30(2): 88-91 T¹p chÝ Sinh häc 6-2008<br />
<br />
<br />
<br />
Thu nhËn vµ nu«i cÊy tÕ bµo sinh d−ìng cña bß rõng Bos<br />
javanicus (Wagrer, 1844) nh»m b¶o tån nguån gien cÊp ®é tÕ bµo<br />
Hoµng NghÜa S¬n, TrÇn CÈm Tó<br />
ViÖn Sinh häc nhiÖt ®íi<br />
Lª V¨n Ty<br />
ViÖn C«ng nghÖ sinh häc<br />
<br />
Bß rõng Bos javanicus (Wagrer, 1844) thuéc DMEM (Gibco); FBS(Gibco); trypsin (Sigma);<br />
hä Bovidae, lµ lo¹i thó cì lín, cã träng l−îng c¬ EDTA (Merk); polyvinyl alcohol (China); L-<br />
thÓ 600 - 800 kg. glutamine (Sigma); D-glucose (Sigma).<br />
Bß rõng thÝch sèng ë nh÷ng vïng rõng th−a 2. VËt liÖu<br />
tho¸ng m¸t, nhÊt lµ rõng khép hoÆc nh÷ng khu MÉu m« cña tai bß rõng ®−îc thu nhËn t¹i<br />
rõng rËm cã thung lòng cã nhiÒu cá. c¬ së nu«i thó hoang d· ë khu vùc TuyÒn L©m,<br />
ë ViÖt Nam, tr−íc ®©y bß rõng cã nhiÒu ë thµnh phè §µ L¹t.<br />
c¸c tØnh §ång Nai (Biªn Hoµ, La Ngµ…), Bµ RÞa 3. Ph−¬ng ph¸p<br />
- Vòng Tµu, B×nh ThuËn (Phan RÝ - Phan ThiÕt),<br />
L©m §ång, §¾c L¾c…. §©y lµ loµi thó quý hiÕm Nghiªn cøu thùc nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh t¹i<br />
cña rõng nhiÖt ®íi, th−êng bÞ s¨n b¾n ë nhiÒu ViÖn Sinh häc nhiÖt ®íi vµ Tr−êng §¹i häc<br />
n¬i nªn ®ang ®øng tr−íc nguy c¬ tuyÖt chñng. Quèc gia thµnh phè Hå ChÝ Minh.<br />
Trong S¸ch §á ViÖt Nam (2000), bß rõng ®−îc a. Ph−¬ng ph¸p thu nhËn vµ xö lý mÉu<br />
xÕp ë cÊp ®é V (SÏ nguy cÊp) [1]; trong Danh MÉu tai bß rõng sau khi ®−îc thu nhËn,<br />
lôc §á cña IUCN (2004), bß rõng ë møc EN ®−îc röa s¹ch trong m«i tr−êng PBS(-); mét nöa<br />
(Nguy cÊp) [2]; cßn trong NghÞ §Þnh cho vµo týp ®«ng l¹nh chøa 1 ml PBS 10%<br />
48/2002/N§-CP cña ChÝnh phñ, bß rõng ®−îc DMSO ®Ó ®«ng l¹nh. Nöa cßn l¹i cho vµo<br />
xÕp trong phô lôc IB [3]. Do vËy, vÊn ®Ó b¶o tån effendorf chuyÓn vÒ phßng ThÝ nghiÖm tÕ bµo<br />
nguån gien lµ mét trong nh÷ng nhiÖm vô chiÕn ®éng vËt, ViÖn Sinh häc nhiÖt ®íi.<br />
l−îc cña c«ng nghÖ sinh häc ViÖt Nam.<br />
MÉu tai bß rõng ®−îc xö lý qua nh÷ng b−íc<br />
Trªn c¬ së tÕ bµo sinh d−ìng cña loµi bß sau: effendorf chøa mÉu ®−îc xÞt cån 70o råi<br />
rõng cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn trong m«i tr−êng ®−a vµo tñ v« trïng. MÉu ®−îc röa qua dung<br />
DMEM ®−îc bæ sung huyÕt thanh, ®ång thêi dÞch PBS(-) 3 lÇn, råi tiÕn hµnh c¹o s¹ch l«ng.<br />
dùa vµo nh÷ng ®iÒu kiÖn s½n cã cña phßng thÝ Sau ®ã, ng©m mÉu vµo cån trong vßng 10 gi©y<br />
nghiÖm, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thu nhËn vµ nu«i vµ röa l¹i 3 lÇn b»ng dung dÞch PBS(-).<br />
cÊy tÕ bµo sinh d−ìng cña bß rõng nh»m b¶o tån<br />
b. Ph−¬ng ph¸p nu«i s¬ cÊp mÉu m«<br />
nguån gien ë cÊp ®é tÕ bµo vµ lµm nguyªn liÖu<br />
®Ó t¹o dßng v« tÝnh vÒ sau nµy. TiÕn hµnh c¾t nhá mÉu m« thµnh nh÷ng<br />
KÕt qu¶ thu ®−îc lµ tÕ bµo sinh d−ìng cña m¶nh cã kÝch th−íc 0,5 × 0,5 mm. Sau ®ã, g¾p<br />
bß rõng ph¸t triÓn tèt trong m«i tr−êng DMEM nh÷ng m¶nh m« vµo ®Üa nhùa 4 giÕng. Mçi<br />
®−îc bæ sung 10% huyÕt thanh cña bµo thai bª giÕng tõ 4 ®Õn 5 m¶nh m«. Chê tõ 20 ®Õn 30<br />
vµ ®· thu ®−îc sè l−îng lín tÕ bµo fibroblast cña phót ®Ó mÉu m« cè ®Þnh trªn mÆt ®Üa.<br />
bß rõng. Sau khi mÉu ®· cè ®Þnh, bæ sung 400 µl m«i<br />
tr−êng DMEM 10% FBS vµ chuyÓn vµo tñ Êm<br />
I. PH¦¥NG PH¸P NGHI£N CøU<br />
37 - 38oC; 5% CO2 ®Ó nu«i cÊy.<br />
1. Hãa chÊt Sau mçi 24 giê, kiÓm tra vµ ghi nhËn h×nh<br />
Dung dÞch PBS(-); cån 70o (China); m«i tr−êng ¶nh.<br />
88<br />
H×nh 3. TÕ bµo sau<br />
H×nh 1. Sau 4 ngµy nu«i s¬ cÊp H×nh 2. Sau 10 ngµy nu«i<br />
10 ngµy nu«i (X20)<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
H×nh 4. TÕ bµo sau H×nh 5. Sau khi t¸ch H×nh 6. TÕ bµo sau 24 giê<br />
10 ngµy nu«i (X10) b»ng trypsin/edta 0,25% ®−îc cÊy chuyÒn lÇn 1<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
H×nh 7. TÕ bµo sau 48 giê cÊy<br />
H×nh 8. TÕ bµo sau 48 giê ®−îc cÊy chuyÒn lÇn 2 (X20)<br />
chuyÒn lÇn 1<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
H×nh 9. TÕ bµo sau 48 giê ®−îc cÊy chuyÒn lÇn 2 (X10)<br />
89<br />
c. Ph−¬ng ph¸p cÊy chuyÒn §iÒu nµy chøng tá, sau khi ®−îc nu«i cÊy<br />
trong m«i tr−êng DMEM 10% FBS vµ cÊy<br />
MÉu m« ®−îc nu«i sau 5 ngµy, g¾p bá m¶nh<br />
chuyÒn nhiÒu lÇn, tÕ bµo thu ®−îc lµ nguyªn bµo<br />
m« vµ bæ sung m«i tr−êng. Quan s¸t sù ph¸t<br />
sîi.<br />
triÓn cña nguyªn bµo sîi, khi thÊy tÕ bµo lan hÕt<br />
mÆt ®Üa th× tiÕn hµnh cÊy chuyÒn. Môc tiªu ®Æt ra lµ nu«i cÊy thµnh c«ng<br />
nguyªn bµo sîi tõ mÉu tai bß rõng. Trong quÇn<br />
Hót bá hÕt m«i tr−êng cò ra, bæ sung vµo<br />
thÓ tÕ bµo thu ®−îc sau khi ®· cÊy chuyÓn 5 lÇn:<br />
200 µl trypsin/EDTA 0,25%; l¾c nhÑ ®Üa ®Ó tÕ<br />
bµo t¸ch khái mÆt ®Üa; quan s¸t d−íi kÝnh hiÓn - Chñ yÕu lµ nguyªn bµo sîi ®iÓn h×nh: cã<br />
vi, khi thÊy tÕ bµo bung ra hÕt th× bæ sung thªm h×nh thoi, h×nh sao.<br />
200 µl m«i tr−êng DMEM 10% FBS ®Ó bÊt ho¹t - Cã sù sinh s¶n víi ph©n bµo ®iÓn h×nh.<br />
trypsin. Nh− vËy, quÈn thÓ nguyªn bµo sîi thu ®−îc<br />
Hót 200 µl huyÒn phï tÕ bµo vµo ®Üa 4 giÕng chøng tá ®· nu«i cÊy thµnh c«ng tÕ bµo sinh<br />
míi vµ bæ sung thªm 200 µl m«i tr−êng DMEM d−ìng cña bß rõng trong m«i tr−êng DMEM<br />
10% FBS. TiÕp tôc nu«i trong tñ Êm 5% CO2. 10% FBS ®Ó thu nhËn sè l−îng lín tÕ bµo nh»m<br />
Sau mçi 24 giê, kiÓm tra vµ ghi nhËn h×nh ¶nh. b¶o tån nguån gien ë cÊp ®é tÕ bµo, t¹o nguyªn<br />
liÖu cho nh÷ng nghiªn cøu s©u h¬n nh− chuyÓn<br />
II. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN nh©n, t¹o dßng v« tÝnh….<br />
<br />
1. KÕt qu¶ nu«i cÊy s¬ cÊp mÉu m« da tai bß TµI LIÖU THAM KH¶O<br />
rõng<br />
Khi ®−îc nu«i nguyªn ph¸t tõ m¶nh m«, c¸c 1. Bé Khoa häc, C«ng nghÖ vµ M«i tr−êng,<br />
nguyªn bµo sîi t¨ng sinh rÊt nhanh, di c− ra 2000: S¸ch §á ViÖt Nam, phÇn I: ®éng vËt.<br />
khái mÉu m« ban ®Çu vµ ph¸t triÓn rÊt tèt sau Nxb. Khoa häc vµ Kü thuËt, Hµ Néi.<br />
khi g¾p bá m¶nh m« ra khái m«i tr−êng nu«i 2. IUCN, 2004: Red List of Threatened<br />
cÊy. Species.<br />
Cã thÓ quan s¸t ®−îc rÊt nhiÒu tÕ bµo ph©n 3. ChÝnh phñ n−íc CHXHCN ViÖt Nam,<br />
chia trong ®Üa nu«i víi nhiÒu h×nh d¹ng kh¸c 2002: NghÞ §Þnh 48/2002/N§-CP vÒ söa<br />
nhau; sau 4 ngµy, tÕ bµo mäc lan ra vµ sau 10 ®æi, bæ sung danh môc thùc vËt, ®éng vËt<br />
ngµy, tÕ bµo lan hÕt bÒ mÆt ®Üa 4 giÕng vµ cã thÓ hoang d· qóy hiÕm ban hµnh kÌm theo N§<br />
tiÕn hµnh cÊy chuyÒn ra ®Üa 4 giÕng míi. 18/H§BT ngµy 17/1/2002 cña Héi ®ång Bé<br />
2. KÕt qu¶ sau khi cÊy chuyÒn lÇn 1 tr−ëng.<br />
Sau khi ®−îc cÊy chuyÒn lÇn 1, c¸c tÕ bµo 4. Fresney I. R., 1984: Culture of animal<br />
tiÕp tôc ph©n chia vµ ph¸t triÓn m¹nh trong m«i cells: A manual of basic technique. Aln R.<br />
tr−êng nu«i cÊy. Sau 6 ngµy, tÕ bµo mäc lan hÕt Liss, Inc., New York.<br />
bÒ mÆt cña ®Üa 4 giÕng vµ ®¹t mËt ®é cÊy 5. NguyÔn Phan Xu©n Lý, 2006: LuËn v¨n<br />
chuyÒn qua ®Üa míi. th¹c sÜ “ThiÕt lËp quy tr×nh nu«i nguyªn bµo<br />
Khi nu«i cÊy in vitro, c¸c tÕ bµo b¸m trªn bÒ sîi tõ da quy ®Çu ng−êi”. Tr−êng §¹i häc<br />
mÆt cña ®Üa ®a phÇn cã h×nh sao hoÆc h×nh thoi, Khoa häc tù nhiªn, §HQG thµnh phè Hå<br />
cã nh©n to h×nh cÇu. ChÝ Minh.<br />
TiÕp tôc cÊy chuyÒn khi tÕ bµo mäc lan ra 6. Lª V¨n Ty vµ cs., 2003: T¹p chÝ C«ng nghÖ<br />
h¬n 80% diÖn tÝch cña ®Üa nu«i. sinh häc, 25(2): 1-6. Hµ Néi.<br />
3. KÕt qu¶ sau khi cÊy chuyÒn lÇn 2 7. Lª V¨n Ty vµ cs., 2003: Nh©n nu«i, b¶o<br />
Sau khi cÊy chuyÒn lÇn 2, nguyªn bµo sîi qu¶n ®«ng l¹nh tÕ bµo, t¹o ph«i b»ng kü<br />
vÉn tiÕp tôc ph©n chia vµ lan hÕt bÒ mÆt cña ®Üa thuËt cÊy nh©n nh»m b¶o vÖ ®a d¹ng sinh<br />
nu«i sau 6 ngµy. häc loµi bß tãt: 712-716. Héi nghÞ C«ng<br />
nghÖ sinh häc toµn quèc. Nxb. Khoa häc vµ<br />
H×nh d¹ng cña tÕ bµo cã h×nh sao hoÆc thoi, Kü thuËt, Hµ Néi.<br />
cã nh©n to h×nh cÇu.<br />
90<br />
Collect and culture of bull somatic cell Bos javanicus<br />
(Wagrer, 1844) for gene conservation<br />
<br />
Hoang nghia son, le van ty<br />
<br />
<br />
Summary<br />
<br />
Vietnam is a tropical country which has plentiful animals and plants, especially wide animals. Many<br />
animal species were listed in the Red Data Book of Vietnam (2000). However, many animal species were<br />
illegally hunted for aesthetic and economic purposes, for example bull.<br />
According to some points of view, bull somatic cells had the ability to develop in the DMEM added<br />
serum; besides, in our lab conditions, we have collected and cultured bull somatic cells to gene conservation<br />
for the making of materials for cloning later.<br />
Study results showed that bull somatic cells grew well in the DMEM medium added 10% FBS and we<br />
have collected a large number of typical firoblasts.<br />
<br />
<br />
Ngµy nhËn bµi: 1-9-2007<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
91<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
