Xây dựng quy trình định lượng tạp chất phân hủy của esomeprazol bằng phương pháp HPLC

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TẠP CHẤT PHÂN HỦY<br /> CỦA ESOMEPRAZOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC<br /> Lê Trung Hậu*, Nguyễn Đức Tuấn**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề – Mục tiêu nghiên cứu: Đối với một nguyên liệu hay chế phẩm thuốc, tác dụng dược lý của<br /> hoạt chất chính bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, trong đó có các chất phân hủy. Đây là một trong những nguyên<br /> nhân gây tác dụng phụ hay làm giảm tác dụng dược lý của hoạt chất chính. Do đó, ngoài những tiêu chuẩn xác<br /> định chất lượng của thuốc như định tính, định lượng, độ hòa tan..., việc kiểm soát tạp chất phân hủy hiện diện<br /> trong nguyên liệu và chế phẩm tương ứng cũng cần thiết. Thuốc kháng acid Esomeprazol STADA được sản xuất<br /> từ nguyên liệu esomeprazol bởi công ty TNHH Liên Doanh STADA Việt Nam cũng không phải là trường hợp<br /> ngoại lệ.Hiện tại, chỉ duy nhất Dược điển Châu Âu có quy định kiểm tra tạp chất cho nguyên liệu này và chưa có<br /> chuyên luận chế phẩm tương ứng.Trong tiêu chuẩn thành phẩm Esomeprazol STADA cũng chưa xây dựng chỉ<br /> tiêu kiểm tra tạp chất phân hủy.Vì vậy, việc xây dựng một qui trình định lượng tạp chất phân hủy trong nguyên<br /> liệu và chế phẩm của hoạt chất này là cần thiết.<br /> Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao phađảo để định lượng<br /> tạp chất phân hủy trong nguyên liệu esomeprazol và chế phẩm Esomeprazol STADA.<br /> Kết quả: Đã xác định được điều kiện sắc ký thích hợp để tách tạp chất phân hủy và esomeprazol, sử dụng cột<br /> sắc ký Eurospher C8 (250 x 4,6 mm; 5μm), pha động acetonitril - đệm pH 7,6 (25:75), tốc độ dòng 1,0 ml/phút,<br /> bước sóng phát hiện 280 nm. Kết quả thẩm định cho thấy quy trình có khoảng tuyến tính từ 0,04 – 0,50 ppm với<br /> hệ số tương quan cao, giới hạn phát hiện 0,01 ppm, giới hạn định lượng 0,04 ppm, độ đúng với tỉ lệ phục hồi 98%<br /> - 102% và độ chính xác với RSD < 2%.<br /> Kết luận: Đề tài đã xây dựng thành công quy trình HPLC định lượng tạp chất phân hủy của esomeprazol.<br /> Quy trình đã được áp dụng để kiểm tra tạp chất phân hủy trong 3 lô nguyên liệu và 3 lô thành phẩm tương ứng.<br /> Từ khóa: tạp chất phân hủy, esomeprazol, sắc ký lỏng hiệu năng cao.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> QUANTITATIVE DETERMINATION OF DEGRADATION IMPURITY<br /> OF ESOMEPRAZOLE BY HPLC<br /> Le Trung Hau, Nguyen Duc Tuan<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: 134 - 138<br /> Introduction – Aims::For drug substances ormedicines, pharmacologicaleffectoftheactiveingredientis<br /> affected bymanyfactors such as presence of degradation impurities. This is oneofthecauses of side effects<br /> orreducingpharmacological effectsofthe active ingredient. Therefore, the quality of drugs is not only monitored by<br /> identification, assay, and dissolution tests, etc but also controlled via impurity tests in raw materials and finished<br /> products. The antacid Esomeprazol STADA capsule produced by STADA Viet Nam Joint Venture Co., Ltd is not<br /> an exception. Currently, the API monograph esomeprazole with impurities tests is only available in European<br /> Pharmacopoeia.While specification of Esomeprazol STADA finished product has not had impurity test yet. Hence,<br /> development of a method for degradation impurity assay in esomeprazole raw material and finished product is<br /> * Công ty TNHH Liên Doanh STADA Việt Nam<br /> Tác giả liên lạc: DS. Lê Trung Hậu ĐT: 0913799068<br /> <br /> 134<br /> <br /> ** Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> Email: diemnhim@yahoo.com<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> necessary.<br /> Subjects and Methods: A reversed phase high performance liquid chromatographic method was developed<br /> for quantitative determination of degradation impuirity in esomeprazole raw material and Esomeprazol STADA<br /> finished product. The appropriate chromatographic conditions were found out for complete separation of<br /> degradation<br /> Results: impurity and esomeprazole, using Eursopher C8 column (250 x 4.6 mm; 5 μm), mixture of<br /> acetonitril and buffer pH 7.6 (25:75, v/v) as eluent in isocratic mode, flow rate of 1.0 ml/min, and detection<br /> wavelength of 280 nm. The method was validated and shown linearity range from 0.04 ppm to 0.50 ppm with<br /> high correlation coefficient, detection limit of 0.01 ppm, quantitation limit of 0.04 ppm, accuracy with recovery<br /> ratio in 98% - 102%, and precision with RSD < 2%.<br /> Conclusion: A liquid chromatographic method was successfully developed for degradation impurity assay of<br /> esomeprazole. The validated method was applied for impurity test in three batches of raw materials and of finished<br /> products.<br /> Key words: Degradation impurity, esomeprazole, HPLC.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> <br /> Trong nghiên cứu, sản xuất thuốc, ngoài<br /> việc nghiên cứu tác dụng dược lý của các hoạt<br /> chất chính, các nhà nghiên cứu còn phải khảo<br /> sát tác dụng dược lý của các tạp chất có thể<br /> phát sinh trong nguyên liệu hoặc thành phẩm<br /> do nguyên liệu đầu vào còn lẫn tạp hoặc tạp<br /> chất phân hủy trong quá trình sản xuất và lưu<br /> hành. Những tạp chất phát sinh có thể làm<br /> thay đổi hiệu quả lâm sàng và đặc tính an toàn<br /> của thuốc hoặc gây các tác dụng khác nhau với<br /> hậu quả không lường trước được. Việc kiểm<br /> soát các tạp chất liên quan trong nguyên liệu<br /> và đặc biệt là trong chế phẩm tương ứng đã<br /> được quy định chặt chẻ đối với phần lớn<br /> chuyên luận trong Dược điển các nước (EP,<br /> USP, BP).Esomeprazol (Nexium, Esomeprazol<br /> STADA) là đồng phân S của omeprazol, được<br /> dùng làm thuốc ức chế bơm proton, làm giảm<br /> tiết acid dạ dày (4).Hiện tại, chỉ duy nhất Dược<br /> điển Châu Âu có quy định kiểm tra tạp chất<br /> cho nguyên liệu này và chưa có chuyên luận<br /> chế phẩm tương ứng.Trong tiêu chuẩn thành<br /> phẩm Esomeprazol STADA cũng chưa xây<br /> dựng chỉ tiêu kiểm tra tạp chất phân hủy.Vì<br /> vậy, việc xây dựng một qui trình định lượng<br /> tạp chất phân hủy trong nguyên liệu và chế<br /> phẩm của hoạt chất này là cần thiết.<br /> <br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Tạp chất phân hủy của esomeprazol: 5Methoxy-2-(((4-methoxy-3,5-dimethyl pyridin-2l)methyl)sulphonyl)-1H-benzimidazole (tạp D,<br /> Sulphon)(1,3).<br /> <br /> Trang thiết bị, hóa chất và dung môi<br /> Trang thiết bị<br /> Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu<br /> LC-20A. Cột sắc ký Eurospher C8 (250 x 4,6 mm;<br /> 5 μm). Cột Inert Sustain C8 (125 x 4,6 mm; 5 μm).<br /> Cân phân tích GH 202 Mettler Toledo. Các thiết<br /> bị phân tích đã được hiệu chuẩn.<br /> Hóa chất và dung môi<br /> Acetonitril đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký<br /> lỏng (Merck).Dinatri hydrophosphat, acid<br /> phosphoric đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck).<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Khảo sát điều kiện phân tích<br /> Esomeprazol và tạp D là những chất phân<br /> cực, nên pha động sử dụng phải phân cực. Vì<br /> vậy, sắc ký pha đảo được áp dụng. Theo Dược<br /> điển Châu Âu, điều kiện sắc ký để kiểm tra tạp<br /> phân hủy là sử dụng cột pha đảo C8, pha động<br /> bao gồm acetonitril và đệm phosphat pH 7,6<br /> (27:73). Căn cứ vào đó, một số điều kiện sắc ký<br /> <br /> 135<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> đã được khảo sát như cột sắc ký, kích thước cột,<br /> tỉ lệ dung môi pha động, nồng độ mẫu đo để<br /> chọn được điều kiện sắc ký thích hợp thỏa mãn<br /> các yêu cầu sau: độ phân giải Rs giữa tạp D và<br /> esomeprazol (và các tạp khác nếu có) phải lớn<br /> hơn 1,5; hệ số bất đối (As) của pic tạp D phải nằm<br /> trong khoảng 0,8 đến 1,5.<br /> Điều kiện sắc ký ban đầu(1): pha động<br /> acetonitril - đệm pH 7,6 (27:73), cột sắc ký phả<br /> đảo C8 (125 x 4,6 mm, 5 μm), bước sóng phát<br /> hiện 280 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích<br /> tiêm mẫu 40 μl.<br /> <br /> Thẩm định phương pháp<br /> Theo hướng dẫn của ICH ban hành tháng 11<br /> năm 2005 (2), bao gồm khảo sát tính phù hợp của<br /> hệ thống, tính chọn lọc, độ đúng, độ chính xác,<br /> khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới<br /> hạn định lượng.<br /> Xác định hàm lượng tạp chất trong nguyên liệu<br /> và chế phẩm esomeprazol<br /> Phương pháp sau khi thẩm định sẽ được<br /> ứng dụng để xác định hàm lượng tạp phân hủy<br /> trong nguyên liệu và chế phẩm esomeprazol.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> Khảo sát điều kiện phân tích<br /> Dựa theo điều kiện sắc ký trong Dược điển<br /> Châu Âu, sử dụng cột pha đảo C8 (125 x 4,6 mm;<br /> 5 μm), do đó cột Inert Sustain có kích thước<br /> tương đương được sử dụng để khảo sát trên hỗn<br /> hợp chuẩn esomeprazol và tạp D, tỉ lệ tạp D là<br /> 0,2% so với esomeporazol (1). Kết quả cho thấy<br /> esomeprazol và tạp D không tách hoàn toàn. Khi<br /> tăng chiều dài cột lên 250 mm, độ phân giải vẫn<br /> không được cải thiện. Các khảo sát tiếp theo<br /> được tiến hành trên cột sắc ký Eurospher C8 cho<br /> thấy độ phân giải được cải thiện đáng kể với cột<br /> Eurospher C8 (250 x 4,6 mm; 5 μm), esomeprazol<br /> và tạp D tách hoàn toàn.<br /> Kết quả khảo sát tỉ lệ acetonitril và đệm<br /> phosphat pH 7,6 lên độ phân giải của mẫu thử<br /> giả lập (được chuẩn bị từ chế phẩm Esomeprazol<br /> STADA có thêm chuẩn tạp D sao cho tỷ lệ tạp D<br /> <br /> 136<br /> <br /> là 0,2% so với esomeprazol) cho thấy:<br /> - Với tỉ lệ 27:73, esomeprazol và tạp D tách<br /> hoàn toàn, độ phân giải giữa tạp chưa biết gần<br /> tạp D nhất khoảng 1,3.<br /> - Với tỉ lệ 25:75, esomeprazol và tạp D tách<br /> hoàn toàn, độ phân giải giữa tạp chưa biết gần<br /> tạp D nhất khoảng 2,7.<br /> Khảo sát tỉ lệ giữa esomeprazol và tạp D cho<br /> thấy hỗn hợp esomeprazol và tạp D có nồng độ<br /> tương ứng 200 ppm và 0,4 ppm khi tiến hành sắc<br /> ký nhiều lần liên tiếp thì 2 pic vẫn tách hoàn<br /> toàn, hệ số bất đối của pic tạp D vẫn nằm trong<br /> khoảng 0,8 – 1,5 và số đĩa lý thuyết cột không bị<br /> giảm, điều này chứng tỏ cột không bị quá tải.<br /> Như vậy, điều kiện sắc ký thích hợp để định<br /> lượng tạp D là:<br /> - Pha động: acetonitril - đệm phosphat pH<br /> 7,6 (25:75)<br /> - Cột sắc ký: Eurospher (250 x 4,6 mm; 5 μm)<br /> - Bước sóng phát hiện: 280 nm<br /> - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút<br /> - Thể tích tiêm mẫu: 40 μl<br /> <br /> Thẩm định phương pháp<br /> Khảo sát tính phù hợp của hệ thống<br /> Bảng 1: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống<br /> trên mẫu chuẩn (n=6)<br /> Thông số RSD%<br /> RSD%<br /> RSD% của<br /> của thời của diện<br /> RS AS số đĩa lý<br /> gian lưu tích pic<br /> Chất<br /> thuyết<br /> (tR)<br /> (S)<br /> Tạp D<br /> 0,50<br /> 0,42<br /> - 1,0<br /> 1,53<br /> Esomeprazol<br /> 0,24<br /> 0,17<br /> 11,6 1,1<br /> 1,65<br /> <br /> Nhận xét: Hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8<br /> – 1,5. RSD của các thông số sắc ký cho các lần<br /> tiêm lặp lại đều nhỏ hơn 2%. Độ phân giải lớn<br /> hơn 1,5. Tiến hành sắc ký 6 lần trên mẫu thử<br /> cũng cho thấy độ phân giải giữa pic tạp D và pic<br /> gần nhất lớn hơn 1,5. Vậy quy trình phân tích<br /> đạt tính phù hợp của hệ thống.<br /> <br /> Tính chọn lọc<br /> Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu giả dược,<br /> mẫu chuẩn, mẫu thử (chế phẩm Esomeprazol<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> STADA) theo điều kiện sắc ký đã chọn, mỗi<br /> mẫu tiêm 2 lần. Kết quả cho thấy mẫu trắng và<br /> mẫu giả dược không xuất hiện pic tại thời gian<br /> lưu của pic tạp D và pic esomeprazol, sắc ký<br /> đồ mẫu thử cho 2 pic có thời gian lưu tương<br /> ứng với thời gian lưu của 2 pic tạp D và<br /> Mẫu trắng<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> esomeprazol trong mẫu chuẩn, tạp D tách<br /> hoàn toàn esomeprazol và các tạp chưa biết<br /> khác với độ phân giải lớn hơn 1,5. Như vậy,<br /> qui trình phân tích có tính đặc hiệu. Sắc ký đồ<br /> của các mẫu được minh họa ở hình 1.<br /> <br /> Mẫu giả dược<br /> <br /> Mẫu chuẩn<br /> <br /> Esomeprazol<br /> <br /> Mẫu th<br /> Esomeprazol<br /> Tạp D<br /> Tạp D<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu giả dược, mẫu chuẩn và mẫu thử.<br /> <br /> Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định<br /> lượng (LOQ)<br /> Pha loãng nồng độ chất phân tích đến mức<br /> tín hiệu nhỏ nhất còn phát hiện được để xác định<br /> LOD và pha loãng nồng độ chất phân tích đến<br /> mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ chính xác và độ<br /> đúng để xác định LOQ. Đo tín hiệu thu được từ<br /> mẫu trắng (N) và mẫu thử (S). Thiết lập tỉ số S/N.<br /> Nồng độ mẫu thử tại điểm có S/N = 3/1 là LOD<br /> và S/N = 10/1 là LOQ. Kết quả thu được như sau:<br /> LOD và LOQ của tạp D lần lượt là 0,01μg/ml và<br /> 0,04 μg/ml.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Khoảng tuyến tính, độ chính xác và độ đúng<br /> Khoảng tuyến tính được xác định trong<br /> khoảng nồng độ từ LOQ - 120% so với giới hạn<br /> qui định (0,2%). Tiến hành pha 6 dung dịch<br /> chuẩn có nồng độ khác nhau. Mỗi dung dịch tiến<br /> hành sắc ký 2 lần.<br /> Độ lặp lại: Chuẩn bị 6 mẫu thử và 6 mẫu thử<br /> giả lập, tiến hành sắc ký mỗi mẫu 1 lần trong<br /> cùng một ngày.<br /> Độ chính xác trung gian: chuẩn bị mẫu giống<br /> như độ lặp lại và tiến hành trong 2 ngày khác<br /> nhau, trên thiết bị phân tích khác.<br /> <br /> 137<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Độ đúng được thực hiện bằng cách thêm<br /> chuẩn tạp D vào mẫu thử ở ba mức nồng độ<br /> 80%, 100% và 120% so với giới hạn quy định<br /> (0,2%). Ở mỗi mức nồng độ, chuẩn bị 3 mẫu và<br /> tiến hành sắc ký mỗi mẫu 1 lần.<br /> Kết quả thống kê cho thấy qui trình phân<br /> tích có khoảng tuyến tính từ 0,04 ppm – 0,50<br /> ppm với giá trị bình phương của hệ số tương<br /> quan cao, tỷ lệ hồi phục nằm trong khoảng 98% 102% và RSD < 2% đối với độ chính xác.<br /> Bảng 2: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, độ chính<br /> xác và độ đúng<br /> Phương trình hồi qui<br /> Khoảng tuyến tính (ppm,<br /> µg/ml)<br /> 2<br /> R<br /> Độ lặp lại (RSD, n = 6)<br /> Độ chính xác trung gian<br /> (RSD, n = 18)<br /> Độ đúng (tỷ lệ hồi phục,<br /> n=9)<br /> <br /> Tạp D<br /> y = 57279,9x<br /> 0,04 – 0,50<br /> 0,9997<br /> Mẫu thử: 1,91%; Mẫu thử giả<br /> lập: 1,16%<br /> Mẫu thử: 1,78%; Mẫu thử giả<br /> lập: 1,61%<br /> 98,23% - 101,39%<br /> <br /> Bảng 3: Kết quả xác định hàm lượng tạp D trong<br /> nguyên liệu và chế phẩm esomeprazol<br /> Lô<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> <br /> Dựa vào các kết quả thực nghiệm thu được,<br /> có thể áp dụng quy trình đã thiết lập để định<br /> lượng tạp chất phân hủy D trong nguyên liệu<br /> esomeprazol và trong chế phẩm Esomeprazol<br /> STADA. Quy trình có tính chọn lọc, độ chính xác<br /> và độ đúng cao, giới hạn phát hiện và giới hạn<br /> định lượng thấp, giúp phát hiện và kiểm tra tạp<br /> chất phân hủy trong nguyên liệu và thành phẩm<br /> tương ứng.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1.<br /> 2.<br /> 3.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> European pharmacopoeia (2010), 1951-1953.<br /> ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of<br /> analytical procedures: text and methodology, 1-5.<br /> Nalwade SU, Reddy VR, Rao DD, Morisetti NK(2012), A<br /> validated stability indicating ultra performance liquid<br /> chromatographic method for determination of impurities in<br /> esomeprazole magnesium gastro resistance tablets, Journal of<br /> Pharmaceutical and Biomedical Analysis 57:109-114<br /> Reuters T (2009), Physicians’ Desk Referrence, 652.<br /> <br /> Ngày nhận bài báo:<br /> <br /> 10.12.2012<br /> <br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: 25.12.2013<br /> Ngày bài báo được đăng:<br /> <br /> 138<br /> <br /> Chế phẩm (%)<br /> 0,10<br /> 0,10<br /> 0,09<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> Xác định hàm lượng tạp D trong nguyên<br /> liệu và chế phẩm esomeprazol<br /> Tiến hành xác định tạp D trên 3 lô nguyên<br /> liệu và 3 lô chế phẩm tương ứng. Mỗi lô chuẩn bị<br /> 2 mẫu. Mỗi mẫu sắc ký 2 lần với điều kiện sắc ký<br /> đã chọn.<br /> <br /> Nguyên liệu<br /> Không phát hiện<br /> Không phát hiện<br /> Không phát hiện<br /> <br /> 10.03.2014<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br />