Xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic trong đinh lăng lá xẻ [polyscias fruticosa (L.) harms.] bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID OLEANOLIC<br /> TRONG ĐINH LĂNG LÁ XẺ [POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS.]<br /> BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Nguyễn Thị Phương Thảo*, Võ Thị Bạch Tuyết*, Nguyễn Minh Đức*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Nghiên cứu phương pháp định lượng acid oleanolic trong Đinh lăng lá xẻ bằng sắc ký lỏng hiệu<br /> năng cao (HPLC)<br /> Phương pháp: Cao Đinh lăng lá xẻ sau khi chiết xuất và thủy phân sẽ được tiến hành sắc ký lỏng hiệu năng<br /> cao nhằm xác định hàm lượng acid oleanolic.<br /> Kết quả: Đã xây dựng hoàn chỉnh và thẩm định quy trình định lượng acid oleanolic trong thân lá và rễ<br /> Đinh lăng bằng HPLC.<br /> Kết luận: Phương pháp định lượng HPLC xây dựng đáng tin cậy. Hàm lượng acid oleanolic trong thân và<br /> lá Đinh lăng lá xẻ khá cao (1,5%), trong khi hàm lượng trong rễ rất thấp (0,063%)<br /> Từ khóa: Đinh lăng, saponin, acid oleanolic, HPLC.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> QUANTITATIVE DETERMINATION OFOLEANOLIC ACID<br /> IN POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS - ARALIACEAE) BY HPLC<br /> Nguyen Thi Phuong Thao, Vo Thi Bach Tuyet, Nguyen Minh Duc<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 593 - 597<br /> Objectives: Study on a HPLC method for quantitative determination of oleanolic acid in Polyscias fruticosa<br /> (stems and leaves, and roots).<br /> Methods: Extracts of Polyscias fruticosa were hydrolyzed, purifified prior to quantity determination of<br /> oleanolic acid by HPLC.<br /> Results:: A HPLC method to determine oleanolic acid in Polyscias fruticosa was established..<br /> Conclusions: The analytical method was proven to be reliable. The content of oleanolic acid in stems and<br /> leaves, and in roots were determined to be 1,5% and 0,063%, respectively.<br /> Keywords: Polyscias fruticosa, saponin, oleanolic acid, HPLC.<br /> phẩm đang lưu hành hiện nay còn rất đơn giản.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Đinh lăng lá xẻ (Polyscias fruticosa (L.) Harms<br /> - Araliaceace), còn được gọi là cây Gỏi cá, là một<br /> dược liệu được sử dụng khá rộng rãi với tác<br /> dụng bổ, tăng lực, chống mệt mỏi, giúp tăng<br /> cường khả năng lao động và hoạt động trí<br /> não…(1,3). Đinh lăng lá xẻ chứa saponin triterpen<br /> với aglycon chính là acid oleanolic(4). Tuy nhiên,<br /> các tiêu chí kiểm nghiệm Đinh lăng và các chế<br /> *Khoa Dược – Đại Học Y Dược TPHCM<br /> Tác giả liên lạc: GS. TS. Nguyễn Minh Đức<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Vì vậy mục tiêu của đề tài này là nhằm<br /> nghiên cứu phương pháp định lượng acid<br /> oleanolic trong Đinh lăng lá xẻ bằng sắc ký lỏng<br /> hiệu năng cao (HPLC)(2) với chất chuẩn là acid<br /> oleanolic, nhằm góp phần phục vụ cho việc<br /> kiểm định Đinh lăng lá xẻ và các chế phẩm hơn<br /> hiệu quả.<br /> <br /> ĐT: 0908989865<br /> <br /> Email: ducng@hcm.vn.vnn<br /> <br /> 593<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> Nguyên liệu<br /> - Rễ Đinh lăng thu hái ở Phú Yên, thân lá<br /> Đinh lăng thu hái ở Tây Ninh vào tháng 4/2010.<br /> - Acid oleanolic chuẩn (độ tinh khiết 99%) do<br /> Ban Nghiên cứu Khoa học-Thư viện, Khoa<br /> Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> cung cấp.<br /> <br /> Phương pháp<br /> Máy sắc ký<br /> Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu<br /> LC-10AD, detector SPD-M10AVP. Cột HPLC<br /> pha đảo Prontosil LC8 (150 x 4.6 mm, 3 μm).<br /> Quy trình chiết xuất và định lượng acid<br /> oleanolic<br /> Rễ, thân và lá Đinh lăng, rửa sạch, phơi khô,<br /> xay nhỏ, xác định độ ẩm. Cân chính xác khoảng<br /> 2 g (thân lá) hoặc 5 g (rễ). Chiết kiệt bằng 150 ml<br /> methanol với dụng cụ Soxhlet trong 20 giờ. Cô<br /> dịch chiết đến cắn, hòa với 30 ml dung dịch HCl<br /> 10% trong cồn. Thủy phân hồi lưu ở nhiệt độ sôi<br /> trong 6 giờ. Lắc dịch thủy phân với 200 ml<br /> <br /> dichloromethan (20 ml x 5 lần + 10 ml x 5 lần + 5<br /> ml x 10 lần). Lắc dịch dichloromethan với 500 ml<br /> nước cất (100 ml x 5 lần). Làm khan dịch<br /> dichloromethan với muối Na2SO4 khan. Cô dịch<br /> dichloromethan đến cắn và sấy chân không ở<br /> nhiệt độ 50oC thu được sapogenin toàn phần<br /> (chứa chủ yếu acid oleanolic). Cân chính xác<br /> khoảng 3 mg sapogenin toàn phần (thân lá) hoặc<br /> 10 mg (rễ), hòa tan trong methanol HPLC trong<br /> bình định mức 5 ml. Lọc qua giấy lọc đường<br /> kính lỗ lọc 0.45 μm, tiến hành sắc ký HPLC, tính<br /> hàm lượng acid oleanolic trong Đinh lăng lá xẻ.<br /> <br /> Điều kiện tiến hành HPLC định lượng acid<br /> oleanolic<br /> Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu<br /> Pha động: CH3CN- H2O (72:28)<br /> Cột sắc ký: Prontosil LC8 (150 x 4,6 mm, 3<br /> μm).<br /> Detector SPD phát hiện ở bước sóng 203 nm.<br /> Tốc độ dòng 0,768 ml/ phút<br /> Thể tích bơm mẫu: 20 μl<br /> <br /> Hình 1. Sắc đồ HPLC của acid oleanolic chuẩn (trái, Rt ~ 6,5) và sapogenin toàn phần cao thân lá Đinh lăng<br /> (phải).<br /> <br /> Thẩm định phương pháp HPLC<br /> Xác định tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại của phương pháp.<br /> <br /> 594<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ<br /> Kết quả điều chế mẫu để định lượng hoạt chất trong Đinh lăng bằng HPLC<br /> Bảng 1. Kết quả điều chế mẫu để định lượng hoạt chất trong Đinh lăng bằng HPLC<br /> Tên mẫu<br /> <br /> Độ ẩm dược liệu<br /> <br /> Thân lá<br /> <br /> 8,65%<br /> <br /> Lượng dược liệu<br /> ban đầu (g)<br /> 2,0004<br /> <br /> Lượng dược liêu<br /> Lượng cắn<br /> khô (g)<br /> sapogenin (mg)<br /> 1,8274<br /> 136,9<br /> <br /> Định lượng acid oleanolic trong thân và lá<br /> Đinh lăng<br /> Đường chuẩn HPLC định lượng acid oleanolic<br /> trong thân và lá Đinh lăng<br /> Tiến hành xác định diện tích đỉnh acid<br /> oleanolic của các mẫu chuẩn có nồng độ từ 24<br /> đến 300 μg/ml ta thu được kết quả sau:<br /> Diện tích đỉnh<br /> <br /> 4500000<br /> 4000000<br /> <br /> y = 13855x + 21100<br /> <br /> 3500000<br /> <br /> R = 0.9998<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3000000<br /> 2500000<br /> <br /> Lượng cắn pha mẫu<br /> định lượng (mg)<br /> 3,49<br /> <br /> Bảng 3. Các thông số sắc ký ứng với đỉnh acid<br /> oleanolic<br /> Số lần<br /> bơm<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> TB<br /> SD<br /> RSD%<br /> <br /> Thời Diện tích Hệ số Độ phân Số đĩa lý<br /> gian lưu đỉnh<br /> bất đối<br /> giải<br /> thuyết<br /> 6.507 2354748 0.88<br /> 1.6<br /> 1604<br /> 6.461 2378642 0.86<br /> 1.55<br /> 1628<br /> 6.425 2315583 0.83<br /> 1.54<br /> 1611<br /> 6.44 2398933 0.86<br /> 1.62<br /> 1592<br /> 6.471 2439432 0.86<br /> 1.58<br /> 1546<br /> 6.548 2433719 0.87<br /> 1.59<br /> 1562<br /> 6.475333 2386843 0.86<br /> 1.58<br /> 1590.5<br /> 0.045364 47506.76 0.016733 0.030332 30.99516<br /> 0.700562 1.99036 1.945721 1.919715 1.948768<br /> <br /> 2000000<br /> <br /> RSD% của thời gian lưu là 0.7% (