Luận án Tiến sĩ Y học: Tính kháng thuốc oseltamivir của virut cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

-----------------*-------------------

HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG

TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR

CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH

TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

HÀ NỘI – 2014

ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

-----------------*-------------------

HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG

TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR

CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH

TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012

Chuyên ngành: Vi sinh Y học

Mã số : 62.72.01.15

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. GS.TS. Đặng Đức Anh

2. PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai

HÀ NỘI – 2014

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong

bất kỳ công trình nào khác.

NGHIÊN CỨU SINH

Hoàng Vũ Mai Phương

iv

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn:

 Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương.

 Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ

Trung Ương.

Đã tạo điều khiện tốt nhất, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến GS.TS Đặng Đức Anh, người đã tạo điều kiện

cho tôi đến với chuyên ngành vi rút, cho tôi những lời khuyên hữu ích, sự động viên và

lòng nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi

lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai, người đã tận tình dìu dắt giúp

đỡ tôi từ những ngày đầu tiên bước chân vào lĩnh vực vi rút học, truyền đạt những

kinh nghiệm quý báu và luôn khuyến khích tôi bước về phía trước, tiếp cận với những

kiến thức nâng cao và mở rộng để tôi có thể hoàn thành luận văn này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Ths Nguyễn Cơ

Thạch, Ths Lê Thị Thanh, CN Phạm Thị Hiền cùng các bạn đồng nghiệp công tác

tại Phòng thí nghiệm Cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương đã

nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ của Trung tâm Cúm thuộc Viện sức

khỏe Hàn Quốc (KNIH )trong suốt quá trình nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Mendi Jamsran, TS Aeron Hurt, chuyên viên

của Tổ chức Y tế Thế giới, cho những hỗ trợ kỹ thuật ban đầu của nghiên cứu.

Tôi xin gửi tặng Gia đình, bạn bè và những người thân trong gia đình đã hết

lòng giúp đỡ, động viên tôi trên con đường sự nghiệp khoa học để tôi đạt được thành

quả ngày hôm nay.

Hà nội, ngày 22 tháng 10 năm 2013

HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG

v

MỤC LỤC

Trang phụ bìa .................................................................................................... i

Lời cam đoan ..................................................................................................... ii

Lời cảm ơn......................................................................................................... iii

Mục lục .............................................................................................................. iv

Chữ viết tắt ........................................................................................................ vii

Danh mục bảng ................................................................................................. viii

Danh mục hình, biểu đồ, sơ đồ ......................................................................... ix

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................... 1

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN ............................................................................ 4

1.1. Vi rút cúm A ............................................................................................... 4

1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A ................................................. 4

1.1.2. Cơ chế nhân lên của vi rút cúm A .............................................................. 11

1.1.3. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A ...................... 13

1.1.4. Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A ............................... 15

1.1.5. Khả năng gây bệnh của vi rút cúm ............................................................. 16

1.1.6. Tiến hóa của vi rút cúm A ......................................................................... 17

1.2. Phòng và điều trị cúm A ............................................................................ 18

1.2.1. Văc xin phòng cúm ................................................................................... 18

1.2.2. Thuốc điều trị vi rút cúm A ....................................................................... 20

1.2.3. Các thuốc kháng vi rút mới ....................................................................... 23

1.3. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút ............ 25

1.3.1. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine ..................... 25

1.3.2. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir...................... 26

1.4. Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A ...... 27

vi

1.4.1. Nguyên nhân của hiện tượng kháng thuốc ................................................. 27

1.4.2. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự

thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm ........................................................... 28

1.4.3. Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của

neuraminidase ..................................................................................................... 32

1.4.4. Giám sát sự kháng thuốc vi rút cúm........................................................... 34

CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 37

2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 37

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 37

2.3. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm ................................................................. 38

2.3.1. Vật liệu ..................................................................................................... 38

2.3.2. Kỹ thuật xét nghiệm .................................................................................. 42

2.4. Phân tích số liệu.......................................................................................... 51

CHƯƠNG III – KẾT QUẢ ............................................................................... 53

3.1. Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 – 2012 ............................ 53

3.2. Xác định giá trị IC50 ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A .......................... 54

3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A ....................................... 60

3.4. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng cúm A liên quan đến kháng

thuốc oseltamivir .............................................................................................. 65

3.5. Tỉ lệ các chủng vi rút cúm A kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam,

2001-2012 .......................................................................................................... 69

3.6. Sự tương đồng về gen HA và NA giữa các vi rút cúm A có biểu hiện giảm độ

nhạy oseltamivir với các vi rút cùng phân típ lưu hành trong giai đoạn

nghiên cứu .......................................................................................................... 72

vii

CHƯƠNG IV – BÀN LUẬN............................................................................. 86

4.1. Sự lưu hành của các vi rút cúm A trong khoảng thời gian nghiên cứu .......... 86

4.2. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông

qua giá trị ức chế 50% (IC50) ............................................................................... 88

4.3. Sự liên quan của các đột biến trên gen NAvới quá trình kháng thuốc

oseltamivir của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam ..................... 94

4.4. Sự liên quan về mặt di truyền học của các chủng vi rút A mang gen đột biến

và các vi rút cúm A lưu hành cùng thời gian. ...................................................... 98

KẾT LUẬN ....................................................................................................... 101

KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 103

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

viii

CHỮ VIẾT TẮT

ABI Applied Biosystems

Association of Public Health Laboratories APHL (Tổ chức của các PTN trong hệ thống Y tế Cộng đồng)

ATSH An Toàn Sinh Học

DNA Deoxiribonucleic Acid

Global Influenza Surveillance and Response System GISRS (Hệ thống phản ứng và giám sát cúm toàn cầu)

Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50% vi rút) IC50

IQR Interquartile Range (Khoảng liên tứ phân vị)

International Society for Influenza and other Respiratory

Virus Diseases – Antiviral Group (Hiệp hội quốc tế về ISIRV-AVG cúm và các vi rút gây bệnh đường hô hấp khác – Nhóm

nghiên cứu thuốc kháng vi rút)

Kb Kilobase

NAI Neuraminidase Inhibition (Ức chế neuraminidase)

National Institute of Infectious Diseases - Japan NIID (Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia – Nhật Bản)

PCR Polymerase Chain Reaction

pdm Pandemic

PTN Phòng Thí Nghiệm

RNA Ribonucleic Acid

RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction

SOP Standard Operating Procedure (Quy trình chuẩn)

TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới

United States- Centers for Disease Control and Prevention US-CDC (Trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ)

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

ix

DANH MỤC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

6 1.1. Các phân đoạn gen của vi rút cúm A ............................................................

3.1. Phân bố theo năm các phân típ virut cúm A sử dụng trong nghiên cứu .........53

3.2. Giá trị trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu

và giá trị IC50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn ................................ 56

3.3. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và

2009 .............................................................................................................60

3.4. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm

2009 và 2011 ................................................................................................61

3.5. Giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 từ năm 2003 đến 2012 ...........................62

3.6. Giá trị IC50 của các chủng A/H5N1 năm 2005 và 2008 ................................62

3.7. Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với

oseltamivir................................................................................................64

3.8. Mức độ giảm nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir và các điểm

đột biến ........................................................................................................70

3.9. Tỉ lệ kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A trong nghiên cứu

dựa trên hai phương pháp (ức chế neuraminidase và giải trình tự gen) ..........71

x

DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

Hình Tên hình Trang

4 1.1. Cấu trúc vi rút cúm .......................................................................................

4 1.2. Hình ảnh vi rút cúm ......................................................................................

1.3. Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm ...........10

1.4. Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm ....................................................10

1.5. Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút ...........12

1.6. Cấu trúc và cơ chế tác dụng của amantadine và rimantadine ........................21

1.7. Cấu trúc của oseltamivir và zanamivir ..........................................................22

1.8. Cơ chế hoạt động của neuraminidase và chất ức chế neuraminidase

trong quá trình giải phóng vi-rút ra khỏi tế bào .............................................23

2.1. Thang chỉ thị phân tử chuẩn 1 kb Invitrogen ................................................50

3.1. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1 .............66

3.2. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm

A/H1N1pdm09 .............................................................................................67

3.3. Đột biến tại vị trí 117 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1 ..............68

3.4. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1 ..............69

3.5. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 ..............................74

3.6. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N1 –

nhóm 2, 2001-2009 .......................................................................................75

3.7. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 ..............................76

3.8. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm A/H1N1- nhóm

2, 2001-2009 ................................................................................................77

3.9. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1pdm09 ................................79

3.10. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1pdm09 ................................80

3.11. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 .................................................83

xi

3.12. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 1 ................................84

3.13. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 2.3.4 ...............................84

Sơ đồ Tên sơ đồ Trang

2.1. Quá trình phân lập vi rút cúm ................................................................ 43 2.2. Quá trình xác định giá trị ức chế 50% của oseltamivir với vi rút cúm ..........45

Biểu đồ Tên biểu đồ Trang

3.1. Sự phân bố giá trị IC50 của toàn bộ các chủng cúm A, 2001-2012 .................55

3.2. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 trong nghiên

57 cứu ...............................................................................................................

3.3. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 trong

nghiên cứu ................................................................................................ 58

3.4. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 trong nghiên

cứu ...............................................................................................................58

3.5. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng H5N1 trong nghiên

59 cứu ...............................................................................................................

4.1. Sự lưu hành vi rút cúm tại Việt Nam 2006 – 2012 ........................................86

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh truyền nhiễm trong thế kỷ XX và những năm đầu của thế kỷ XXI vẫn

đang là một thách thức lớn với các nhà khoa học trong ngành y học dự phòng ở

Việt Nam. Nếu như trước đây, bệnh truyền nhiễm có nguyên nhân chủ yếu từ vi

khuẩn thì hiện nay căn nguyên vi rút lại là nguyên nhân chính gây ra những vụ

dịch nguy hiểm, đe dọa tới sức khoẻ cũng như tính mạng của con người. Các vụ

dịch điển hình xảy ra gần đây như dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông năm 1998,

dịch SARS năm 2003, dịch cúm A/H1N1 năm 2009, A/H7N9 năm 2013. Bệnh

cúm tại Việt Nam, theo thống kê của viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương trong quá

trình giám sát các ca nhiễm cúm phối hợp với trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa

Kỳ (US-CDC), số người mắc cúm có xu hướng tăng lên từ 19,1% năm 2007, lên

21% năm 2008, 26,1% năm 2009 (Hệ thống giám sát cúm Quốc gia-NISS), đặc

biệt đã có những trường hợp tử vong do nhiễm cúm gia cầm có độc lực cao.

Các phương pháp áp dụng trong điều trị và phòng chống nhiễm vi rút cúm là

tiêm văc xin và sử dụng thuốc điều trị đặc hiệu. Tuy nhiên, văc xin cúm đang lưu

hành là văc xin cúm theo mùa, chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm trước vụ dịch

cúm. Hơn nữa, muốn đạt hiệu quả cao, chủng cúm trong thành phần văc xin phải

có sự tương đồng kháng nguyên với chủng cúm lưu hành. Ngoài ra, đáp ứng miễn

dịch khi tiêm văc xin cúm còn phụ thuộc vào cơ địa của từng cá thể và loại văc xin

sử dụng (văc xin cúm bất hoạt truyền thống, văc xin cúm bán phần (split

vaccine)…). Do vậy, hiện tại sử dụng thuốc kháng vi rút đặc hiệu (amantadine,

oseltamivir...) là phương pháp hữu hiệu trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút

cúm, đặc biệt là vi rút cúm A/H5N1. Tuy nhiên, sự tương tác của thuốc với vi rút

có thể gây ra thay đổi trong vật liệu di truyền của vi rút mà một trong những hệ

quả là xuất hiện vi rút kháng thuốc ở thế hệ sau. Hiện tượng kháng thuốc có thể

ảnh hưởng đến quá trình điều trị của bệnh nhân: thời gian điều trị kéo dài, khả

năng hồi phục sau điều trị chậm và tăng khả năng lây truyền chủng vi rút cúm

kháng thuốc ra cộng đồng, làm tăng thêm gánh nặng bệnh tật cho bản thân bệnh

nhân và xã hội [28, 81, 90, 121].

Việc tìm hiểu khả năng kháng thuốc, mức độ tiến hoá của vi rút có ý nghĩa lớn

cho việc điều chỉnh phác đồ điều trị, phối hợp thuốc, hạn chế ảnh hưởng và lan

2

truyền của hiện tượng kháng thuốc trong quần thể. Đặc tính kháng thuốc cũng như

mức độ tiến hoá của vi rút đã được tiến hành tại nhiều phòng thí nghiệm (PTN)

trên thế giới như Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan.... Các nghiên cứu tập

trung vào việc phát hiện, giám sát và theo dõi các trường hợp kháng thuốc đơn lẻ

hoặc theo nhóm, tìm hiểu các đột biến trên gen có liên quan đến khả năng kháng

thuốc của vi rút cúm trên người và trên gia cầm [8,11,12,26,51]. Số liệu từ các

nước Châu Âu, Úc, Mỹ và các nước khu vực Đông Nam Á cho thấy vi rút A/H1N1

lưu hành trước năm 2007 có tỉ lệ kháng oseltamivir thấp (0,3-2,2%), từ 2007 đến

2009 tỉ lệ kháng tăng dần (23% năm 2007, 43-60% năm 2008 và 95% năm 2009)

[27, 66, 110]; các vi rút A/H3N2 được xác định kháng hoàn toàn (100%) với

amantadine.

Tại Việt Nam, quá trình này đã được thực hiện bước đầu từ năm 2005 dựa trên

chương trình Giám sát Cúm Quốc gia và đơn vị nghiên cứu lâm sàng trường đại

học Oxford thuộc bệnh viện Bệnh nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh [18,36,37].

Tại phòng thí nghiệm Cúm - viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, những trường hợp

nhiễm vi rút cúm có mang gen kháng thuốc đơn lẻ đã được xác định từ những năm

2001 [56, 58, 60]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi rút cúm kháng thuốc mới chỉ

hoàn thành ở mức độ ca bệnh riêng lẻ hoặc theo dõi một chùm ca bệnh, chưa có

nghiên cứu hệ thống theo dõi quá trình kháng thuốc và sự tiến hoá theo thời gian

của chủng vi rút cúm A mang gen kháng thuốc.

Để tìm hiểu hiện tượng kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm về sự lưu hành,

tần suất, mức độ và khả năng lây truyền của vi rút cúm theo thời gian, cần có một

nghiên cứu hệ thống trên cơ sở giám sát và xác định cơ chế kháng với từng loại

thuốc của vi rút cúm A. Với những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài nghiên

cứu “Tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt

Nam, 2001 – 2012” với mục tiêu:

- Xác định nồng độ ngưỡng của oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC50) vi

rút cúm A tại miền Bắc Việt Nam.

- Xác định mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với

oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50).

3

- Đánh giá sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy

cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu

vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012.

4

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN

1.1. Vi rút cúm A

1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A

Cấu tạo chung

Vi rút cúm thuộc họ

Orthomyxoviridae gồm 3 típ A, B

và C, trong đó típ A và B thường

gây thành dịch, típ C gây bệnh

nhẹ và không lan thành dịch. Hệ

gen của vi rút cúm A là Axit

Ribonucleic (RNA) đơn âm, chia

8 phân đoạn mã hoá cho 11

protein. Về mặt cấu trúc,

nucleocapsid được bao bọc bởi Hình 1.1. Cấu trúc vi rút cúm màng protein nền (M1), phía ngoài Nguồn: http://viralzone.expasy.org/

màng lại được bao bọc bởi vỏ ngoài là

lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng

sinh chất của tế bào chủ. Protein M2

đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài,

tạo thành các kênh ion, làm cho pH

trong endosome thay đổi, có vai trò

quan trọng trong việc hình thành hạt Hình 1.2. Hình ảnh vi rút cúm

vi rút mới. Trên phần vỏ có 2 loại Nguồn: www.nature.com

glycoprotein xuyên màng là heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA).

Heamagglutinin có cấu trúc hình trụ, được cấu tạo bởi hai phân tử riêng biệt HA1

và HA2 nối với nhau bằng cầu disulphua, các phân tử trên HA gắn vào màng lipid

bằng đầu kỵ nước. Glycoprotein quan trọng thứ hai trên bề mặt vi rút cúm là

neuraminidase (NA). Cấu trúc NA có dạng hình nấm, các phân tử NA ở phần thân

gắn với lớp màng qua các đầu kỵ nước. Phần lõi của vi rút bao gồm các phức hợp

5

ribonucleoprotein: các polymerase protein PB1 (polymerase basic 1), PB2

(polymerase basic 2) và PA (polymerase acidic); NP (nucleoprotein).

Nucleoprotein gắn với các đoạn RNA của vi rút tạo thành nucleocapsid. Tồn tại

trong thành phần của vi rút cúm còn có các RNA-RNA polymerase PB1, PB2, PA

và các protein không cấu trúc NS (non structure).

Cấu trúc hệ gen và các protein tương ứng của vi rút cúm A

Hệ gen của vi rút cúm A

Vi rút cúm A có 8 phân đoạn gen, mã hóa cho 11 protein. Các gen của vi rút

cúm được đánh số theo độ dài nucleotide giảm dần (Bảng 1). Đoạn RNA 1, 3, 4, 5

và 6 chỉ mã hóa cho một protein tương ứng là PB2, PA, HA, NP và NA. Mỗi phân

đoạn 2, 7 và 8 mã hóa cho 2 protein tương ứng là PB1-PB1F2, M1-M2 và NS1-

NS2. Tại hai đầu mỗi phân đoạn gen có trình tự nucleotide bảo tồn gồm 13

nucleotide ở đầu 5' (5'-AGUAGAAACAAGG) và 12 nucleotide ở đầu 3'

(3'UCGUUUUCGUCC), trừ phân đoạn gen 1, 2, 3 và 7 nucleotide thứ 4 C thay

cho U [47]. Trình tự nucleotide này đặc trưng riêng cho vi rút cúm mà không tồn

tại ở các vi rút các, có ý nghĩa lớn trong việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử

phân tích trình tự gen của vi rút.

Cấu trúc và chức năng của các protein của vi rút

Heamagglutinin (HA): Heamagglutinin là protein trên bề mặt của vi rút được mã

hóa bởi đoạn RNA số 4, có chức năng bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và

khởi đầu sự xâm nhập của vi rút cúm vào cơ thể. Protein HA được tổng hợp ở dạng

tiền thân là một chuỗi polypeptide HA0. Dưới điều kiện pH axit và các enzyme

phân tách protein dạng trypsin và furin, HA0 phân tách ra hai phần: HA1 và HA2,

kết với nhau qua cầu nối di-sulphua [19]. Phần đầu chỏm của HA1 tại các vị trí xác

định (106, 203, 222) có khả năng gắn với thụ thể axit sialic trên màng tế bào cảm

nhiễm.

6

Bảng 1.1. Các phân đoạn gen của vi rút cúm A

Chức năng Đoạn RNA Chiều dài đoạn gen (Nucleotide) Protein được mã hóa Chiều dài protein được mã hóa (Axit amin)

2341 PB2 759 Polymerase khởi đầu phiên mã 1

PB1 757 Kéo dài phiên mã, hoạt hóa enzyme nội bào

2341 2

PB1-F2 87 Thúc đẩy quá trình chết của tế bào chủ

2233 PA 716 Kéo dài phiên mã 3

1778 HA 550 4 Ngưng kết hồng cầu, bám gắn xâm nhập vào tế bào chủ

1565 NP 498 5 Bám gắn với RNA, điều khiển quá trình nhân lên của vi rút.

1413 NA 454 6 Giải phóng vi rút khỏi tế bảo chủ

M1 252 Protein nền: Thành phần chính của vi rút.

7 1027

M2 97 Kênh ion, cởi áo và lắp ráp thành phần vi rút

NS1 230 Protein đối kháng interferon, điều khiển dấu ấn của vi rút trên tế bào chủ 8 890

NS2 121 Chuyển RNA vi rút từ nhân ra tế bào chất (trong tế bào chủ)

7

Trên bề mặt tế bào biểu mô đường hô hấp của người, HA gắn vào thụ thể α2,6 axit

sialic; đối với gia cầm, HA gắn vào thụ thể α2,3 axit sialic; trên tế bào của lợn có

mang cả hai loại thụ thể α2,3 axit sialic và α2,6 axit sialic. Ngoài ra, HA gắn vào

thụ thể trên bề mặt tế bào hồng cầu người nhóm máu O, hồng cầu chuột lang, hồng

cầu ngỗng, hoặc gà tây gây nên hiện tượng ngưng kết hồng cầu [118]. Năm vị trí

quyết định kháng nguyên khác cũng đã được xác định trên protein HA1, tương tác

với kháng thể của vật chủ. Các thay đổi có liên quan đến thay đổi đặc tính kháng

nguyên xảy ra chủ yếu trên phần HA1, do vậy, HA1 được sử dụng để tìm hiểu đặc

tính kháng nguyên và tiến hóa của vi rút.

Neuraminidase (NA): Protein bề mặt thứ hai có chức năng là một enzyme,

neuraminidase, được mã hóa bởi phân đoạn gen thứ 6. Neuraminidase sau khi được

phiên mã, protein có dạng hình nấm bao gồm 4 chuỗi polypeptide. NA xúc tác cho

quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic phá hủy thụ thể HA trên bề

mặt tế bào, tạo điều kiện cho sự giải phóng vi rút mới ra khỏi tế bào chủ. Việc loại

bỏ phần axit sialic khỏi phần HA mới được tổng hợp còn có tác dụng tránh sự tự

ngưng kết giữa các hạt vi rút mới sau khi được giải phóng ra khỏi tế bào, đảm bảo

vi rút mới sau khi được giải phóng có khả năng gây nhiễm. Neuraminidase cũng

đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi rút cúm. Sự hoạt động của

neuraminidase làm tăng hoạt động của các cytokine, thúc đẩy nhanh quá trình chết

của tế bào chủ. Ngoài ra, các nhà khoa học đã chứng minh được vi khuẩn gây nhiễm

trùng thứ phát như viêm phổi đặc biệt nguy hiểm cho các bệnh nhân có bệnh mạn

tính, trẻ nhỏ, người già và phụ nữ có thai, có quan hệ chặt chẽ với những hoạt động

của neuraminidase như nhiễm Streptococcus pneumonia, có thể làm quá trình viêm

nhiễm đường hô hấp trầm trọng hơn [122].

Vi rút cúm A được chia thành các phân típ dựa trên hai kháng nguyên bề mặt

heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) của vi rút. Sử dụng HA để xác định

phân nhóm của vi rút cúm A, các nhà khoa học đã xác định được 17 loại

hemagglutinin khác nhau, trong đó H17 được xác định từ vi rút phân lập từ dơi

8

[105]. Các phân típ NA chủ yếu gây bệnh trên người là N1 (H1N1, H5N1, H1N1

đại dịch), N2 (H3N2, H9N2) và gần đây là N9 (H7N9).

Dựa vào sự khác nhau về axit amin tại vùng đầu phía ngoài, neuraminidase của vi

rút cúm được chia làm 2 nhóm riêng biệt [109]:

 Nhóm 1 gồm N1, N4, N5 và N8

 Nhóm 2 gồm N2, N3, N6, N7 và N9.

Sự thay đổi axit amin tại vị trí 147-152 đã tạo nên vùng khác biệt về hình khối nằm

ngay cạnh vị trí hoạt động của N1 mà không xảy ra trên N2. Vùng khác biệt này có

thể được coi là vùng đích của thuốc kháng vi rút trong tương lai.

Thuốc kháng vi rút oseltaminvir, zanamivir gắn vào NA, ức chế khả năng giải

phóng của vi rút cúm dựa trên hiểu biết về hoạt động của neuraminidase, xúc tác

quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic giữa axit sialic và thụ thể

HA. Tuy nhiên, các đột biến về axit amin trên phân đoạn gen mã hóa NA tại các vị

trí bám gắn với thuốc là nguyên nhân của sự kháng thuốc của vi rút, cụ thể với N1

tại vị trí I117V, I222K, S246N, H275Y và N294S; với N2 tại các vị trí E119V,

Q136K, R292K và N294S.

Protein màng (M-matrix): Đoạn RNA số 7 được coi là gen có tính bảo tồn cao,

mã hóa cho hai protein M1 và M2. Protein M1 được mã hóa từ nucleotide vị tí 26

đến 784, protein M2 được tổng hợp qua quá trình ghép nối từ nucleotide vị trí 26-

51 và từ 740-1007 [19, 65]. Protein M1 là protein nền (matrix) nằm ngay dưới lớp

vỏ của vi rút, làm cầu nối giữa các thành phần bên trong và các protein bề mặt của

vi rút, có vai trò quan trọng trong việc lắp ráp các thành phần để tạo nên hạt vi rút,

tạo điều kiện cho vi rút nảy chồi. M2 là một protein xuyên màng, phần ngoài tương

tác với hệ miễn dịch của vật chủ [54] và phần xuyên màng hoạt động như một kênh ion có trách nhiệm bơm ion H+ từ nội bào vào trong vi rút, phá vỡ mối liên kết

protein-protein trên protein nền M1 với RNP, giải phóng các RNP của vi rút vào

trong nội bào của tế bào cảm nhiễm [3] [22, 56, 57].

9

Amantadine gắn vào kênh ion xuyên màng, ngăn chăn sự “cởi áo” này. Tuy

nhiên, những thay đổi axit amin tại vị trí bám gắn 26, 27, 30, 31 và 34 trên kênh ion

với amantadine đã tạo ra sự kháng thuốc của vi rút (vị trí gắn kết V27A Valin

chuyển sang Alanin, A30T Alanin sang Threonin, S31N Serin sang Asparagin và

G34E Glycin sang Axit Glutamic), trong đó vị trí 31 chuyển từ Serin sang

Asparagin là vị trí có tần suất xuất hiện nhiều [47, 52]. Hiện tượng kháng

amantadine xảy ra phổ biến trên gen M của vi rút cúm A/H3N2, ít gặp ở các chủng

cúm A/H1N1, tuy nhiên khi chủng cúm A/H1N1pdm09 xuất hiện thì hầu hết gen

M, do hiện tượng trao đổi và tích hợp gen, mang gen M của chủng vi rút cúm lợn Á

Âu có đột biến kháng thuốc amantadine tại vị trí 31 (S31N) [18, 53].

Các polymerase PB1, PB2 và PA: Tồn tại trong hệ gen của vi rút cúm có các

phân đoạn gen 1, 2 và 3 chịu trách nhiệm tạo ra các RNA-RNA polymerase. Phức

hợp PA-PB1-PB2 ở trong nhân tế bào cảm nhiễm có nhiệm vụ khởi đầu và kích

hoạt quá trình tổng hợp mRNA của vi rút [15] (hình 1.3 và hình 1.4). Trong quá

trình hoạt động của vi rút cúm, đột biến xảy ra trên phân đoạn gen mã hóa PB2 có

liên quan đến khả năng thích nghi của vi rút [56, 99], đặc biệt với vi rút cúm gia

cầm H5N1. Đột biến E627K (Glutamin chuyển thành Lysin) trên PB2 của vi rút

cúm gia cầm làm tăng khả năng thích nghi với điều kiện sống của vi rút trên vật chủ mới - người (vi rút tồn tại và nhân lên trên gia cầm tại nhiết độ tối ưu là 37oC, khi

mang gen đột biến, vi rút có khả năng thích nghi và phát triển được trên tế bào đường hô hấp trên của người – với nhiệt độ tối ưu là 33oC) [99]. Đột biến này đã

được xác định trên gen PB2 của chủng cúm gia cầm mới xuất hiện A/H7N9 [62,

63]. Một protein có kích thước nhỏ PB1-F2 (87 axit amin) có chức năng thúc đẩy

quá trình chết của tế bào chủ mà không tìm thấy dạng tương tự trong hệ gen của vi

rút cúm B và C [65, 122].

Nucleoprotein (NP): NP được mã hóa bởi phân đoạn thứ 5 trong bộ gen của vi

rút cúm có tính bảo tồn cao đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên, tạo

thành hạt vi rút mới [43]. Chức năng chủ yếu của NP là tham gia vào quá trình tổng

hợp RNA của vi rút và quá trình tạo thành hạt vi rút mới. Ngoài ra, NP tương tác

10

với và các protein PB1 và PB2 nhưng không xảy ra với protein PA [85]. Các

enzyme này khi hoạt hóa sẽ tham gia vào quá trình nhân lên và phiên mã RNA của

vi rút cúm đồng thời hoạt động như một nuclease nội bào có liên hệ với

ribonucleoprotein (RNP).

Hình 1.3. Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm

Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2937865/

Hình 1.4. Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm

Nguồn: Paul Digard, Dept. Pathology, University of Cambridge.

Protein không cấu trúc (NS1-NS2): NS1 và NS2 được mã hóa bởi đoạn RNA

số 8. Phần NS1 có chức năng cản trở sự di chuyển của mRNA tế bào từ nhân ra tế

bào chất tạo điều kiện cho RNA của vi rút được phiên mã ở ribosome của tế bào

chủ. Ngoài ra, NS1 còn được cho là tham gia vào ức chế quá trình sản xuất

interferon, chất có khả năng làm giảm sự nhân lên của vi rút cúm, của tế bào chủ.

Phần NS2 của protein không cấu trúc này được tổng hợp sau NS1 và được biết với

chức năng tạo thuận lợi cho việc vận chuyển các RNP mới được tổng hợp từ nhân

ra tế bào chất tăng cường cho quá trình nhân lên của vi rút [43, 118, 122].

11

1.1.2. Cơ chế nhân lên của vi rút cúm A

Sự bám dính của vi rút

Vi rút cúm bám vào tế bào biểu mô đường hô hấp bằng cách dùng

heamagglutinin gắn vào phần axit sialic của glucoprotein và glucolipid trên bề mặt

tế bào. Tùy vào tế bào chủ là tế bào biểu mô đường hô hấp của người hay gia cầm

mà vi rút cúm có thể sử dụng phần α2,3 hay α2,6 axit sialic trong protein HA để

bám dính vào thụ cảm thể của tế bào chủ. Ngay khi quá trình bám dính hoàn thành,

vi rút tiếp tục ngay quá trình thâm nhập vào tế bào chủ.

Sự thâm nhập của vi rút

Vi rút tiến vào tế bào chủ bằng quá trình thực bào, toàn bộ vi rút được bao bọc

bởi màng tế bào chủ và đưa vào trong tế bào chất của tế bào chủ qua thể thực bào

trong điều kiện pH thấp.

Sự cởi áo của vi rút

Sự hoạt động của protein M2 chấm dứt tình trạng pH thấp trong thể thực bào,

đồng thời làm tăng cường sự hòa màng từng phần của protein HA trên màng sinh

chất với màng của thể thực bào. Dòng ion từ nội bào tràn vào hạt vi rút dẫn đến sự

mất liên kết giữa các protein của vi rút, khiến cho các RNP vi rút thoát khỏi sự kiểm

soát của vỏ vi rút (vi rút cởi áo). Khi quá trình hòa màng đã hoàn thành, các RNP

được giải phóng vào tế bào chất của tế bào chủ.

Sự tổng hợp RNA, các protein và sự giải phóng của vi rút

Khác với các vi rút mang RNA sợi đơn âm, RNA của vi rút cúm được tổng hợp

và nhân lên tại nhân tế bào. Các RNP được chuyển vào nhân tế bào, phức hợp

polymerase gắn vào RNA của vi rút, đồng thời cắt mRNA của tế bào chủ bằng hoạt

động của nuclease nội bào. Nuclease nội bào của vi rút cắt đầu 5’ đã được gắn mũ

và metyl hóa của mRNA của tế bào chủ với độ dài khoảng 13 đến 15 ba-zơ và dùng

đoạn này làm mồi để tổng hợp mRNA của vi rút. Enzyme RNA polymerase của vi

12

rút thực hiện quá trình tổng hợp sợi mRNA bổ sung với RNA đơn âm. Phần intron

(vùng câm) của mRNA vi rút bị cắt bởi các enzyme của tế bào để các protein M1

hay NS1 được tổng hợp mà không cần thêm một sự phân cắt nào. Một số protein

mới được tổng hợp quay trở lại nhân tế bào gắn vào RNA để hình thành RNP. Các

protein còn lại di chuyển tới lưới nội bào và thể Golgi thực hiện quá trình glucosyl

hóa sau đó tiếp tục tới màng tế bào và gắn vào lớp lipid kép của màng. Khi quá

trình gắn của các protein vào màng hoàn chỉnh, các RNP và M1 liên kết các thành

phần lại để tạo nên hạt vi rút. Cuối cùng, hạt vi rút nảy chồi ra phía ngoài màng tế

bào chủ rồi được tách ra khỏi tế bào nhờ hoạt động của neuraminidase (Hình 1.5).

Hình 1.5. Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút

Nguồn: Nature Review – Drug Discovery

13

1.1.3. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A

Những thay đổi nhỏ trên gen

Polymerase của vi rút cúm và các vi rút mang RNA nói chung không có chức

năng sửa chữa sai sót trong quá trình kéo dài chuỗi sau mỗi lần nhân lên (khoảng

một lỗi sai sau mỗi lần nhân lên) và đã tạo ra các biến đổi trong RNA thế hệ mới.

Những biến đổi này xuất hiện một cách tự nhiên trên các phân đoạn gen của vi rút

cúm nhưng chỉ làm xuất hiện những thay đổi nhỏ về đặc tính kháng nguyên của vi

rút. Những biến đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA và NA thường được quan

tâm hơn bởi những tác động của chúng lên tính lây nhiễm của vi rút cúm thế hệ mới

trong quy trình gây dịch tại các năm tiếp theo, ước tính khoảng một phần trăm khác

biệt trong số axit amin của HA và NA xuất hiện trong mỗi mùa dịch [6, 43, 70].

Những biến đổi nhỏ này xảy ra còn liên quan đến sự né tránh miễn dịch của vi rút

cúm với kháng thể đã được tạo ra bởi những lần nhiễm trước đó, vì vậy, các vi rút

mang những biến đổi này có thể là nguyên nhân gây nên những vụ dịch cúm hàng

năm. Những thay đổi nhỏ xảy ra trên protein bề mặt HA và NA được ghi nhận

thường xuyên nhưng lại hiếm khi với các nucleoprotein [52].

*Những thay đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA

Protein HA đóng vai trò quan trọng trong biểu hiện kháng nguyên của vi rút

cúm. Vùng đầu chỏm của protein HA mang 5 vùng quyết định kháng nguyên, mỗi

sự thay đổi trong những vùng này cũng có ảnh hưởng nhất định đến đặc tính kháng

nguyên của vi rút [51, 94]. Protein HA của vi rút A/H3N2 có sự thay đổi sau mỗi 3

năm. Tuy nhiên, đáp ứng miễn dịch chéo giữa vi rút H3N2 lưu hành nổi trội với vi

rút H3N2 lưu hành trước đó vẫn xảy ra [97]. Điều này chứng tỏ sự thay đổi nhỏ trên

phân đoạn gen mã hóa HA chưa tạo ra được sự né tránh miễn dịch toàn bộ của vi rút

cúm cho dù tần suất thay đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút A/H3N2

diễn ra nhanh (3 năm), những chủng H3N2 mới vẫn chịu ảnh hưởng của miễn dịch

tồn lưu được tạo ra bởi vi rút lưu hành những năm trước đó.

14

*Những thay đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa NA

Cũng giống protein HA, protein NA cũng có những thay đổi nhỏ xảy ra trong

quá trình hoạt động. Các nghiên cứu đã chỉ ra sự thay đổi của axit amin xảy ra trên

bề mặt của protein NA, nơi có các điểm gắn với axit sialic (vị trí 222, 329 và 344

trên gen N2) [92, 118]. Tương tự kháng nguyên bề mặt HA, kháng nguyên NA cũng

có khả năng tạo kháng thể có tính bảo vệ. Các đột biến, thay đổi trên protein NA

(đặc biệt tại khu vực bảo tồn) ảnh hưởng đến tính kháng nguyên của NA trong quá

trình đáp ứng miễn dịch, vi rút cúm thay đổi để "tránh né" ảnh hưởng của kháng thể

kháng NA, tạo nên một dòng kháng thể mới khác biệt so với dòng kháng thể thu

được trước đây khi chưa xuất hiện đột biến [92]. Tuy nhiên, chỉ miễn dịch thu được

khi tác dụng với phần bảo tồn của NA mới mang tính bảo vệ.

*Những thay đổi nhỏ trên gen M

Tìm hiểu về tiến hóa của gen M cho thấy M1 có sự thay đổi axit amin ở mức

26,4% và M2 có sự thay đổi 48,5% axit amin. Sự khác biệt này là do gen M2 chịu

áp lực chọn lọc của kháng thể bảo vệ cao hơn M1. Tuy nhiên, sự thay đổi nhiều trên

gen M2 chỉ quan sát thấy trên các vi rút cúm người và cúm lợn, hầu như không xảy

ra với các chủng cúm gia cầm. Quan sát gen M1, hầu hết các thay đổi trên gen đều

không dẫn đến thay đổi axit amin, ngoài ra, so sánh tần suất đột biến theo năm trên

M1 và M2 và các gen còn lại của vi rút cho thấy tần suất này thấp hơn tần suất đột

biến của gen còn lại, do vậy có thể coi gen M là gen có tính bảo tồn cao [29].

Những thay đổi lớn trên gen liên quan đến sự thay đổi về mặt kháng nguyên

Những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm so sánh các vi rút phân lập được từ

những vụ dịch những năm 1918, 1947-1956, 1957-1967, 1968 cho thấy những vụ

dịch này cùng có một nguyên nhân là cúm A phân típ H1N1 nhưng có sự biến đổi

lớn về mặt di truyền học và đặc tính kháng nguyên (không có hoặc có kết quả phản

ứng chéo với hiệu giá không cao khi thực hiện phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu

giữa vi rút mới xuất hiện và các kháng thể tồn lưu tạo ra bởi các phân típ vi rút cũ).

15

Như vậy, tuy cùng mang tên một phân típ vi rút (H1N1) nhưng bản chất vi rút đã

có sự thay đổi hoàn toàn, vì vậy các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu sẽ không cho kết

quả đáp ứng chéo bảo vệ giữa các phân típ vi rút cùng tên đã biết.

Hậu quả của sự xuất hiện vi rút mới mà không có kháng thể tồn lưu có khả năng

chống lại trong quần thể, sẽ là nguyên nhân một đại dịch lan rộng trên toàn thế giới

(đại dịch cúm 1918, 1977, 2009 với vi rút cúm A phân típ H1N1) [51, 70, 97, 98].

Việc xuất hiện các biến đổi lớn dẫn đến sự thay đổi hoàn toàn đặc tính kháng

nguyên trên cả hai phân đoạn gen mã hóa HA và NA của vi rút cúm được giải thích

bằng giả thuyết của sự trao đổi và tích hợp giữa các phân típ vi rút khác nhau.

1.1.4. Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A

Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, với hệ gen phân đoạn như vậy, sự tái sắp xếp

của vật liệu di truyền giữa các chủng vi rút cúm có khả năng xảy ra khi có sự đồng

nhiễm hai hay nhiều vi rút cúm A phân típ khác nhau trên một vật chủ. Kết quả là

sự tạo ra một loại vi rút mới có hệ gen là sự trộn và sắp xếp lại các phân đoạn gen

của các vi rút cúm đồng nhiễm. Trên thực tế, khi phân tích gia hệ chủng vi rút cúm

A/H1N1 lưu hành từ năm 1918 đến nay thấy rằng vi rút đã trải qua nhiều lần trao

đổi và tích hợp gen của từng phân đoạn gen. Phân đoạn gen mã hóa PB1, NA và M

xuất hiện từ đầu những 1940 vẫn lưu hành trong các vi rút của năm 1947, đặc biệt

phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút gây dịch năm 1947 hoàn toàn khác so với HA

của các chủng vi rút lưu hành năm 1943-1945 [12, 30, 33]. Năm 2009, chủng H1N1

gây đại dịch có sự trao đổi và tích hợp giữa vi rút cúm người, cúm gia cầm và cúm

lợn, trong đó các phân đoạn gen mã hóa HA, NP, NS được tích hợp từ chủng cúm

lợn, NA, M từ chủng vi rút cúm lợn Á Âu, đặc biệt PA và PB2 là 2 gen có mức trao

đổi tích hợp cấp ba (2 gen này là sự trao đổi của cả 3 chủng vi rút cúm từ người, gia

cầm và lợn) [5, 27]. Chủng vi rút cúm này mang bộ gen có sự trao đổi vào tích hợp

với bộ gen có nguồn gốc từ vi rút gây bệnh cho người nên chủng vi rút mới hoàn

toàn có khả năng nhân lên tại các tế bào biểu mô đường hô hấp ở người và dễ dàng

lan truyền trong quân thể người với phạm vi lớn. Tuy nhiên, các protein bề mặt của

16

vi rút mới khác biệt hoàn toàn với các chủng vi rút cúm gây bệnh cho người lưu

hành trước đó và vật chủ không được bảo vệ bởi các kháng thể tồn lưu. Vi rút cúm

mới xuất hiện H7N9 cũng mang hệ gen có sự trao đổi và tích hợp cao, trong đó

phân đoạn gen mã hóa HA tương tự gen H7 của gia cầm, phân đoạn gen mã hóa NA

tương tự N9 của vi rút A/H11N9, các gen còn lại tương tự vi rút A/H9N2 [63].

Ngoài ra, qua sự trao đổi và tích hợp này, vi rút cúm mới có thể mang gen kháng

thuốc từ chủng vi rút cúm khác, điển hình là gen M mang đột biến kháng

amantadine của vi rút H1N1pdm09 và phân đoạn gen mã hóa NA mang đột biến

kháng oseltamivir của vi rút H7N9 [30, 63]. Như vậy, chủng vi rút mới sẽ có thể là

căn nguyên của đại dịch lan rộng toàn cầu, đe doạ sự an toàn của các quốc gia và

sức khoẻ của người dân trên toàn thế giới [33, 34].

1.1.5. Khả năng gây bệnh của vi rút cúm

Cúm là một bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do vi rút cúm gây ra.

Đường lây truyền chủ yếu của vi rút cúm có thể qua giọt nước bọt nhỏ mang vi rút

tung ra khi người bệnh tiếp xúc trực tiếp với người lành. Thời gian ủ bệnh trung

bình là 2 ngày, thường kéo dài từ 1 đến 4 ngày [43], sau đó bệnh nhân biểu hiện các

triệu chứng như: sốt, mệt mỏi, đau mỏi cơ chủ yếu vùng lưng và các triệu chứng

chảy mũi, chảy nước mắt…. Bệnh nhân có thể hết sốt sau 5 đến 7 ngày kèm theo

mệt mỏi và ho, sau khoảng 10 ngày thì hồi phục nếu không có biến chứng bội

nhiễm [4].

Từ đầu thế kỷ XX đến nay, thế giới ghi nhận 4 đại dịch cúm, khởi đầu tại Tây

Ban Nha năm 1918-1919 do vi rút cúm A/H1N1 gây nên là một trong những dịch

cúm gây tỉ lệ tử vong cao, ước tính có khoảng 40 triệu người đã chết do nhiễm cúm

[43]. Dịch cúm châu Á năm 1957-1958 có nguồn gốc từ Singapore do vi rút cúm

A/H2N2 gây nên với khoảng 69.800 trường hợp tử vong. Dịch cúm xảy ra năm

1968-1969 tại Hồng Kông do vi rút cúm A/H3N2 gây nên [84]. Dịch cúm

A/H1N1pdm09 xảy ra năm 2009 khởi đầu tại Mexico, sau đó nhanh chóng lan sang

Hoa Kỳ, Canada, châu Âu và châu Á. Cuối tháng 5 năm 2009, Việt Nam ghi nhận

17

ca mắc cúm A/H1N1 đại dịch đầu tiên. Số ca mắc bệnh tăng nhanh, đến tháng 12

năm 2009 đã có hơn mười nghìn mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm cúm A/H1N1pdm09

được gửi đến PTN cúm, viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương [2]. Dịch cúm gia cầm

đầu tiên xuất hiện tại Hồng Kong 1997-2002 gây ra bởi vi rút cúm A phân típ

H5N1. Vi rút lây từ gia cầm sang người, tử vong 6/18 trường hợp mắc [95]. Năm

2003, dịch cúm gia cầm đã xuất hiện tại Việt Nam, tính đến nay đã có 125 trường

hợp được khẳng định nhiễm cúm A/H5N1, có 62 trường hợp tử vong [115]. Tháng

3 năm 2013, tổ chức Y tế Thế (TCYTTG) giới nhận được thông báo các trường hợp

nhiễm cúm A/H7N9 đầu tiên tại Trung Quốc, vi rút được xác định lây từ gia cầm

sang người với tổng số người nhiễm là 133 và số tử vong là 34 [116].

Dựa vào các số liệu giám sát tại phòng thí nghiệm từ năm 2001 và chương trình

giám sát cúm quốc gia tại Việt Nam (viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương phối hợp

với US-CDC từ năm 2006), bệnh cúm ở Việt Nam xuất hiện quanh năm, có hai đỉnh

rõ rệt vào mùa đông xuân với sự lưu hành của vi rút cúm B (tháng 2 – tháng 3) và

mùa hạ với sự lưu hành của các chủng thuộc phân típ cúm A (tháng 7 – tháng 8) [5].

1.1.6. Tiến hóa của vi rút cúm A

Sự tiến hóa của vi rút cúm được ghi nhận đầu tiên là sự tiến hóa về di truyền

học với những thay đổi nhỏ, thay đổi lớn trên gen. Những thay đổi nhỏ xảy ra

thường xuyên có thể không tạo sự thay đổi về kháng nguyên nhưng tạo nên sự đa

dạng trong kiểu gen của các chủng vi rút cúm. Những thay đổi lớn gây ảnh hưởng

đến tính kháng nguyên, tuy xảy ra với tần suất thấp, nhưng là sự thay đổi quan trọng

trong tiến hóa của vi rút cúm. Điểm đặc trưng trong tiến hóa của vi rút cúm là sự

trao đổi và tích hợp các phân đoạn gen để tạo ra phân típ vi rút cúm mới. Hiệu ứng

của sự tiến hóa này là sự thay đổi đặc tính kháng nguyên, sự thay đổi vật chủ, sự

tăng độc lực, tăng khả năng lây truyền, kháng thuốc….

Sự tiến hóa của vi rút cúm A được khẳng định là sự tiến hóa thích nghi, chỉ xảy

ra rải rác trong quần thể vi rút cúm, dưới ảnh hưởng của một số hiện tượng như:

18

cùng đồng nhiễm trên một vật chủ, hoặc xuất hiện của một biến thể vi rút từ nơi

khác [83]. Hai phân đoạn gen mã hóa cho glycoprotein bề mặt HA và NA chịu áp

lực lớn từ khả năng trung hòa của kháng thể sinh ra trong quá trình nhiễm bệnh. Các

phân đoạn gen còn lại tuy không chịu áp lực chọn lọc từ đáp ứng miễn dịch nhưng

lại được cho rằng chúng đã phải trải qua quá trình chọn lọc để thích nghi với từng

loài vật chủ trong đó điển hình là phân đoạn gen mã hóa PB2 [57].

Tác động của con người lên sự tiến hóa của vi rút cúm A chưa được đánh giá

một cách rõ ràng nhưng những hoạt động như sử dụng gia cầm, tiêm văc xin hay sử

dụng thuốc kháng vi rút cũng có khả năng ảnh hưởng đến sự tiến hóa. Ngoài ra, với

việc sử dụng thuốc kháng vi rút, hiện tượng kháng thuốc đã xuất hiện, như vậy, vi

rút đã bắt đầu thay đổi để thích nghi với môi trường và những thay đổi này sẽ là

những bước tiến hóa tiếp theo của vi rút cúm.

1.2. Phòng và điều trị vi rút cúm A

1.2.1. Văc xin phòng cúm

Văc xin phòng bệnh cúm bắt đầu được áp dụng từ năm 1945 với mục tiêu giảm

tỉ lệ mắc cúm, giảm gánh nặng bệnh tật do vi rút cúm gây nên. Các loại văc xin đưa

vào sử dụng được sản xuất trên trứng gà có phôi với kháng nguyên gồm hai chủng

A (một chủng A/H3N2 và một chủng A/H1N1pdm09) và một chủng cúm B, được

lựa chọn từ hơn 100 trung tâm cúm quốc gia từ hơn 80 quốc gia trên thế giới. Sự lựa

chọn các chủng vi rút được TCYTTG thực hiện vào tháng Hai hàng năm với các

nước ở Bắc Bán cầu, tháng Chín hàng năm với các nước ở Nam Bán cầu [117]. Để

đạt được hiệu quả trong phòng bệnh, văc xin phải được tiêm chủng trong cộng đồng

hàng năm, do khả năng biến đổi nhanh của vi rút trên phân đoạn gen mã hóa HA và

NA. Tuy nhiên, tại Việt Nam, văc xin phòng cúm chưa được sử dụng rộng rãi trong

toàn bộ quần thể dân cư, do đó hiệu quả phòng bệnh còn hạn chế.

19

Các loại văc xin

Văc xin bất hoạt

Loại văc xin này được sản xuất từ các chủng vi rút nuôi trong túi niệu của trứng

gà có phôi sau đó bị bất hoạt bởi formandehyde hoặc β-propiolacton rồi tinh sạch

bằng siêu ly tâm. Loại văc xin này bao gồm văc xin toàn phần và văc xin bán phần.

Văc xin toàn phần an toàn và có khả năng dung nạp tốt với hiệu lực bảo vệ ở người

lớn và trẻ em là 60-90%. Văc xin bán phần chỉ gồm hai thành phần là protein HA và

NA, các thành phần khác của vi rút đã được loại bỏ. Loại văc xin này gây ít phản

ứng phụ tuy nhiên có ý kiến cho rằng văc xin kém hiệu quả trong trường hợp có sự

lưu hành của chủng vi rút mới [50].

Văc xin sống giảm độc

Văc xin này được áp dụng nhằm mục đích tăng cường đáp ứng miễn dịch dịch

thể và miễn dịch tại chỗ (tại đường hô hấp) của cơ thể đối với vi rút cúm. Khác với

văc xin bất hoạt, thành phần của văc xin sống giảm độc là các chủng vi rút được thích ứng ở điều kiện nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ cơ thể (25oC) để khi được đưa vào

qua đường mũi với nhiệt độ cơ thể các vi rút sẽ bị bất hoạt nhằm kích thích sinh

kháng thể ngay tại đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới đồng thời cũng tăng

cường đáp ứng miễn dịch tế bào. Loại văc xin này đã được đưa vào sử dụng tại Mỹ

vào năm 2003 và những năm trước đây tại Liên Xô cũ với độ an toàn khá cao [50].

Các loại văc xin thế hệ mới

Việc sản xuất văc xin có thành phần là các vi rút cúm được nuôi cấy trên tế bào

MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) hoặc tế bào Vero có khả năng thay thế văc

xin sản xuất trên trứng gà có phôi đang được các nhà sản xuất văc xin quan tâm

không chỉ vì khả năng tăng năng suất mà còn bởi tác dụng phụ của loại văc xin này

được hi vọng là thấp hơn loại văc xin đang sử dụng hiện tại.

20

Văc xin được sản xuất dựa trên ứng dụng công nghệ gen (văc xin sử dụng công

nghệ di truyền ngược, văc xin DNA, văc xin protein) cũng đang được nghiên cứu

với hi vọng được áp dụng rộng rãi trong tương lai.

Văc xin được sản xuất dựa trên sự thay đổi về cấu trúc gen của vi rút làm giảm

khả năng nhân lên (gen M2 và NS2 bị loại bỏ) và mất khả năng tổng hợp chất ức

chế interferon của tế bào (loại bỏ gen NS1) có khả năng gây đáp ứng miễn dịch,

không theo quy trình sản xuất văc xin hiện tại [50].

1.2.2. Thuốc điều trị vi rút cúm A

Các thuốc kháng vi rút dòng ức chế sự xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm

Amantadine và rimantadine là các dẫn chất của adamantane, được sử dụng từ

những năm 60 của thế kỷ trước (Hình 1.6). Cơ chế tác dụng của các chất này là ức chế kênh trao đổi ion M2 xuyên màng của vi rút cúm A, ion H+ không thể đi vào

bên trong vi rút, pH trong vi rút không thay đổi, hạn chế quá trình hòa màng của vi

rút với tế bào chủ , ngăn cản quá trình vi rút "cởi áo" để xâm nhập vào bên trong tế

bào chủ (Hình 1.6). Amatadine có hiệu quả điều trị chống lại tất cả các phân típ cúm

A gây bệnh cho người trước đây (H1N1, H2N2, H3N2) nhưng không chống lại

được vi rút cúm B do protein M2 chỉ có ở vi rút cúm A [31]. Hiện tượng kháng

thuốc thường xảy ra với các chủng cúm A/H3N2 do xuất hiện các điểm đột biến

trên gen M (phần M2) dẫn đến thay đổi các axit amin tại năm vị trí 26, 27, 30, 31 và

34, làm thay đổi vị trí tương tác của amantadine với M2. Trong đó, vị trí 31 thay đổi

từ Serin (Ser-S) sang Arginine (Asn-N) là vị trí thường gặp ở các chủng vi rút trong

các nghiên cứu trên thế giới [9, 42, 89].

21

Hình 1.6. Cấu trúc và cơ chế tác dụng của amantadine và rimantadine

(Nguồn: http://umanitoba.ca và Drugs discovery approaches – Wiley 2007)

Các thuốc kháng vi rút dòng ức chế neuraminidase

Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt

neuraminidase của vi rút cúm (Hình 1.7). Neuraminidase phân cắt axit sialic trên bề

mặt tế bào chủ khỏi glycoprotein HA của hạt vi rút mới nảy chồi tại cầu nối đặc

hiệu α 2,3Gal-sialic hoặc α2,6 Gal-sialic. Do vậy, neuraminidase giúp giải phóng

hạt vi rút, tạo điều kiện cho hạt vi rút mới có khả năng xâm nhập vào tế bào biểu mô

khác, tăng cường sự phát tán của vi rút. Ức chế quá trình này, vi rút chỉ có khả năng

nhiễm và nhân lên trong tế bào nhiễm nhưng không thể phát tán xâm nhập các tế

bào lành khác, ngăn chặn khả năng gây bệnh của vi rút (Hình 1.8).

Neuraminidase là enzyme trên bề mặt vi rút có tính chất khá bảo tồn ở các chủng vi

rút cúm, các nhà khoa học dự đoán khả năng xảy ra sự kháng thuốc của vi rút đối

với oseltamivir thấp hơn amantadine [21]. Tuy nhiên, gần đây đã có những nghiên

cứu trong nước và trên thế giới chỉ ra sự xuất hiện của những chủng vi rút kháng lại

oseltamivir chủ yếu trên phân típ A/H1N1 và đặc biệt một chủng vi rút cúm gia cầm

22

A/H5N1 có nguồn gốc từ Việt Nam đã có biểu hiện kháng thuốc [8, 11, 26, 31].

Trong thời gian diễn ra đại dịch cúm A/H1N1pdm09, đã ghi nhận các trường hợp

kháng oseltamivir [30]. Hiện tượng kháng thuốc xảy ra có liên quan đến sự thay đổi

axit amin tại vùng tiếp xúc của neuraminidase và thuốc điều trị (oseltamivir) , cụ thể

là các vị trí E119V, R292K, H275Y và R152K trên phân đoạn gen mã hóa NA [11,

13, 26, 36, 55, 58, 59]. Sự đột biến tại các vị trí này làm giảm hiệu quả tương tác

giữa thuốc và neuraminidase. Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm gần đây cho

thấy zanamivir dường như vẫn có tác dụng với các chủng đã kháng với oseltamivir

[19]. Các số liệu cho thấy đột biến tại hai điểm trên phân đoạn gen mã hóa NA liên

quan đến kháng oseltamivir (H275Y và I223R trên phân đoạn gen mã hóa NA của

chủng vi rút A/H1N1pdm09) làm cho mức độ kháng thuốc của vi rút tăng gấp 1000

lần so với chủng vi rút nhạy cảm [40]. Các phương pháp xác định nồng độ

oseltamivir bị kháng bởi vi rút đã và đang được tiến hành với mục đích xác định

chính xác mức độ kháng của vi rút với thuốc [40, 41].

Hình 1.7. Cấu trúc của oseltamivir và zanamivir (Nguồn: http://umanitoba.ca )

23

Hình 1.8. Cơ chế hoạt động của neuraminidase và chất ức chế neuraminidase trong

quá trình giải phóng vi rút ra khỏi tế bào

Nguồn: Drug Discovery Approaches – Wiley 2007

1.2.3. Các thuốc kháng vi rút mới

Thuốc ức chế sự xâm nhập của vi rút vào tế bào

Arbidol là thuốc kháng vi rút được điều chế và sử dụng đầu tiên tại Nga từ năm

1993 và sau đó tại Trung Quốc năm 2006 [18], có khả năng ức chế sự xâm nhập của

vi rút vào tế bào cảm nhiễm với khả năng phá vỡ môi trường pH thấp làm cho vi rút

cúm không thể hòa màng khi xâm nhập vào tế bào và mất khả năng cởi áo giải

phóng các thành phần của vi rút khi đã ở bên trong tế bào.

Thuốc ức chế thụ thể trên bề mặt tế bào – DAS181 – là một loại protein tái tổ

hợp bao gồm phần có tác dụng xúc tác của sialidase và phần protein gắn chặt trên

bề mặt màng tế bào biểu mô đường hô hấp. Axit sialic trên bề mặt tế bào chủ, thụ

thể đặc hiệu của protein HA của vi rút cúm, sẽ bị phá hủy khi cho tế bào tiếp xúc

với sialidase, một loại enzyme ngoại bào có tác dụng tách axit sialic ra khỏi liên kết

24

với các glycoprotein và glycolipid. Bên cạnh đó, phần protein gắn chặt trên bề mặt

màng tế bào tồn tại trên khắp bề mặt tế bào biểu mô đường hô hấp có khả năng làm

tăng hiệu quả tác dụng của sialidase khi đặt thêm một phân tử bên cạnh axit sialic.

Các thuốc ức chế neuraminidase

Hai loại thuốc kháng vi rút mới hoạt động theo cơ chế ức chế neuraminidase

đang trong quá trình thử nghiệm giai đoạn III tại Mỹ nhưng đã được cấp phép sử

dụng tại Nhật và Hàn Quốc là Peramivir và Laninamivir vào các năm 2006 và 2010.

Peramivir có cấu tạo tương tự axit sialic, có khả năng ức chế đặc hiệu

neuraminidase, được sử dụng dạng tiêm. Laninamivir có cấu trúc tương tự như

zanamivir nhưng khả năng bám gắn của laninamivir với NA được đánh giá cao, có

thời gian bán thải dài (khoảng 3 ngày), được coi là sự lựa chọn tốt đối với những

bệnh nhân nhiễm cúm có biến chứng nặng hoặc suy giảm miễn dịch.

Các thuốc ức chế sự sao chép và nhân lên của vi rút trong tế bào

Thuốc ức chế sự tái tạo vi rút của vi rút cúm - T-705 còn được biết dưới tên

faviparavir, là một phân tử nonpeptide nhỏ có khả năng kháng vi rút cúm dựa trên

cơ chế ức chế sự tái tạo hạt vi rút, có tác dụng chống lại cả ba phân típ cúm A, B và

C. Faviparavir tác dụng ức chế lên quá trình tổng hợp RNA của vi rút nhưng không

ức chế quá trình tổng hợp DNA và RNA của tế bào chủ. T-705 đã được chứng

minh có tác dụng chống lại vi rút cúm gia cầm có độc lực cao A/H5N1 và đang

trong quá trình thử nghiệm giai đoạn I. Tuy nhiên, cơ chế hoạt động của T-705 chưa

được chứng minh một cách rõ ràng [48].

Ribarivin và viramidine là 2 hoạt chất kháng vi rút phổ rộng. Ribarivin được sử

dụng điều trị viêm gan C phối hợp với interferon từ nhiều năm có cơ chế tác dụng

trực tiếp lên quá trình sao chéo và nhân lên bộ gen của vi rút. Viramidine là dạng

tiền hoạt động của ribavirin, có cơ chế hoạt động tương tự ribavirin nhưng ít tác

dụng phụ hơn. Ribavirin được thử nghiệm điều trị nhiễm cúm nhưng kết quả điều trị

kém hơn amantadine và các thuốc ức chế neuraminidase. Viramidine đã được thử

25

nghiệm với vi rút cúm A/H5N1 và cho kết quả khả quan nhưng mới chỉ dừng ở giai

đoạn thử nghiệm [100].

1.3. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút

Hiện nay, các phương pháp áp dụng chủ yếu trong điều trị và phòng chống

nhiễm vi rút cúm là tiêm văc xin và sử dụng thuốc đặc hiệu kháng vi rút. Văc xin

phòng chống nhiễm vi rút cúm A/H5N1 hiện tại được phát triển tại một số nước, tuy

nhiên vẫn chưa lưu hành trên thị trường. Văc xin cúm đang phổ biến hiện tại là văc

xin cúm theo mùa và chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm trước vụ dịch cúm và

chủng vi rút cúm lưu hành trong vụ dịch tương tự chủng vi rút trong thành phần văc

xin. Sau khi tiêm văc xin cúm, đáp ứng miễn dịch còn phụ thuộc rất nhiều vào cơ

địa của từng cá thể và loại văc xin được sử dụng. Thuốc kháng vi rút cúm đặc hiệu

đang lưu hành (amantadine, oseltamivir...) được sử dụng trong điều trị và dự phòng

nhiễm vi rút, đặc biệt là vi rút A/H5N1. Tuy vậy, một trong những tương tác của

thuốc với vi rút là hiện tượng đột biến xuất hiện trong vật liệu di truyền của vi rút và

hệ quả là sự kháng thuốc của vi rút ở thế hệ sau [56, 58, 67].

1.3.1. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine

Amantadine và rimantadine là các dẫn chất của adamantane, được sử dụng từ

những năm 60 của thế kỷ trước. Amatadine có hiệu quả điều trị chống lại tất cả các

phân típ cúm A gây bệnh cho người trước đây (H1N1, H2N2, H3N2) nhưng không

chống lại được vi rút cúm B do protein M2 chỉ có ở vi rút cúm A [21]. Sau 7 năm

đưa vào sử dụng (1995-2002), tác dụng của adamantane trong điều trị và phòng

bệnh được ghi nhận nhưng có hiệu quả không cao bởi quá trình kháng thuốc đã xuất

hiện và lan truyền nhanh trong quần thể. Tỉ lệ kháng thuốc amantidine là 2% năm

2002, tăng lên 12% năm 2004 và 100% ở các chủng A/H3N2 năm 2005. Theo kết

quả của các nghiên cứu về tỉ lệ kháng amantadine của vi rút cúm A cho thấy 100%

các vi rút cúm A/H3N2 và A/H1N1pdm09 kháng amantadine. Tuy nhiên, một

nghiên cứu tại Nhật năm 2008 đã xác định chủng cúm A/H3N2 có khả năng trở nên

26

nhạy với amantadine. Sự quay trở lại này là kết quả của quá trình trao đổi và tích

hợp bộ gen giữa các chủng vi rút cúm lưu hành vào mùa cúm 2002-2003, 2004-

2005 và 2005-2006 [12].

Các nghiên cứu về vi rút cúm A/H5N1 kháng amantadine cho thấy chủng H5N1

lưu hành tại các nước Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan, Cambodia mang đột

biến kháng thuốc chủ yếu tại vị trí S31N, đặc biệt các chủng lưu hành tại Việt Nam

năm 2004 mang 2 đột biến tại vị trí 31 và 27 (V27A) trong khi các chủng lưu hành

tại Trung Quốc và Indonesia lại vẫn duy trì sự nhạy cảm với thuốc amantadine [9,

15].

1.3.2. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir

Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt,

neuraminidase, của vi rút cúm được đưa vào sử dụng từ năm 1999, enzyme này có

tính chất khá bảo tồn ở các chủng vi rút cúm, do vậy khả năng xảy ra sự kháng

thuốc của vi rút được các nhà khoa học tiên lượng là thấp hơn amantadine [21]. Tuy

nhiên, gần đây các nghiên cứu trong nước và trên thế giới chỉ ra rằng những chủng

vi rút kháng lại oseltamivir chủ yếu trên phân típ A/H1N1 lưu hành trước năm

2009. Tỉ lệ kháng oseltamivir của phân típ này chỉ ở mức dưới 1% [46, 59] vào

những năm 2005-2006, các chủng kháng với oseltamivir đã bắt đầu xuất hiện năm

2007, sau đó tăng nhanh 43-60% năm 2008 và lan rộng trên toàn thế giới năm 2009

với tỉ lệ kháng lên đến 95% (Nhật, Mỹ, Châu Âu) [64, 110]. Chủng vi rút cúm gia

cầm A/H5N1 cũng đã có biểu hiện kháng oseltamivir, trong đó có 2 trường hợp

xuất hiện kháng thuốc trong quá trình điều trị tại bệnh viện [67] và một trường hợp

mang chủng kháng thuốc không qua điều trị, ba chủng này có nguồn gốc từ Việt

Nam [8, 11, 26, 31]. Trong thời gian diễn ra đại dịch cúm A/H1N1pdm09, đã ghi

nhận các trường hợp kháng oseltamivir đơn lẻ và theo nhóm tại Việt Nam, Úc và

Nauy [35, 39, 58]. Bệnh nhân nhiễm chủng vi rút A/H1N1pdm09 kháng thuốc

ngoài các trường hợp có liên quan đến điều trị còn bao gồm những trường hợp có

bệnh mạn tính, suy giảm hệ miễn dịch và không liên quan đến điều trị thuốc [37].

27

Ngoài ra, vi rút cúm mới xuất hiện trên người A/H7N9 tại Trung Quốc được thông

báo mang đã mang sẵn phân đoạn gen mã hóa NA có điểm đột biến R292K gây

kháng oseltamivir [63], gây khó khăn cho công tác phòng và điều trị.

1.4. Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút

cúm A

1.4.1. Nguyên nhân và cơ chế của hiện tượng kháng thuốc

Thuốc amatadine: Amantadine được đưa vào sử dụng từ những năm 1960 với

mục đích phòng và điều trị cúm A. Theo khảo sát từ năm 1994, hiện tượng kháng

amantadine đã xuất hiện [50]. Tìm hiểu nguồn gốc của sự kháng thuốc, phân đoạn

gen mã hóa M đã được phân tích trình tự nucleotide để xác định sự thay đổi có liên

quan đến kháng thuốc. Theo các nghiên cứu, hiện tượng kháng amantadine thường

xảy ra với các chủng cúm A/H3N2 có xuất hiện các điểm đột biến trên phân đoạn

gen mã hóa M (phần M2) dẫn đến thay đổi các axit amin tại các vị trí gắn kết. Năm

vị trí axit amin liên quan đến việc kháng amatadine là 26, 27, 30, 31 và 34, trong đó,

vị trí 31, thay đổi từ Serin (Ser-S) sang Arginine (Asn-N), là vị trí thường gặp [9,

42, 89]. Các đột biến này làm vị trí tiếp xúc với thuốc được "nới rộng", không còn

tương ứng với kích thước của thuốc, amantadine không gắn được vào đúng vị trí

trên protein M2 [82]. Do đó, vi rút không bị ức chế, vẫn tiếp tục quá trình hòa

màng, "cởi áo", đưa các RNP và tế bào cảm nhiễm của vật chủ. Ngoài ra, sự kháng

thuốc có thể xảy ra không liên quan đến hiện tượng đột biến mà do sự trao đổi và

tích hợp bộ gen (trường hợp vi rút H1N1pdm09 khi xuất hiện kháng 100% với

amantadine).

Thuốc oseltamivir: Nguồn gốc của hiện tượng kháng oseltamivir là do có sự

thay đổi axit amin tại vùng tiếp xúc của neuraminidase với thuốc, cụ thể là các vị trí

I117V, H275Y, N294S trên N1 và E119V, R152K, R292K, N294S trên phân đoạn

gen mã hóa N2 [24, 101, 104]. Sự đột biến tại các vị trí này gây giảm hiệu quả

tương tác giữa thuốc và neuraminidase dẫn đến sự giảm độ nhạy hoặc kháng của vi

28

rút với thuốc. Tuy nhiên, theo dõi sự kháng thuốc của vi rút với zanamivir, dường

như zanamivir vẫn có hiệu quả trên các chủng vi rút đã kháng với oseltamivir và

đây có thể do sự khác nhau về cấu trúc không gian của hai loại thuốc này [79].

Tương tự như trường hợp vi rút H1N1pdm09 kháng amantadine, phân đoạn gen mã

hóa NA của vi rút cúm mới xuất hiện trên người A/H7N9 cũng đã mang đột biến tại

vị trí R292K liên quan đến kháng oseltamivir thông qua quá trình trao đổi và tích

hợp đoạn gen [62].

Như vậy, sự kháng thuốc của vi rút cúm A qua thời gian tập trung vào các

nguyên nhân sau: đột biến tại các vị trí liên quan đến sự bám gắn của thuốc trên

phân đoạn gen mã hóa NA và M; áp lực duy trì nòi giống của vi rút mà biểu hiện

chính là sự trao đổi và tích hợp bộ gen, do đó vi rút hoàn toàn có khả năng mang

gen kháng thuốc từ khi mới xuất hiện; sự thích nghi với nhiều loại vật chủ của vi rút

cúm A tạo điều kiện thuận lợi cho sự kháng thuốc xuất hiện (vi rút cúm B có tỉ lệ

kháng thuốc thấp hợp vi rút cúm A).

1.4.2. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự

thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm

Kỹ thuật giải trình tự gen thông thường (phương pháp Sanger)

Việc xác định chủng vi rút có mang gen kháng thuốc sử dụng phương pháp

giải trình tự gen thông thường đã được thực hiện từ những năm 90, qua đó có thể

theo dõi được sự xuất hiện hiện tượng kháng thuốc của vi rút cúm [93]. Điển hình

là sự xuất hiện của hiện tượng kháng amantadine của vi rút A/H3N2, hiện tượng

kháng oseltamivir của vi rút A/H1N1 và là phương pháp chủ yếu được lựa chọn để

xác định chủng vi rút cúm A kháng amantadine.

*Ưu điểm

Ưu điểm của kỹ thuật là khả năng ứng dụng rộng rãi, có thể giải trình tự

nucleotide cho toàn bộ gen đích hoặc từng phần gen có mang vị trí đột biến liên

29

quan đến kháng thuốc. Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen này cũng có thể xác định

được hiện tượng kháng thuốc không hoàn toàn, hoặc nhiều đột biến liên quan đến

kháng thuốc. Chủng vi rút mang nhiều đột biến tại các vị trí khác nhau trên gen

đích cùng có tác dụng gây kháng thuốc có thể phát hiện được nhờ khả năng giải

trình tự đoạn nucleotide dài. Ngoài ra, các đột biến khác không liên quan đến kháng

thuốc nhưng có liên quan đến sự tiến hóa, thay đổi đặc tính kháng nguyên của vi rút

cũng được xác định [93].

*Nhược điểm

Kỹ thuật phải thực hiện trên các gen đích khuếch đại từ các chủng vi rút cúm

phân lập, thời gian thực hiện dài và chi phí để thực hiện còn cao.

Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn giới hạn (RFLP - Restriction Fragment Length

Polymorphism)

Đa hình độ dài đoạn giới hạn là kỹ thuật thường được sử dụng phối hợp cùng kỹ

thuật PCR [33]. Sử dụng enzyme giới hạn phân tích đoạn gen của vi rút cúm có thể

xác định được chủng vi rút có mang đột biến liên quan đến kháng thuốc sau khi thu

được sản phẩm PCR. Để thực hiện kỹ thuật này, phản ứng PCR được thực hiện với

đoạn mồi đặc hiệu (mồi ngược) được thiết kế mang vị trí cắt của enzyme giới hạn

xác định (ví dụ BspHI..) [78]. Sản phẩm PCR thu được sẽ được xử lý bằng enzyme

giới hạn tương ứng với mồi thiết kế. Enzyme giới hạn BspHI [33] hoặc BclI [78] sẽ

cắt sản phẩm PCR tại với vị trí xác định có trình tự tương ứng với vi rút không

mang đột biến kháng thuốc (vi rút nhạy cảm với thuốc), trong trường hợp vi rút

mang gen kháng thuốc, sản phẩm PCR sẽ không được cắt bởi enzyme giới hạn.

*Ưu điểm

Kỹ thuật này có thể thực hiện được với số lượng mẫu lớn, giá thành thấp và có thể

thực hiện trên bệnh phẩm lâm sàng và vi rút phân lập.

*Nhược điểm

30

Việc lựa chọn enzyme thích hợp để thiết kế mồi và phân tích sản phẩm PCR

không dễ, đặc biệt với các đột biến trên protein neuraminidase (NA) khi bản chất

của protein này cũng là một enzyme, vì vậy hiện tượng cắt tại các vị trí không mong

muốn (dương tình giả) , hoặc không tạo sản phẩm PCR tương thích... là các vấn đề

hay gặp, ảnh hưởng tới độ tin cậy của phương pháp, cần sử dụng kỹ thuật giải trình

tự gen để xác định lại kết quả.

Kỹ thuật giải trình tự đoạn gen ngắn thực hiện với từng nucleotide xác định (pyro-

sequencing)

Pyrosequencing là kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới, được ứng dụng lần đầu

tiên năm 1996 tại Thụy Điển, đến năm 2001 phương pháp bắt đầu được áp dụng

trên thế giới. Pyrosequencing đáp ứng được yêu cầu muốn xác định trình tự gen cho

một đoạn DNA nhỏ và có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn.

Mục tiêu chính của phương pháp là xác định các điểm đột biến, ngoài ra có thể sử

dụng phương pháp này trong định típ vi sinh vật và được coi là một phương pháp

xét nghiệm khẳng định kết quả [88]

*Ưu điểm

Kỹ thuật này mang ưu điểm có thể rút ngắn thời gian giải trình tự khi so sánh

với giải trình tự thông thường, có thể áp dụng cho nhiều loại mẫu khác nhau như

bệnh phẩm lâm sàng, vi rút đã nuôi cấy và có thể thực hiện với số lượng bệnh phẩm

lâm sàng lớn, phù hợp với tính chất giám sát học [25, 26]. Ngoài ra, phương pháp

này còn được ứng dụng trong việc định loại vi sinh vật (tuy không thông dụng) và

xác định cá thể mang gen dị hợp, hỗ trợ cho quá trình chẩn đoán trong phòng thí

nghiệm [10, 88]

*Nhược điểm

Pyrosequencing có nhược điểm là chỉ thực hiện trên đoạn DNA ngắn và phát

hiện được các đột biến được chỉ định, nên phạm vi ứng dụng còn hạn chế và chỉ tập

31

trung vào các nghiên cứu, giám sát cụ thể [25, 88]. Việc phát hiện đột biến liên

quan đến kháng oseltamivir bằng phương pháp pyrosequencing chỉ cho phép nhận

diện sơ bộ khả năng kháng thuốc của vi rút, các xét nghiệm tiếp theo để khẳng định

khả năng, mức độ kháng thuốc cần được bổ sung.

Kỹ thuật realtime RT-PCR

Nhằm mục đích có thể phát hiện nhanh vi rút mang gen đột biến trên số lượng

bệnh phẩm lớn, kỹ thuật realtime RT-PCR được phát triển và áp dụng. Kỹ thuật

này được đưa vào thử nghiệm lần đầu tiên năm 2008 [16] với ứng dụng ban đầu là

tìm điểm đột biến H275Y trên phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm A/H1N1.

Từ năm 2012, tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo có thể sử dụng kỹ thuật realtime

RT-PCR để xác định ban đầu bệnh phẩm nhiễm cúm nghi ngờ có mang gen kháng

thuốc.

*Ưu điểm

Kỹ thuật này có thể áp dụng cho bệnh phẩm lâm sàng, có thể thực hiện với số

lượng bệnh phẩm lớn, cho kết quả sàng lọc sớm trong vòng 3 giờ [16, 35]. Hơn nữa,

realtime RT-PCR có giá thành thấp hơn so với giải trình tự gen cổ điển và

pyrosequencing, do đó có thể sử dụng như một biện pháp sàng lọc bệnh phẩm mang

vi rút kháng thuốc góp phần phát hiện sớm những trường hợp kháng thuốc trong

cộng đồng.

*Nhược điểm

Với kỹ thuật này, đột biến liên quan đến kháng thuốc chỉ được xác định tại một

điểm nhất định (H275Y) trên phân đoạn gen mã hóa NA trong đó với kỹ thuật giải

trình tự gen cổ điển có thể phát hiện đột biến trên toàn bộ đoạn gen.

32

1.4.3. Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của

neuraminidase

Đây là quá trình cần thiết để xác định mức độ kháng oseltamivir của vi rút cúm

đươc thực hiện dựa trên nguyên lý hoạt động của neuraminidase chứng minh cho

việc phát hiện đột biến liên quan đến kháng thuốc trên gen là chính xác. Kỹ thuật

bao gồm hai bước chính: xác định hoạt động của neuraminidase và xác định mức độ

kháng thuốc oseltamivir hoặc zanamivir.

Xác định hoạt động của neuraminidase

Mục đích của việc xác định hoạt động của neuraminidase là đánh giá hoạt động

của enzyme trong quá trình nhân lên của vi rút và chuẩn hóa nồng độ vi rút trước

khi thực hiện việc xác định mức độ kháng thuốc của vi rút.

Xác định mức độ kháng oseltamivir/zanamivir

*Dựa trên hoạt động của neuraminidase với chất phát quang có nguồn gốc hóa

học

Việc nhận định mức độ kháng thuốc oseltamivir/zanamivir của vi rút cúm dựa

vào sự phát quang của chất có nguồn gốc hóa học (chemiluminesence). Kết quả thu

được từ kỹ thuật này được đánh giá có đủ độ tin cậy và được sử dụng tại nhiều

phòng thí nghiệm (PTN) chuẩn thức trên thế giới như PTN tại trung tâm kiểm soát

bệnh dịch Hoa Kỳ (US-CDC), PTN tại Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia Nhật

Bản (NIID) [73, 104]. Các bộ kit xác định mức độ kháng thuốc có chất phát quang

có nguồn gốc quang học được Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo sử dụng là NA-

Star và NA-XTD hãng Applied Biosystem, Mỹ [111].

Ưu điểm

Đây là kỹ thuật xác định mức độ kháng thuốc có độ nhạy cao, có thể sử dụng

với các vi rút có nồng độ thấp, cùng một lúc có thể thử nghiệm với nhiều loại thuốc

khác nhau và là kỹ thuật hỗ trợ khẳng định sự kháng thuốc của vi rút cúm.

33

Nhược điểm

Do có độ nhạy cao nên kỹ thuật không nhận định được rõ ràng kết quả nếu mẫu

thử nghiệm là vi rút không đột biến hoàn toàn . Hơn nữa, để sử dụng hiệu quả cần

phương tiện hỗ trợ đặc biệt (bộ phận chứa phiến 96 giếng, bộ phận chia dung dịch

dừng phản ứng tự động gắn liền với máy) cho máy đọc kết quả do chất phát sáng có

nguồn gốc hóa học này dễ bị phân hủy khi gặp ánh sáng và giá thành tương đối cao

so với kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của

neuraminidase với chất phát huỳnh quang.

*Dựa trên hoạt động của neuraminidase với chất phát quang là huỳnh quang

Đây là kỹ thuật xác định độ nhạy cảm của neuraminidase với thuốc ức chế hoạt

động của enzyme (oseltamivir, zanamivir...) có sử dụng chất huỳnh quang trong

thành phần của phản ứng. Kết quả của thử nghiệm xác định được nồng độ thuốc ức

chế 50% hoạt động của vi rút. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các PTN do

khả năng ứng dụng linh hoạt trong sử dụng hóa chất sinh phẩm và được tổ chức y tế

thế giới khuyến cáo sử dụng xác định mức độ kháng thuốc của các chủng vi rút

[111].

Ưu điểm

Ưu điểm của kỹ thuật là thời gian tiến hành nhanh, kết quả có thể phân định

được rõ ràng chủng nhạy cảm và chủng kháng thuốc [14]. Ngoài ra, không giống kỹ

thuật NAI dựa vào sự phát quang của chất có nguồn gốc hóa học đề cập ở trên, kỹ

thuật này cho phép sử dụng sinh phẩm là bộ kit thương mại, NA Fluor kit, Applied

Biosystem hoặc các hóa chất sinh phẩm có sẵn tại phòng thí nghiệm sử dụng chất

phát quang MUNANA của hãng Sigma.

Nhược điểm

Độ nhạy của kỹ thuật không được đánh giá cao như kỹ thuật xác định mức độ

kháng oseltamivir/zanamivir dựa trên hoạt động của neuraminidase với chất phát

34

quang có nguồn gốc hóa học [111]. Do đó, để khẳng định lại những chủng vi rút

nghi ngờ về khả năng kháng thuốc, cần sử dụng kỹ thuật NAI sử dụng chất phát

quang có nguồn gốc hóa học.

1.4.4. Giám sát sự kháng thuốc vi rút cúm

Quá trình giám sát kháng thuốc của vi rút cúm đã được thực hiện tại các nước

phát triển ở châu Âu và châu Mỹ. Các trường hợp nghi ngờ có liên quan đến kháng

thuốc đều được kiểm tra kỹ lưỡng và ghi nhận. Hiện nay, tại Việt Nam phòng thí

nghiệm cúm đang tiến hành triển khai giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm dựa

trên giám sát sự thay đổi trên phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút với sự giúp đỡ

của TCYTTG. Giám sát được sự kháng thuốc của vi rút cúm góp phần tăng cường

năng lực đáp ứng với sự xuất hiện của đại dịch cúm trong tương lai, chủ động trong

quá trình phòng và điều trị bệnh cúm trong đó việc sử dụng thuốc đóng vai trò quan

trọng.

Xây dựng quy trình giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm

Tại Việt Nam, ba trong số các kỹ thuật xét nghiệm trình bày ở phần trên đã

được thực hiện tại phòng thí nghiệm cúm viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương là giải

trình tự gen, realtime RT-PCR và xác định mức độ kháng thuốc bằng chất màu

huỳnh quang. Hiện tại, các phương pháp đều đã được xây dựng quy trình chuẩn

(SOP) nhằm tạo tiền đề cho việc thực hiện xét nghiệm giám sát thường xuyên sự

kháng thuốc của vi rút cúm tại phòng thí nghiệm.

Chiến lược thực hiện giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm tại phòng thí nghiệm

Giám sát vi rút cúm kháng thuốc tại Việt Nam được bắt đầu từ những năm

2005, tuy nhiên cũng chỉ dừng lại ở những trường hợp đơn lẻ của vi rút cúm

A/H1N1, A/H5N1. Những kết quả tìm hiểu sự kháng thuốc của vi rút cúm thu được

từ đại dịch cúm A/H1N1pdm09 là tiền đề để phát triển chương trình giám sát kháng

thuốc trong tương lai.

35

Giám sát sự kháng thuốc của vi rút bao gồm sự giám sát sự thay đổi, đột biến

liên quan đến kháng thuốc, trên gen của vi rút và sự thay đổi trên kiểu hình tương

ứng với kiểu gen. Tại Viện các bệnh truyền nhiễm (NIID)-Nhật Bản, khoảng 5-10%

chủng vi rút được lựa chọn ngẫu nhiên để xét nghiệm xác định mức độ kháng thuốc

của vi rút [69] bằng phương pháp ức chế neuraminidase. Sự thay đổi trên kiểu gen

có thể được giám sát qua phương pháp giải trình tự gen cổ điển (Sanger sequence)

trên các vi rút đã được xác định mức độ kháng thuốc. Các trường hợp nghi ngờ có

biểu hiện kháng thuốc nhưng chưa xác định được mức độ kháng thuốc có thể áp

dụng phương pháp giải trình tự pyrosequencing thực hiện trên bệnh phẩm lâm sàng

[25, 36, 104]. Quy trình giám sát vi rút cúm kháng thuốc được tổ chức giám sát sự

kháng thuốc của vi rút cúm (ISIRV) khuyến cáo thực hiện bao gồm quá trình xác

định biểu hiện kháng thuốc của các chủng vi rút thông qua kỹ thuật NAI với cơ chất

huỳnh quang, sau đó các chủng có biểu hiện kháng thuốc sẽ được xác định vị trí đột

biến liên quan đến kháng thuốc trên gen NA bằng các phương pháp như giải trình tự

gen thông thường hoặc realtime RT-PCR. Quy trình này hiện nay đang được áp

dụng tại các phòng thí nghiệm tham chiếu của TCYTTG tại CDC-Altanta,

Melbourne và NIID-Nhật Bản.

Những kết quả có thể thu được khi thực hiện giám sát sự kháng thuốc của vi rút

cúm

Sự kháng thuốc của vi rút nếu được phát hiện sớm tại các bệnh viện sẽ tạo điều

kiện cho bác sĩ lâm sàng thay đổi phác đồ điều trị phù hợp, rút ngắn thời gian nằm

viện của bệnh nhân. Hơn nữa, việc phát hiện sớm rất có ý nghĩa trong công tác

phòng chống dịch khi các trường hợp kháng thuốc được xác định trong thời điểm

bùng phát dịch, đặc biệt với các trường hợp là nhóm ca bệnh có liên quan đến kháng

thuốc, từ đó có thể áp dụng các biện pháp can thiệp phòng chống vi rút mang gen

kháng thuốc lan truyền trong quần thể.

Mỗi vi rút mang gen kháng thuốc có biểu hiện về mức kháng thuốc khác nhau,

mức kháng thuốc tăng cao đặc biệt ở vi rút mang đồng thời cả hai loại đột biến liên

36

quan đến kháng thuốc [38, 74], do vậy, giám sát kháng thuốc để tăng cường khả

năng phát hiện và theo dõi được tình trạng kháng thuốc của vi rút và sự tương tác

của vi rút với môi trường.

Xu hướng lưu hành vi rút cúm tại Việt Nam khác với các nước ở vùng khí hậu

hàn đới, nơi có mùa cúm rõ ràng, khi có hai đỉnh dịch cúm B vào tháng 2-3 và cúm

A vào tháng 7-8 [1] . Nghiên cứu về đặc điểm kháng nguyên của vi rút cúm cho

thấy dường như vi rút cúm lưu hành tại Việt Nam có đặc điểm gần giống với các

chủng vi rút cúm lưu hành tại Nam bán cầu [106]. Do đó với các chủng mang đột

biến kháng thuốc sẽ được giám sát sự tiến hóa trong quá trình tiến hóa chung của vi

rút cúm, từ đó có thể xác định được kiểu gen và kiểu hình đặc thù của vi rút cúm

lưu hành tại Việt Nam.

37

CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Các chủng cúm A bao gồm các phân típ A/H1N1, A/H1N1pdm09, A/H3N2 và

A/H5N1 phân lập được tại PTN Cúm, viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương từ năm

2001 đến 2012 từ các nguồn sau:

- Giám sát phòng thí nghiệm 2001 – 2005: Vi rút phân lập từ các bệnh nhân có hội chứng cúm theo giám sát của phòng thí nghiệm (sốt trên 38oC, ho và/hoặc

đau họng)

- Chương trình giám sát cúm quốc gia 2006 – 2012: Vi rút phân lập từ các bệnh

nhân có hội chứng cúm trong chương trình giám sát cúm Quốc gia phối hợp với US-CDC với tiêu chuẩn: sốt trên 38oC, ho và hoặc đau họng và không có chẩn

đoán nào khác.

- Giám sát viêm phổi nặng 2003 – 2012 (vi rút A/H5N1): Vi rút phân lập từ các

bệnh nhân viêm phổi nặng khi có đầy đủ triệu chứng của hội chứng cúm kèm

theo khó thở, có chỉ định áp dụng hỗ trợ hô hấp, hình ảnh X-quang phổi có tổn

thương đặc hiệu cho viêm phổi do vi rút và không hướng đến căn nguyên nào

khác ngoải vi rút.

Các chủng cúm A được thu thập tại các tỉnh phía Bắc gồm Lạng Sơn, Hòa Bình, Hà

Nội, Hà Nam, Nam Định, Bắc Ninh, Ninh Bình, Hưng Yên, Thái Bình và Thanh

Hóa.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Toàn bộ các vi rút cúm mùa A/H1N1, A/H1N1pdm09, A/H3N2 và A/H5N1 sau

khi phân lập được xác định mức độ kháng thuốc bằng phương pháp ức chế

neuraminidase, các vi rút có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir sẽ được

giải trình tự phân đoạn gen mã hóa NA để xác định điểm đột biến liên quan đến

38

kháng thuốc và phân đoạn gen mã hóa HA để xác định sự tiến hóa của vi rút [46,

112, 113]. Tuy nhiên, để thực hiện mục tiêu của nghiên cứu về sự tiến hóa của vi

rút, toàn bộ chủng cúm A trong nghiên cứu được giải trình tự hai phân đoạn gen mã

hóa HA và NA.

2.3. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm

2.3.1. Vật liệu

2.3.1.1. Chủng vi rút

Cỡ mẫu trong nghiên cứu được xác định là cỡ mẫu toàn bộ 342 chủng bao gồm:

42 chủng H1N1 thu thập từ năm 2001 đến 2009; 157 chủng H1N1pdm09 thu thập

từ tháng 6 năm 2009 đến 2012; 115 chủng H3N2 thu thập từ năm 2003 đến 2012 và

28 chủng H5N1 thu thập từ năm 2004 đến 2012

Các chủng cúm thu thập theo năm được sử dụng trong nghiên cứu

Số lượng chủng Năm A/H1N1 A/H3N2 A/H5N1

A/H1N1 pdm09 - 8 0 - 2001

- 4 0 - 2002

- 14 4 1 2003

- - 13 4 2004

- - 2 3 2005

- 3 0 - 2006

- - 16 8 2007

- 7 1 5 2008

86 6 36 4 2009

13 - 12 3 2010

58 - 1 - 2011

- - 30 - 2012

42 157 115 28 Tổng 342

39

2.3.1.2. Tế bào

Tế bào thường trực thận chó MDCK (Madin – Darby Canine Kidney) có nguồn

gốc từ trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ (US-CDC)

2.3.1.3. Sinh phẩm

Sinh phẩm cho phương pháp phân lập vi rút

Sinh phẩm Xuất xứ

Tế bào Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) US-CDC

Chai nuôi cấy tế bào T-75 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) Corning Cat.No. 430720 GIBCO Cat.No. 11965-092

GIBCO Cat.No. 15140-023

Penicillin-Streptomycin, dạng dung dịch đặc (10,000 U/ml penicillin G; 10,000 μg/ml streptomycin sulfate) Dung dịch Bovine serum albumin fraction V, 7.5% GIBCO Cat.No. 15260-011

Inc Fetal bovine serum, 40 nm filtered

HyClone Laboratories, Cat.No. A-1111-L GIBCO Cat.No. 25300-054

Sigma Cat.No. T-8642 Trypsin-EDTA (0.05% trypsin; 0.53 mM EDTA.4Na) Trypsin, TPCK

dạng dung dịch GIBCO Cat.No 15750-011 reagent

Merck Cat.No.1.00983.1000

Gentamicin (50mg gentamicin sulfate/ml) Cồn (96-100%)

Sinh phẩm cho phương pháp giải trình tự gen

* Tạo đoạn DNA bổ sung

- Mồi Universal 12 (Invitrogen)

40

- Enzyme Superscript III reverse transcriptase – Invitrogen (Mã catalog

18080085).

* PCR

- PCR kit

- Qiagen HotStar Hifidelity (Mã catalog 202602)

- Qiagen One step RT-PCR (Mã catalog 210212)

- Mồi cho PCR và giải trình tự phân đoạn gen mã hóa NA

Mồi Trình tự Hướng

Ba-NA-1F AGCGAAAGCAGGAGT Xuôi

Ba-NA-1413R AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT Ngược

N1-780F GGGGAAGATTGTYAAATCAGTYGA Xuôi

N1-1273R CWACCCAGAARCAAGGYCTTATG Ngược

- Mồi cho PCR và giải trình tự phân đoạn gen mã hóa HA

Phân típ cúm Mồi Trình tự Hướng

H5-3F CTC GGA AAC CCA ATG TGT GAC Xuôi

H5-R1 GAC AGT ATT TGG TAA ATT CC Ngược H5HA H5-5R GGA CTC AAG AAT TAT GAA AAG TG Xuôi

H5-3R CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG Ngược

Bm-HA-1F AGCGAAAGCAGGGG Xuôi H1HA và

H1pdm09 HA Bm-NS-890R AGTAGAAACAAGGGTGTTTT Ngược

* Tinh sạch sản phẩm

- Kit làm tinh sạch sản phẩm PCR (khi sản phẩm PCR thu được một băng đặc

hiệu) của hãng Qiagen: Purification kit Qiaquick (250) Mã catalog 28106

41

- Kit làm tinh sạch sản phẩm PCR (khi sản phẩm PCR thu được một gồm nhiều

băng không đặc hiệu, trong số đó có băng là sản phẩm mong muốn) của hãng

Qiagen: Qiaquick Gel Extraction kit (250) Mã catalog 28706

- Kit làm tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide

của hãng Qiagen: DyeEx 2.0 Spin kit Qiagen Mã catalog 63206

* Giải trình tự gen

- Kit BigDye Terminator v3.1 ABI. Mã catalog 4336917

- Polymer: POP 7 ABI. Mã catalog 4352759

Sinh phẩm cho phương pháp xác định nồng độ oseltamivir ức chế

neuraminidase

- 2-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) (Sigma-Aldrich Mã catalog M3671)

- Oseltamivir Carboxylate (Roche. GS4071)

- Zanamivir (Glaxo-Smithkline. GR121167X)

- MUNANA [2’ 2’-(4-Methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid sodium

salt hydrate] (Sigma - Aldrich Mã catalog M8639)

2.3.1.4. Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị

Thiết bị Xuất xứ

Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 3 Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

Tủ an toàn sinh học cấp 2 Bioquell – Anh

Máy khuếch đại gen Biorad – Mỹ

Máy giải trình tự gen ABI3130 Hitachi – Nhật

Máy đọc tín hiệu huỳnh quang Perkin Elmer – Mỹ

Máy ly tâm Beckman Coulter – Mỹ

Votex IKA – Malaysia

42

Dụng cụ

Dụng cụ sử dụng trong các thí nghiệm bao gồm:

- Pipet vi lượng 10µl - 1000µl

- Đầu côn có lọc vô trùng 10µl - 1000µl

- Phiến nuôi cấy tế bào 25cm2, 75 cm2

- Phiến 96 giếng màu đen đáy phẳng

- Tuýp Eppendorf 1,5ml – 2ml

Và các dụng cụ khác.

2.3.2. Kỹ thuật xét nghiệm

2.3.2.1. Phân lập vi rút

Chuẩn bị

- Tế bào MDCK mọc đẹp thành một lớp trong tuýp nuôi cấy tế bào.

- Dung dịch phát triển gồm: D-MEM x10, Fetal Bovine Serum 7,5%, Penicillin 100

U/ml và Streptomycin 100 µg/ml , NaHCO3 và nước cất hai lần vô trùng.

- Dung dịch môi trường nuôi cấy vi rút gồm:D-MEM x10, Bovine serum albumine

2%, Penicillin 100 U/ml và Streptomycin 100 µg/ml , TPCK- treated trypsin và

nước cất hai lần vô trùng.

Các vi rút cúm A/H1N1, A/H1N1pdm09 và A/H3N2 được phân lập tại PTN ATSH

cấp 2, vi rút A/H5N1 được phân lập tại PTN ATSH cấp 3

Tiến hành

- Cho 250 µl bệnh phẩm vào phiến nuôi cấy có tế bào MDCK, ủ 60 phút tại nhiệt độ 33oC, thêm 1,5ml môi trường nuôi cấy, quan sát sự huỷ hoại tế bào (CPE) qua kính

hiển vi lộn ngược trong vòng 1-2 tuần.

43

- Xác định típ và phân típ của chủng vi rút bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng

cầu (HAI) có sử dụng các kháng huyết thanh chuẩn của tổ chức y tế thế giới.

- Phương pháp RT-PCR với các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng thêm để xác định

Bệnh phẩm dịch họng thu thập từ bệnh nhân

RT-PCR với các mồi đặc hiệu

Âm tính

Dương tính

Nuôi cấy trên tế

CPE dương tính

bào MDCK

Giá trị HA ≥ 8

Giá trị HA ≤ 8

CPE âm tính

Cấy chuyển 3 lần, nếu CPE âm tính, bệnh phẩm âm tính

Kiểm tra lại bằng RT-PCR

Định týp bằng phản ứng HAI

típ và phân típ của chủng vi rút cúm A

Sơ đồ 2.1. Quá trình phân lập vi-rút cúm

2.3.2.2. Xác định mức độ kháng thuốc của vi rút cúm với oseltamivir

Nguyên lý

Kỹ thuật xác định mức độ nhạy cảm với oseltamivir bao gồm 2 bước: xác định

mức độ hoạt động của neuraminidase và xác định độ nhạy cảm của vi rút cúm với

oseltamivir bằng phản ứng ức chế neuraminidase (NA). Kỹ thuật này dựa trên

44

nguyên lý hoạt động của NA. Dưới tác dụng của NA, axit sialic phân tách với nhóm

đường, giải phóng vi rút cúm khỏi bề mặt tế bào cảm nhiễm. Do vậy, ức chế sự

phân tách này sẽ cản trở quá trình giải phóng vi rút cúm, ngăn chặn sự phát tán của

vi rút trong cơ thể. MUNANA [2’ 2’-(4-Methylumbelliferyl)-α-D-N-

acetylneuraminic acid sodium salt hydrate] là chất nền huỳnh quang được sử dụng

trong thử nghiệm xác định mức độ nhạy cảm với oseltamivir và mức độ hoạt động

của neuraminidase của vi rút cúm. Trong phản ứng này, MUNANA sẽ bị phân tách

bởi NA, giải phóng phân tử phát huỳnh quang 4-Methylumbelliferyl (4-MU) và

được đọc bởi máy đọc tín hiệu huỳnh quang.

Xác định mức độ hoạt động của neuraminidase

Đây là bước xác định mức độ hoạt động của neuraminidase mà qua đó có thể

xác định được mức phát quang chuẩn, từ đó có thể dựa vào để xác định độ pha

loãng của vi rút trong phản ứng ức chế neuraminidase tiếp theo.

Chất nền MUNANA được đưa vào dung dịch chứa vi rút đã được pha loãng bậc hai bằng dung dịch đệm. Ủ hỗn hợp tại 37oC trong 60 phút, thêm chất dừng phản

ứng, đọc bằng máy đọc tín hiệu huỳnh quang.

Kỹ thuật được thực hiện 3 lần trong cùng một thời điểm để hạn chế sai số.

Phản ứng ức chế neuraminidase

Độ nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir được xác định bởi giá trị IC50 của

vi rút. Giá trị thể hiện nồng độ oseltamivir mà tại đó ức chế được 50% vi rút cúm.

Oseltamivir được pha loãng theo các nồng độ từ 40000nM đến 0.04nM rồi cho

vào dung dịch vi rút đã pha loãng dựa trên các giá trị thu được từ phản ứng xác định mức độ hoạt động neuraminidase nói trên, ủ 37oC/30 phút trong tủ ấm. Sau đó cho MUNANA vào hỗn dịch, ủ 37oC/60 phút trong tủ ấm. Đọc tín hiệu huỳnh quang

trên máy VICTOR X2 trong vòng 20 phút sau khi dừng phản ứng (Sơ đồ 2.2).

45

Thí nghiệm được thực hiện 3 lần tại cùng một thời điểm để hạn chế sai số. Với

các chủng A/H5N1 thí nghiệm sẽ được thực hiện tại phòng thí nghiệm an toàn sinh

học (ATSH) cấp 3. Các chủng cúm A/H1N1, A/H1Npdm09 được thực hiện tại

Chủng cúm A phân típ H1N1, H1N1pdm09, H3N2 và H5N1

Xác định hoạt động của neuraminidase

Ủ 37oC/60 phút Dừng phản ứng

+ 50µl vi rút được pha loãng bậc hai bằng dung dịch đệm + 50µl dung dịch MUNANA

Đọc kêt quả tại bước sóng 355/460nm

Xác định độ pha loãng của từng vi rút

Ủ 37oC/45 phút + 50µl dung dịch MUNANA Ủ 37oC/60 phút Dừng phản ứng

+ 25µl vi rút đã được pha loãng bằng dung dịch đệm + 25µl oseltamivir pha loãng theo nồng độ 0- 40.000nM

Đọc kêt quả tại bước sóng 355/460nm

Xác định giá trị IC50 bằng phần mềm JASPR

phòng thí nghiệm ATSH cấp 2.

46

Sơ đồ 2.2. Quá trình thực hiện xác định mức độ kháng oseltamivir của vi-rút cúm

Chủng chuẩn làm chứng

- Bộ chứng chuẩn được cung cấp bởi phòng thí nghiệm tham chiếu của TCYTTG

tại Melbourne –Úc

Vi rút Phân típ Giá trị IC50 (nM)

A/Mississippi/03/2001 A(H1N1) 0,5

A/Mississippi/03/2001 A(H1N1) 3455

A/Perth/265/2009 A(H1N1pdm09) 0,6

A/Perth/261/2009 A(H1N1pdm09) 2179

A/Fukui/20/2004 A(H3N2) 0,2

A/Fukui/45/2004 A(H3N2) 42,3

Nhận định kết quả

Kết quả sau khi xác định giá trị IC50 được nhận định dựa theo bảng nhận định kết

quả của Tổ chức Y tế Thế giới.

Nhận định giá trị IC50 của vi rút cúm

Cúm A Cúm B Kết quả Từ ngưỡng ức chế bình thường

< 10 lần < 5 lần Thuốc ức chế vi rút mức bình thường

10-100 lần 5 - 50 lần Giảm hiệu quả ức chế vi rút của thuốc kháng vi rút

47

>100 lần > 50 lần Giảm mạnh hiệu quả ức chế vi rút của thuốc kháng vi rút

Nguồn: WHO Weekly epidemiological record, Sep 2012

Ngưỡng ức chế bình thường của thuốc kháng vi rút (oseltamivir) được xác định

trong quá trình thực hiện dựa trên các giá trị IC50 của các vi rút cúm. Mỗi típ/phân

típ vi rút cúm khác nhau có ngưỡng ức chế bình thường khác nhau.

2.3.2.3. Giải trình tự gen sử dụng phương pháp thông thường (Sanger)

Nguyên lý

Sự xuất hiện của các di-deoxynucleotide (các nucleotide mất gốc -OH ở vị trí

Cac-bon 3' và được thay bằng -H, đã được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác

nhau) trong quá trình tổng hợp DNA bổ sung (mẫu gen cần giải trình tự ở dạng

DNA sợi đơn) tạo ra những đoạn DNA có độ dài khác nhau. Khi nucleotide gắn

huỳnh quang được gắn vào đoạn DNA bổ sung, quá trình tổng hợp DNA bổ sung sẽ

bị dừng lại.Mỗi đoạn DNA mang một nucleotide gắn huỳnh quang ở điểm cuối. này

được điện di qua mao quản từ kích thước nhỏ đến lớn và các dideoxynucleotide

được phát hiện bởi đầu đọc laser. Trình tự gen của mẫu chính là trình tự bổ sung các

dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser.

Quá trình thực hiện nói chung bao gồm:

- Tạo sản phẩm PCR

- Tinh sạch sản phẩm PCR

- Chu trình nhiệt tạo đoạn DNA đơn gắn các dideoxynucleotide

- Tinh sạch sản phẩm đã gắn các dideoxynucleotide

- Điện di qua mao quản và đọc trình tự bởi đầu đọc laser.

Tạo đoạn DNA bổ sung

* Các bước tiến hành

Tạo hỗn hợp 1

48

1 1 phản ứng 5µl 1µl 10µl Sinh phẩm Mồi Uni 12 (10nM) dNTPs RNA Ủ 65oC/ 5phút, giữ lạnh

Tạo hỗn hợp 2

Sinh phẩm 1 phản ứng

Đệm x5 5µl

DTT 1µl

RNase inhibitor 1µl

SuperscriptIII RT enzyme 1µl

Giữ lạnh

Trộn hỗn hợp 1 và 2 ủ tại nhiệt độ 50oC/45phút và 70oC/15 phút; sau đó lưu giữ tại -20oC làm mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại phân đoạn gen mã hóa NA.

Khuếch đại phân đoạn gen mã hóa NA

*Tạo hỗn hợp sinh phẩm cho phản ứng PCR

Sinh phẩm 1 phản ứng

Đệm 10x 10 µl

Mồi xuôi (100nM) 0.5 µl

Mồi ngược (100 nM) 0.5 µl

HotStar Taq 2 µl

Nước tinh sạch 29µl

cDNA 8 µl

Tổng 50 µl

Mồi sử dụng cho phân đoạn gen mã hóa NA: Ba-NA-1F, Ba-NA-1413 R

* Chu trình chạy

Chu kỳ

1 vòng Nhiệt độ/ Thời gian 95oC/5phút

49

35 vòng

1 vòng

Giữ cho tới bước tinh sạch tiếp theo 94oC/15 giây 48oC/1 phút 68oC/2 phút 68oC/10 phút 4oC

Tinh sạch sản phẩm PCR

Mục đích: Loại bỏ những đoạn mồi thừa và sinh phẩm sẽ gây nhiễu trong quá

trình giải trình tự phân đoạn gen mã hóa HA và NA. Sản phẩm PCR sau khi điện di

cho nhiều băng, trong đó có băng sản phẩm cần giải trình tự gen, cần tiến hành tinh

sạch sản phẩm trên thạch.

* Các bước tiến hành:

- Cắt băng DNA đặc hiệu trên thạch. Cho thạch vào tuýp 1,5ml hoặc 4,5ml.

- Xác định trọng lượng của miếng thạch. Trộn 3 thể tích đệm QG với 1 thể tích miếng thạch chứa DNA có độ dài từ 70bp - 10kb. Ủ tại 50oC trong 10 phút cho

tới khi thạch hoà tan hết. Lắc tuýp mỗi 2 phút trong quá trình ủ. Kiểm tra dung

dịch có màu vàng trong trước khi tiến hành bước tiếp theo.

- Nhỏ dung dịch nói trên vào cột lọc. Ly tâm 13.000vòng/1 phút. Loại bỏ nước

thu được. Quá trình được lặp lại cho tới khi hết dung dịch.

- Lần ly tâm cuối cùng cho 500µl QG vào cột lọc, ly tâm 13.000vòng/1 phút.

- Rửa DNA bằng 750µl đệm PE, ly tâm 13.000vòng/1 phút. Ly tâm thêm 1 lần

nữa sau khi loại bỏ nước thu được.

- Chuyển cột lọc sang tuýp 1,5ml sạch, cho 30µl đệm EB vào chính giữa cột, ủ

tại nhiệt độ phòng trong vòng 1 phút sau đó ly tâm 13.000vòng/1 phút.

- DNA tinh sạch giữ ở -20oC đến -80oC.

Chu trình nhiệt tạo đoạn DNA gắn các dideoxynucleotide

* Tạo hỗn hợp sinh phẩm cho phản ứng

Sinh phẩm Thể tích

50

Terminator Ready Reaction Mix 8µl

Tuỳ theo chất lượng mà lấy thể tích Mẫu khác nhau

Mồi (3,2 pmol) xuôi hoặc ngược 1µl

Nước tinh sạch X µl

Tổng 20µl

* Xác định hàm lượng DNA trong mẫu theo thang DNA chuẩn * Lượng DNA được tính theo bảng sau: Mẫu Số lượng (sản phẩm PCR)

100-200bp 1-3ng

200-500bp 3-10ng

500-1000bp 10-40ng

>2000bp 20-50ng

Hình 2.1. Thang chỉ thị phân tử chuẩn 1 kb Invitrogen

* Chu trình nhiệt:

Chu kỳ

1 vòng

Nhiệt độ/ Thời gian 96oC/ 1 phút 96 oC/ 10giây 25 vòng

51

Giữ cho tới bước tinh sạch tiếp theo 50 oC/ 5 giây 60 oC/ 4 phút 4 oC

Sinh phẩm được trộn trong từng tuýp 0,2 ml riêng rẽ, ly tâm ngắn trước khi cho vào

máy.

Tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide

Mục đích: Loại bỏ những dideoxynucleotide thừa và sinh phẩm sẽ gây nhiễu trong

quá trình giải trình tự phân đoạn gen mã hóa NA.

* Các bước tiến hành:

- Lắc nhẹ nhàng cột DyeEx 2.0 Spin

- Nới lỏng nắp cột

- Loại bỏ phần dưới cột DyeEx 2.0 Spin, đặt cột vào tuýp thu 2ml

- Ly tâm 8000 vòng / 2- 3 phút loại bỏ dung dịch bảo quản gel

- Chuyển cột DyeEx 2.0 Spin sang tuýp 1,5ml sạch.

- Dùng pipet cho toàn bộ sản phẩm vào cột gel

- Ly tâm 8000 vòng / 2-3 phút

- Loại bỏ cột DyeEx 2.0 Spin

- Làm khô và chuẩn bị đưa vào máy giải trình tự gen. Trong trường hợp không

đưa vào máy ngay, có thể giữ mẫu đã làm khô ở -20oC không quá 24h.

Điện di qua mao quản và đọc trình tự bởi đầu đọc laser

* Chuẩn bị mẫu điện di:

- Cho 10µl HiDi Formamide vào tuýp 1,5ml chứa DNA sau khi tinh sạch ở bước

2 (khi cho vào trộn nhẹ nhàng bằng pipet)

* Chuyển mẫu vào máy:

- Chuyển toàn bộ sản phẩm sang đĩa 96 giếng (dành riêng cho máy ABI 3130) - Ủ tại nhiệt 96oC/5 phút

52

- Sau đó chuyển ngay vào giá giữ lạnh.

- Chuyển đĩa 96 giếng vào máy ABI 3130

2.4. Phân tích số liệu

2.4.1. Phân tích kết quả, xác định ngưỡng và mức độ kháng oseltamivir của vi

rút cúm

Các giá trị IC50 thu được sau khi thực hiện thí nghiệm được xử lý bằng phần

mềm JASPR được cung cấp bởi CDC-Altanta Hoa Kỳ. Giá trị ngưỡng và mức độ

kháng oseltamivir của vi rút cúm được xác định và phân tích thông qua phần mềm

Graphpad Prism 6.0.2, Hoa Kỳ.

2.4.2. Phân tích kết quả giải trình tự gen

Trình tự nucleotide phân đoạn gen mã hóa NA và HA của các vi rút sau khi

được giải trình tự được phân tích sự tương đồng và các điểm đột biến liên quan đến

kháng thuốc bởi phần mềm DNASTAR, Winscosin, USA, Bioedit phiên bản 7.2.3;

cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA và NA được xây dựng bằng phần mềm

MEGA5 sử dụng phương pháp Maximum Likelihood [59]. Các trình tự phân đoạn

gen HA và NA tham chiếu thuộc các phân típ vi rút tương ứng được thu thập từ

ngân hàng dữ liệu DNA (www.ncbi.com).

53

CHƯƠNG III - KẾT QUẢ

3.1. Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 - 2012

Từ năm 2001 đến 2012, tổng số 342 vi rút cúm A được thu thập với các phân típ

A/H1N1, A/H1N1 đại dịch 09 (A/H1N1pdm09), A/H3N2 và A/H5N1. Số lượng và

tỷ lệ của các phân típ vi rút cúm A thay đổi theo từng năm và phụ thuộc vào sự lưu

hành của vi rút cúm trong giai đoạn nghiên cứu [1, 5]. Trong các năm 2001, 2002

và 2006, chỉ thu thập được vi rút cúm thuộc phân típ A/H1N1; năm 2012 chỉ thu

thập được vi rút A/H3N2. Trong khi năm 2003, có cả 3 phân típ vi rút cúm bao gồm

H1N1 (74%), H3N2 (21%) và H5N1 (5%) được thu thập. Tương tự, phân típ H3N2

và H5N1 là hai phân típ cúm thu được trong năm 2004, 2005và 2007.

Bảng 3.1. Phân bố theo năm các phân típ vi rút cúm A sử dụng trong nghiên cứu

A/H1N1

A/H1N1pdm09

A/H3N2

A/H5N1

Tổng

Năm

(N)

(n/N)%

n

(n/N)%

(n/N)%

(n/N)%

N

n

n

8

100

-

-

-

-

-

8

-

2001

4

100

-

-

-

-

-

4

-

2002

14

74

-

-

4

21

1

19

5

2003

-

-

-

-

13

76,4

4

17

23,6

2004

-

-

-

-

2

40

3

5

60

2005

3

100

-

-

-

-

-

3

-

2006

-

-

-

-

16

66,7

8

24

33,3

2007

7

54

-

-

1

7,7

5

13

38,3

2008

6

4,5

86

65,1

36

27,3

4

132

3,1

2009

-

-

13

46,4

12

42,9

3

28

10,7

2010

-

-

58

98,3

1

1,7

-

59

-

2011

-

-

0

0

30

100

-

30

-

2012

157

42

115

28

342

Tổng

n: Số lượng vi rút thu được theo từng năm của mỗi phân típ

N:Số lượng vi rút thu được theo năm

54

Năm 2008, vi rút H1N1 có mặt với chủng đại diện chiếm 54% số chủng trong

năm, 38,3% thuộc vi rút H5N1 và 7,7% là vi rút H3N2. Với sự có mặt của

H1N1pdm09 từ cuối tháng 5 năm 2009, năm 2009 có số chủng thu được thuộc bốn

phân típ tương đương bốn phân típ cúm lưu hành với tỉ lệ 4,5% H1N1,

65,1%H1N1pdm09, 27,3% H3N2 và 3,1% H5N1. Số chủng thu được năm 2010 bao

gồm ba phân típ 46,4% H1N1pdm09, 42,9% H3N2 và 10,7% H5N1. Với sự vắng

mặt của H5N1 năm 2011, số chủng cúm thu được trong năm này chỉ gồm hai phân

típ H1N1pdm09 với tỉ lệ 98,3% và 1,7% H3N2 (Bảng 3.1). Theo thời gian thực hiện

nghiên cứu, số lượng các vi rút lưu hành trong năm cũng như ưu thế của từng phân

típ vi rút thể hiện sự khác nhau. Phân típ vi rút A/H1N1 chiếm tỷ lệ tuyệt đối

(100%) trong các năm 2001, 2002 và 2006, và giảm trong năm 2003 (74%), 2008

(54%). 2009 (4,5%) và hoàn toàn không xuất hiện trong các năm sau (Bảng 3.1). Sự

xuất hiện lần đầu tiên của phân típ A/H1N1pdm09 vào năm 2009 với tỷ lệ 65,1%

(2009), 46,4% năm 2010, 98,3% năm 2011 và không phát hiện trong năm 2012.

Phân típ A/H3N2 không có đại diện trong nghiên cứu tại các năm 2001, 2002, 2006

(0%) nhưng là phân típ vi rút có mặt hầu hết trong các năm nghiên cứu (9/12 năm)

với tỷ lệ dao động từ 1,7% (2011) đến 100% (2012). Với vi rút cúm gia cầm

A/H5N1, lần đầu tiên được ghi nhận gây bệnh cho người vào năm 2003 [115] cũng

có mặt trong nghiên cứu (5%) và tiếp tục xuất hiện với tỷ lệ dao động từ 3,1%

(2009) đến 60% (2005). Vi rút A/H5N1 không xuất hiện tại miền Bắc Việt Nam vào

các năm 2006, 2011 và 2012 (Bảng 3.1)

3.2. Xác định giá trị IC50 ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A

Sử dụng phần mềm JASPR và Graphpad prism chúng tôi xác định giá trị IC50

trung bình và sự phân bố của các giá trị qua biểu đồ hình hộp và tia

(box&whiskers), biểu đồ phân bố độ tập trung. Biểu đồ 1 dạng box&whiskers thể

hiện giá trị nhỏ nhất, giá trị lớn nhất và khoảng liên tứ phân vị của các giá trị IC50

được quy ra log10. Toàn bộ vi rút sử dụng trong nghiên cứu được sử dụng để xác

định giá trị ngưỡng cho từng phân típ, tuy nhiên phần mềm Graphad prism tự động

55

loại bỏ các cá thể có những giá trị vượt ngoài khoảng liên tứ phân vị (IQR) vì vậy

số vi rút sử dụng trong xây dựng giá trị ngưỡng không tương đồng với tổng số vi rút

sử dụng trong nghiên cứu, cụ thể: số vi rút cúm A/H1N1 sử dụng là 30/42 vi rút;

A/H1N1pdm09 là 152/157 vi rút; riêng vi rút A/H5N1 số lượng là 21/28 vi rút do

có 4 chủng không đủ điều kiện thực hiện thử nghiệm ức chế neuraminidase và 3

chủng có giá trị IC50 vượt ngoài khoảng liên tứ phân vị (Bảng 3.2).

Quan sát biểu đồ cho thấy phần lớn các giá trị IC50 của các vi rút tập trung trong

Q3

Giá tr(cid:0) l(cid:0)n nh(cid:0)t

Trung vị (Q2)

Q1

Giá tr(cid:0) nh(cid:0) nh(cid:0)t

khoảng giữa tứ phân vị thứ 1 (Q1) và tứ phân vị thứ 3 (Q3).

Biểu đồ 3.1. Sự phân bố giá trị IC50 của toàn bộ các chủng cúm A, 2001-2012 (biểu

đồ box and whiskers - giá trị trung vị và 2 giá trị lớn nhất, nhỏ nhất - GraphPad Prism)

56

Cho dù có sự phân tán lẻ tẻ của giá trị IC50 trong mỗi biểu đồ của từng phân típ

vi rút nhưng độ tập trung của số đông vẫn được ghi nhận, vì vậy, kết hợp với phân

tích tứ phân vị, chúng tôi có thể xác định được giá trị IC50 ngưỡng của các vi rút

tương đương với giá trị trung bình IC50 và giá trị trung vị (Q2).

Bảng 3.2. Giá trị IC50 trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu

và giá trị IC50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn [114].

Vi rút Số vi rút Giá trị IC50 trung bình (nM)

30/42 0,413 A/H1N1

152/157 0,334 A/H1N1pdm09

115/115 0,164 A/H3N2

21/28 2,947 A/H5N1

Vi rút chứng Giá trị IC50 (nM)

0,5 A/Mississippi/03/2001 (A/H1N1)

0,6 A/Perth/265/2009 (A/H1N1pdm09)

0,2 A/Fukui/20/2004 (A/H3N2)

# : Bộ chứng chuẩn không bao gồm H5N1, chủng chứng được sử dụng là chủng nằm trong

nghiên cứu

1,3 A/Vietnam/1194/2004# (A/H5N1)

57

3.2.1. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H1N1

Giá trị ức chế 50% (IC50) của 30 chủng vi rút cúm A/H1N1 trong nghiên cứu

có giá trị trung bình dao động trong khoảng 0,061 – 0,765nM. Độ tập trung của giá

trị IC50 được biểu thị qua biểu đồ 3.2 với log10 giá trị IC50 cho thấy tổng số 30/42

cá thể có giá trị IC50 nằm dưới giá trị IC50 trung bình (0,413nM) và 12 cá thể còn lại

có IC50 lớn hơn giá trị trung bình. Toàn bộ số cá thể này đều nằm trong trong

khoảng giữa tứ phân vị thứ 1 (Q1) và tứ phân vị thứ 3 (Q3). So sánh với vi rút

chuẩn A/Mississippi/03/2001 (A/H1N1) có giá trị IC50 là 0,5nM cũng nằm trong

nhóm đông của vi rút nghiên cứu, vì vậy giá trị IC50 ngưỡng được xác định cho phân

típ vi rút A/H1N1 trong nghiên cứu này chính là giá trị IC50 trung bình đã được xác

Giá trị trung bình

định là 0,413 ± 0.352 nM (Biểu đồ 3.2)

Biểu đồ 3.2. Độ tập trung các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 trong nghiên cứu

3.2.2. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H1N1pdm09

Với các chủng A/H1N1pdm09, sự dao động giá trị IC50 trong tổng số 152 vi rút

được phân tích không nhiều, độ tập trung cao của 147/ 152 vi rút xung quanh giá trị

IC50 trung bình 0,334nM được ghi nhận tại biểu đồ 3.3, tương tự giá trị IC50 của vi

rút tham chiếu chuẩn A/Perth/265/2009 (A/H1N1pdm09) là 0,6nM, vì vậy giá trị

ngưỡng của vi rút được xác định là 0,334 ± 0,286 nM.(Biểu đồ 3.3.)

58

Giá trị trung bình

Biểu đồ 3.3. Độ tập trung các giá trị IC50 của các

chủng A/H1N1pdm09 trong nghiên cứu

3.2.3. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H3N2

Tổng số 115 chủng vi rút thuộc phân típ A/H3N2 có giá trị IC50 vi rút trung bình

dao động từ 0,04 đến 0,29 nM . Biểu đồ 4 cho thấy sự tập trung cao xung quanh giá

trị IC50 trung bình 0,164 nM , tương đương với giá trị IC50 0,2 nM của vi rút tham

chiếu chuẩn A/Fukui/20/2004 (A/H3N2), vì vậy giá trị IC50 ngưỡng của phân típ vi

Giá trị trung bình

rút cúm A/H3N2 được xác định là 0,164 ± 0,126 nM. (Biểu đồ 3.4.)

Biểu đồ 3.4. Độ tập trung các giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 trong nghiên cứu

59

3.2.4. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H5N1

Tổng số 21/28 chủng vi rút cúm A/H5N1 được chấp nhận phân tích kết quả theo

chương trình Graphpad prism. Phân tích cụ thể theo từng cá thể cho thấy giá trị

IC50 nhỏ nhất là 0,13 nM, giá trị lớn nhất là 8,98 nM đã được ghi nhận. Khoảng

cách giữa các giá trị IC50 đã được biểu hiện trên biểu đồ 3.5 cho thấy số vi rút

A/H5N1 có giá trị IC50 tập trung gần hoặc dưới giá trị IC50 trung bình 2,947 nM

tham chiếu chuẩn chiếm đa số (17/21), giá trị IC50 của chủng vi rút

A/Vietnam/1194/2003 (A/H5N1) là 1,3 nM, thấp hơn giá trị trung bình của các vi

rút trong nghiên cứu. Giá trị ngưỡng của phân típ cúm A/H5N1 được xác định sẽ là

2,947 ± 2,539 nM (Biểu đồ 3.5)

Biểu đồ 3.5. Độ tập trung các giá trị IC50 của các chủng A/H5N1 trong nghiên cứu

Như vậy, chúng tôi đã xác định được giá trị ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A

trong nghiên cứu là:

Phân típ vi rút cúm Giá trị IC50 ngưỡng

Vi rút A/H1N1 0,413 ± 0.352 nM

Vi rút A/H1N1pdm09 0,334 ± 0,286 nM

Vi rút A/H3N2 0,164 ± 0,126nM

Vi rút A/H5N1 2,947 ± 2,539 nM

60

3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A

3.3.1. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H1N1

Tổng số 42 vi rút A/H1N1 lưu hành từ năm 2001 đến 2009 được thu thập, sử

dụng thử nghiệm ức chế neuraminidase (NAI), chúng tôi đã xác định được 12 vi rút

A/H1N1 có giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng trong nghiên cứu. Toàn bộ các vi rút

này được xác định là vi rút lưu hành trong năm 2008 và 2009 (Bảng 3.3).

Bảng 3.3. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và 2009 Giá trị Giá trị IC50/ Giá Giá trị IC50 Năm Tên chủng/Số chủng IC50 (nM)±SD trị IC50 ngưỡng ngưỡng

2001 0,28 ± 0,09 8 0,68

2002 0,51 ± 0,32 4 1,23

2003 0,33 ± 0,14 14 0,79

2006 1,06 ± 0,09 3 2,57

A/Vietnam/TX285/08 534,23 ± 3,58 1294

A/Vietnam/TB289/08 1624,44 ± 4,52 3933

A/Vietnam/TX200/08 456,11 ± 5,38 1104 2008 A/Vietnam/TX233/08 453,28 ± 9,39 1097

A/Vietnam/BT241/08 678,45 ± 6,12 0,413 1643

A/Vietnam/LS324/08 59,98 ± 2,35 145

A/Vietnam/32036/09 704,20 ± 4,80 1705

A/Vietnam/EL197/09 581,24 ± 4,78 1407

A/Vietnam/Q271/09 464,86 ± 6,49 1126 2009 A/Vietnam/31808/09 527,95 ± 15,75 1278

A/Vietnam/34381/09 575,72 ± 5,81 1273

A/Vietnam/N116/09 565,95 ± 11,17 1370

Chứng A/Mississippi/03/2001 458,2 1109

61

Các năm trước đó, vi rút cúm A/H1N1 được xác định là nhạy cảm với oseltamivir,

khi các giá trị IC50 nằm trong giới hạn ngưỡng ức chế bình thường của oseltamivir

đối với vi rút H1N1. Đối với số vi rút cúm A/H1N1 (11 vi rút) trong năm 2008 và

2009 có giá trị IC50 cao hơn giá trị IC50 ngưỡng trên 1000 lần, đặc biệt một chủng

A/Vietnam/TB289/08 có giá trị IC50 1624,44 nM cao gấp 3933 lần giá trị ngưỡng.

Tuy cũng có biểu hiện kháng nhưng A/Vietnam/LS324/08 có giá trị IC50 59,98nM

tương đương gấp hơn 100 lần giá trị ngưỡng.

3.3.2. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H1N1pdm09

Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi xác định được hai chủng cúm

A/H1N1pdm09 là A/Vietnam/33419/09 có giá trị IC50 125.99nM năm 2009 và

A/Vietnam/36530/11 127.91nM năm 2011 có giá trị IC50 tăng từ 350 – 400 lần so

với giá trị IC50 ngưỡng của vi rút H1N1pdm09 (Bảng 3.4).

Ngoài ra, số liệu trong bảng 3.4 còn thể hiện giá trị IC50 của ba chủng

H1N1pdm09 đã được thực hiện năm 2009 [58]. So với giá trị IC50 ngưỡng, ba

chủng H1N1pdm09 này đều có giá trị IC50 cao trên 1000 lần.

Bảng 3.4. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 kháng oseltamivir

năm 2009 và 2011

Giá trị IC50/ Giá trị IC50 Giá trị IC50 Năm Tên chủng Giá trị IC50 (nM)±SD ngưỡng ngưỡng

A/Vietnam/32043/09 429,5 ± 10,25 1422

A/Vietnam/32060/09 323,66 ± 12,68 1072 2009 A/Vietnam/32067/09 889,2 ± 9,73 2944 0,334 A/Vietnam/33419/09 125,99 ± 13,44 417

2011 A/Vietnam/36530/11 127,91 ± 9,84 356

Chứng A/Perth/261/2009 191,2 572

62

3.3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H3N2

Kết quả thử nghiệm NAI thực hiện trên 157 chủng vi rút A/H3N2 cho thấy giá

trị IC50 của các chủng H3N2 dao động trong khoảng 0,038 – 0,29nM, không phát

hiện vi rút nào có giá trị nào vượt giá trị ngưỡng (0,164nM) từ 10 lần trở lên (theo

bảng nhận định kết quả). Bảng 3.5 cho thấy giá trị IC50 theo từng năm của vi rút

H3N2. Kết quả này cho phép khẳng định trong nghiên cứu này vi rút cúm A/H3N2

lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2003 -2012 có đáp ứng tốt với thuốc kháng vi rút

oseltamivir.

Bảng 3.5. Giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 từ năm 2003 đến 2012

Năm SD (nM) Giá trị IC50 trung bình (nM) Giá trị IC50 trung bình ± SD (nM)

2003 0,302 0,299

2004 0,169 0,139

2007 0,323 0,254 0,164 ± 0,126 2009 0,055 0,040

2010 0,093 0,076

2012 0,190 0,099

3.3.4. Mức độ giảm độ nhạy, kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm

A/H5N1

Số chủng vi rút cúm A/H5N1 thực hiện trong nghiên cứu là 28 vi rút phân lập

trên bệnh nhân nhiễm vi rút cúm A/H5N1 trong giai đoạn từ 2004-2010. Kết quả

nghiên

63

Bảng 3.6. Giá trị IC50 các chủng A/H5N1 năm 2005 và 2008

Giá trị IC50/ Giá trị IC50 Giá trị IC50 Năm Tên chủng Giá trị IC50 (nM)±SD ngưỡng ngưỡng

2005 A/Vietnam/HN30408/05 90 ± 5,82 30

A/Vietnam/HN31412/08 19,04 ± 2,34 6 2,947 2008 A/Vietnam/HN31413/08 14,48 ± 2,09 5

Chứng A/Vietnam/HN30408/05 90 30

cứu đã xác định được 2 vi rút A/Vietnam/HN31412/08 và A/Vietnam/HN31413/08

lưu hành năm 2008 có giá trị IC50 đạt 19,04nM (19,04 ± 2,34nM) và 14,48nM

(14,48 ± 2,09nM). Hai vi rút này có giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng lần lượt là 6

lần và 5 lần. Ngoài ra, chủng A/Vietnam/HN30408/05 lưu hành năm 2005 có giá trị

IC50 đã được xác định năm 2005 tăng 30 lần so với giá trị ngưỡng (Bảng 3.6).

3.3.5. Nhận định kết quả kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A lưu

hành 2001 – 2012

Theo phân loại của TCYTTG về sự tương tác của oseltamivir tới các vi rút cúm

liên quan đến hiện tượng giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc [114], kết quả nghiên cứu

của chúng tôi cho thấy có 20 vi rút thuộc các phân típ A/H1N1; A/H1N1pdm09 và

A/H5N1 có giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng được xác định đều có thể xếp loại

vào các mức độ giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir (Bảng 3.7).

64

Bảng 3.7. Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với

oseltamivir

Năm Tên chủng Nhận định kết quả Giá trị IC50/ Giá trị IC50 ngưỡng

Vi rút A/H1N1

A/Vietnam/TX285/08 1294

A/Vietnam/TB289/08 3933

A/Vietnam/TX200/08 1104 2008 A/Vietnam/TX233/08 1097

A/Vietnam/BT241/08 1643

A/Vietnam/LS324/08 145

A/Vietnam/32036/09 1705 Giảm mạnh độ nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir

A/Vietnam/EL197/09 1407

A/Vietnam/Q271/09 1126 2009 A/Vietnam/31808/09 1278

A/Vietnam/34381/09 1273

A/Vietnam/N116/09 1370

Vi rút A/H1N1pdm09

A/Vietnam/32043/09 1422

A/Vietnam/32060/09 1072 2009 A/Vietnam/32067/09 2944 Giảm mạnh độ nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir A/Vietnam/33419/09 417

2011 A/Vietnam/36530/11 356

Vi rút A/H5N1

2005 A/Vietnam/HN30408/05 30 Giảm độ nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir

A/Vietnam/HN31412/08 6

2008 A/Vietnam/HN31413/08 5 Có biểu hiện giảm độ nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir

65

Kết quả bảng 3.7 cho thấy nhóm 12 vi rút cúm A/H1N1 với biểu hiện giá trị

IC50 cao hơn giá trị ngưỡng từ 145 - 3933 lần sẽ được xếp vào nhóm các vi rút

giảm mạnh độ nhạy cảm với thuốc kháng vi rút oseltamivir. Tương tự, nhóm 5

chủng cúm H1N1pdm09 cũng được xếp vào nhóm các vi rút giảm mạnh độ nhạy

với thuốc kháng vi rút oseltamivir khi giá trị IC50 của vi rút nhóm này cao hơn giá

trị ngưỡng từ 356 đến 2944 lần. Vi rút H5N1 với giá trị IC50 chỉ lớn hơn giá trị

ngưỡng 5-6 lần được đánh giá ở mức có biểu hiện giảm độ nhạy (hai vi rút) và vi rút

có giá trị IC50 lớn hơn giá trị ngưỡng 30 lần được xác định là giảm độ nhạy với

osetlamivir. Số vi rút còn lại trong nghiên cứu (322 vi rút) đều có giá trị IC50 nhỏ

hơn , bằng hoặc trong giới hạn của giá trị ngưỡng, đặc biệt toàn bộ số chủng vi rút

cúm A/H3N2 trong nghiên cứu đều được xác định là nhạy cảm với oseltamivir

(Bảng 3.5).

3.4. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng vi rút cúm A liên quan đến

kháng thuốc oseltamivir

Toàn bộ 20 vi rút cúm A có biểu hiện các mức độ giảm độ nhạy với

oseltamivir được tiến hành xác định đột biến liên quan thông qua phân tích trình tự

phân đoạn gen mã hóa NA. Các vị trí đột biến thường gặp liên quan đến hiện tượng

giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir của các phân típ vi rút khác nhau thường

không giống nhau do cấu trúc của protein NA của các phân típ. Biểu hiện giảm độ

nhạy hoặc kháng oseltamivir có thể là kết quả của một hoặc nhiều đột biến trên

protein NA của vi rút. Các vi rút được phân tích trong nghiên cứu này là A/H1N1,

A/H1N1pdm09 và A/H5N1 thuộc phân típ NA1 (N1), vì vậy một số đột biến tương

đồng và thường gặp trên phân đoạn gen mã hóa N1 được ghi nhận là H275Y,

N295S hoặc I117V sẽ được phân tích bằng phương pháp phân tích trình tự chuỗi

thông thường (Sanger sequecing). Kết quả sẽ được xác nhận khi so sánh với trình

tự chuỗi nucleotide của các vi rút không có biểu hiện giảm độ nhạy hoặc kháng

oseltamivir và các vi rút tham chiếu chuẩn.

66

3.4.1. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng vi rút cúm A/H1N1 liên

quan đến kháng thuốc oseltamivir

Năm vị trí đột biến liên quan đến giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir trên

phân đoạn gen mã hóa NA của các vi rút cúm A/H1N1 thường gặp là Q137K

(Glutamine chuyển sang Lysine), Y156H (Tyrosine chyển sang Histidine), I223V

(Isoleucine chuyển sang Valine), S247G (Serin chuyển sang Glycin) và H275Y

(Histidine chuyển sang Tyrosine) [44]. Kết quả phân tích trình tự phân đoạn gen mã

hóa NA của 12 vi rút cúm A/H1N1 cho thấy toàn bộ các vi rút này đều phát hiện đột

biến tại vị trí 275. Cụ thể, trình tự nucleotide đã có sự thay đổi từ CAC (bộ ba mã

hóa cho Histidine-H) sang TAC (bộ ba mã hóa cho Tyrosine), và protein thay đổi

tại vị trí này được ghi nhận là H275Y (Hình 3.1) . Không phát hiện các đột biến liên

quan khác tại vị trí 137, 156, 223 hoặc 247.

Hình 3.1. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1

67

3.4.2. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng vi rút cúm A/H1N1pdm09

liên quan đến kháng thuốc oseltamivir

Vi rút cúm A/H1N1pdm09 được ghi nhận các đột biến liên quan đến hiện tượng

giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir bao gồm I223M, I223K, S247N, H275Y và

đồng đột biến tại hai vị trí Q313K và I427T [44]. Tương tự với kết quả phân tích

phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm A/H1N1, tổng số 5 vi rút A/H1N1pdm09

có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir đều xuất hiện đột biến H275Y trên

protein NA (hình 3.2). Các đột biến khác tại các vị trí I223M, I223K, S247N không

được phát hiện trên các vi rút này.

Hình 3.2. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1pdm09

68

3.4.3. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng vi rút cúm A/H5N1 liên

quan đến kháng thuốc oseltamivir

Trên phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm gia cầm A/H5N1, các vị trí axit

amin thay đổi liên quan đến giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir bao gồm I117V,

Q136L, D199G, S247N, H275Y, N295S [44]. Trong nghiên cứu này toàn bộ 28 vi

rút cúm A/H5N1 được phân tích trình tự chuỗi nucleotide (1413 nucleotide).

Kết quả cho thấy trong 3 vi rút có biểu hiện tăng IC50 và mang đột biến H275Y

được phát hiện trên vi rút A/Vietnam/HN30408, không phát hiện trên hai vi rút còn

lại là A/Vietnam/HN31412/08 và A/Vietnam/HN31413/08. Tuy nhiên đột biến tại

vị trí I117V đã được phát hiện trên hai chủng này. Ngoài ra, chủng

A/Vietnam/HN31209/07cũng được phát hiện mang đột biến I117V trên phân đoạn

gen mã hóa NA nhưng không xác định được giá trị IC50. Các đột biến còn lại

Q136L, D199G, S247N, N295S không được xác định trong nghiên cứu này (Hình

3.3 và 3.4).

Hình 3.3. Đột biến tại vị trí 117 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1

69

Hình 3.4. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1

3.5. Tỉ lệ các chủng vi rút cúm A kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam,

2001-2012

Vi rút được xác định giảm độ nhạy oseltamivir dựa vào hai yếu tố quyết định,

mức độ giảm độ nhạy (biểu hiện kiểu hình) và xuất hiện điểm đột biến liên quan

đến kháng thuốc xảy ra trên phân đoạn gen mã hóa NA (kiểu gen) của cùng một vi

rút.

Bảng 3.8 cho thấy tổng số 20 vi rút được phát hiện có biểu hiện tăng IC50 ở các

mức độ giảm độ nhạy khác nhau đều xuất hiện đột biến liên quan. Đột biến được

ghi nhận phổ biến là H275Y (Histidine chuyển sang Tyrosine), xuất hiện trên 18/20

vi rút, đột biến I117V chỉ xuất hiện trong 2 vi rút có giá trị IC50 lớn hơn ngưỡng 5-

6 lần

70

Bảng 3.8. Mức độ giảm nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir và các điểm đột biến

Năm

Tên chủng

Nhận định kết quả

Đột biến

Giá trị IC50/ Giá trị IC50 ngưỡng

Vi rút A/H1N1

1294

A/Vietnam/TX285/08

3933

A/Vietnam/TB289/08

1104

A/Vietnam/TX200/08

2008

1097

A/Vietnam/TX233/08

1643

A/Vietnam/BT241/08

H275Y

145

A/Vietnam/LS324/08

1705

A/Vietnam/32036/09

Giảm mạnh độ nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir (trung bình 1448 lần)

1407

A/Vietnam/EL197/09

1126

A/Vietnam/Q271/09

2009

1278

A/Vietnam/31808/09

1273

A/Vietnam/34381/09

1370

A/Vietnam/N116/09

Vi rút A/H1N1pdm09

1422

A/Vietnam/32043/09

1072

A/Vietnam/32060/09

2009

H275Y

2944

A/Vietnam/32067/09

417

A/Vietnam/33419/09

Giảm mạnh độ nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir (trung bình 1242 lần)

356

2011

A/Vietnam/36530/11

Vi rút A/H5N1

30

2005

A/Vietnam/HN30408/05

H275Y

6

A/Vietnam/HN31412/08

2008

I117V

5

A/Vietnam/HN31413/08

Giảm độ nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir Có biểu hiện giảm độ nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir

71

Căn cứ vào kết quả trên, tỉ lệ giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc theo từng phân típ

trong khoảng thời gian từ 2001 đến 2012 là 28,5% (12/42) đối với chủng cúm

A/H1N1, 3,2% (5/157) chủng vi rút cúm A/H1N1pdm09 và một chủng chủng vi rút

A/H5N1giảm nhạy cảm với oseltamivir; phân típ A/H3N2 thể hiện sự nhạy cảm

với oseltamivir qua bảng 3.9.

Bảng 3.9. Tỉ lệ kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A trong nghiên cứu dựa

trên hai phương pháp (ức chế neuraminidase và giải trình tự gen)

Số chủng kháng oseltamivir/ Tổng số chủng

Chủng vi rút

Năm

Tỉ lệ kháng oseltamivir theo năm (%)

Tỉ lệ kháng oseltamivir chung (%)

Phương pháp NAI

Phương pháp giải trình tự gen

2001-2007

0/29

0/29

0

2008

6/7

6/7

85,7

A/H1N1

28,5 (12/42)

2009

6/6

6/6

100

2009

4/86

4/86

4,7

2010

0/13

0/13

0

A/H1N1pdm09

3,2 (5/157)

2011

1/58

1/58

1,7

A/H3N2

2003-2012

0/115

0/115

0

0

Phân tích theo từng năm, mỗi phân típ cúm thể hiện sự kháng oseltamivir với

các tỉ lệ khác nhau. Chủng cúm A/H1N1 thu thập từ năm 2001 đến 2006 nhạy cảm

với thuốc kháng vi rút oseltamivir, tuy nhiên, 12 vi rút thu thập trong hai năm 2008

và 2009 có giá trị IC50 cao và được xác định 100% mang đột biến liên quan đến

kháng oseltamivir. Tỉ lệ chủng kháng thuốc của A/H1N1 năm 2008 là 85,7% (6/7

chủng) và 2009 là 100% (6/6 chủng).

72

Đối với vi rút cúm A/H1N1pdm09 thu thập trong năm 2009 chúng tôi đã xác

định được 4 trong tổng số 86 chủng nghiên cứu được nằm trong tiêu chuẩn giảm độ

nhạy oseltamivir và chiếm tỉ lệ 4,7% (4/86). Tương tự, kết quả nghiên cứu đã xác

định 1 trường hợp vi rút cúm A/H1N1pdm09 lưu hành năm 2011 trong tổng số 58

vi rút thu thập đạt tiêu chuẩn chiếm tỉ lệ 1,7% (1/58).

Đối với vi rút cúm A/H5N1, nghiên cứu này xác định 3 chủng vi rút đảm bảo

tiêu chuẩn về kiểu hình và kiểu gen trong giới hạn giảm độ nhạy hoặc kháng

oseltamivir. Do số lượng vi rút cúm A/H5N1 hạn chế nên chúng tôi không phân

tích tỷ lệ theo năm.

3.6. Sự tương đồng về phân đoạn gen mã hóa HA và NA giữa các vi rút cúm A

có biểu hiện giảm độ nhạy osletamir với các vi rút cùng phân típ lưu hành

trong giai đoạn nghiên cứu.

Các vi rút được xác định có biểu hiện giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir

trong nghiên cứu này đều xuất hiện các đột biến liên quan tại protein NA. Nhằm

tìm hiểu những đột biến này có liên quan đến sự tiến hóa của vi rút cúm A hoặc có

thể ảnh hưởng tới sự thay đổi kháng nguyên của các vi rút, chúng tôi tiến hành phân

tích các gen liên quan HA và NA, xây dựng cây gia hệ để đánh giá sự tương đồng

về mặt di truyền cũng như khả năng tiềm tàng thay đổi đặc tính kháng nguyên.

3.6.1. Sự tương đồng về gen giữa các chủng cúm A/H1N1 giảm độ nhạy cảm

oseltmivir với các chủng vi rút cúm A/H1N1 trên thế giới

Cây gia hệ HA của vi rút A/H1N1 được xây bởi phương pháp Maximum

Likelihood bằng trình tự các vi rút A/H1N1 trong nghiên cứu , các vi rút đại diện

trong khu vực (Trung Quốc, Malaysia, Úc), châu Âu và châu Mỹ và các vi rút dự

tuyển văc xin trong giai đoạn nghiên cứu: A/New Caledonia/20/1999,

A/Wellington/1/2001, A/Solomon Island/3/2006 và A/Brisbane/59/2007. Hình ảnh

cây gia hệ cho thấy phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút H1N1 lưu hành tại Việt

Nam 2001 – 2009 được chia thành 2 nhóm chính: nhóm 1 và nhóm 2. Các vi rút

73

trong nhóm 1 lại được phân tách thành các phân nhóm phụ : 1A ,1B và 1C; tương

tự, nhóm 2 có các phân nhóm phụ 2A, 2B và 2C. Các vi rút trong nghiên cứu có

biểu hiện giảm độ nhạy osletamivir đều nằm trong nhóm 2 và phân bố tại các nhóm

phụ 2B (12 vi rút). Nhóm 2 của cây gia hệ được tập hợp bởi các vi rút lưu hành

trong các năm 2006 và 2008 và có độ tương đồng cao với vi rút dự tuyển văc xin

A/Solomon Island/3/2006. Như vậy, theo phân tích cây gia hệ, các vi rút biểu hiện

kháng oseltamivir không tạo các nhóm riêng và tương đồng cao với các vi rút lưu

hành trong cùng thời gian (Hình 3.5 và 3.6).

Song song với phân đoạn gen mã hóa HA, cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA

cũng có sự phân nhánh rõ rệt từ nhóm 1 bao gồm các vi rút năm 2001; nhóm 2 với

các vi rút lưu hành từ 2003-2009 và tạo thành nhóm phụ 2A bởi các vi rút lưu hành

năm 2003, nhóm phụ 2C gồm các vi rút lưu hành năm 2006-2009. Trong cây gia hệ

của phân đoạn gen mã hóa NA, các chủng kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam

hai năm 2008 và 2009 được nhóm vào nhóm 2C và không xác định sự khác biệt về

di truyền học giữa các vi rút giảm độ nhạy oseltamivir và các vi rút cùng lưu hành

trong cùng thời gian tại Việt nam và các nước trong khu vực (Hình 3.7 và 3.8).

74

Hình 3.5. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009

75

Hình 3.6. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N1 –

nhóm 2, 2001-2009

76

Hình 3.7. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009

77

Hình 3.8. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm

A/H1N1- nhóm 2, 2001-2009

78

3.6.2. Sự tương đồng về gen giữa các chủng cúm A/H1N1pdm09 giảm độ nhạy

cảm oseltmivir với các chủng cúm A/H1N1pdm09 trên thế giới

Tổng số 119 trình tự toàn bộ độ dài phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút

A/H1N1pdm09 bao gồm các vi rút đại diện lưu hành tại Việt Nam (65 trình tự) và

các nước trong khu vực được đưa vào phần mềm Mega 5 xây dựng cây gia hệ vi rút

A/H1N1pdm09 sử dụng phương pháp Maximum Likelihood. Chủng dự tuyển văc

xin A/California/07/99 được chọn làm gốc của cây gia hệ. Hình 3.9 cho thấy, các

chủng cúm H1N1pdm09 năm 2009 và 2010 tại Việt Nam có độ tương đồng cao với

các chủng lưu hành tại Thái Lan và Trung Quốc, không thể hiện sự phân nhánh rõ

ràng so với chủng gốc A/California/07/99. Bốn phân đoạn gen mã hóa HA của các

vi rút A/H1N1pdm09 giảm độ nhạy cảm oseltamivir năm 2009 tương đồng cao với

các chủng lưu hành trong cùng năm. Đối với các vi rút gây dịch năm 2011 và 2013,

chúng tôi nhận thấy đã có sự phân tách nhánh thành hai nhánh riêng biệt cho từng

năm (2011 và 2013). Vi rút giảm độ nhạy cảm với oseltamivir năm 2011 nằm trong

phân nhánh cùng với các vi rút khác lưu hành cùng năm (Hình 3.9).

Phân đoạn gen mã hóa NA của các chủng H1N1pdm09 thể hiện sự tương đồng

cao với chủng dự tuyển văc xin A /California/07/99 và các chủng khác lưu hành tại

các nước láng giềng Thái Lan, Trung Quốc và các nước trong khu vực Singapore,

Đài Loan-Trung Quốc, Úc từ năm 2009-2011. Phân đoạn gen mã hóa NA của các vi

rút giảm độ nhạy oseltamivir không có biểu hiện tách nhánh, thể hiện sự tương đồng

cao với các chủng cùng thời kỳ.

Như vậy, tuy có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir với các mức độ

khác nhau, mang đột biến trên protein NA tại vị trí H275Y nhưng năm chủng

H1N1pdm09 không thể hiện sự khác biệt trong quá trình tiến hóa của vi rút (Hình

3.10).

79

80

Hình 3.9. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm

A/H1N1pdm09, 2009-2012

81

Hình 3.10. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm

A/H1N1pdm09, 2009-2012

3.6.3. Sự tương đồng về gen giữa các chủng cúm A/H5N1 giảm độ nhạy cảm

oseltmivir với các chủng cúm A/H5N1 trên thế giới

Sử dụng phần mềm MEGA5, phương pháp Maximum Likelihood để xây dựng

cây gia hệ HA và NA của vi rút cúm A/H5N1. Trình tự toàn bộ độ dài phân đoạn

gen mã hóa HA (1778 nucleotide) của các chủng cúm gia cầm A/H5N1 gây bệnh

trên người (25/28 chủng) và động vật tại Việt Nam cùng các chủng H5N1 trên

người và gia cầm tại các nước và vùng lãnh thổ khác như Hồng Kông, Thái Lan,

Indonesia, Trung Quốc thu thập theo chiều dài thời gian nghiên cứu được đưa vào

cây gia hệ. Gốc của cây gia hệ được xác định là vi rút A/Hongkong/156/97, chủng

vi rút H5N1 đầu tiên phân lập được trên người [107], cùng với các vi rút trên gia

cầm tại Quảng Đông (1996), Sơn Đông (2003) và vi rút gây bệnh trên người tại

Hồng Kông năm 1997 tạo thành clade 0 [95]. Hình 3.11 cho thấy từ clade 0, vi rút

H5N1 phát triển thành nhiều clade khác nhau, tính đến 2012, có tổng số 10 clade

được đề cập đến (0-9). Vi rút H5N1 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam (6 chủng) từ

năm 2003-2005 tập trung tại calde 1, có sự tương đồng với các chủng H5N1 của

Thái Lan, Trung Quốc và Cambodia. Chủng H5N1 giảm độ nhạy cảm với

oseltamivir A/Vietnam/HN30408/2005 nằm trong phân nhánh của các vi rút lưu

hành năm 2004 và 2005. Các vi rút thu thập được trong những năm tiếp theo thể

hiện sự phân tách rõ rệt sang clade 2, vi rút H5N1 tại Việt Nam nằm trong phân

nhánh 2.3.4 cùng các chủng vi rút đến từ Trung Quốc với sự xuất hiện sớm nhất của

chủng A/Vietnam/HN30850/2005. Tuy nhiên, trong phân nhánh này, các vi rút lại

phân tách thành những phân nhánh nhỏ hơn từ 2.3.4.1 đến 2.3.4.3. Clade 2.3.4.3 bao gồm hầu hết các vi rút H5N1 gây bệnh trên người và động vật tại Việt Nam

năm 2007 và 2008, tương đồng với chủng A/chicken/Fujian/1/2007 của Trung

Quốc. Hai chủng A/Vietnam/HN31412/2008 và A/Vietnam/HN31413/2008 mang

đột biến liên quan đến kháng thuốc tại vị trí I117V trên protein NA và có biểu hiện

giảm độ nhạy cảm với oseltamivir cũng nằm trong phân nhánh 2.3.4.3.

82

Như vậy, với các vi rút H5N1 trên người nhạy cảm hoặc giảm sự nhạy cảm với

oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam, phân đoạn gen mã hóa HA đều có sự tiến hóa

chung với các chủng lưu hành trên gia cầm tại Việt Nam và có sự tương đồng với

các chủng H5N1 gây bệnh tại miền Nam Trung Quốc (Hình 3.11-3.13).

Kết quả phân tích cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm A/H5N1

cho thấy, phân đoạn gen mã hóa NA được phân tách thành hai nhóm chính. Nhóm

thứ nhất là các vi rút H5N1 lưu hành trên chim hoang có phân đoạn gen mã hóa NA

đầy đủ. Nhóm thứ hai bao gồm các vi rút H5N1 mang protein NA bị mất 20 axit

amin ở phần thân được ghi nhận thích ứng vào gia cầm và gây bệnh cho người [95].

Nhóm thứ hai hình thành bởi các các vi rút mang phân đoạn gen mã hóa HA thuộc

clade 1, clade 2.3.4.3 và 2.3.4.2. Không có sự phân tách thành nhiều nhóm phụ như

cây HA, tuy nhiên các vi rút thuộc nhóm II cũng hình thành 2 nhóm phụ chính (2A

và 2B tương đương clade 1 và clade 2 theo phân đoạn gen mã hóa HA). Vi rút

A/Vietnam/HN30408/2005 mang đột biến H275Y biểu hiện giảm độ nhạy với

oseltamivir thuộc nhóm 2A. Hai vi rút còn lại đã được xác định mang đột biến

I117V trên protein NA (A/Vietnam/HN31412/2008 và A/Vietnam/HN31413/2008)

nằm trong nhóm 2B. Kết quả trên cho thấy, phân đoạn gen mã hóa NA của các vi

rút mang đột biến liên quan đến giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir không nằm

ngoài nhóm các vi rút lưu hành cùng thời kỳ và có sự tiến hóa tương đương với

phân đoạn gen mã hóa HA (Hình 3.14).

Như vậy, các vi rút H5N1 trong nghiên cứu có biểu hiện giảm độ nhạy với

oseltamivir mang phân đoạn gen mã hóa HA và NA có cùng độ tiến hóa với các vi

rút H5N1 trên người và các vi rút gây bệnh trên gia cầm khác tại miền Bắc Việt

Nam.

83

Hình 3.11. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm

84

A/H5N1, 2003-2010

Hình 3.12. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm

A/H5N1 clade 1, 2003-2004

Hình 3.13. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm

85

A/H5N1 clade 2.3.4, 2007-2010

Hình 3.14. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm

86

A/H5N1, 2003-2010

CHƯƠNG IV - BÀN LUẬN

4.1. Sự lưu hành của các vi rút cúm A trong khoảng thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu của chúng tôi dựa trên các chương trình giám sát cúm đã thực hiện tại

miền Bắc Việt nam từ năm 2001-2005 và chương trình giám sát cúm quốc gia từ

2006-2012. Kết quả giám sát cho thấy vi rút cúm mùa là A/H1N1 và A/H3N2 lưu

hành luân phiên nhau trong khoảng thời gian 2001 đến đầu năm 2009 [1, 5]. Từ

tháng 5 năm 2009, vi rút A/H1N1pdm09 xuất hiện gây đại dịch toàn cầu và tiếp tục

1

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

1 g n á h T

3 g n á h T

5 g n á h T

7 g n á h T

9 g n á h T

1 g n á h T

3 g n á h T

5 g n á h T

7 g n á h T

9 g n á h T

1 g n á h T

3 g n á h T

5 g n á h T

7 g n á h T

9 g n á h T

1 g n á h T

3 g n á h T

5 g n á h T

7 g n á h T

9 g n á h T

1 g n á h T

3 g n á h T

7 g n á h T

9 g n á h T

1 g n á h T

3 g n á h T

5 g n á h T

7 g n á h T

9 g n á h T

1 g n á h T

3 g n á h T

5 g n á h T

7 g n á h T

9 g n á h T

1 1 g n á h T

1 1 g n á h T

1 1 g n á h T

1 1 g n á h T

1 1 g n á h T

1 1 g n á h T

1 1 g n á h T

2006

2007

2008

2009

2010

2012

2011

H1N1pdm09

H1N1

H3N2

Cúm B

gây dịch trong các năm tiếp theo cùng vi rút cúm A/H3N2 đã biết [38, 77, 98, 108].

Biểu đồ 4.1. Sự lưu hành vi rút cúm tại Việt Nam 2006 - 2012

Nguồn: Chương trình giám sát cúm Quốc gia, viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.

87

Số lượng 342 chủng cúm A thu được trong nghiên cứu trong giai đoạn 2001-

2012 với các phân típ đại diện cho từng năm lưu hành đã đảm bảo tính bao quát của

nghiên cứu. Với số lượng 42 vi rút cúm A/H1N1; 157 vi rút cúm A/H1N1pdm09;

115 vi rút cúm A/H3N2 và 28 vi rút cúm A/H5N1 phản ánh quy mô của hoạt động

giám sát cúm tại Việt Nam. Trong giai đoạn 2001-2005, giám sát cúm chưa thành

hệ thống, chỉ được thực hiện tại một số điểm giám sát của Hà Nội vì vậy số lượng vi

rút thu thập trong các năm này thấp dao động từ 4 vi rút (2001) đến 19 vi rút

(2003), trong khi số vi rút thu thập tại các năm sau đó cao hơn từ 24 vi rút (2007)

đến 132 vi rút (2009) sau khi hệ thống giám sát cúm quốc gia hình thành với sự tăng

số điểm giám sát thường xuyên (Bảng 3.1). Tỷ lệ của các phân típ vi rút thu thập

trong từng năm của nghiên cứu tương đồng tỷ lệ lưu hành các phân típ vi rút cúm A

trong kết quả giám sát (Bảng 3.1, Biểu đồ 5.1). Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụng vi

rút phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng dương tính với RT-PCR, vì vậy một số phân típ

vi rút sẽ không có mặt trong nghiên cứu khi sự lưu hành của phân típ này với tỷ lệ

quá thấp, ví dụ năm 2012 có ghi nhận sự lưu hành của A/H1N1pdm09 (Biểu đồ

5.1), nhưng không phân lập được vi rút (Bảng 3.1). Vì vậy kết quả nghiên cứu tuy

mang tính tổng quan nhưng chưa thực sự đại diện và đầy đủ, do đó việc nâng cao

hiệu quả của công tác phân lập vi rút là rất cần thiết trong những nghiên cứu tiếp

theo.

Song hành với các vi rút cúm mùa, vi rút cúm gia cầm A/H5N1 được xác định

gây bệnh trên người từ năm 1997 và bùng phát năm 2003 với tỉ lệ tử vong cao.

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, tại Việt Nam tính đến năm 2013 có 125

ca mắc và 62 ca tử vong (49,6%) [115]. Khác với các vi rút cúm mùa, sự xuất hiện

vi rút A/H5N1 tại Việt Nam không theo chu kỳ và được xác định có liên quan đến

sự nhiễm cúm trên đàn gia cầm [55, 75, 123]. Tổng số 28 chủng vi rút cúm A/H5N1

thu thập trong nghiên cứu được tập trung vào các năm 2004, 2007 và 2008; không

thu thập được trong các năm 2006, 2011 và 2012 (Bảng 3.1). Trong năm 2006,

không ghi nhận trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 tại Việt Nam, tiếp theo các năm

2011 và 2012 số người nhiễm vi rút cúm A/H5N1 có được ghi nhận tại Việt Nam,

88

tuy nhiên các trường hợp này chỉ được xác định tại khu vực phía Nam [115]. Như

vậy, kết quả thu thập vi rút cúm gia cầm A/H5N1 trong nghiên cứu này đã phản ánh

đúng tình hình nhiễm cúm A/H5N1 trên người tại miền Bắc Việt Nam trong giai

đoạn 2003-2012.

4.2. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông

qua giá trị ức chế 50% (IC50)

4.2.1 Giá trị IC50 ngưỡng của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt

Nam

Phương pháp xác định giá trị ức chế 50% (IC50) của oseltamivir bằng thử

nghiệm ức chế neuraminidase (chất phát quang flouroresence) với các vi rút cúm A

lần đầu tiên được áp dụng tại PTN cúm viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương với mục

đích xác định giá trị ngưỡng (IC50) của từng típ/phân típ vi rút cúm để từ đó có thể

xác định mức độ giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành

tại Việt nam theo thường quy của TCYTTG.

Từ những kết quả thu được trong nghiên cứu cho thấy sự tương tác của

oseltamivir tới mỗi phân típ vi rút cúm khác nhau không giống nhau cho dù có cùng

kiểu dạng protein NA thể hiện ở giá trị IC50 trung bình cho các phân típ vi rút cúm

mang protein NA1 lưu hành tại Việt Nam (Bảng 3.2). Kết quả của chúng tôi phù

hợp với những nghiên cứu trước đó tại Úc, Anh và Nhật [36, 79, 104, 122]. Tại

Anh, giá trị IC50 trung bình của vi rút cúm A/H1N1 và A/H3N2 lần lượt là 0,45-

1,73 nM và 0,2-0,94 nM [122]. Sự khác nhau này có thể giải thích do mỗi vi rút

cúm xâm nhập vào các quần thể người khác nhau có thể tạo ra các biểu hiện kiểu

hình (phenotype) khác nhau trong quá trình tiến hóa. Ngoài ra, sự khác nhau về giá

trị ngưỡng của típ/phân típ vi rút cúm có thể do mỗi neuraminidase của từng loại

cúm có sự tương tác khác nhau với oseltamivir, điển hình là vi rút cúm B, trên phân

đoạn gen mã hóa NA không mang các đột biến liên quan đến kháng thuốc nhưng

giá trị IC50 thu được cao hơn ở vi rút cúm A [79] hoặc vi rút cúm A/H5N1 có giá trị

89

IC50 trung bình cao hơn các phân típ cúm A khác như đã trình bày trong phần Kết

quả.

Theo dõi được sự đa dạng trong tương tác của vi rút cúm với oseltamivir theo

từng năm ta có thể xây dựng được cơ sở dữ liệu về giá trị IC50 của từng vi rút cúm

theo từng phân típ, tạo nền tảng để thực hiện công tác giám sát kháng thuốc của vi

rút cúm tại miền Bắc Việt Nam nói riêng và mở rộng ra toàn quốc nói chung. Theo

hướng dẫn của tổ chức APHL (Association of Public Health Laboratories), giá trị

IC50 trung bình của mỗi phân típ cúm phải được cập nhật theo từng năm. Mỗi năm ít

nhất 20 chủng vi rút thuộc từng phân típ cúm phải được thực hiện xác định giá trị

IC50 và đưa vào cơ sở dữ liệu [8].

Sự tương tự về kết quả trong nghiên cứu được khẳng định, tuy nhiên giá trị thực

tế của IC50 tại mỗi quốc gia sẽ khác nhau, ví dụ vi rút cúm B tại Việt Nam có IC50

được xác định là 24,79 nM, trong khi giá trị này tại Anh được xác định là 15.19 nM

[122]. Vì vậy, việc xác định giá trị ngưỡng IC50 cho từng quốc gia, từng khu vực địa

lý là cần thiết trong việc tiến hành giám sát sự kháng thuốc tại từng quốc gia.

Nghiên cứu của chúng tôi xác định giá trị IC50 ngưỡng cho từng phân típ vi rút cúm

A được thực hiện dựa trên thực tế của chính các vi rút sử dụng trong nghiên cứu. Sử

dụng phần mềm Graphpad prism cho phép xác định được độ tập trung của các cá

thể khác nhau, đồng thời cho phép xác định giá trị giá trị nhỏ nhất, giá trị lớn nhất

và khoảng liên tứ phân vị của các giá trị IC50. Từ đó có thể xác định được giá trị

ngưỡng thông qua tính đại diện của số đông trong quần thể nghiên cứu và đảm bảo

được sự tương đồng với của từng phân típ khi kết hợp với giá trị IC50 trung bình của

vi rút tham chiếu chuẩn được cung cấp bởi hiệp hội quốc tế giám sát sự kháng thuốc

của vi rút cúm (ISRIV-AVG) [45]. Giá trị ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A

được xác định trong nghiên cứu này đã đảm bảo tính chính xác cho các kết quả của

nghiên cứu.

4.2.2. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir

90

Trong thời gian nghiên cứu, từ 2001 đến 2012, vi rút cúm A lưu hành tại miền

Bắc Việt Nam luôn thể hiện những sự biến đổi thích nghi với vật chủ (người) tương

tự như các phân típ vi rút cúm lưu hành trên thế giới như thay đổi đặc tính kháng

nguyên (H3N2, H5N1) [55, 71, 72, 120], hoặc sự thích nghi liên quan đến khả năng

gây bệnh trên người của vi rút cúm gia cầm A/H5N1 [57, 75, 99]. Sự thay đổi về độ

mẫn cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút cũng là một biểu hiện của sự thay đổi để

thích nghi và phát triển trên vật chủ của vi rút cúm. Thông qua giá trị ức chế 50%

của oseltamivir (IC50) với các vi rút cúm A, nghiên cứu của chúng tôi đã xác định

được tổng số 20 vi rút cúm thuộc các phân típ A/H1N1, A/H1N1pdm09 và A/H5N1

yêu cầu nồng độ oseltamivir cao để ức chế sự phát triển của mình. Các vi rút này

được xếp vào nhóm giảm độ nhạy mạnh, giảm độ nhạy và có biểu hiện giảm độ

nhạy theo phân loại của TCYTTG (Bảng 3.7)

Sự giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc của các vi sinh vật (vi rút hoặc vi khuẩn)

thường xuất hiện do áp lực của việc sử dụng thuốc kháng vi rút hoặc kháng sinh,

trong nghiên cứu của chúng tôi, đã xuất hiện các vi rút cúm A/H1N1,

A/H1N1pdm09 được xác định giảm độ nhạy cảm với oseltamivir vào các năm

2008, 2009 và 2011. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy có sự xuất hiện của

các vi rút cúm A/H1N1 giảm độ nhạy với oseltamivir vào các năm 2008 và 2009

với tỷ lệ 85,7% và 100%. Tuy số chủng chỉ giới hạn trong nghiên cứu nhưng cũng

đã gợi ý về sự tự biến chuyển về kiểu hình của phân típ vi rút cúm này (Bảng 3.9).

Điều này được khẳng định khi kết quả mức độ nhạy cảm với oseltamivir của H1N1

trong nghiên cứu tương tự với các chủng A/H1N1 lưu hành tại Nhật Bản, Trung

Quốc, Mỹ và Châu Âu giai đoạn 2006 – 2009. Cụ thể, các vi rút A/H1N1 lưu hành

trên thế giới năm 2006 có tỉ lệ kháng oseltamivir thấp (0,3-2,2%), nhưng từ 2007

đến 2009 tỉ lệ kháng thuốc tăng dần 23% năm 2007, 43-60% năm 2008 và 95% năm

2009. [27, 66, 110]. Mùa cúm 2008-2009, sự kháng của H1N1 với oseltamivir được

ghi nhận trên thế giới với tỉ lệ 100% [14, 20, 34, 110]. Kết quả của nghiên cứu

cũng cho thấy mức độ giảm nhạy cảm với oseltamivir của phân típ vi rút này gần

như tuyệt đối khi giá trị IC50 được xác định cao hơn giá trị ngưỡng từ 1104 đến

91

3933 lần (Bảng 3.7). Với kết quả trên, có thể nhận định phân típ vi rút cúm A/H1N1

trong nghiên cứu vào các năm 2008 và 2009 có khả năng kháng hoàn toàn thuốc

kháng vi rút oseltamivir. Để có thể xác định toàn diện về hiện tượng này, nghiên

cứu hồi cứu về độ nhạy cảm của A/H1N1 nên được thực hiện với cỡ mẫu đủ lớn và

đại diện cho các vùng tại Việt Nam. Sự kháng thuốc mạnh mẽ của A/H1N1 sẽ là

quan ngại lớn cho sức khỏe cộng đồng nếu phân típ vi rút này tiếp tục lưu hành

trong các năm tiếp theo, tuy nhiên từ năm 2010 phân típ vi rút này đã không được

xác nhận trong báo cáo của hệ thống giám sát quốc gia tại Việt Nam cũng như hệ

thống giám sát cúm toàn cầu (GISRS)

Vi rút cúm A/H1N1pdm09 đã xuất hiện và bắt đầu lưu hành từ năm 2009 bằng

đại dịch xảy ra từ tháng 5/2009 đến tháng 4/2010 trên toàn thế giới và tiếp tục lưu

hành đến nay thay thế cho vi rút cúm A/H1N1 [12, 23, 77]. Cũng như các vi rút

cúm A khác, hiện tượng giảm độ nhạy cảm với oseltamivir có thể xảy ra, nhất là

trong giai đoạn đầu mới xuất hiện, khi văc xin đặc hiệu chưa có và oseltamivir là

công cụ chủ yếu để điều trị nhiễm vi rút. Trong nghiên của chúng tôi, tổng số có 5

vi rút được xác định có biểu hiện giảm độ nhạy với oseltamivir (Bảng 3.7), 4/5 vi

rút này được phát hiện trong giai đoạn đại dịch 2009 và 1/5 trường hợp được phát

hiện vào năm 2011. Tỷ lệ lưu hành của vi rút A/H1N1pdm09 giảm độ nhạy với

oseltamivir tại Việt Nam trong nghiên cứu được xác định là 4,7% năm 2009 và

1,7% năm 2011 (Bảng 3.9). Tỉ lệ kháng thuốc của H1N1pdm09 năm 2009 trong

thời điểm đại dịch được cho là hợp lý khi chúng tôi tham khảo nghiên cứu của

Moghadas về mô hình kháng thuốc trong đại dịch cúm (năm 2008) và Hurt về sự

kháng thuốc của vi rút cúm trong đại dịch (năm 2012) [40, 68]. Các tác giả đều cho

rằng tỉ lệ kháng thuốc của vi rút thường tăng cao trong thời điểm vi rút lan rộng trên

toàn thế giới. Theo báo cáo của hệ thống giám sát cúm toàn cầu và với một số nước

trên thế giới trong cùng giai đoạn tỷ lệ vi rút A/H1N1pdm09 kháng thuốc được xác

định là 0,5% tại Mỹ; 0,8% tại Anh hoặc 1,1% tại châu Á - Thái Bình Dương [21,

59, 91], tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi tỉ lệ này dường như cao hơn

(1,7% năm 2011). Sự khác biệt này có thể giải thích do phạm vi nghiên cứu chỉ nằm

92

trong giới hạn miền Bắc Việt Nam và thực hiện trên quần thể là vi rút phân lập,

không phải tổng số mẫu dương tính với vi rút cúm (được xác định bằng phương

pháp RT-PCR). Số vi rút được xác định giảm độ nhạy với oseltamivir trong nghiên

cứu này không bao gồm các trường hợp viêm phổi nặng nghi do vi rút tại Việt Nam,

vì vậy để xác định chính xác tỷ lệ giảm độ nhạy với thuốc kháng vi rút, cần phải

mở rộng nghiên cứu cũng như thống nhất cách đánh giá tỷ lệ của hệ thống giám sát

cúm toàn cầu trong tương lai.

Mức độ giảm độ nhạy với oseltamivir của vi rút cúm A/H1N1pdm09 lưu hành tại

Việt Nam được xác định ở mức độ mạnh khi độ chênh lệch với giá trị ngưỡng được

xác định cao hơn từ 356 đến 2944 lần so với giá trị IC50 ngưỡng (Bảng 3.8). Kết quả

trên cho thấy sự đa dạng về đáp ứng với oseltamivir trong nhóm vi rút có cùng biểu

hiện về kiểu gen đột biến liên quan H275Y. Kết quả nghiên cứu này cũng tương tự

với các thông báo từ các nước khác như Mỹ, Anh và Úc… trong cùng thời gian [21,

38, 53]. Sự khác nhau về mức độ nhạy cảm với oseltamivir của vi rút cúm

A/H1N1pdm09 đặt ra yêu cầu cần phải tiếp tục giám sát thường xuyên và có những

chiến lược giám sát cụ thể trong hệ thống giám sát cúm toàn cầu khi thời gian xuất

hiện của vi rút này chưa lâu và sự thay đổi, tiến hoá của vi rút vẫn trong giới hạn

kiểm soát.

Vi rút cúm A/H5N1 trong nghiên cứu được xác định là vi rút cúm gia cầm lưu

hành trên người, chưa có những thay đổi về kiểu gen (đột biến liên quan đến thay

đổi thụ cảm thể bám gắn từ gia cầm sang người trên phân đoạn gen mã hóa HA

hoặc đột biến liên quan đến khả năng thích ứng của vi rút trong tế bào động vật có

vú trên gen PB2…) hoặc thay đổi về kiểu hình (dễ dàng lây truyền từ người sang

người). Vì vậy tổng số người nhiễm vi rút A/H5N1 trên toàn thế giới hiện tại là 637

ca mắc và chỉ giới hạn trong 15 nước và vùng lãnh thổ [115]. Do sự xuất hiện lẻ tẻ,

không phổ biến nên hiện tại việc sản xuất văc xin phòng chống cúm A/H5N1 chỉ

dừng lại trên quy mô phòng thí nghiệm, vì vậy thuốc kháng vi rút Taminflu

(oseltamivir) là công cụ chủ yếu và duy nhất trong việc điều trị nhiễm cúm A/H5N1

93

và sẽ rất nguy hiểm nếu hiện tượng kháng thuốc hoặc giảm độ nhạy xảy ra trên

phân típ cúm này.

Nghiên cứu của chúng tôi đã phát hiện ra trường hợp kháng thuốc đầu tiên của

vi rút cúm A/H5N1 vào năm 2005 [56]- vi rút A/Vietnam/HN30408/2005 - với giá

trị IC50 cao hơn 30 lần so với giá trị ngưỡng được đánh giá ở mức giảm độ nhạy

cảm với oseltamivir (Bảng 3.8). Vi rút này thuộc clade 1, lưu hành tại miền Bắc

Việt Nam trong giai đoạn 2003-2005. Vi rút này cũng được phân tích sâu về kiểu

gen và cho thấy, đây là vi rút có đột biến không hoàn toàn, chỉ có 6 trong tổng số 10

clone có nguồn gốc từ vi rút này được phát hiện có đột biến H275Y, vì vậy việc

biểu hiện kiểu hình đa dạng của các vi rút mang đột biến là có thể và liên quan

nhiều đến hiện tượng "quasi-species" [24, 49, 56]. Ngoài ra, vi rút này cũng được

ghi nhận hiện tượng đột biến xuất hiện dưới áp lực của điều trị [49, 56], do vậy việc

kiểm soát điều trị hay xây dựng phác đồ điều trị thuốc kháng vi rút phù hợp sẽ góp

phần kiểm soát hiện tượng kháng thuốc của vi rút cúm.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phát hiện hai vi rút cúm A/H5N1 thuộc

clade 2.3.4.3 lưu hành năm 2008, có đột biến tại vị trí I117V và có biểu hiện giảm

độ nhạy với giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng 5-6 lần. Kết quả này tương tự với kết

quả các nghiên cứu của Hurt (2012) và Takano (2012) thu được giá trị IC50 sau khi

thực hiện đột biến I117V trong nghiên cứu (giả định) tại phòng thí nghiệm cùng cho

kết quả tăng hơn 5-6 lần so với giá trị trung bình [41, 102].

Nghiên cứu với 115 chủng H3N2 chúng tôi nhận thấy giá trị IC50 của phân típ vi

rút cúm này ít có sự khác biệt giữa các vi rút và không phát hiện sự giảm nhạy cảm

với oseltamivir trong giai đoạn từ năm 2003 đến 2012. Tham khảo các tài liệu về sự

kháng thuốc của vi rút H3N2 cho thấy dường như vi rút này chủ yếu kháng

amantadine (thuốc điều trị cúm được sử dụng trước oseltamivir) và chỉ kháng

oseltamivir ở mức độ thấp [61, 89]. Tỉ lệ kháng oseltamivir tại các nước như Úc,

Anh, Mỹ, Nhật cũng chỉ ở mức dưới 1% [13, 103]. Không giống với tỷ lệ kháng

oseltamivir cao của vi rút cúm A/H1N1 (80-100% trong năm 2008-2009), vi rút

94

cúm A/H3N2 dường như vẫn đảm bảo độ nhạy cảm cao với oseltamivir, lý giải cho

hiện tượng này, chúng tôi cho rằng đó có thể do khả năng gắn kết giữa protein NA

của vi rút H3N2 với thuốc tốt hơn H1N1 và các đột biến tuy có xảy ra trên phân

đoạn gen mã hóa NA nhưng khả năng gây hiện tượng kháng thuốc không mạnh.

Mặc dù vậy việc theo dõi mức độ nhạy cảm của vi rút H3N2 với oseltamivir vẫn

phải được thực hiện định kỳ hàng năm với mục đích phát hiện sớm các trường hợp

kháng thuốc trong quá trình điều trị tại bệnh viện và trong cộng đồng dân cư.

Trong quá trình nghiên cứu, nhóm nghiên cứu thực hiện xác định tỉ lệ kháng

oseltamivir của vi rút cúm dựa trên phương pháp đang được sử dụng tại các phòng

thí nghiệm chuẩn thức của TCYTTG và đã được TCYTTG chấp nhận là phương

pháp thường quy để thực hiện việc xác định sự kháng thuốc của vi rút cúm (bao

gồm xác định mức độ kháng thuốc của vi rút sau đó kiểm tra các đột biến liên quan

đến kháng thuốc trên phân đoạn gen mã hóa NA) [111]. Trên thực tế, việc giám sát

sự kháng thuốc của vi rút cúm thường xuyên tại PTN mới được TCYTTG khuyến

cáo thực hiện trong vòng 5 năm gần đây (từ 2009) [46]. Do vậy, phương pháp giám

sát chuẩn thức vẫn được điều chỉnh hàng năm cho phù hợp với sự thay đổi của vi

rút cúm và tình hình nhiễm cúm của từng quốc gia. Với phương pháp áp dụng cho

nghiên cứu, chúng tôi xác định được các chủng vi rút cúm kháng oseltamivir. Với

các bệnh phẩm lâm sàng dương tính với cúm nhưng không phân lập được vi rút,

trong tương lai gần, chúng tôi sẽ áp dụng phương pháp giải trình tự gen với từng

nucletotide xác định (pyrosequencing) để xác định trực tiếp đột biến liên quan đến

kháng thuốc trên bệnh phẩm lâm sàng. Như vậy, việc giám sát kháng thuốc tại PTN

sẽ bao quát được không những các chủng vi rút kháng thuốc mà còn những bệnh

phẩm lâm sàng nghi ngờ mang vi rút cúm kháng thuốc.

4.3. Sự liên quan của các đột biến trên phân đoạn gen mã hóa NA với quá trình

kháng thuốc oseltamivir của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam

Dựa vào cấu trúc của protein NA , thuốc kháng vi rút cúm có tác dụng hạn chế

sự phát tán của vi rút cúm được phát triển theo cơ chế ức chế neuraminidase. Hiện

95

tại, các chế phẩm thương mại thường được nhắc đến đó là Taminflu (oseltamivir) ,

zanamivir... Tác dụng ức chế neuraminidase của oseltamivir thông qua sự bám kết

của oseltmivir vào các vị trí hoạt động của neuraminidase tại vị trí Glu276, Ala246,

Arg224, và Ile222 [9, 25, 32, 34, 64, 87]. Ái lực gắn bám sẽ quyết định hiệu quả

hoạt đông ức chế của oseltamivir. Với cơ chế như vậy, nên bất cứ sự đột biến, thay

đổi của axit amin trên protein NA tại các vị trí này hoặc các vị trí xung quanh đều

ảnh hưởng đến ái lực gắn bám hoặc làm thay đổi vị trí tương tác với oseltamivir sẽ

dẫn đến hiện tượng giảm độ nhạy, hoặc kháng oseltamivir. Theo kết quả thống kê từ

những giám sát kháng thuốc được thực hiện sau khi thuốc Taminflu (oseltamivir)

xuất hiện trên thị trường, đột biến trên protein NA1 như Q137K, Y156H, I223V,

S247G và H275Y là phổ biến, ngoài ra các đột biến tại các vị trí I117V, R152K,

E119V, R292K, S295N ... cũng được ghi nhận liên quan đến hiện tượng giảm độ

nhạy hoặc kháng oseltamivir [44]. Trên protein NA2 (vi rút cúm A/H3N2), đột biến

E119V, R292K có ảnh hưởng đến khả năng ức chế neuraminidase của oseltamivir,

tuy nhiên các báo cáo về hiện tượng này rất hạn chế [7, 80].

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chỉ phát hiện đột biến H275Y và I117V trên

protein NA, trong đó vị trí H275Y chiếm ưu thế 90% (18/20 vi rút) trong khi đột

biến I117V chỉ chiếm 10% (2/20 vi rút) (Bảng 3.8). Trong các vi rút mang phân

đoạn gen mã hóa N1 trong nghiên cứu, chỉ vi rút A/H5N1 có hai loại đột biến trên

phân đoạn gen mã hóa NA liên quan đến kháng thuốc. Theo thống kê các đột biến

liên quan đến kháng thuốc của tổ chức ISIRV, dường như đột biến I117V chỉ được

đề cập trong phân típ cúm A/H5N1, không xuất hiện trong các vi rút cúm người

phân típ N1 (A/H1N1 hoặc A/H1N1pdm09). Đột biến này cũng phát hiện trên vi rút

cúm A/H5N1 lưu hành trên gia cầm năm 2007-2008 tại Việt Nam [76] chứng tỏ sự

liên hệ giữa vi rút cúm lưu hành trên gia cầm và trên người và cho phép nghĩ đến

hiện tượng đột biến tự nhiên, không chịu áp lực của thuốc kháng vi rút oseltamivir.

Rameix-Welti và cộng sự (2006) cũng đã chứng tỏ các vi rút cúm gia cầm lưu hành

từ 2004-2006 có ái lực với oseltamivir thấp hơn các chủng lưu hành trước đó (1997-

2005) khi thực hiện trên các vi rút không mang đột biến liên quan đến kháng thuốc

96

[86]. Sự lưu hành của những vi rút mang đột biến trong đàn gia cầm sẽ không thể

kiểm soát được và sẽ là nguy hiểm khi vi rút cúm gia cầm A/H5N1 thích ứng, thay

đổi thành vi rút cúm lây bệnh cho người, khi đó thuốc kháng vi rút oseltamivir sẽ

hoàn toàn mất tác dụng. Hơn nữa, sự trao đổi và tích hợp là hiện tượng xảy ra

không những trong nội phân típ mà còn giữa các phân típ với nhau, do đó, khả năng

một vi rút cúm gia cầm mang phân đoạn gen mã hóa NA có sẵn đột biến kháng

thuốc là hoàn toàn có thể xảy ra. Sự nguy hiểm của vi rút cúm gia cầm mang gen

kháng thuốc có khả năng lây bệnh cho người đã được chứng minh khi vi rút cúm

A/H7N9 lưu hành tại Trung Quốc gần đây [63]. Phân đoạn gen mã hóa NA của vi

rút cúm A/H7N9 được xác định có đột biến R292K và đã làm mất/giảm hiệu lực

của thuốc Taminflu và tỷ lệ tử vong cao của những người nhiễm bệnh đã được ghi

nhận (33%) [62, 63, 96, 116]. Vì vậy việc kiểm soát độ nhạy cảm của vi rút cúm gia

cầm A/H5N1 là công việc bắt buộc nên trong nghiên cứu này, khác với các vi rút

cúm A khác chỉ phân tích trình tự phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút có IC50 cao,

toàn bộ 28 vi rút cúm A/H5N1 đều được phân tích trình tự phân đoạn gen mã hóa

NA (Hình 3.9 - 3.12).

Ngoài năm trường hợp H1N1pdm09 được khẳng định kháng thuốc trên cả kiểu

hình và kiểu gen, chúng tôi còn xác định được 4 trường hợp khác cũng mang gen

kháng thuốc nhưng không đủ điều kiện để thực hiện thử nghiệm ức chế

neuraminidase. Bốn trường hợp này cũng mang đột biến H275Y, tuy nhiên, do

không thể xác định mức kháng thuốc (kiểu hình), một điều kiện quan trọng của việc

khẳng định sự kháng thuốc cho nên các chủng này chỉ dừng lại ở mức ghi nhận có

mang đột biến liên quan đến kháng thuốc.

Sự phổ biến của đột biến H275Y được phát hiện trong nghiên cứu hoàn toàn

phù hợp với các báo cáo tại các nước khác trêm thế giới [11, 16, 21, 33, 101]. Trong

nghiên cứu này, hai đột biến H275Y và I117V được phát hiện đều là đột biến đơn

lẻ, nhưng các báo cáo về hiện tượng xuất hiện các đột biến kép giả định I117V và

H275Y hoặc I117M và H275Y đã xảy ra trên vi rút cúm A/H1N1pdm09 thực hiện

97

trong phòng thí nghiệm dẫn đến giá trị IC50 tăng gấp 1800 lần đối với oseltamivir,

500 lần với peramivir so với giá trị ngưỡng trung bình [41]. Ngoài ra, trường hợp

bệnh nhân nhiễm cúm mang đột biến kép I223R và H275Y trên protein NA cũng đã

được đề cập tại một nghiên cứu ở Mỹ gây hiện tượng tăng mạnh giá trị IC50 (9000

lần) so với giá trị IC50 ngưỡng được xác định tại nước này [74]. Do đó, hiện tượng

đột biến tại các vị trí ít gặp hoặc điểm đột biến mới xuất hiện có thể xảy ra trong

tương lai, nên cần phải xây dựng một chương trình giám sát kháng thuốc một cách

chủ động với những phương pháp xác định cập nhật cùng các quy trình thử nghiệm

hiện đại, thực hiện trên các bệnh phẩm thu thập từ chương trình giám sát cúm. Đó

cũng là biện pháp tích cực trong việc phòng tránh sự lây lan của vi rút mang gen

kháng thuốc trong cộng đồng.

Từ những kết quả này, các phương pháp giám sát kháng oseltamivir hiện nay đã

phát triển với các phương pháp phát hiện đột biến chỉ điểm H275Y thông qua các

thử nghiệm đơn giản như realtime PCR hoặc hiện đại như pyrosequencing. Những

thử nghiệm này có thể thực hiện vừa trên chủng vi rút vừa trên các bệnh phẩm lâm

sàng và những bệnh phẩm được xét nghiệm dương tính với vi rút cúm nhưng không

thành công trong phân lập [17, 25, 26, 111]. Điều này rất hữu ích trong việc tầm

soát đột biến liên quan đến kháng thuốc, có thể phát hiện sớm được cá thể mang vi

rút kháng thuốc, do đó tăng cường khả năng ngăn chặn sự phát tán của vi rút kháng

thuốc trong cộng đồng.

Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, sự đa dạng về mức độ giảm độ nhạy với

oseltamivir giữa các phân típ vi rút A/H1N1, A/H1N1pdm09 và A/H5N1 có biểu

hiện cùng kiểu hình NA1 và có cùng đột biến H275Y. Mức độ giảm độ nhạy cao

được ghi nhận ở phân típ A/H1N1 (trung bình >1000 lần), giảm độ nhạy vừa được

xác định ở phân típ A/H1N1pdm09 (>100 lần) và có biểu hiện giảm độ nhạy ở phân

típ A/H5N1 (<100 và <10 lần). Sự khác biệt này có thể do đặc điểm của bản thân

của từng phân típ vi rút , nhưng cũng có thể là do sự đột biến không hoàn toàn (đã

98

quan sát được trên vi rút cúm A/H5N1 [56]), vì vậy yêu cầu những nghiên cứu tiếp

theo sâu và toàn diện hơn về sự khác biệt này trong tương lai.

4.4. Sự liên quan về mặt di truyền của các chủng vi rút A mang gen đột biến và

các vi rút cúm A lưu hành cùng thời gian.

Hệ gen của vi rút cúm A bao gồm tám phân đoạn mã hóa cho 11 protein, dưới

áp lực tương tác với kháng thể vật chủ, phân đoạn gen mã hóa cho các protein bề

mặt đã thể hiện sự đa dạng trong kiểu gen mà trong đó điển hình là phân đoạn gen

mã hóa HA và NA của vi rút. Sự tiến hóa của vi rút cúm A được thể hiện qua sự

thay đổi về di truyền học của các phân đoạn gen nhưng phân đoạn gen mã hóa HA

đóng vai trò quan trọng. Sự tiến hóa của phân đoạn gen mã hóa HA cũng quyết định

sự thay đổi về đặc tính kháng nguyên, yếu tố quyết định sự xuất hiện các vụ dịch

hoặc đại dịch trong cộng đồng. Phân đoạn gen mã hóa NA tuy không đóng vai trò

quan trọng trong sự tiến hóa của vi rút cúm A, nhưng protein NA với vai trò là một

trong hai protein bề mặt của vi rút cúm sẽ ảnh hưởng rất lớn trong quy trình tạo đáp

ứng miễn dịch trong cộng đồng. Sự thay đổi các axit amin trong protein NA không

chỉ ảnh hưởng đến chức năng ezyme của neuramindase như đã đề cập trong nghiên

cứu mà còn ảnh hưởng đến khả năng tạo miễn dịch trong cộng đồng. Chính vì vậy

trong nghiên cứu này, chúng tôi tìm hiểu sự liên quan về mặt di truyền của vi rút

cúm có mang đột biến liên quan đến giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir và các vi

rút cúm cùng phân típ lưu hành tại miền Bắc Việt Nam cũng như các chủng lưu

hành trong cả nước và thế giới thông qua phân tích cây gia hệ phân đoạn gen mã

hóa HA và NA. Thông qua mối liên quan này, có thể phần nào hiểu biết được sâu

hơn về quá trình kháng thuốc trên các chủng cúm tại Việt Nam.

Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA và NA của các phân típ vi rút A/H1N1,

A/H1N1pdm09 và A/H5N1 trong nghiên cứu đã cho thấy một sự tương đồng của

các vi rút giảm độ nhạy cảm với oseltamivir với các vi rút lưu hành trong cùng một

99

thời gian tại các khu vực địa lý khác nhau (Hình 3.5-3.12). Sự tiến hóa của phân

đoạn gen mã hóa HA dường như nhanh hơn phân đoạn gen mã hóa NA trong toàn

bộ các phân típ cúm A. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút A/H1N1

chia thành 2 nhóm với các phân nhánh 2A, 2B và 2C trong khi phân đoạn gen mã

hóa NA của vi rút này qua quan sát cũng có sự phân nhánh nhưng không thể hiện

rõ qua giá trị bootstrap. Tương tự, phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút cúm

A/H5N1 phân tách rõ thành 10 clade chính và rất nhiều clade phụ như 2.3.4.1,

2.3.4.2, 2.3.4.3, trong khi phân đoạn gen mã hóa NA chỉ phân tách thành 2 nhánh

chính và không hình thành các nhánh phụ. Với vi rút cúm A/H1N1pdm09 mới xuất

hiện vào năm 2009, sự thay đổi của phân đoạn gen mã hóa HA và NA không nhiều

(Hình 3.7, 3.8), các vi rút lưu hành vẫn tập trung trong cùng 1 nhóm và có mức độ

tương đồng về di truyền cao so với vi rút dự tuyển văc xin năm 2009

A/California/07/09.

Trong cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA, các vi rút cúm mang đột biến trên

protein NA trong nghiên cứu đều tập trung cùng với các vi rút lưu hành tại Việt

Nam trong cùng giai đoạn tương ứng. Tổng số 12 vi rút A/H1N1 mang đột biến

H275Y đều nằm trong nhóm 2 và phân bố tại các nhóm phụ 2B. Nhóm 2 của cây

gia hệ được tập hợp bởi các vi rút lưu hành trong các năm 2006, 2008 và 2009 tại

Việt Nam, Trung Quốc, Đài Loan và Nhật Bản, có độ tương đồng cao với vi rút dự

tuyển văc xin A/Solomon Island/3/2006 và A/Brisbane/59/2007. Các chủng vi rút

lưu hành năm 2008-2009 tại các nước này đều được xác định có mang gen kháng

thuốc (tỉ lệ kháng ~100%) tương tự vi rút lưu hành trong nghiên cứu này [22, 101,

119]. Kết quả trên cho thấy đột biến kháng thuốc (H275Y) trên phân đoạn gen mã

hóa NA không ảnh hưởng đến sự thay đổi của phân đoạn gen mã hóa HA trên các vi

rút phân típ A/H1N1 có mặt trong nghiên cứu và trên thế giới, các vi rút này không

phân tách thành các nhóm riêng như đột biến trên gen M (S31N) liên quan đến

kháng thuốc amatadine của vi rút cúm A/H3N2 [61, 89].

100

Các vi rút cúm A/H5N1 trong nghiên cứu được nhóm vào hai clade chính trong

cây gia hệ HA là clade 1 và clade 2.3.4 (Hình 3.10, 3.11) và không phát hiện sự

khác biệt của các vi rút mang đột biến H275Y (một vi rút) hoặc I117V (hai vi rút)

trên cây gia hệ. Kết quả này có thể do vi rút mang đột biến với số lượng thấp trong

nghiên cứu, tuy nhiên cũng không loại trừ trường hợp cũng giống như phân típ cúm

A/H1N1, các đột biến tương tự trên phân đoạn gen mã hóa NA không ảnh hưởng

đến quá trình tiến hóa của phân đoạn gen mã hóa HA. Nhận định này càng được

thuyết phục khi clade 2.3.4 trên cây gia hệ có tập trung một số vi rút phân lập từ gia

cầm có đột biến I117V (A/duck/Vietnam/NCVD100/2207) (Hình 3.9).

Tương tự, cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút cúm A/H1N1pdm09

qua quan sát cũng không có sự khác biệt có ý nghĩa của vi rút cúm mang đột biến

H275Y với các vi rút khác lưu hành cùng năm (Hình 3.7).

Như vậy, các đột biến trên phân đoạn gen mã hóa NA (H275Y hoặc I117V)

được phát hiện trên một số vi rút trong nghiên cứu tuy ảnh hưởng đến khả năng

tương tác với oseltamivir, nhưng không ảnh hưởng đến sự thay đổi về mặt di truyền

của phân đoạn gen mã hóa HA, và sẽ không làm thay đổi đặc tính kháng nguyên

của chính vi rút đó.

101

KẾT LUẬN

1. Đã xác định giá trị IC50 ngưỡng của các phân típ cúm A lưu hành tại Việt

Nam, 2001-2012

Vi rút A/H1N1 0,413 ± 0.352 nM

Vi rút A/H1N1pdm09 0,334 ± 0,286 nM

Vi rút A/H3N2 0,164 ± 0,126nM

Vi rút A/H5N1 2,947 ± 2,539 nM

2. Tỉ lệ và mức độ giảm nhạy cảm với oseltamivir của các phân típ chủng vi rút

cúm A tại miền Bắc Việt Nam, 2001-2012 được xác định

 Với vi rút A/H1N1: 28,5% (12/42) vi rút giảm mạnh độ nhạy cảm với

oseltamivir trung bình 1448 lần so với giá trị IC50 ngưỡng; tỉ lệ thay đổi theo

năm.

 Với vi rút A/H1N1pdm09: 3,2% (5/157) vi rút giảm mạnh độ nhạy cảm với

oseltamivir trung bình 1242 lần so với giá trị IC50 ngưỡng; tỉ lệ thay đổi theo

năm.

 Với vi rút A/H3N2: 100% (115/115) không có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với

oseltamivir, giá trị trung bình IC50 (0,164 nM), không vượt giá trị IC50 ngưỡng.

 Với vi rút A/H5N1: trong 28 vi rút, phát hiện 01 vi rút giảm độ nhạy cảm với

oseltamivir: A/Vietnam/HN30408/05 (90nM) và 02 vi rút có biểu hiện giảm độ

nhạy cảm với oseltamivir: A/Vietnam/HN31412/08 (19,04 nM) và

A/Vietnam/HN31413/08 (14,48 nM)

3. Về sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với

oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu vực và trên

thế giới trong giai đoạn 2001-2012

102

 Hai đột biến H275Y và I117V được xác định trên protein NA liên quan đến

giảm sự nhạy cảm của vi rút cúm A với oseltamivir, trong đó đột biến H275Y

chiếm tỷ lệ 90% (18/20) được phát hiện trên các chủng cúm A/H1N1,

A/H1N1pdm09 và A/H5N1. Đột biến I117V chiếm 10% (2/20) chỉ phát hiện

trên phân típ A/H5N1.

 Phân đoạn gen mã hóa HA và NA của các vi rút cúm A có biểu hiện giảm độ

nhạy cảm với oseltamivir thuộc các phân típ A/H1N1, A/H1N1pdm09 và

A/H5N1 thể hiện sự tương đồng về di truyền học với các phân típ vi rút tương

ứng lưu hành trong cùng thời gian tại Việt Nam và một số nước trong khu vực.

 Các đột biến trên phân đoạn gen mã hóa NA liên quan đến giảm độ nhạy của

oselatmivir có thể không ảnh hưởng đến sự tiến hóa của phân đoạn gen mã hóa

HA của các phân típ vi rút tương ứng lưu hành tại miền Bắc Việt Nam trong

giai đoạn 2001-2012.

103

KIẾN NGHỊ

Từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đưa ra một số kiến nghị sau:

1. Tiếp tục và mở rộng hệ thống giám sát cúm trên toàn quốc để tăng cường

khả năng kiểm soát dịch và khả năng lây lan của các chủng kháng thuốc nếu

có.

2. Thiết lập hệ thống giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm, xây dựng quy

trình chuẩn cho xét nghiệm mức độ kháng thuốc (thử nghiệm ức chế

neuraminidase).

3. Phối hợp nghiên cứu, giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm gia cầm trong

các ổ chứa tự nhiên nhằm tạo cơ sở dữ liệu cho công tác phòng và điều trị.

4. Phối hợp nghiên cứu với đơn vị lâm sàng trong việc định hướng lựa chọn

thuốc trong điều trị, dự phòng và phòng chống dịch.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Lê Khánh Hằng. (2010), Nghiên cứu căn nguyên của các vụ dịch

cúm người đầu những năm 2000 tại miền Bắc Việt Nam, , Trường Đại học

Khoa học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia. tr. 66-68.

2. Nguyễn Trần Hiển. (2012), Cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt Nam, Nhà xuất

bản Y học. tr. 29-32.

3. Đinh Duy Kháng. (2010), Các vi rút cúm, in Vi rút Y học. Nhà xuất bản Y

học. tr. 28-45.

4. Nguyễn Thanh Liêm. (2006), "Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, dịch tễ học,

phương pháp chẩn đoán sớm, phác đồ điều trị hiệu quả và dự phòng bệnh

viêm đường hô hấp cấp do vi rút cúm H5N1, vi rút cúm A và vi rút hợp bào

đường hô hấp". Đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ nhà nước, Hà Nội.

5. Huỳnh Phương Liên, Nguyễn Lê Khánh Hằng, Nghiêm Kim Hà, Nguyễn

Công Đoàn, Hiroshi Suzuki, Reiko Saito. (2005), "Nghiên cứu các chủng vi

rút cúm và các vi rút gây viêm đường hô hấp cấp ở Hà Nội, 2001 ". Tạp chí Y

học thực hành, 505(3), tr. 23-26.

6. Phạm Văn Ty. (2004), Vi rút Orthomyxo, họ Rthomyxoviridae, in Vi rút học,

Nhà xuất bản giáo dục. tr. 205-211.

TIẾNG ANH

7. Abed Y., B. M., Biovin G.,. (2006), "Impacts of neurminidase mutations

conferring influenza resistance to neuraminidase inhibitors in the N1and N2

genetic background". Antiviral Therapy, 11, pp. 971-976.

8. APHL. (2013), Influenza Virologic Surveillance Right Size Sample Size:

Detecting, Monitoring Antiviral Resistance.

http://www.aphl.org/aphlprograms/infectious/influenza/Pages/Calculator-

B.aspx.

9. Bai G. R., et al. (2009), "Amantadine- and oseltamivir-resistant variants of

influenza A viruses in Thailand". Biochem Biophys Res Commun, 390(3),

pp. 897-901.

10. Bao R. J. , H. K. T., Piscitelli E. A., et. al. (2011), "Reverse-transcription

polymerase chain reaction/pyrosequencing to characterize neuraminidase

H275 residue of influenza A 2009 H1N1 virus for rapid and specific

detection of the viral oseltamivir resistance marker in a clinical laboratory".

Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 71, pp. 396-402.

11. Baranovich T, S. R., Suzuki Y, Zaraket H, Dapat C, Caperig-Dapat I, Oguma

T, Shabana II, Saito T, Suzuki H. (2010), "Emergence of H274Y oseltamivir-

resistant A(H1N1) influenza viruses in Japan during the 2008-2009 season".

J Clin Virol., 47(1), pp. 23-28.

12. Barr I. G., C. L., Komadina N, Lee RT, Lin RT, Deng Y, Caldwell N, Shaw

R, Maurer-Stroh S.,. (2010), "A new pandemic influenza A(H1N1) genetic

variant predominated in the winter 2010 influenza season in Australia, New

Zealand and Singapore". Euro Surveill., 15(42), pp. pii=19692.

13. Baz M., A. Y., McDonald J., Boivin G.,. (2006), "Characterization of

Multidrug-Resistant Influenza A/H3N2 Viruses Shed during 1 Year by an

Immunocompromised Child". Clinical Infectious Diseases, 43, pp. 1555–

1561.

14. Bloom D. J., G. I. L., Baltimore D.,. (2010), "Permissive Secondary

Mutations Enable the Evolution of Influenza Oseltamivir Resistance".

Science, 328, pp. 1272.

15. Boivin S., C. S., Ruigrok W. H. R., Hart J. D.,. (2010), "Influenza A Virus

Polymerase: Structural Insights into Replication and Host Adaptation

Mechanisms". J Biol Chem., 285(37), pp. 28411-28417.

16. Bolotin S., R. A. V., Eshaghi A.,. (2009), "Development of a novel real-time

reverse-transcriptase PCR method for the detection of H275Y positive

influenza A H1N1 isolates". Journal of Virological Methods, 158.

17. Bolotin S., R. A. V., Eshaghi A., De Lima C., Lombos E., Chong-King E.,

Burtona L., Mazzullia T., Drews S.J.,. (2009), "Development of a novel real-

time reverse-transcriptase PCR method for the detection of H275Y positive

influenza A H1N1 isolates". Journal of Virological Methods, 158, pp. 190-

194.

18. Boriskin YS, L. I., Pécheur EI, Polyak SJ. (2008), "Arbidol: a broad-

spectrum antiviral compound that blocks viral fusion". Curr Med Chem,

15(10), pp. 997-1005.

19. Bouvier N. M., P. P. (2008), "The biology of influenza viruses". Vaccine, 26

Suppl 4, pp. D49-53.

20. Buchholz U., B. S., Duwe S., Schweiger B., an der Heiden M., Reinhardt B.,

Buda S.,. (2010), "Household transmissibility and other characteristics of

seasonal oseltamivir-resistant influenza A(H1N1) viruses, Germany, 2007-

8". Euro Surveill., 15(6), pp. pii=19483.

21. Calatayud L., L. A., Reynolds A., McMenamin J., Phin F. N., Zambon C.

M., Pebody R.,. (2011), "Oseltamivir-Resistant Pandemic (H1N1) 2009

Virus Infection in England and Scotland, 2009–2010". Emerging Infectious

Diseases, 17(10), pp. 1807-1815.

22. Chen H., C. C. L., Tai H., Zhao P., Chan J. F.W. , Cheng V. C., Chan K.,

Yuen K., . (2009), "Oseltamivir-Resistant Influenza A Pandemic (H1N1)

2009 Virus, Hong Kong, China". Emerging Infectious Diseases, 15(12), pp.

1970-1972.

23. Dawood S. F., J. S., Lindstrom S., Garten R., Uyeki M. T.,. (2009),

"Emergence of a Novel Swine-Origin Influenza A (H1N1) Virus in

Humans". N Engl J Med, 360, pp. 2605-2615.

24. Deyde V. M., et al. (2009), "Detection of molecular markers of antiviral

resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method".

Antimicrob Agents Chemother, 53(3), pp. 1039-47.

25. Deyde V. M., et al. (2009), "Pyrosequencing as a tool to detect molecular

markers of resistance to neuraminidase inhibitors in seasonal influenza A

viruses". Antiviral Res, 81(1), pp. 16-24.

26. Deyde V. M., et al. (2010), "Detection of molecular markers of drug

resistance in 2009 pandemic influenza A (H1N1) viruses by

pyrosequencing". Antimicrob Agents Chemother, 54(3), pp. 1102-10.

27. Dharan J. N., B. S. E., Fiore A. et. al,. (2010), "Influenza antiviral

prescribing practices during the 2007–08 and 2008–09 influenza seasons in

the setting of increased resistance to oseltamivir among circulating influenza

viruses". Antiviral Research, 88, pp. 182-186.

28. Dutkowski R. (2010), "Oseltamivir in seasonal influenza: cumulative

experience in low- and high-risk patients". J Antimicrob Chemother, 65

Suppl 2, pp. ii11-ii24.

29. Furuse Y., et al. (2009), "Evolution of the M gene of the influenza A virus in

different host species: large-scale sequence analysis". Virol J, 6, pp. 67.

30. Garten, R. J., et al. (2009), "Antigenic and genetic characteristics of swine-

origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans". Science,

325(5937), pp. 197-201.

31. Greenwood D., F. R., Davey P., Wilcox M.,, (2007), Antimicrobial

Chemotherapy, in Antimicrobial Chemotherapy,Fifth David Greenwood,

R.F., Peter Davey, Editor, Oxford University Press: Oxford. pp. 105 - 107.

32. Gubareva V. L. (2004), "Molecular mechanisms of influenza virus resistance

to neuraminidase inhibitors". Virus Research, 103, pp. 199–203.

33. Guo L., et al. (2009), "Rapid identification of oseltamivir-resistant influenza

A(H1N1) viruses with H274Y mutation by RT-PCR/restriction fragment

length polymorphism assay". Antiviral Res, 82(1), pp. 29-33.

34. Hauge H. S., D. S., Borgen K., Lackenby A., Hungnes O.,. (2009),

"Oseltamivir-Resistant Infl uenza Viruses A (H1N1), Norway, 2007–08".

Emerging Infectious Diseases, 15(2), pp. 155-162.

35. Hauge H. S., D. S., Borgen K., Lackenby A., Hungnes O., . (2009),

"Oseltamivir-Resistant Infl uenza Viruses A (H1N1), Norway, 2007–08".

Emerging Infectious Diseases, 15(2), pp. 155-161.

36. Hurt A. C., et al. (2003), "Surveillance for neuraminidase inhibitor resistance

in human influenza viruses from Australia". Commun Dis Intell, 27(4), pp.

542-7.

37. Hurt A. C., et al. (2012), "Antiviral resistance during the 2009 influenza A

H1N1 pandemic: public health, laboratory, and clinical perspectives". Lancet

Infect Dis, 12(3), pp. 240-248.

38. Hurt A. C., L. R. T., Leang K. S., et. al (2011), "Increased detection in

Australia and Singapore of a novel influenza A(H1N1)2009 variant with

reduced oseltamivir and zanamivir sensitivity due to a S247N neuraminidase

mutation". Euro Surveill, 16(23).

39. Hurt A.C., H. K., Wilson N.J et al. (2012), "Characteristics of a Widespread

Community Cluster of H275Y Oseltamivir-Resistant A (H1N1)pdm09

Influenza in Australia". Journal of Infectious Diseases, 206, pp. 148-157.

40. Hurt C. A., C. T., Cox J N., Daniels R., Fry M. A., Gubareva V. L.,

Hayden G. F., et al.,. (2012), "Antiviral resistance during the 2009 influenza

A H1N1 pandemic: public health, laboratory, and clinical perspectives".

Lancet Infect Dis, 12, pp. 240-248.

41. Hurt C. A., L. S. K., Speers J. D., Barr G. I., Maurer-Stroh S.,. (2012),

"Mutations I117V and I117M and Oseltamivir Sensitivity of Pandemic

(H1N1) 2009 Viruses". Emerg Infect Dis, 18(1), pp. 109–112.

42. Inoue Y., Y. M., Kitahori Y.,. (2007), "Dual mutations in the HA1 peptide of

amantadine-resistant influenza viruses at positions 193 and 225.".

Jpn.J.Infect.Dis., 60(2), pp. 147-148.

43. Irving W., A. A. D., Boswell T.,. (2006), Influenza viruses, in Medical

Microbiology, Taylor & Francis e-Library: New York. pp. 85-88.

44. ISIRV. (2013), Amino acid substitutions in the NAs of variants in clinical

samples or isolates causing reduced antiviral susceptibility.

http://www.isirv.org/site/images/stories/avg_documents/Resistance/mutation

s_18.04.12.pdf.

45. ISIRV Antiviral Group. (2012), Panel of Influenza A and B Viruses for

Assessment of Neuraminidase Inhibitor Susceptibility.

http://www.isirv.org/site/index.php/reference-panel.

46. ISIRV Antiviral Group. (2013), Monitoring.

http://www.isirv.org/site/index.php/monitoring.

47. John W. McCauley, B. W. J. M. (1983), "Structure and function of the

influenza virus genome". Biochem. J., 211, pp. 281-294.

48. Kiso M., et al. (2010), "T-705 (favipiravir) activity against lethal H5N1

influenza A viruses". Proc Natl Acad Sci U S A, 107(2), pp. 882-7.

49. Kiso M., O. M., Mai T.Q.L., Imai H., et al.,. (2011), "Effect of an

Asparagine-to-Serine Mutation at Position 294 in Neuraminidase on the

Pathogenicity of Highly Pathogenic H5N1 Influenza A Virus". Journal of

Virology, 85(10), pp. 4667-4672.

50. Korsman S., (2006), Vaccines, in Influenza Report 2006Kamps B.S., Editor,

Flying Publisher: Cologne. pp. 127-131.

51. Kryazhimskiy S., et al. (2008), "Directionality in the evolution of influenza

A haemagglutinin". Proc Biol Sci, 275(1650), pp. 2455-64.

52. Kryazhimskiy S., et al. (2011), "Prevalence of epistasis in the evolution of

influenza A surface proteins". PLoS Genet, 7(2), pp. e1001301.

53. Lackenby A., M. G. J., Pebody R., Miah S., Calatayud L., Bolotin S., Vipond

I., Muir P., Guiver M., McMenamin J., Reynolds A., Moore C., Gunson R.,

Thompson C., Galiano M., Bermingham A., Ellis J., Zambon M.,. (2011),

"Continued emergence and changing epidemiology of oseltamivir-resistant

influenza A(H1N1)2009 virus, United Kingdom, winter 2010/11". Euro

Surveill., 16(5), pp. pii=19784.

54. Lamb R. A., Z. S. L., Richardson C. D.,. (1985), "Influenza virus M2 protein

is an integral membrane protein expressed on the infected-cell surface". Cell

Press, 40(3), pp. 627-633.

55. Le M. T. Q., W. H. F. L., Nguyen H. D., Taylor W., Hoang P. V. M., et al.,.

(2008), "Influenza A H5N1 Clade 2.3.4 Virus with a Different Antiviral

Susceptibility Profile Replaced Clade 1 Virus in Humans in Northern

Vietnam". PLoS ONE, 3(10), pp. e3339. doi:10.1371.

56. Le Q. M., et al. (2005), "Avian flu: isolation of drug-resistant H5N1 virus".

Nature, 437(7062), pp. 1108.

57. Le Q. M., S.-T. Y., Ozawa M., Ito M., Kawaoka Y.,. (2009), "Selection of

H5N1 Influenza Virus PB2 during Replication in Humans". Journal of

Virology, 83(10), pp. 5278-5281.

58. Le Q. M., W. H. F. L., Tran N.D.,van Doorn H. R., Nguyen T.H., Horby P.

(2009), "A Community Cluster of Oseltamivir-Resistant Cases of 2009

H1N1 Influenza". The new England journal of medicine, 362(1), pp. 86-87.

59. Leang K., D. Y., Shaw R., Caldwell N., et al.,. (2013), "Influenza antiviral

resistance in the Asia-Pacific region during 2011". Antiviral Research, 97,

pp. 206-210.

60. Li, D., et al. (2008), "Genetic analysis of influenza A/H3N2 and A/H1N1

viruses circulating in Vietnam from 2001 to 2006". J Clin Microbiol, 46(2),

pp. 399-405.

61. Li D., S. R., Le T. Q. M., Nguyen L. K. H., Suzuki Y., Shobugawa Y.,

Dinh T. D., et al.,. (2008), "Genetic Analysis of Influenza A/H3N2 and

A/H1N1 Viruses Circulating in Vietnam from 2001 to 2006". JOURNAL OF

CLINICAL MICROBIOLOGY, 46(2), pp. 399–405.

62. Liu D., S. W., Shi Y., et. al (2013), "Origin and diversity of novel avian infl

uenza A H7N9 viruses causing human infection: phylogenetic, structural,

and coalescent analyses". The Lancet, pp. http://dx.doi.org/10.1016/S0140-

6736(13)60938-1.

63. Liu Q. , L. L., Sun Z., Chen G., Wen Y., Jiang S. . (2013), "Genomic

signature and protein sequence analysis of a novel influenza A (H7N9) virus

that causes an outbreak in humans in China". Microbes and Infection, pp. in

press.

64. Matsuzaki Y., et al. (2010), "A two-year survey of the oseltamivir-resistant

influenza A(H1N1) virus in Yamagata, Japan and the clinical effectiveness

of oseltamivir and zanamivir". Virol J, 7, pp. 53.

65. McCauley J. W. and Mahy B. W. (1983), "Structure and function of the

influenza virus genome". Biochem J, 211(2), pp. 281-94.

66. Meijer A., L. A., Hungnes O., Lina B., van der Werf S., Schweiger B., et al.

(2009), "Oseltamivir-resistant influenza A (H1N1) virus, Europe, 2007–08

season". Emerg Infect Dis, 15(4), pp. 552-560.

67. Menno D. de Jong, M. D., Ph.D., Tran Tan Thanh, M.Sc., Truong Huu

Khanh, M.D., Vo Minh Hien, M.D., Gavin J.D. Smith, Ph.D., Nguyen Vinh

Chau, M.D., Bach Van Cam, M.D., Phan Tu Qui, M.D., Do Quang Ha,

M.D., Ph.D., Yi Guan, M.D., Ph.D., J.S. Malik Peiris, D.Phil., M.D., Tran

Tinh Hien, M.D., Ph.D., and Jeremy Farrar, D.Phil., F.R.C.P. (2005),

"Oseltamivir Resistance during Treatment of Influenza A (H5N1) Infection".

N Engl J Med, 353, pp. 2667-2672.

68. Moghadas SM, B. C., Rost G, Wu J. (2008), "Population-Wide Emergence

of Antiviral Resistance during Pandemic Influenza". PLoS ONE, 3(3), pp.

e1839. doi:10.1371.

69. National Institute of Infectious Diseases. (2013), Antiviral resistance

surveillance in Japan. http://www.nih.go.jp/niid/en/influenza-e/2132-flu/flu-

dr-e/.

70. Nelson M. I. and Holmes E. C. (2007), "The evolution of epidemic

influenza". Nat Rev Genet, 8(3), pp. 196-205.

71. Nelson M. I., E. L., Spiro D. J., Boyne A. R., Bera J., et al.,. (2008),

"Molecular Epidemiology of A/H3N2 and A/H1N1 Influenza Virus during a

Single Epidemic Season in the United States". PLoS Pathogens, 4(8), pp.

e1000133. doi:10.1371.

72. Nelson M. I., V. A. L., Kitikoon P.,Holmes E. C., Gramer M. R., . (2012),

"Evolution of Novel Reassortant A/H3N2 Influenza Viruses in North

American Swine and Humans, 2009–2011". J. Virol., 86(16), pp. 8872.

73. Nguyen H. T., Fry A. M., and Gubareva L. V. (2012), "Neuraminidase

inhibitor resistance in influenza viruses and laboratory testing methods".

Antivir Ther, 17(1 Pt B), pp. 159-73.

74. Nguyen H. T., et al. (2010), "Recovery of a multidrug-resistant strain of

pandemic influenza A 2009 (H1N1) virus carrying a dual H275Y/I223R

mutation from a child after prolonged treatment with oseltamivir". Clin

Infect Dis, 51(8), pp. 983-4.

75. Nguyen T. D., N. T. V., Vijaykrishna D., WebsterG. R., Guan Y., Peiris J.S.

M., Smith J.D. G.,. (2008), "Multiple Sublineages of Influenza A Virus

(H5N1), Vietnam, 2005−2007". Emerg Infect Dis., 14(4), pp. 632–636.

76. Nguyen T., R. P., Davis C. T., Do T. H., Balish ., Nguyen H. D., et al.,.

(2012), "Evolution of highly pathogenic avian influenza (H5N1) virus

populations in Vietnam between 2007 and 2010". Virology, 432, pp. 405–

416.

77. Nguyen T. Y., G. B. S., Nguyen H. T., Tran N. D., Pham D. T., Le T.Q.

M., Tran H. N., Bui T. C., Dang T. D., Nguyen T. L., Uyeki M. T., Dennis

D., Kile C. J., Kapella K. B., Iuliano A.D., Widdowson M-A., Nguyen T.

H.,. (2013), "National surveillance for influenza and influenza-like illness in

Vietnam, 2006−2010". Vaccine, 31, pp. 4368–4374.

78. Nukiwa N., S. A., Furuse Y., Shimabukuro K., Odagiri T., Khandaker I.,

Oshitani H. (2010), "Simplified screening method for detecting oseltamivir

resistant pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus by a RT-PCR/restriction

fragment length polymorphism assay". Journal of Virological Methods, 170,

pp. 165-168.

79. Okomo-Adhiambo, M., et al. (2010), "Neuraminidase inhibitor susceptibility

testing in human influenza viruses: a laboratory surveillance perspective".

Viruses, 2(10), pp. 2269-89.

80. Okomo-Adhiambo M., D.-H. J. G., Deyde M. V.,1 Sheu G. T., Xu X.,

Klimov I. A., Gubareva V. L.,. (2010), "Detection of E119V and E119I

Mutations in Influenza A (H3N2) Viruses Isolated from an

Immunocompromised Patient: Challenges in Diagnosis of Oseltamivir

Resistance". Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 54(5), pp. 1834–

1841.

81. Peasah SK, A.-B. E., Breese J, Meltzer MI, Widdowson MA,. (2013),

"Influenza cost and cost-effectiveness studies globally--a review.". Vaccine,

31(46), pp. 5339-48.

82. Pielaka M. R., S. R. J., Chou J. J., . (2009), "Mechanism of drug inhibition

and drug resistance of influenza A M2 channel". PNAS, 106(18), pp. 7379–

7384.

83. Ping J., K. L., Forbes E. N., et. al. (2011), "Genomic and Protein Structural

Maps of Adaptive Evolution of Human Influenza A Virus to Increased

Virulence in the Mouse". PLoS ONE, 6(6), pp. e21740.

doi:10.1371/journal.pone.0021740.

84. Potter C. W. (2001), "A history of influenza". Journal of Applied

Microbiology, 91(4), pp. 572-579.

85. Prokudina E. N., et al. (2008), "An antigenic epitope of influenza virus

nucleoprotein (NP) associated with polymeric forms of NP". Virol J, 5, pp.

37.

86. Rameix-Welti M. A., A. F., Buchy P., Mardy S., Aubin J. T., Veron M., van

der Werf S. , Naffakh N.,. (2006), "Natural Variation Can Significantly Alter

the Sensitivity of Influenza A (H5N1) Viruses to Oseltamivir". Antimicrobial

Agents and Chemotherapy, 50(11), pp. 3809–3815.

87. Reddy D. (2010), "Responding to pandemic (H1N1) 2009 influenza: the role

of oseltamivir". J Antimicrob Chemother, 65(Suppl 2), pp. ii35–40.

88. Ronaghi M. (2011), "Pyrosequencing Sheds Light on DNA Sequencing".

Genome Res., 11, pp. 3-11.

89. Saito R., et al. (2007), "High prevalence of amantadine-resistance influenza a

(H3N2) in six prefectures, Japan, in the 2005-2006 season". J Med Virol,

79(10), pp. 1569-76.

90. Samaan, G., M. McPherson, and J. Partridge. (2013), "A review of the

evidence to support influenza vaccine introduction in countries and areas of

WHO's Western Pacific Region". PLoS One, 8(7), pp. e70003.

91. Samuel B. Graitcer, L. G., Laurie Kamimoto, Saumil Doshi et al.,. (2011),

"Characteristics of Patients with Oseltamivir- Resistant Pandemic (H1N1)

2009, United States". Emerging Infectious Diseases, 17(2), pp. 255.

92. Sandbulte M. R., et al. (2011), "Discordant antigenic drift of neuraminidase

and hemagglutinin in H1N1 and H3N2 influenza viruses". Proc Natl Acad

Sci U S A, 108(51), pp. 20748-53.

93. Sanger F., C. A. R. (1975), "A rapid method for determining sequences in

DNA by primed synthesis with DNA polymerase". Journal of Molecular

Biology, 94(3), pp. 441-446.

94. Shih C., A., Hsiao T., Ho M., LiW.,. (2007), "Simultaneous amino acid

substitutions at antigenic sites drive influenza A hemagglutinin evolution".

PNAS, 105(15), pp. 6283-6288.

95. Sims L. D., E. T. M., Liu K. K., et.al. (2003), "Avian influenza in Hong

Kong 1997-2002". Avian Diseases, 47(3), pp. 832-838.

96. Sleeman, K., et al. (2013), "R292K substitution and drug susceptibility of

influenza A(H7N9) viruses". Emerg Infect Dis, 19(9), pp. 1521-4.

97. Smith D. J., et al. (2004), "Mapping the antigenic and genetic evolution of

influenza virus". Science, 305(5682), pp. 371-6.

98. Smith G. J., et al. (2009), "Origins and evolutionary genomics of the 2009

swine-origin H1N1 influenza A epidemic". Nature, 459(7250), pp. 1122-5.

99. Subbarao EK, L. W., Murphy BR. (1993), "A single amino acid in the PB2

gene of influenza A virus is a determinant of host range". J Virol., 67(4), pp.

1761-1764.

100. Suki Man-Yan Lee, H.-L. Y. (2012), "Targeting the host or the virus Current

and novel concepts for antiviral approaches against influenza virus

infection". Antiviral Research, 96, pp. 391-404.

101. Suzuki Y., S. R., Sato I., Zaraket H., Nishikawa M., Tamura T., Dapat C.,

Caperig-Dapat I., Baranovich T., Suzuki T., Suzuki H.,. (2011),

"Identification of oseltamivir resistance among pandemic and seasonal

influenza A (H1N1) viruses by an His275Tyr genotyping assay using the

cycling probe method". J.Clin.Microbiol., 49(1), pp. 125-130.

102. Takano R, K. M., Igarashi M, Le QM, Sekijima M, Ito K, Takada A,

Kawaoka Y.,. (2013), "Molecular mechanisms underlying oseltamivir

resistance mediated by an I117V substitution in the neuraminidase of

subtype H5N1 avian influenza A viruses". J Infect Dis., 207(1), pp. 89-97.

103. Tamura D., M. K., Yamazaki M., Fujino M., et al.,. (2009), "Oseltamivir-

Resistant Influenza A Viruses Circulating in Japan". J. Clin. Microbiol.,

47(5), pp. 1424-1427.

104. Tashiro M., et al. (2009), "Surveillance for neuraminidase-inhibitor-resistant

influenza viruses in Japan, 1996-2007". Antivir Ther, 14(6), pp. 751-61.

105. Tong S., et al. (2012), "A distinct lineage of influenza A virus from bats".

Proc Natl Acad Sci U S A, 109(11), pp. 4269-74.

106. Vuong D. C., Hoang V. M. P., Nguyen L. K. H., et al. (2012), "The genetic

match between vaccine strains and circulating seasonal influenza A viruses

in Vietnam, 2001–2009". Influenza and Other Respiratory Viruses,

DOI:10.1111/irv.12038.

107. Wallace R. G., et al. (2007), "A statistical phylogeography of influenza A

H5N1". Proc Natl Acad Sci U S A, 104(11), pp. 4473-8.

108. Walter M. B., I. M., Pamela K. Y., Frances MD G., Adolfo G., Noelia M.,

Daniel R P., Ana S G.-R., Brent S S. (2013), "Influenza A(H1N1)pdm09

virus infection in marine mammals in California". Emerging Microbes and

Infections, 2(e40), pp. doi:10.1038.

109. Wang M., Q. J., Liu Y., Vavricka C. J., Wu Y., Li Q., Gao F. G.,. (2011),

"Influenza A Virus N5 Neuraminidase Has an Extended 150-Cavity ".

Journal of Virology, 85(16), pp. 8431-8435.

110. WHO. (2009), "Influenza A(H1N1) virus resistance to oseltamivir -

2008/2009 influenza season, northern hemisphere".

111. WHO. (2011), "Manual for the laboratory diagnosis and virological

surveillance of influenza". pp. 103-114.

112. WHO. (2012), "Laboratory methodologies for testing the antiviral

susceptibility of influenza viruses: Neuraminidase inhibitor (NAI)

Genotyping: molecular-based assays".

113. WHO. (2012), "Laboratory methodologies for testing the antiviral

susceptibility of influenza viruses: Neuraminidase inhibitor (NAI)

Phenotyping: neuraminidase inhibition assays".

114. WHO. (2012), "Weekly epidemiological record". 39(87), pp. 369-380.

115. WHO. (2013), Cumulative number of confirmed human cases for avian

influenza A(H5N1) reported to WHO, 2003-2013.

http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/EN_GIP_20130426C

umulativeNumberH5N1cases.pdf.

116. WHO. (2013), Number of confirmed human cases of avian influenza

A(H7N9) reported to WHO.

http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/influenza_h7n9/06_R

eportWebH7N9Number.pdf.

117. WHO. (2013), Vaccines. http://www.who.int/influenza/vaccines/en/.

118. Wright P. F., N. G., Kawaoka Y.,, (2007), Orthomyxoviridae, in Field's

Virology,5th David M. Knipe, P.M.H., Editor, Lippincott Williams &

Wilkins: Philadelphia. pp. 1713-1716.

119. Yang J., L. Y., Huang Y., Su C., Lo J. , Ho Y., Yao C., Hsu L., Wu H., Liu

M.,. (2011), "Reassortment and Mutations Associated with Emergence and

Spread of Oseltamivir-Resistant Seasonal Influenza A/H1N1 Viruses in

2005–2009". PLoS ONE, 6(3), pp. e18177.

120. Yi P. L., X. X., Wharton A. S., Martin R. S., et al.,. (2013), "Evolution of

the receptor binding properties of theinfluenza A(H3N2) hemagglutinin".

PNAS, 110(7), pp. 2677-2683.

121. Zambon, M. (2011), "Assessment of the burden of influenza in children".

Lancet, 378(9807), pp. 1897-8.

122. Zambon M., P. C., (2009), Influenza, in Clinical Virology,6th al., A.J.Z.e.,

Editor, John Wiley&Sons: Sussex.

123. Zhao D., L. L., Li Y., Jiang Y., Liu L, et al.,. (2012), "Phylogenetic and

Pathogenic Analyses of Avian Influenza A H5N1 Viruses Isolated from

Poultry in Vietnam". PLoS ONE, 7(11), pp. e50959. doi:10.1371.

PHỤ LỤC 1

1. Hình ảnh minh họa các bước thực hiện thử nghiệm ức chế neuraminidase

1.1 Xác định độ hoạt động của neuraminidase

1.1.1 Hoạt động của neuraminidase qua máy đọc Victor X2

1.1.2 Biểu đồ thể hiện sự hoạt động của neuraminidase và mức độ pha loãng của mỗi vi rút cúm

1.2 Thử nghiệm ức chế neuraminidase

1.2.1 Kết quả ban đầu qua máy đọc Victor X2

1.2.2 Giá trị IC50 của các phân típ vi rút cúm A thông thường

Stt

A/H1N1

A/H1N1pdm09 (nM) 0.37 0.19 0.08 0.24 0.02 0.1 0.13 0.09 0.06 0.12 0.09 0.12 0.11 0.06 0.29 0.45 0.05 0.32 0.16 0.29 0.08 0.12 0.15 0.07 0.14 0.18 0.21 0.1 0.12 0.17 0.12 0.1 1.51 0.17 0.09 A/H3N2 (nM) 0.34 0.05 0.18 0.01 0.01 0.25 0.52 0.31 0.11 0.08 0.07 0.18 0.17 0.04 0.04 0.24 0.02 0.05 0.07 0.35 0.99 0.02 0.07 0.59 0.27 0.04 0.22 0.24 0.53 0.39 0.18 0.31 0.02 0.20 0.03 A/H1N1 (nM) 0.16 0.37 0.24 0.35 0.21 0.34 0.4 0.16 0.31 0.2 0.48 1.03 0.25 0.4 0.26 0.33 0.45 0.45 0.12 0.13 0.33 0.64 0.25 0.96 1.18 1.03 1.35 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 A/H5N1 (nM) 1.3 0.13 1.2 0.3 0.56 0.94 0.79 2.36 4.55 1.75 4.16 1.83 7.27 7.3 3.41 8.98 2.65 6.3 0.45 3.65 2.01 1.2.3 Biểu đồ thể hiện mức độ kháng thuốc của vi rút bằng phần mềm JASPR

A/H1N1pdm09

A/H3N2

A/H5N1

Chủng chứng

Vi-rút cúm A/H1N1

Đột biến trên protein NA (Vị trí axit amin*)

Tên chủng

Q137K

Y156H

I223V S247G H275Y



-

A/Vietnam/TX285/08

-

-

-



-

A/Vietnam/TB289/08

-

-

-



-

A/Vietnam/TX200/08

-

-

-

2008



-

A/Vietnam/TX233/08

-

-

-



-

A/Vietnam/BT241/08

-

-

-

-

A/Vietnam/LS324/08

-

-

-



-

A/Vietnam/32036/09

-

-

-





-

A/Vietnam/E197/09

-

-

-



-

A/Vietnam/Q271/09

-

-

-

2009



-

A/Vietnam/31808/09

-

-

-



-

A/Vietnam/34381/09

-

-

-



-

A/Vietnam/N116/09

-

-

-

Vi rút cúm A/H1N1pdm09

Đột biến trên protein NA (Vị trí axit amin*)

Tên chủng

Q313K

I223M

I223K

S247N H275Y

vàI427T



-

A/Vietnam/32023/09

-

-

-



-

A/Vietnam/32043/09

-

-

-



-

A/Vietnam/32047/09

-

-

-



-

A/Vietnam/32060/09

-

-

-

2009



-

A/Vietnam/32067/09

-

-

-

-

A/Vietnam/32081/09

-

-

-





-

A/Vietnam/32085/09

-

-

-



-

A/Vietnam/33419/09

-

-

-



-

-

-

-

2011 A/Vietnam/36530/11

Vi rút cúm A/H5N1

Tên chủng

Đột biến trên protein NA (Vị trí axit amin*)

2. Các vị trí đột biến trên protein NA chủng A/H1N1, A/H1N1pdm09 và A/H5N1 được xác định sau khi giải trình tự gen của các chủng vi rút trong nghiên cứu

I117V Q136L V149A D199G S247N H275Y N295S

-

-

2003 A/Vietnam/UT3030/03

-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/1203/04

-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/1194/04

-

-

-

-

-

2004

-

-

A/Vietnam/3062/04

-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/JP178/04

-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/JP14/05

-

-

-

-

-

-

-

2005

A/Vietnam/JP4207/05

-

-

-

-

-

-

-

A/VietNam/HN30408/05

-

-

-



-

-

-

A/Vietnam/HN31203/07

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/HN31209/07



-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/HN31242/07

-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/HN31244/07

-

-

-

-

-

2007

-

-

A/Vietnam/HN31312/07

-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/HN31323/07

-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/HN31239/07

-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/HN31388/07

-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/HN31394/08

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/HN31412/08

-

-

-

-

-



-

-

2008

A/Vietnam/HN31432M/08

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/HN31413/08

-

-

-

-

-



-

-

A/Vietnam/HN31461/08

-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/HN31641/09

-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/HN31604/09

-

-

-

-

-

2009

-

-

A/Vietnam/HN31633/09

-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/HN31673/09

-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/HN36250/10

-

-

-

-

-

-

-

2010

A/Vietnam/HN36282/10

-

-

-

-

-

-

-

A/Vietnam/HN36285/10

-

-

-

-

-

3. Mã số các trình tự gen mã hóa HA và NA của các chủng vi rút cúm A/H1N1, A/H1N1pdm09 và A/H5N1 trên Ngân hàng dữ liệu DNA NCBI (National Center for Biotechnology Information – US National Library of Medicine)

3.1 Mã số các trình tự gen mã hóa HA và NA của các chủng vi rút cúm A/H1N1

STT Tên chủng Mã số đăng ký

A/HaNoi/2017/2001 1 A/HaNoi/2143/2001 2 A/HaNoi/2253/2001 3 A/HaNoi/2476/2001 4 A/HaNoi/2480/2001 5 A/HaNoi/2532/2001 6 A/HaNoi/2546/2002 7 A/HaNoi/2704/2002 8 A/HaNoi/ARI36/2003 9 10 A/HaNoi/BM857/2003 11 A/HaNoi/BM862/2003 12 A/HaNoi/BM870/2003 13 A/HaNoi/BM893/2003 14 A/HaNoi/BM898/2003 15 A/HaNoi/BM902/2003 16 A/HaNoi/BM910/2003 17 A/HaNoi/BM945/2003 18 A/HaNoi/BM949/2003 19 A/HaNoi/BM959/2003 20 A/HaNoi/BT241/2008 21 A/HaNoi/HN1004/2003 22 A/HaNoi/HN1017/2003 23 A/HaNoi/HN1024/2003 24 A/HaNoi/HN337/2003 25 A/HaNoi/Q421/2006 26 A/HaNoi/Q555/2006 27 A/HaNoi/Q580/2006 28 A/HaNoi/Q591/2006 31 A/HaNoi/N229/2008 32 A/HaNoi/TX200/2008 33 A/HaNoi/TX233/2008 Gen HA CY103972 CY104686 CY103980 CY103988 CY104694 CY103996 CY104004 CY104012 CY104702 CY105222 CY105230 CY104710 CY104718 CY104020 CY104726 CY104734 CY104742 CY104028 CY104750 CY104870 CY104036 CY104758 CY104044 CY104766 CY105118 CY104838 CY104846 CY104284 CY104292 CY105134 CY105142 Gen NA CY103974 CY104688 CY103982 CY103990 CY104696 CY103998 CY104006 CY104014 CY104704 CY105224 CY105232 CY104712 CY104720 CY104022 CY104728 CY104736 CY104744 CY104030 CY104752 CY104872 CY104038 CY104760 CY104046 CY104768 CY105120 CY104840 CY104848 CY104286 CY104294 CY105136 CY105144

3.2 Mã số các trình tự gen mã hóa HA và NA của các chủng vi rút cúm A/H1N1pdm09

Mã số đăng ký

STT

Tên chủng

Gen HA CY128467 CY128435 CY128443 CY128451 CY128459 CY128064 CY128371 CY128379 CY128387 CY128054 CY128395 CY128403 CY128411 CY128419 CY128427 CY128131 CY128139 CY128147 CY128155 CY128163 CY128171 CY128179 CY128187 CY128195 CY128467 CY128435 CY128443 CY128451 CY128459 CY128064 CY128371

Gen NA CY128469 CY128437 CY128445 CY128453 CY128461 CY128066 CY128050 CY128381 CY128389 CY128056 CY128397 CY128405 CY128413 CY128421 CY128429 CY128133 CY128141 CY128149 CY128157 CY128165 CY128173 CY128181 CY128189 CY128197 CY128085 CY128077 CY128093 CY128109 CY128101 CY128125 CY128117

A/Viet Nam/001-1020/2009 1 A/Viet Nam/001-1424/2009 2 A/Viet Nam/001-1716/2009 3 A/Viet Nam/001-1880/2009 4 A/Viet Nam/001-1889/2009 5 A/Viet Nam/001-1890/2009 6 A/Viet Nam/11032002/2009 7 A/Viet Nam/11032006/2009 8 9 A/Viet Nam/11032010/2009 10 A/Viet Nam/11032011/2009 11 A/Viet Nam/11032016/2009 12 A/Viet Nam/11032017/2009 13 A/Viet Nam/11032021/2009 14 A/Viet Nam/12032001/2009 15 A/Viet Nam/12032005/2009 16 A/Viet Nam/13032001/2009 17 A/Viet Nam/13032002/2009 18 A/Viet Nam/13032008/2009 19 A/Viet Nam/13032009/2009 20 A/Viet Nam/13032011/2009 21 A/Viet Nam/13032015/2009 22 A/Viet Nam/13032016/2009 23 A/Viet Nam/13032019/2009 24 A/Viet Nam/13032030/2009 25 A/Viet Nam/811/2009 26 A/Viet Nam/817/2009 27 A/Viet Nam/818/2009 28 A/Viet Nam/823/2009 31 A/Viet Nam/835/2009 32 A/Viet Nam/841/2009 33 A/Viet Nam/850/2009

3.3 Mã số các trình tự gen mã hóa HA và NA của các chủng vi rút cúm A/H5N1

STT Tên chủng Mã số đăng ký

Gen HA Gen NA

1 A/Vietnam/UT3028/2003 HM114449 HM114451

2 A/Vietnam/UT3030/2003 HM114465 HM114467

3 A/Vietnam/UT3035/2003 HM114473 HM114475

4 A/Viet Nam/1203/2004 EF541403 EF541467

5 A/Viet Nam/3046/2004 AY651335 AY651446

6 A/Viet Nam/JP178/2004 EF456795 EF456796

7 A/Vietnam/1194/2004 EF541402 EF541466

8 A/Vietnam/UT30259/2004 HM114513 HM114515

9 A/Vietnam/UT3040/2004 HM114481 HM114483

10 A/Vietnam/UT3062/2004 HM114505 HM114507

11 A/Viet Nam/HN30408/2005 EF456803 EF456804

12 A/Viet Nam/JP14/2005 EF456799 EF456801

13 A/Viet Nam/JP4207/2005 EF456798 EF456800

14 A/Vietnam/UT30850/2005 HM114537 HM114539

15 A/Viet Nam/HN31242/2007 EU294369 EU294372

16 A/Vietnam/HN31244/2007 HQ215515 HQ215516

17 A/Vietnam/HN31388M1/2007 HM114585 HM114587

18 A/Vietnam/UT31203A/2007 HM114545 HM114547

19 A/Vietnam/UT31239/2007 HM114553 HM114555

20 A/Vietnam/UT31244II/2007 HM114561 HM114563

21 A/Vietnam/UT31312II/2007 HM114577 HM114579

22 A/Vietnam/HN31432M/2008 HM114617 HM114619

23 A/Vietnam/UT31394II/2008 HM114593 HM114595

24 A/Vietnam/UT31412II/2008 HM114601

25 A/Vietnam/UT31413II/2008 HM114609 HM114611

PHỤ LỤC 2

Hình ảnh làm việc tại phòng thí nghiệm ATSH cấp 2

Hình ảnh làm việc tại phòng thí nghiệm ATSH cấp 3