Ứng dụng công nghệ sinh học trong sinh tổng hợp một số Flavonoid glycosides có hoạt tính y dược học

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Glycosides is the learning of learning have structure gồm các phân tử gắn kết với phần còn lại có các chất khác nhau như steroid, flavonoid, terpenoid hoặc alkaloid, v.v. Glycosides được phát hiện yếu tố chủ yếu ở thực vật có mạch và xạ khuẩn (xạ khuẩn) dưới dạng chất trao đổi thứ sinh và có hoạt động của y dược học quan trọng. Mời các bạn cùng tìm hiểu nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng công nghệ sinh học trong sinh tổng hợp một số Flavonoid glycosides có hoạt tính y dược học

ỨNG D NG CÔNG NGHỆ SINH HỌG TRONG SINH TỎNG HỢP MỘT SỎ FLAVONOID GLYCOSIDES CÓ HOẠT TÍNH Y D ư ợ c HỌC TS. N guyễn H uy Th uần * TÓM T T Glycosides là các họp chất hoá học có cấu trúc gồm phân tử đường gắn với phần còn lại có bản chất khác nhau như steroid, flavonoid, térpenoid hoặc alkaloid, v.v. Glycosides được phát hiện chù yếu ở thực vật có mạch và xạ khuẩn (actinomycetes) đưới dạng các chất trao đổi thứ sinh và có hoạt tính y được học quan trọng. Ví đụ, các chất flavonoid glycosides tách chiết từ gừng, đưa hấu, nghệ có tác dụng chống oxy hoá, kháng khuẩn, kháng viêm, v.v. Do đó, nhu cầu về sử dụng hợp chất glycosides trong nghiên cứu và thực tiễn (thực phẩm ăn kiêng, thuốc chữa bệnh, kháng sinh) ngắy càng tăng cao. Tuy vậy, các phương pháp tách chiết hoá học để sản xuất ra glycosiđes có nhiều hạn chế đã dẫn đến giá thành sản phẩm tăng cao, khó tiếp cận. Bời vậy, chúng tôi tiến hành áp dụng các biện pháp công nghệ sinh học hiện đại để sinh tổng họp glycosides nhằm đa dạng hoá sản phẩm, tãng năng suất và hướng tói phát triển công nghệ sản xuất các hợp chất này ở Việt Nam, đặc biệt trong lĩnh vực dược học. * Từ khoá: Vi khuẩn Esch richia coli; Công nghệ DNA tái tổ họp; Flavonoid; Glycosides. A p p lic a tio n o f b io t c h n o lo g ic a l a p r ro a c h f o r b io s y n th sis o f f la v o n o id g lycosid s, th rap u tica lly valu ab l a g n ts S u m m ary Structurally, glycosides are consisting of sugar molecule linking with the remaining one like steroid, flavonoid, terpenoid or alkaloid, etc. These compounds are ubiquitous in vascular plants and actinomycetes as secondary metabolites and own lots of significantly medical and pharmaceutical effects. As an example, flavonoid glycosides obtained from ginger, watermelon and turmeric display antioxidant, antiinflammatory, antibacterial properties, etc. Thereby, requirement for glycosides have been increasing in the science as well as in the human life (diet foods, drugs, antibiotics). However, chemical method for glycosides extraction still have much restricts and in this manner obtained products are of high cost as well as limiting their commercial available. We have applied modern biotechnological methods for biosynthesis of flavonoid glycosides using recombinant Esch richia coli as hosts. It is proven as a feasible approach for structural diversification, improvement of productivity as well as green technology for synthesis of glycosidcs. Furthermore, we are setting up the bases to scale up production of these valuable compounds in Vietnam. * Key words: Esch richia coli, Recombinant DNA technology; Flavonoid; Glycosides. I. ĐẶT VÁN ĐÈ v ề phương diện trao đổi chất, qu á tr nh chuyển hoá của rất nhiều hợp chất như steroid, terpenoid, alkaloid, etc thường dẫn tới phản ứng gắn phân tử đường khác nhau (glycosylation) vào các chất này để tạo ra phân tử glycoside tan tốt trong nước, cớ hoạt tính bền vững và tham gia trong nhiều quá tr nh sinh lý, sinh hoá của cơ thể sinh vật. Những hợp chất này vốn là thành phần quan trọng của cây thuốc như quercetin và kaempferol (Phạm Thanh Kỳ và c s , 2005; Bachir và c s , 1992). Trước đây, người ta thường sử dụng dạng hợp chất thô cùa glycosides như lấy dịch chiết nhưng hiệu quả thu được chưa cao. Ngày càng có nhiều nghiên cứu đề cập đến vai trò của các glycosides như chất kháng ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn và chống oxy hoá mạnh (Kren và c s , 2001; Di Carlo và CTV, 1999; Fuchs và c s , 1993; Lê Thị Diễm Hồng và c s , 2007) và do đó, * Đại học Duy Tân Đà Năng 574
nhu cầu với nhóm hợp chất này tăng lên. Tuy nhiên, phương pháp tách chiết hoá học với nhược điểm phụ thuộc vào nguồn cung thực vật, hàm lượng glycoside cần tách chiết thấp, tinh sạch phức tạp đã không tạo ra được sản lượng glycosides lớn (Srivastava và cs, 2009). Phương pháp tổng hợp hoá học cũng có những hạn chế như tạo ra sản phẩm là hỗn hợp nhiều dẫn xuất, khó thiết lập điều kiện phản ứng, tinh sạch tốn kém và đòi hỏi nhiều thời gian (Ren và cs, 2012). Bởi vậy, giá thành cùa glycosides trên thị trường khá cao, khó tiếp cận. Những năm gần đây, do sự phát triển của các ngành thuộc công nghệ sinh học như công nghệ gen và protein tái tổ hợp, công nghệ vi s in h ... đã tạo ra bước đột phá cho phép sinh tổng họp hàng ioạt các hợp chất glycoside khác nhau góp phần tạo ra sự đa dạng hoá sản phẩm, tăng năng suất và điều quan trọng nó là công nghệ sạch, ít gây ô nhiễm môi trường. Trong báo cáo này, chứng tôi mô tả một số thành tựu sinh tổng họp flavonoid glycosides đã được thực hiện và các bước xây dựng cơ bản đã và đang được tiến hành tại Trường Đại học Duy Tân (Đà Nằng) nhằm hướng tới sản xuất các hợp chất glycosides tại V iệt Nam bằng biện pháp công nghệ sinh học. 1 2 3 H nh l. Cấu trúc của m ột số hợp chất flavonoid dùng trong thí nghiệm sinh tổng họp flavonoid glycosides. 1: apigenein; 2: baicalein; 3: myricetin II. Đ Ó I TƯỢNG VÀ PHƯƠNG P H Á P NGHIÊN c ứ u 2.1. Đối tượ ng n gh iên cứu Sinh tổng hợp một số hợp chất flavonoid glycosides từ cơ chất chọn lựa ban đầu (h nh 1) bằng biện pháp công nghệ sinh học. 2.2. P h ương p h á p ng hiên cứ u * Sinh tổng hợp các flavonoid glycosides: Phương pháp chuyển hóa cơ chất sử dụng trực tiếp tế bào vi khuẩn E.coỉỉ tái tổ hợp. Nguyên tắc căn bản của phương pháp này là chuyển gen mã hóa cho flavonoid glycosyltransferase vào trong vi khuẩn E.coli. Đồng thời, vi khuẩn này cũng được cải biến các gen tham gia vào chuỗi sinh tổng hợp phân tử đường (UDPglucose hoặc TD Prhamnose). T hí nghiệm được bắt đàu bằng việc nuôi cấy vi k h u ẩ n trê n trong môi trường dinh dưỡng thích hợp, sau đó khi m ật độ vi khuẩn đạt đến ngưỡng nhất định th sẽ bổ sung cơ chất là các flavonoid (myricetin, apigenein hoặc baicalein). Vi khuẩn chuyển hóa các chất này thành dạng glycosides tương ứng, rồi giải phóng ra môi trường (h nh 2a, 2b). Sử dụng các phương pháp tách chiết, phát hiện sản sân phẩm n hư TLC, HPLC, LCESI/MS (T hu anv à cs, 2013). 575
OH Recombtiwrt E. coil 8 12 1
glucos -l-phosphat uridyltransf ras và glucosyltransferase (tách từ Arabìdopsỉs). Sản phẩm được tạo thành là apigenein7ỡglucoside và baicalein7ỡglucoside. Một số gen tham gia vào chuỗi trao đổi chất nhánh bên đã bị xoá để nhằm tăng tích luỹ ƯDPglucose nội bào như D-gỉucos phosphat ỉsom ras (pgi), UDP-glucos hydrolas (ushA) và D-gỉucos -6-phosphat d hydrog n as (zwf). * Các phư ng pháp nghiên cứu thực nghiệm: Sử dụng các thao tác kỹ thuật di truyền hiện đại được mô tả theo protocol chuẩn (Sambrook và c s , 2001) trong việc cắt, nối, nhân các đoạn gen mong muốn (PCR). Hàm lượng các cơ chất được sử dụng cho chuyển hoá là 100 fiM. Phương pháp sắc ký để phát hiện, đo hàm lượng và tinh sạch sản phẩm được mô tả chi tiết theo các tài liệu (Simkhada và cs. 2010; Thuan và cs. 2013). m . K Ế T QUẢ i 2 * Sinh tong hợp 3 hợp chat flavono id glycosid s: Bằng phương pháp được tiến hành như mô tả ờ Hình 2a và 2by chúng tôi đã sử dụng gen 3ỡrhanm osyl glycosyltransferase biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coỉi MG3, đồng thời chủng vi khuẩn này cũng được cài biến m ỵ rice tm con đường sinh tổng hợp đường TDPLrhamnose để tăng sinh nhiều hơn loại đường này. Cuối cùng, chúng m ỉd c e tm -th a o m o s ỉđ e tôi thu được chủng tái tổ hợp E. coỉi M3G3. Chủng này sau đó được sử dụng để chuyển hóa cơ chất thuộc nhóm flavonol là myricetin, và cho ra sản phẩm là myricetin 3OLrhamnoside. Sản phẩm này được phát hiện, đo hàm lượng bằng phương pháp sắc ký TLC, HPLC và LCESI/MS (h nh 3a, 3b, 3c). H àm lượng sản phẩm tối H nh 3a. sắ c ký lớp mỏng (TLC) của myricetin đa thu nhận được là 55,6 ỆiM. và dẫn xuất rhamnosiđes (2) so với đối chứng (1). iĩ A + 1 Ả H A (12hí ử |Ị (24hí ........... _ A ...... ử h ________ / t _ ẳ Ầ . (36h) + 1 ủ ...... _ aa_. h ị*m ứ h (60h) 6 ỉ 10 n 14 it II 20 H nh 3b: Phân tích HPLC quá tr nh chuyển hoá myricetin (khoảng phút thứ 8) thành rayricetm3OLrhamnosiđe (khoảng phút thứ 10) 577
Oil 46S.10ỈI [Myricclín3f>rỉ)atti K>s dc]' 1 Ọ »T »K p 319.0444 rnm 1 IB MI « s «1 a ĩ» ỉe 260 % 3JJ a 3« Ỉ60 so « eo w I H I SĐQ S20' m/z H nh 3c. D ữ liệu LCESI/MS của phân tử myricetin3Orhamnoside Tương tự, chúng tôi đã tiến hành thiết kế và tạo ra chủng E. coli MA 3F mang gen mã hóa cho 1-0- glucosyltransferase từ Arabidopsis thaỉỉana. Chuỗi gen sinh tổng hợp UDPĐglucose cũng được cải biến để tăng cường tích lữy hợp chất này. Vi khuẩn được sử dụng như một nhà máy tế bào (microbial factory) thực hiện chuyển hóa 2 cơ chất thuộc nhóm flavones là apigenein và baicalein thành sàn phẩm tương ứng là apigenein7Oglucoside và baicalein7ơghicosiđe. Các sản phẩm này được phát hiện, đo hàm lượng bằng phương pháp TLC, HPLC, LCESI/MS (H nh 4a, 4b, 4c, 4d, 4e). Hiệu suất chuyển hóa các chất này trong điều kiện tối ưu lần lượt là 90,88 và 76,82 % tương ửng với 90,88 và 76,82 |i M . 1 2 3 * substrates H nh 4a. sắ c ký lớp mỏng phát hiện sự chuyển hoá flavones thành các dẫn xuất apigenin7Oglucoside (2) và baỉcaỉein~7ơglucoside (3) so với đối chứng (1)
Minutes H nh 4b. Dữ liệu HPLC phân tích sự chuyển hoá apigenin (khoảng phút thứ 5) thành glucoside tương ứng (khoảng phút thứ 9) 'W í r Relative abnjjdaoce (Vi) 1 271.0620 433.1144 272,0543 7 434.1173 / 120^812. J46.0617225.0650 247.Ị44Ô 273.0664 . 331.2108 9MIWI] 368 0061 ^35-1188 521.1299 m tr n n TTTtmi IT*>y 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 l l/z H nh 4c. D ữ liệu LCESI/MS của phân từ apigenin7Oglucosiđe H nh 4d. Dữ liệu HPLC phân tích sự chuyển hoá baicalien (phút thứ 5.5) thành glucoside tương ứng (khoảng phút thử 9,5)
H nh 4e. D ữ liệu LCESI/M S của phân tử baicalein7Oglucoside IV. M Ộ T SÓ N Ộ I D UN G N G H IÊ N c ứ u ĐÃ VÀ ĐAN G Đ Ư Ợ C T R I N K H A I T Ạ I ĐẠ I H Ọ C DUY TÂN Phương pháp và kết quả nghiên cứu sinh tổng hợp glycosiđes đă tr nh bày ở trên có ý nghĩa quan trọng giúp cho tác giả và c s có cơ sở thiết lập phòng thí nghiệm, máy móc thiết bị, chủng giống vi khuẩn, vật liệu di truyền và các hóa chất liên quan. Bắt đầu từ tháng 01 năm 2012, cho đến nay, nhờ sự đầu tư đặc biệt của Hội đồng quản trị và lãnh đạo của Ban giám hiệu nhà trường, chúng tôi đã xây dựng được Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử với các thiết bị hiện đại, đồng bộ phục vụ cho nghiên cứu và giảng dạy. C ụ thể với các thí nghiệm làm sinh tổng hợp glycoside nói riêng v à các hợp chất có hoạt tính nói chung, chúng tôi đã đầu tư đầy đủ các trang thiết bị, vật tư thí nghiệm để làm tách dòng (gen cloning), biểu hiện gen, làm thí nghiệm sinh tổng hợp invitro hoặc invivo. Ngoài ra, các thiết bị phục vụ cho nghiên cứu phát hiện, tách chiết, tinh sạch cũng đă được đầu tư như TLC, HPLC, cột tinh sạch và vật tư đi kèm, thiết bị lên men, chưng cất và đông khô. Hiện nay, chúng tôi đang triển khai sinh tổng hợp một số dẫn xuất cùa flavonoid như flavonoid glycoside, flavonoid bị methyl hóa hoặc các họp chất carotenoid. Hướng ưu tiên của chúng tồi là thiết lập quy tr nh sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học bằng sử dụng các biện pháp công nghệ sinh học hiện đại tập trung đầu tư trọng điểm cho lĩnh vực dược học. V. K ẾT LUẬN Chóng tôi đã ứng dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử trong việc sinh tổng hợp thành công hợp chất fiavonoid glycosides (chuyển hóa invivo) bao gồm myricetin3OLrhamnoside, apigenein7Oglucoside và baicalein7Ogỉucosiđe. Các thí nghiệm này được tiến hành trên cơ sở phân tích mối quan hệ ĐNA protein để thiết lập các hệ thổng sinh học phục vụ chuyển hoá. Sau đó, các k ỹ thuật sắc ký được sử dụng để phát hiện (định tính) và đo hàm lượng sản phẩm tạo thành (định lượng). Các phương pháp sinh tổng hợp này hiện đã trở nên khá phổ biến ở các nước phát triển. Tuy nhiên, hiện nay ờ V iệt Nam, việc ửng dụng, cải biến chúng mới chỉ ở bước đầu. Do vậy, chúng tôi hiện đang thiết lập phòng thí nghiệm sinh tổng hợp và sẽ tiến tới nghiên cứu quy tr nh sản xuất các chất có hoạt tính sinh học sử dụng các nguồn gen từ thực vật, động vật hoặc vi sinh vật khác bằng cách sử đụng vi khuẩn E. coli tái tổ họp làm vật chủ. 580
TÀ I LIỆ U TH A M K H Ả O 1. Lê Thị Diễm Hồng, Nguyễn Thị Hồng Nhiên, Nguyễn Thị Hồng Vân, Nguyễn Viết Thân và Nguyễn Xuân Thắng, 2007. Nghiên cứu tác đụng chống viêm mạn của saponin và flavonoid cây kim ngân (Lonic rajaponica Thunb.). Tạp chí dược học, 378, tr.2429. 2. Phạm Thanh Kỳ, Phí Tùng Lâm và Vũ Thị Nguyệt Minh, 2005. Kết quả nghiên cứu về flavonoid trong lá mức hoa Irắng (Holarrhena anditysenterica wallApocynaceae). Tạp chí Thông tin Y được, 11, tr.2527. 3. Bachir B; Albert JC; Mourad K; and Francois T. 1992. FJavonoid glycosides from Erica cinerea. Phytochemistry. 31, pp.24832486. 4. Di Carlo G; Mascolo N, Izzo, AA; and Capasso F 1999. Flavonoids: old and new aspects of a class of natural therapeutic drugs. Life Science, 65, pp.337353. 5. Fuchs J, Milbrađt R, 1993. Skin antiinflammatory activity of apigenein7glucoside in rats. Aizneimittelforschung, 43, pp.370372. 6. KrenV, Martinkova L. 2001. Glycosides in medicine: the role of glycosidic residue in biological activity. Current Medicial Chemistry. 8, pp.13031328. 7. Nguyen Huy Thuan, 2013. Synthesis of flavonoid and sterol glycosides by biotransformation, (doctoral dissertation), Sun Moon University, Korea. 8. Ren G, Hou J, Fang Q, Sun H, Liu X, Zhang, L, and Wang PG (2012). Synthesis of flavonoi 3Oglycoside by UGT78D1. Glycoconjugate Journal, 29, pp.425432. 9. Sambrook J, Russell D w, 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. 3rdedition.Cold Spring: Harbor Laboratory Press NewYork, USA. 10. Sirakhada D, Lee HC, Sohng JK., 2010. Genetic engineering approach for the production of rhamnosyl and allosyi fiavonoids from Escherichia coll. Biotechnology and bioengineering, 107(1), pp.15462. 11. Srivastava, JK, Gupta, s, 2009. Extraction, characterization, stability and biological activity of fiavonoids isolated from chamomile flowers. Molecular and celỉular Pharmacology, , pp.138. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI MÔ u TRÊN CHUỘT THIẾU H T MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƯ THANH QUẢN NGƯỜI Ths. N guyễn T h ị B ìn h * H ư ởng dẫn; PGS. TS. Trịnh X uân Đàn* TÓM T T Ung thư biểu mô thanh quản là bệnh lý ác tính thường gặp đứng thứ hai trong các ung thư vùng đầu cổ sau ung thư vòm. Xuất phát từ thực tế, tại Việt Nam vẩn đề tạo mô h nh ung thư biểu mô thanh quan người trên chuột nuđe chưa được nghiên cứu nhiêu. Chính v vậy, chúng tôi tiên hành nghiên cứu này với 2 mục tiêu: Xây đựng mô h nh tạo khối ung thư thanh quản người trên chuột thiểu hụt miễn dịch bằng kỹ thuật ghép dị loài; Mô tả đặc điểm h nh thái mả u trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư thanh quản người. Đối tưọng và phương pháp nghiên cứu: 10 chuột nhắt BALB/c thiếu hụt miễn dịch, không có tế bào lympho T (nude mice, Foxnlnu) được nhập khẩu từ Công ty CharlesRiver (Hoa Kỳ). Dòng tế bào úng thư biểu mô thanh quản n p ố i Hep2 được mua từ công ty ATCC, Hoa Kỳ. Tiến hành tiêm vào dưới đa đui bên phải mỗi chuột dung dịch chứa tê bào ung thư với số lượng lx 106 tế bào/chuột cho tổng số 10 con chuột. Sau đó theo dõi sự h nh thành khồi u ưên chuột và lấy mô u làm giải phẫu bệnh sau ghép 4 tuần. Kết quả: 10 ngày sau ghép tế bào, 10/10 (Ỉ00%) chuột h nh thành khối u, kích thước khối u đạt 37,2 ± 7,1 mm3 Sau 4 tuần, các khối u phát triển đạt kích thước trung b nh 593,6 ± 117,2 mm3. Trên tiêu bản nhuộm HE: tế bào u CO h nh đa điện, nhân to nhỏ không đều, tăng kiềm tính, chất màu thô đậm, nhiều h nh ảnh nhân chia bất thường tỷ lẹ nhân so với bào tương lớn. Một sổ nơi tế nào u bị loạn sừng và tạo thành cầu sừng. Quan sát mô u trên kính hien vi điện tửừuỵền qua cho thấy tế bào ung íhư có h nh cầu, h nh bẩú dục hoặc h nh đa diện trong đó có nhân lớn chiếm gần 2/3 mỗi tể bào phản ánh tỷ iệ hạt nhân cao. Một số tế bào ung thư có h nh ảnh lõm hạt nhân. * Đại học Y Dược Thái Nguyên 581