá mối và cá cơm bằng enzyme protease từ B. 0,026218mg/mL và 0,026564mg/mL, cao gấp subtilis S5 cho thấy nồng độ enzyme protease 2,76 lần, 3,18 lần, 3,69 lần, 3,75 lần và 3,80 từ B. subtilis S5 thích hợp cho quá trình thủy lần so với ban đầu. Kết quả này cho thấy khi 14 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
  17. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian thủy phân đến hàm lượng peptid tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập. tăng nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase - papain dịch thủy phân để đánh giá hàm lượng Naa. từ 0,1% ÷0,3% thì hàm lượng peptid tạo thành Kết quả được thể hiện trên hình 5. trong dịch thủy phân cũng tăng mạnh theo Kết quả phân tích trình bày ở hình 5 cho thời gian và tăng mạnh theo chiều tăng nồng thấy hàm lượng Naa tạo thành trong tất cả các độ enzyme. Nhưng khi tăng nồng độ hỗn hợp mẫu thủy phân thủy phân sụn cá mập bằng hỗn enzyme alcalase - papain > 0,3% thì hàm lượng hợp alcalase-papain đều tăng theo thời gian peptid tạo thành trong dịch thủy phân tăng rất thủy phân và nồng độ hỗn hợp enzyme nhưng ít và không tương xứng với mức độ tăng nồng mức độ tăng của các mẫu thí nghiệm sử dụng độ enzyme. Mặt khác, kết quả đánh giá cũng nồng độ enzyme khác nhau cũng khác nhau. cho thấy sự khác biệt về hàm lượng peptid tạo Cụ thể, sau 2 giờ thủy phân, hàm lượng Naa thành trong dịch thủy phân ở các mẫu bổ sung của dịch thủy phân tương ứng với nồng độ 0,3%, 0,4% và 0,5% không đáng kể, không có hỗn hợp enzyme 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% và ý nghĩa thống kê. Như vậy, khi tăng nồng độ 0,5% là 5,21243g/lít, 5,21243g/lít, 7,00673g/ hỗn hợp enzyme alcalase - papain > 0,3% thì lít, 7,11911g/kg và 7,21414g/lít, cao gấp tương không làm tăng hàm lượng peptid trong dịch ứng so với ban đầu là 4,24 lần, 4,98 lần, 5,70 thủy phân dẫn tới nếu tăng nồng độ hỗn hợp lần, 5,79 lần và 5,87 lần. Ở thời điểm sau 10 enzyme alcalase - papain > 0,3% sẽ dẫn tới giờ thủy phân, hàm lượng Naa của dịch thủy lãng phí enzyme. phân sụn cá mập bằng hỗn hợp enzyme alca- Từ các phân tích hàm lượng peptid ở trên lase-papain ở nồng độ 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% cho thấy nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase - và 0,5% là 8,28690g/lít, 9,62671g/lít, 11,08536 papain thích hợp cho quá trình thủy phân sụn g/lít, 11,36078g/kg và 11,56613g/lít, cao gấp cá mập là 0,3%. 6,74 lần, 7,83 lần, 9,01 lần, 9,24 lần và 9,40 lần 3. Ảnh hưởng thời gian thủy phân và nồng độ so với ban đầu. Kết quả này cũng cho thấy khi hỗn hợp alcalase-papain tới hàm lượng Naa tăng nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase - papain Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn từ 0,1% ÷0,3% thì hàm lượng Naa tạo thành cá mập bằng hỗn hợp enzym alcalase - papain trong dịch thủy phân sụn cá mập tăng mạnh với nồng độ khác nhau: 0,1%, 0,2%, 0,3%, theo chiều tăng nồng độ enzyme và thời gian 0,4% và 0,5%. Sau các khoảng thời gian: 0h, thủy phân. Trái lại, khi tăng nồng độ hỗn hợp 2h, 4h, 6h, 8h và 10 giờ thủy phân, lấy mẫu enzyme alcalase - papain > 0,3% thì hàm lượng TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 15
  18. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 Hình 5. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian thủy phân đến hàm lượng Naa tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập. Naa tạo thành trong dịch thủy phân lại tăng rất đoạn sau 2 giờ thủy phân sụn cá mập bằng chậm, không đáp ứng được mức độ tăng nồng hỗn hợp enzyme alcalase-papain, hàm lượng độ enzyme. Như vậy, khi tăng nồng độ hỗn hợp chondroitin sulphate tạo thành trong dịch thủy enzyme alcalase - papain > 0,3% thì không làm phân của các mẫu thí nghiệm sử dụng enzyme tăng đáng kể hàm lượng Naa trong dịch thủy với nồng độ 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% và 0,5% là phân dẫn tới nếu tăng nồng độ hỗn hợp enzyme 7,33062mg/mL, 9,11400mg/mL, 9,84540mg/ alcalase - papain > 0,3% có thể dẫn tới lãng phí mL, 10,43168mg/mL và 10,54282mg/mL, cao enzyme. gấp tương ứng so với ban đầu là 18,85 lần, Từ những phân tích ở trên khi xét theo khía 23,43 lần, 25,31 lần, 26,82 lần và 27,10 lần. Ở cạnh hàm lượng nitơ acid amin thì sử dụng hỗn thời điểm sau 10 giờ thủy phân sụn cá mập bằng hợp enzyme alcalase - papain để thủy phân sụn hỗn hợp enzyme alcalase-papain, hàm lượng cá mập với nồng độ enzyme 0,3% là phù hợp. chondroitin sulphate của dịch thủy phân tương 4. Ảnh hưởng thời gian thủy phân và nồng ứng với nồng độ enzyme đã sử dụng 0,1%, độ hỗn hợp alcalase-papain tới hàm lượng 0,2%, 0,3%, 0,4% và 0,5% là 23,23486mg/ chodroitin sulphate tạo thành mL, 28,40800mg/mL, 32,44880mg/mL, Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn 33,05696mg/mL và 33,09104mg/mL, cao gấp cá mập bằng hỗn hợp enzym alcalase - papain tương ứng 59,73 lần, 73,03 lần, 83,42 lần, với nồng độ khác nhau: 0,1%, 0,2%, 0,3%, 84,98 lần và 85,07 lần so với ban đầu. Kết quả 0,4% và 0,5%. Sau các khoảng thời gian: 0h, này cho thấy khi tăng nồng độ hỗn hợp enzyme 2h, 4h, 6h, 8h và 10 giờ thủy phân, lấy mẫu dịch alcalase - papain từ 0,1% ÷0,3% thì hàm lượng thủy phân để đánh giá hàm lượng chondroitin chondroitin sulphate tạo thành trong dịch sulphate. Kết quả được thể hiện trên hình 6. thủy phân tăng mạnh theo chiều tăng nồng độ Kết quả phân tích trình bày ở hình 6 cho enzyme. Tuy vậy, khi tăng nồng độ hỗn hợp thấy hàm lượng chondroitin sulphate tạo thành enzyme alcalase - papain > 0,3% thì hàm lượng trong tất cả các mẫu thủy phân thủy phân chondroitin sulphate tạo thành trong dịch thủy sụn cá mập bằng hỗn hợp alcalase-papain phân có xu hướng tăng chậm lại và mức độ đều tăng theo thời gian thủy phân và nồng tăng không tương xứng với mức độ tăng nồng độ hỗn hợp enzyme nhưng mức độ tăng khác độ enzyme. Mặt khác, kết quả đánh giá cũng nhau tùy thuộc vào nồng độ enzyme. Ở giai cho thấy sự khác biệt về hàm lượng chondroitin 16 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
  19. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 Hình 6. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian thủy phân đến hàm lượng chondroitin sulphate tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập. sulphate tạo thành trong dịch thủy phân của các papain thích hợp cho quá trình thủy phân sụn mẫu bổ sung enzyme với nồng độ 0,3%, 0,4% cá mập là 0,3%. và 0,5% không đáng kể, không có ý nghĩa 5. Ảnh hưởng thời gian thủy phân và nồng thống kê. Như vậy, khi tăng nồng độ hỗn hợp độ hỗn hợp alcalase-papain tới hàm lượng enzyme alcalase - papain > 0,3% thì không làm NNH3 tăng đáng kể hàm lượng chondroitin sulphate Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn trong dịch thủy phân dẫn tới khi tăng nồng độ cá mập bằng hỗn hợp enzym alcalase - papain hỗn hợp enzyme alcalase - papain > 0,3% sẽ với nồng độ khác nhau: 0,1%, 0,2%, 0,3%, dẫn tới lãng phí enzyme. 0,4% và 0,5%. Sau các khoảng thời gian: 0h, Từ những phân tích ở trên khi xét theo 2h, 4h, 6h, 8h và 10 giờ thủy phân, lấy mẫu khía cạnh hàm lượng chondroitin sulphate tạo dịch thủy phân để đánh giá hàm lượng NNH3. thành thì nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase - Kết quả được thể hiện trên hình 7. Hình 7. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian thủy phân đến hàm lượng NNH3 tạo thành trong dịch thủy phân vi sụn cá mập. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 17
  20. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2020 Từ kết quả phân tích ở hình 7 cho thấy hàm 1) Nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase- lượng NNH3 tạo thành trong các mẫu thủy phân papain và thời gian thủy phân có ảnh hưởng sụn cá mập bằng hỗn hợp enzyme alcalase- mạnh đến hàm lượng protein hòa tan, peptid, papain với nồng độ enzyme sử dụng khác nhau Naa, chondroitin sulphate và NNH3 tạo thành đều tăng theo thời gian thủy phân nhưng mức trong dịch thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp độ tăng chậm và khác nhau không đáng kể giữa enzyme alcalase-papain. các mẫu thí nghiệm. Cụ thể, sau 10 giờ thủy 2) Nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain phân sụn cá mập bằng hỗn hợp enzym alcalase thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập - papain, các mẫu thủy phân sử dụng enzyme là 0,3%. Sau 10h thủy phân sụn cá mập bằng với nồng độ: 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% và 0,5% hỗn hợp enzyme alcalase-papain với nồng độ đều có hàm lượng NNH3 tăng trong khoảng từ enzyme 0,3%, nhiệt độ thủy phân 50ºC, thủy 1,13-1,27 lần so với ban đầu và sự chênh lệch phân ở pH tự nhiên (6,8), khối lượng mẫu 2kg về hàm lượng NNH3 giữa các mẫu thí nghiệm và tỷ lệ nước bổ sung 2 lít, dịch thủy phân không có ý nghĩa thống kê. có hàm lượng protein hòa tan, peptid, Naa, IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ chondroitin sulphate và NNH3 cao gấp 7,06 lần, Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép 3,68 lần, 9,01 lần, 83,42 lần và 1,27 lần so với rút ra kết luận: ban đầu. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Vũ Ngọc Bội (2004), Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng enzyme protease từ B. subtilis, Luận án tiến sĩ Sinh học chuyên ngành Hóa sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 2. Vũ Ngọc Bội, Lê Hương Thủy, Phạm Thị Hương, Đặng Thị Thu Hương (2015), “Nghiên cứu thủy phân moi biển (Acetes sp) bằng hỗn hợp enzym alcalase - bromelin thô”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, Số 4/2015, Trường Đại học Nha Trang, Trang 18-26. 3. Trần Cảnh Đình và cộng sự (2010), Nghiên cứu ứng dụng sản xuất thử nghiệm chondroitin và glucosamin từ nguyên liệu thủy sản, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học thuộc chương trình CNSH - thủy sản, Viện Hải sản, Hải phòng. 4. Đặng Văn Hợp, Đỗ Minh Phụng, Vũ Ngọc Bội, Nguyễn Thuần Anh (2010), Phân tích kiểm nghiệm thực phẩm thủy sản, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 5. Phạm Thị Khánh Vân & Vũ Thị Thái (2004), "Phím nước mắt và tác dụng của chondroitin sulphat". Tạp chí Thuốc và Sức khỏe, Số 273(12). Tiếng Anh 6. Antonilli L. and Paroli E. (1993), “Role of the oligosaccharide inner core in the inhibition of human leukocyte elastase by chondroitin sulfates”, Int. J. Clin. Pharmacol. Res.;13 Suppl:11-7. 7. Bruyere O. & Reginster J. Y. (2007), "Glucosamine and chondroitin sulfate as therapeutic agents for knee and hip osteoarthritis”, Drugs Aging, 24(7): p. 573-580. 8. Farndale W. R., Buttle D. J. & Barrett A. J. (1986), "Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue", Biochim. Biophys. Acta., 883: p. 173-177. 9. J. Jayaraman (1998), Laboratory manual in biochemistry, Wiley Eastern Limited. 10. Robert M. Lauder (2009), "Chondroitin sulphate: A complex molecule with potential impacts on a wide range of biological systems", Complementary Therapies in Medicine, 17: p. 56-62. 18 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2