Vai trò công nghệ tế bào trong công nghệ sinh học

Chia sẻ: Trương đình Dũng | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:13

Thêm vào BST

Báo xấu

153
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Công nghệ sinh học là quá trình sản xuất các sản phẩm trên quy mô công nghiệp, trong đó nhân tố tham gia trực tiếp và quyết định là các tế bào sống. Mỗi tế bào sống của cơ thể sinh vật hoạt động trong lĩnh vực sản xuất này được xem như một lò phản ứng nhỏ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Vai trò công nghệ tế bào trong công nghệ sinh học

Vai trò công nghệ tế bào trong công nghệ sinh học I. KHÁI NIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌC Có nhiều định nghĩa và cách diễn đạt khác nhau về công nghệ sinh học tùy theo từng tác giả, nhưng tất cả đều thống nhất về khái niệm cơ bản sau đây: Công nghệ sinh học là quá trình sản xuất các sản phẩm trên quy mô công nghiệp, trong đó nhân tố tham gia trực tiếp và quyết định là các tế bào sống (vi sinh vật, thực vật, động vật). Mỗi tế bào sống của cơ thể sinh vật hoạt động trong lĩnh vực sản xuất này được xem như một lò phản ứng nhỏ. Đầu những năm 1980, đã bắt đầu hình thành công nghệ sinh học hiện đ ại là lĩnh vực công nghiệp sử dụng hoạt động sinh học của các tế bào đã được biến đổi di truyền. Công nghệ sinh học hiện đại ra đời cùng với sự xuất hiện kỹ thuật gen. Cơ sở sinh học được áp dụng ở đây bao gồm sinh học phân tử, sinh học tế bào, hóa sinh học, di truyền học, vi sinh vật học, miễn dịch học, cùng các nguyên lý kỹ thuật máy tính... Có hai cách định nghĩa công nghệ sinh học một cách tổng quát nhất: - Do UNESCO (1985) định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ sử dụng một bộ phận hay tế bào riêng rẽ của cơ thể sinh vật vào việc khai thác sản phẩm của chúng. - Do Trường Luật Stanford (1995) định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ chuyển một hay nhiều gen vào sinh vật chủ nhằm mục đích khai thác sản phẩm và chức năng của gen đó. Sự khác biệt rõ rệt nhất của hai định nghĩa trên thuộc về đối tượng tác động của công nghệ sinh học: UNESCO xem cơ quan, bộ phận, tế bào và chức năng riêng rẽ của sinh vật là đối tượng, trong khi đó Trường Luật Stanford lại coi gen là đ ối tượng tác động của công nghệ. Từ các định nghĩa trên, có thể phân biệt đ ược hai nhóm công nghệ sinh học là: 1. Công nghệ sinh học truyền thống (traditional biotechnology) Bao gồm: + Thực phẩm lên men truyền thống (food of traditional fermentations) + Công nghệ lên men vi sinh vật (microbial fermentation technology) + Sản xuất phân bón và thuốc trừ sâu vi sinh vật (production of microbial fertilizer and pesticide) + Sản xuất sinh khối giàu protein (protein-rich biomass production) + Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô và tế bào thực vật (plant micropropagation) + Thụ tinh nhân tạo (in vitro fertilization) 2. Công nghệ sinh học hiện đại (modern biotechnology) Bao gồm: + Nghiên cứu genome (genomics) + Nghiên cứu proteome (proteomics) + Thực vật và động vật chuyển gen (transgenic animal and plant) + Động vật nhân bản (animal cloning) 1
+ Chip DNA (DNA chip) + Liệu pháp tế bào và gen (gene and cell therapy) + Protein biệt dược (therapeutic protein) + Tin sinh học (bioinformatics) + Công nghệ sinh học nano (nanobiotechnology) + Hoạt chất sinh học (bioactive compounds). II. KHÁI NIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO Công nghệ tế bào là một bộ phận quan trọng của công nghệ sinh học, chủ yếu nghiên cứu các quá trình nuôi cấy tế bào động - thực vật và vi sinh vật đ ể s ản xuất sinh khối, sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học (enzyme, vaccine, các chất thứ cấp…). Mặc dù, các kỹ thuật nuôi cấy tế bào chỉ được phát triển vào nửa đầu thế kỷ 20, nhưng đến nay các ứng dụng của chúng đã có những bước tiến vượt bậc nhờ sự đóng góp của công nghệ DNA tái tổ hợp. Công nghệ tế bào bao gồm: - Công nghệ tế bào thực vật. - Công nghệ tế bào động vật. - Công nghệ tế bào vi sinh vật. III. VAI TRÒ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1. Công nghệ tế bào trong công nghệ gen 1.1. Cơ sở khoa học của công nghệ gen  Dựa vào đặc điểm hoạt động của gen - Gen mã hóa protein theo mã bộ ba  biểu hiện tính trạng. + Thay đổi gen  thay đổi tính trạng. + Sử dụng gen để biểu hiện  sản xuất các chế phẩm. - Gen là một đoạn của ADN + Có thể cắt rời nhờ enzim cắt liêt kết phosphodiester (RE). + Gen là một thực thể có thể hoạt động độc lập. + Có khả năng di chuyển vào tế bào lạ nhờ công cụ. - Hoạt động của gen + Gen chuyển vào tế bào lạ  gen biểu hiện được và hệ gen tế bào lạ không bị ảnh hưởng.  Dựa vào tính toàn năng của tế bào Một tế bào đã chuyên hóa chứa một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với một cơ thể trưởng thành, để trong điều kiện nhất định tế bào đó có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. 2
1.3. Vai trò công nghệ tế bào trong công nghệ gen Tùy vào đối tượng nhận gen là tế bào thực vật, tế bào động vật hay vi sinh vật mà vai trò của công nghệ tế bào thể hiện khác nhau. Trong công nghệ gen vai trò của công nghệ tế bào thể hiện ở khâu nuôi cấy tế bào. 1.3.1. Nuôi cấy tế bào thực vật Sau khi thực hiện các bước của quá trình chuyển gen: xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm; phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cDNA hoặc từ thư viện genomic DNA); gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp; biến nạp vào E. coli; tách chiết DNA plasmid; thì biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp khác nhau. Chẳng hạn sử dụng phương pháp xung điện, ở đây tế bào được đặt ở trong một xung điện ngắn, xung điện này có thể làm xuất hiện những lỗ tạm thời ở trên màng tế bào, những phân tử DNA có thể đi vào bên trong tế bào. Sau khi biến nạp người ta tách những enzyme phân giải và để cho tế bào phát triển, thành tế bào mới được tạo nên. Các tế bào biến nạp này được nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo thích hợp cùng với các chất kích thích sinh trưởng để tạo nên cây hoàn chỉnh. Sau đó bằng các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern blot, Northern blot được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen. Bên cạnh các phương pháp biến nạp Agrobacterium hoặc xung điện, hiện nay có hai phương pháp khác cũng thường được sử dụng để đưa DNA vào trong tế bào. Phương pháp thứ nhất là vi tiêm: với một cái pipet rất nhỏ người ta có thể đ ưa các phân tử DNA trực tiếp vào nhân tế bào mà người ta muốn biến nạp. Phương pháp này đầu tiên chỉ được sử dụng ở tế bào động vật, nhưng sau này người ta đã sử dụng cho tế bào thực vật. Phương pháp thứ hai là bắn vào tế bào các vi đạn (microprojectile), thường bằng vàng hoặc wolfram, được bao bọc bởi DNA. Phương pháp này được gọi là phi sinh học và được sử dụng thành công ở nhiều loại tế bào khác nhau. Ở thực vật chuyển gen, sản phẩm cuối cùng thường không phải là tế bào biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn. Phần lớn thực vật được tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô tế bào. Tuy nhiên, tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và các loại cỏ khác cũng gặp một vài khó khăn. Từ một tế bào biến nạp duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gen, trong đó mỗi tế bào mang DNA ngoại lai và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau sau khi nở hoa và tạo hạt. 1.3.2. Nuôi cấy tế bào động vật Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp và ở những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội dung cơ bản gồm các bước chính sau: tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào 3
động vật; tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen; biến nạp gen vào phôi động vật; nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao); phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ và tạo ra dòng động vật chuyển gen gốc một cách liên tục, sản xuất động vật chuyển gen. Tế bào trứng tiền nhân sau khi vi tiêm được nuôi cấy trong ống nghiệm đ ể phát triển đến giai đoạn phôi dâu (morula) hoặc túi phôi (blastocyst). Ở giai đoạn này màng trong (pellucida) bị bong ra và phôi có thể làm tổ được ở dạ con. Những phôi này được cấy chuyển vào con nhận đã được gây chửa giả (pseudopregnant) để phát triển thành cá thể con. Ðối với động vật bậc thấp như cá không cần giai đoạn này. Tuy nhiên ở cá, trứng sau khi thụ tinh màng thứ cấp (chorion) dày lên, rất dai và dính gây trở ngại cho việc định vị chính xác mũi kim tiêm vào vị trí mong muốn để có thể đưa được DNA vào trứng. Mặt khác giai đoạn phôi một tế bào ở cá rất ngắn trong khi đó việc vi tiêm đòi hỏi nhiều thao tác tỉ mỉ và chính xác. Ðể khắc phục các nhược điểm này, người ta có thể tiến hành loại màng thứ cấp, kéo dài giai đoạn phôi 1-4 tế bào và ấp nhân tạo phôi trần để tạo cá bột. Ðể khẳng định động vật có được chuyển gen lạ vào hay không, người ta phải kiểm tra xem gen lạ cóHình 2: Sơpđđượo độngbvậtmáy dintruyền của động vật trưởng xâm nhậ ồ tạ c vào ộ chuyể gen thành hay không và sản phẩm của gen lạ có được tổng hợp ra hay không. Ðối với vấn đề thứ nhất người ta sử dụng phương pháp lai phân tử trên pha rắn (Southern blot, Northern blot...) hoặc PCR. Ðối với vấn đề thứ hai, sản phẩm của gen lạ được đánh giá ở hai mức độ: phiên mã và dịch mã. Sản phẩm phiên mã được đánh giá bằng phương pháp RT-PCR, sản phẩm dịch mã được đánh giá bằng phương pháp Western blot, ELISA hoặc kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) để phát hiện protein lạ trong động vật. Theo dõi các thế hệ sau của động vật chuyển gen (F1, F2, F3, ...) để xác định gen lạ có di truyền hay không. Sau khi kiểm tra thấy gen ngoại lai đã được di truyền ổn định, tiến hành lai tạo và chọn lọc để tạo dòng động vật chuyển gen. 1.3.3. Nuôi cấy tế bào vi sinh vật Sự sinh trưởng của quần thể vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo được gọi là nuôi cấy (cultivation). Một kiểu nuôi cấy chỉ chứa một loại vi sinh vật được gọi là nuôi cấy thuần khiết (pure culture). Nuôi cấy hỗn hợp (mixed culture) là một loại nuôi cấy chứa nhiều hơn một loại vi sinh vật. Các bước cần thiết cho nuôi cấy vi sinh vật như sau: - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy cho phép vi sinh vật có thể sinh trưởng tốt nhất. - Khử trùng môi trường để loại bỏ tất cả các cơ thể sống có trong bình nuôi cấy. - Cấy vi sinh vật vào trong môi trường đã chuẩn bị. 4
Để nuôi cấy vi sinh vật, môi trường nuôi cấy phải được chuẩn bị trong những loại bình nuôi được sử dụng phổ biến nhất, chẳng hạn ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri hoặc nồi lên men. Có hai loại môi trường nuôi cấy chính: môi trường tự nhiên (dựa trên kinh nghiệm) và môi trường tổng hợp (thành phần hóa học xác định). Nói chung, các môi trường dinh dưỡng rất khác nhau về hình thái (dạng rắn hoặc lỏng) và thành phần, tùy thuộc vào loại vi sinh vật được nuôi cấy và mục đích nuôi cấy. Môi trường sau đó phải được khử trùng để loại bỏ tất cả các cơ thể sống trong bình chứa môi trường. Phương pháp khử trùng phổ biến nhất là khử trùng bằng hơi nước dưới áp suất cao trong nồi khử trùng (autoclave). Tiếp mẫu (vi sinh vật) vào bình chứa môi trường dinh dưỡng vô trùng. Sự tiếp mẫu khi nuôi cấy trên môi trường rắn có agar được thực hiện bằng que c ấy có vòng kim loại ở đầu (metal wire hoặc loop) được khử trùng nhanh trước khi sử dụng bằng cách đốt nóng trên đèn cồn. Cấy chuyển trong nuôi cấy lỏng thường được thực hiện bằng Pasteur pipette. Sự tiếp mẫu thường được tiến hành trong tủ cấy vô trùng (laminar flow cabinet) đ ể giảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn. Ví dụ: Người ta đã chuyển gen mã hóa tính trạng sản xuất insulin c ủa người sang cho E. coli. Vi khuẩn E. coli tái tổ hợp gen được nuôi cấy trong nồi lên men có dung tích 1.000 L, sau một thời gian ngắn có thể thu được 200g insulin, tương đương với lượng insulin chiết rút từ 8.000-10.000 con bò. 2. Công nghệ tế bào 2.1. Công nghệ tế bào thực vật 2.1.1. Nuôi cấy mô tế bào a. Cơ sở khoa học - Dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật. - Khả năng phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật. - Sự sinh trưởng của tế u vật ực vật. Mẫ bào th - Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng b. Quy trình Khử trùng Nuôi cấy ban đầu (Tạo callus) Tạo phôi Tạo hạt nhân tạo 5 Tạo chồi Tạo rễ Tạo cây
 Chuẩn bị mẫu vật - Chọn mẫu vật có khả năng nuôi cấy tốt. - Thu hái mẫu vật. - Khử trùng sơ bộ: bằng cồn 700C - Khử trùng tuyệt đối: HgCl2 0,1%  Chuẩn bị môi trường Mặc dù nhu cầu dinh dưỡng của các loại mô nuôi cấy là rất khác nhau nhưng môi trường nuôi cấy mô thực vật đặc trưng chứa các thành phần sau: - Các nguyên tố đa lượng: Bao gồm các loại muối của nitrogen, potassium, calcium, phosphorus, magnesium và sulfur. Đây là sáu nguyên tố chính cần thiết cho sinh trưởng của thực vật bậc cao. - Các nguyên tố vi lượng: Bao gồm các loại muối của sắt, kẽm, mangan, boron, copper, molybdenum và cobalt ở dạng vết. - Các phụ gia hữu cơ: Một lượng nhỏ các loại vitamin (myo-inositol, thiamine, nicotinic acid, pyridoxine, riboflavin…), các amino acid (thường cho phép bỏ qua nhưng trong một số trường hợp đặc biệt thì có thể dùng), và các phụ gia hữu cơ không xác định khác (malt, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nước dừa…). - Các chất kích thích sinh trưởng thực vật: Thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều hòa sinhtrưởng. Các auxin (IAA2 và các dạng tương tự được tổng hợp nhân tạo như 2,4-D3, NAA4, IBA5, NOA6…), và các cytokinin (zeatin, 2i-P7 và các dạng tương tự được tổng hợp nhân tạo như kinetin, BA8…) là những nhóm chất kích thích sinh trưởng và phát sinh hình thái chủ yếu trong nuôi cấy mô và cơ quan của thực vật. - Nguồn carbon: Thường sử dụng sucrose làm nguồn carbon thay cho nguồn carbon được thực vật cố định từ khí quyển bằng quang hợp. Trong đa số các thí nghiệm nuôi cấy, tế bào thực vật đã mất khả năng quang hợp. Glucose cũng thường đ ược đưa vào môi trường và cho hiệu quả tương đương sucrose, trong khi fructose cho hiệu quả kém hơn. - Các tác nhân làm rắn (tạo gel) môi trường : Thường sử dụng là agar, một loại polysaccharide thu được từ một số loài tảo thuộc ngành tảo đỏ (Rhodophyta). Một số hợp chất khác cũng được thử nghiệm thành công như alginate, phytagel, methacel và gel-rite. 6
 Nuôi cấy ban đầu Môi trường MS + 30g/l agar + 30g/l saccharose + 1-3 ppm 2,4 D.  Thực hiện quá trình phản phân hóa tạo callus  Nhân nhanh callus Môi trường MS + 1-2ppm 2,4 D + 1-2 ppm BAP  Tăng số lượng callus  Tạo phôi Môi trường MS + 30g/l saccharose + 8g/l agar + 1-5ppm 2,4 D; 1-2ppm BA; 1- 2ppm NAA;  Tạo phôi để nuôi cấy thành cây  Sản xuất hạt nhân tạo  Tạo chồi Môi trường MS + Kinetin + BAP + Zeatin (1-3ppm)  Tạo chồi từ callus.  Tạo rễ - Môi trường MS + NAA, TAA, PAA (1-3 ppm). - Rễ tạo ra từ callus.  Nuôi cấy tạo cây con Nuôi cấy tiếp trong môi trường tạo rễ tạo cây hoàn chỉnh.  Đưa ra vườn ươm. c. Thành tựu Tạo ra hàng loạt bản sao của một cây ưu việt hay là nhân nhanh cây trồng quy mô công nghiệp. Đây là nền tảng của công nghệ vi nhân giống. Ví du: Atiso, măng tây, củ cải đường, tỏi, gừng, khoai tây, Raspberry, dâu tây, mía đường, khoai lang, khoai nước, dứa dại, hạnh nhân, táo tây, chuối, cam, chanh, dừa, anh đào, kiwi, cọ dầu, đu đủ, lê, dứa, chuối bột, nho, hạt dẻ, tre, lim, bạch đàn, vả, cẩm chướng, cúc,Iris, Gerbera, huệ, lan, Pelagonium, đỗ quyên, hoa hồng, … Một số cây đang được tái sinh trong phòng thí nghiệm: cây bơ, ca cao, cà phê, Jojoba, cao su, chà là, thuốc lá, cà rốt, Endive, cải dầu, ngô, đ ậu, củ từ, đ ậu nành, (theo tài liệu Zimmerman, 1986; Ketchum, 1987; Picrik, 1987). Trong cải tạo giống nhiều khi tạo ra được giống có năng suất cao và chống chịu giỏi nhưng lại không có hạt hoặc rất ít hạt để có thể gieo trồng lại. Bằng phương pháp nói trên, người ta có thể sản xuất hạt nhân tạo bằng các tế bào bình thường của cây này với một lượng lớn. Trên thị trường thế giới có bán nhiều hạt nhân tạo với các tính ưu việt nói trên, trong đó có hạt lúa mì, hạt lúa, táo,… 2.1.2. Công nghệ tế bào trần a. Cơ sở khoa học - Tế bào thực vật có màng cellulose 7
- Các cơ sở của công nghệ nuôi cấy mô tế bào - Dựa vào đặc điểm lai tế bào soma + Nhân lai + tế bào chất lai  cây lai + Nhân lai + tế bào chất không lai + Nhân không lai + Tế bào chất lai + Nhân không lai + tế bào chất không lai b. Quy trình  Tạo mẫu vật - Chọn nguyên liệu Thường sử dụng mô thịt lá trưởng thành ở những cây có tính trạng sinh lý tốt. Vì lá cây là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, dễ phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất. Lấy lá từ những cây không bị xử lý với thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ. Cũng có th ể tách tế bào trần từ mô sẹo, bao phấn. - Xử lý sơ bộ: Các tế bào được ngâm trong dung dịch là ổn định áp suất thẩm th ấu. Thường sử dụng mannitol hoặc sorbitol 12 – 14% để duy trì tính ổn định của màng sinh chất.  Xử lý enzim thủy phân tạo tế bào trần Dùng enzim pectinase, hemicellulase, cellulase để phá vỡ thành tế bào. Có thể dùng riêng lẻ hoặc kết hợp tùy vào từng loại tế bào  Tách tế bào trần - Xác định xem còn thành tế bào hay không: Dùng calcofour để xác đ ịnh. Calcofour bám vào các phân tử cellulose và phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh r ực r ỡ khi soi dưới tia cực tím. Nếu các tế bào đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào, hiển vi thường có màu tối thẫm, các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ của lạp thể. - Xác định khả năng sống sót của tế bào trần: tế bào chất của những tế bào xuất hiện ở dạng dòng chảy hoặc chuyển động tròn, trông như những hạt nhỏ trong nguyên sinh chất là những tế bào sống. Ngược lại những tế bào chết. - Xác định sức sống của tế bào trần: Trộn 2ml dung dịch thuốc nhuộm 1% + 10ml môi trường tách tế bào trần. Lấy 0,25ml huyền phù tế bào trần và đ ưa vào 1ml h ỗn hợp dịch nhuộm trên, để trong 15 phút. Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất, còn những tế bào có màng nguyên sinh chất bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được.  Nuôi cấy trong môi trường đẳng trương c. Thành tựu Công nghệ tế bào trần có vai trò quan trọng trong tạo giống mới. 8
Ngày nay người ta đang sử dụng kĩ thuật dung hợp protoplast để tạo ra những cây lai mới. Chẳng hạn, lai khoai tây trồng và khoai tây hoang dại. Gene cây hoang dại giúp cây trồng chống bệnh virus.. Người ta lai cây cà chua với cây khoai tây (họ hàng chúng xa nhau) cho cây lai mang quả cà chua và củ khoai tây. Bằng cách này, người ta tạo ra cây lai giữa cà rốt và rau mùi, cam và chanh, … Đối với cọ dầu, từ protoplast và sử dụng kĩ thuật tái tổ hợp gene có thể nâng cao hiệu quả, chọn lọc các dòng có dầu có năng suất cao. Đ ối với mía, dung hợp protoplast có ý nghĩa lớn đối với việc phổ biến các giống mía không ra hoa (trốn cờ) hoặc bất thụ. Các kết quả nghiên cứu của CENA (Centre de Nuclear Energy in Agriculture) và CEBTEC (Divis.o de Biotechnology de Plantas et Centro de Biotechnologia Agricola) ở Brazil cho thấy, dung hợp protoplast cây mía có thể giúp chuyển gene kháng thuốc trừ sâu có từ dòng mía này qua dòng mía khác. Dung hợp protoplast có thể chọn giúp các dòng cà phê kháng bệnh và các độc tố do nấm tiết ra để đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm chọn ra các dòng t ế bào kháng độc tố cho cà phê. Năm 1987, ở Costa Rica cũng đã tái sinh cây cà phê t ừ protoplast được tách từ phôi vô tính hình thành từ huyền phù tế bào callus lá. Sau khi nuôi cấy protoplast vài lần trên môi trường chứa 0,5 mg/l kinetine, 0,5 mg/l 2,4D. 0,5 mg/l NAA, các tác giả thu được callus nhỏ. Khi cấy chuyền sang môi trường không có chất sinh trưởng các callus phát triển thành phôi và phát triển thành cây hoàn chỉnh. Người ta cũng dung hợp protoplast cao su từ các tế bào phôi vô tính. Đ ến nay đã có hơn 70 loài cây cũng được sinh ra từ protoplast. Khi dung hợp protoplast, người ta còn tạo ra được giống lai giữa tế bào thực vật và vi khuẩn. Sự dung hợp protoplast giữa tế bào tảo lam (vừa,có đặc tính quang hợp vừa có đặc tính cố định N2 trong không khí) với callus thực vật làm kích thích sự phát triển của chúng. Cũng với kĩ thuật trên, người ta có thể dung hợp được các tế bào soma với tế bào sinh dục (hạt phấn) để tạo ra cây lai giữa các họ với nhau. Tóm lại, kĩ thuật dung hợp protoplast hiện tại đang mở ra một khả năng rộng lớn trong việc tạo ta những giống có thể tập hợp được nhiều đặc tính tốt từ các cây khác nhau. Hơn nữa, nhờ việc tạo thành protoplast, nó trở thành công cụ nghiên cứu các quá trình sinh hóa, đặc biệt là acid nucleic và protein trong tế bào, dùng mô hình nghiên cứu di truyền phân tử, nghiên cứu sự xâm nhập của vi khuẩn vào tế bào, nghiên cứu quá trình cộng sinh vi khuẩn trong cây bộ Đậu, nghiên cứu các enzyme, nghiên cứu cơ chế của quá trình quang hợp v.v. làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu ứng dụng phục vụ cho đời sống của con người. 2.2. Công nghệ tế bào động vật 2.2.1. Chuyển phôi tạo giống vật nuôi 9
a. Cơ sở khoa học - Dựa vào đặc điểm sinh sản của động vật + Động dục + Quá trình thụ tinh + Quá trình nuôi thai - Dựa vào quá trình phát triển phôi động vật + Các giai đoạn phát triển. + Môi trường phát triển - Đặc điểm của tế bào động vật. b. Quy trình - Xử lý con cái cho phôi. + Thực hiện quá trình thụ tinh + Cung cấp phôi. - Xử lý phôi + Tách phôi + Chuyển gen - Xử lý con vật cái mang phôi c. Thành tựu Phương pháp chuyển phôi được sử dụng để tăng khả năng sinh sản của động vật cái. Hiện nay đây là phương pháp phổ biến được sử dụng trong thực tiễn chọn giống gia súc (trâu, bò, cừu, lợn, dê,..) ở nhiều nước trên thế giới. 2.2.2. Nuôi cấy tế bào động vật a. Quy trình  Chọn tế bào nuôi cấy - Dựa vào mục đích để chọn tế bào nuôi cấy - Chọn tế bào có độ tuổi thích hợp (thường là tế bào ở độ tuổi còn non).  Chuẩn bị môi trường Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vật bao gồm các amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối khoáng và glucose. Ngoài ra, môi trường cần được cung cấp từ 2-20% (theo thể tích) huy ết tương của động vật có vú. Môi trường Eagle (Eagle 1959), đây là một trong những môi trường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy tế bào động vật (Hình10)  Nuôi cấy tế bào Nuôi cấy trong bể nuôi cấy tế bào động vật. Phương pháp chính trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất các sản phẩm sinh-dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ lên men. Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực vật khó khăn hơn nhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đ ổi 10 Hình 10: Thành phần môi trường Eagle (1959).
chất trong các loại tế bào này diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ sinh trưởng chậm của tế bào. Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp hơn so với vi khuẩn và nấm men, chúng không có thành tế bào như vi khuẩn vì thế rất dễ biến dạng và vỡ. Do đó, các hệ thống khuấy và sục khí được thiết kế khác với nuôi cấy vi khuẩn. Mặc dù có một số điểm không thuận lợi, nhưng hệ thống lên men đã được sử dụng để nuôi cấy tế bào động vật ít nhất cũng vài chục năm trước đây. Các dòng tế bào khác nhau như BHK-21, LS, các tế bào Namalwa… đã được sinh trưởng trong hệ lên men theo phương thức nuôi cấy chìm ngập trong môi trường để sản xuất các viral vaccine và các sản phẩm khác. Đặc điểm dễ biến dạng và dễ vỡ của tế bào động vật đã được khắc phục bằng cách đưa vào các cánh khuấy có dạng hình mái chèo. Việc cung cấp khí tr ực tiếp có thể tạo ra bọt khí dễ làm vỡ tế bào, vì thế cần cung cấp khí bằng cách khuếch tán thông qua ống silicone. Môi trường chứa nhiều protein huyết thanh có khả năng gây ra hiện tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm và nhẹ. Đối với nuôi cấy mật độ cao, cần cung cấp thêm oxygen.Phương pháp dùng ống silicone để sục khí có nhiều ưu điểm do không tạo ra bọt khí và tốc độ truyền oxygen là thỏa đáng.  Thu nhận chế phẩm - Tách chiết thành phần mong muốn từ tế bào. - Tạo chế phẩm. b. Thành tựu 2.2.3. Nhân bản vô tính động vật 2.2.4. Công nghệ tế bào gốc, tế bào mầm Tế bào gốc là loại tế bào chuyên biệt hoá, có nhiều tiềm năng – có thể biến thành nhiều loại tế bào khác. Phân biệt tế bào gốc phôi, từ thai và từ cơ thể tr ưởng thành. Thường ở giai đoạn phôi thì nó có nhiều. Những thành tựu khoa học mới đây nhất đã cho thấy, từ cơ thể trưởng thành chúng ta đã có thể tách thành các tế bào gốc và từ đó có thể chuyển hoá thành nhiều loại tế bào khác. Cụ thể, là từ tế bào da của người trưởng thành chuyển hoá thành các tế bào gốc, thông qua phương pháp chuyển-mở một số gen trong nhân tế bào, và làm cho chúng trở thành dạng sơ khai, dạng gốc ban đầu. Việc này đưa lại nhiều triển vọng rất lớn trong trị liệu, ví như khi cơ thể của một ai đó bị thoái hoá các c ơ tim ch ẳng hạn, thì người ta lấy tế bào gốc của chính người đó để chuyển hoá thành tế bào cơ tim và nuôi dưỡng chúng thành các cơ tim rồi làm các thủ thuật thay thế. Trong quá trình nghiên cứu, người ta đã tạo ra được tế bào gốc từ nhiều loại tế bào khác nhau, từ phôi, thai, từ tế bào máu, từ tế bào âm đạo, và gần đây là từ tế 11
bào da của người trưởng thành. Và từ tế bào gốc, các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu thành công việc chuyển hoá chúng thành các loại tế bào, các loại mô, cơ khác nhau của cơ thể như tế bào thần kinh, tế bào máu, cơ tim, giác mạc mắt v.v… Với tế bào gốc từ cuống dây rốn, người ra đã có thể chữa được một vài bệnh liệt, tuỷ sống, bỏng… 3. Công nghệ tế bào trong công nghệ protein – enzim 3.1. Cơ sở khoa học công nghệ protein – enzim - Dựa vào tính chất kết tủa, hòa tan của protein. VD: Môi trường (NH4)2SO4 bán bão hòa globulin kết tủa + Các protein khác nhau kết tủa ở pH khác nhau + Protein kết tủa tại điểm đẳng điện khác nhau - Dựa vào sự tích điện của các protein khác nhau  tốc độ chạy điện trong điện di khác nhau - Dựa vào tốc độ chạy qua cột sắc ký khác nhau của các protein khác nhau. 3.2. Quy trình - Tách protein tổng số từ tế bào + Phá hủy màng tế bào + Tách protein tổng số từ hỗn hợp các hóa chất từ hợp chất hữu cơ của tế bào sử dụng tác nhân kết tủa chung. + Tách protein kết tủa bằng phương pháp lọc. - Tách riêng loại protein cần + Sử dụng các tác nhân kết tủa riêng biệt + Tách riêng protein bằng phương pháp lọc Vai trò của công nghệ tế bào trong công nghệ protein – enzim thể hiện ở giai đoạn tách protein tổng số từ tế bào.  Phá vỡ tế bào Protein enzim có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Sau khi được tổng hợp nó có thể được tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong môi trường các dịch cơ thể, dịch môi trường (gọi là protein enzim ngoại bào) hoặc được giữ lại bên trong tế bào (protein enzim nội bào). Các protein enzim nội bào có thể tồn tại ở dạng hòa tan trong tế bào chất và các bào quan nhân của tế bào. Do đó đ ể chiết rút các protein enzim nội bào phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào chứa chúng và chuyển vào dung dịch. Có thể phá vỡ cấu trúc tế bào bằng các biện pháp cơ học như: nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị nghiền đ ồng thể. Đ ể việc phá vỡ có hiệu quả, ở mô thực vật trước khi nghiền người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngăn đá hoặc cho trương nước. Còn ở các mô của động vật như gan hoặc thận, khi chiết protein enzim người ta cần cắt bỏ các mô liên kết. 12
Muốn tách được protein trong các cơ quan tử, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác như: sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethylacetat,….  Chiết rút protein Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của các tế bào tiến hành chiết xuất protein enzim bằng các dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính hoặc bằng nước đối với protein enzim nội bào hoặc bằng ly tâm tách tế bào đối với các protein enzim ngoại bào. Việc chọn phương pháp tách chiết protein enzim tùy thuộc vào tính chất protein enzim cần nghiên cứu 3.3. Thành tựu Protein enzim được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và sản xuất bia. - Amylase dùng trong sản xuất đường mật ngô và chocolate, trong sản xuất bia, chế biến dextrin với dịch đường để sản xuất thức ăn cho người già và trẻ em, trong sản xuất nước quả và trong y học. - Protease thủy phân protein của sữa để chế biến những món ăn kiêng đặc biệt, được dùng trong thuộc da, sản xuất bột giặt, phim ảnh, tơ sợi, len dạ và trong y học. Protease vi sinh vật có thể sử dụng cùng với amylase trong chế biến thức ăn gia súc. - Pectinase là nhóm enzyme thủy phân pectin tạo thành galacturonic acid, glucose, galactose, arabinose, methanol… - Cytolase là hệ enzyme có hoạt tính cao có thể phân hủy hemicellulose, pentozan, lignin… Các enzyme này được gọi chung là cytolase (bao gồm cellulase, hemicelllulase, pentosinase). - Invertase là enzyme nội bào được dùng rộng rãi trong sản xuất bánh kẹo, rượu mùi, kem, mật ong nhân tạo. Nó làm tăng vị ngọt khi thủy phân đường saccharose thành fructose và glucose, làm tăng độ hòa tan của saccharose trong sản phẩm. Trong một tương lai gần, enzyme sẽ được sử dụng rộng rãi trong y học đ ể làm đầu dò (probe) cho các thiết bị phân tích y khoa và để chữa bệnh. Hiện nay, một số enzyme như: glucooxydase, hexokinase, esterase, urease, cholesteroloxydase, alcoholdehydrogenase… đã được sử dụng khá phổ biến trong y học. Điển hình nhất là sử dụng glucooxydase cố định trên bề mặt điện cực platinum trong thiết bị phân tích hàm lượng glucose máu. Trong y học, enzyme còn được sử dụng để chữa trị một số bệnh liên quan đến sự thiếu hụt của một số enzyme trong cơ thể người, hoặc dùng enzyme để loại bỏ những cục thịt, mỡ dư thừa gây nguy hiểm cho một số bộ phận của cơ thể người. Chẳng hạn: dùng enzyme streptokinase và urokinase để làm tan máu đông làm tắc nghẽn mạch máu. 13