Bài giảng Thực hành Hóa phân tích 2 - Trường ĐH Võ Trường Toản

Chia sẻ: Lôi Vô Kiệt | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:21

Thêm vào BST

Báo xấu

43
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Thực hành Hóa phân tích 2 được biên soạn nhằm cung cấp cho sinh viên cơ sở lý thuyết của các quá trình phân tích định tính cũng như định lượng bằng phương pháp dụng cụ để khảo sát phổ UV – Vis của dung dịch kali permanganat trong môi trường acid; định lượng đồng thời hai chất màu (Phương pháp quang phổ UV – Vis); định lượng nitrit (Phương pháp quang phổ UV-Vis);... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Thực hành Hóa phân tích 2 - Trường ĐH Võ Trường Toản

TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC VOÕ TRÖÔØNG TOAÛN KHOA DƯỢC  BÀI GIẢNG MÔN HỌC THỰC HÀNH HÓA PHÂN TÍCH 2 Giảng viên biên soạn: VÕ NGỌC HÂN HỨA HỮU BẰNG Đơn vị: Khoa Dược Hậu Giang – Năm 2016
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC VOÕ TRÖÔØNG TOAÛN BÀI GIẢNG MÔN HỌC Tên môn học: Thực hành Hóa phân tích 2 (Tên tiếng Anh:…………………………….) Trình độ: Đại học Dược Số đơn vị học trình: 01 Giờ thực hành: 30 Thông tin Giảng viên:  Tên Giảng viên: VÕ NGỌC HÂN  Đơn vị: Khoa Dược  Điện thoại:  E-mail: vnhan@vttu.edu.vn NỘI DUNG BÀI GIẢNG 1. Điều kiện tiên quyết Sinh viên đã học xong môn học hóa đại cương vô cơ, hóa hữu cơ và hóa phân tích 1. 2. Mục tiêu môn học Cung cấp cơ sở lý thuyết của các quá trình phân tích định tính cũng như định lượng bằng phương pháp dụng cụ, hướng dẫn tiến hành những phương pháp phân tích định lượng để sinh viên vận dụng tốt khi làm việc trong những lĩnh vực liên quan đến hóa phân tích - kiểm nghiệm. 3. Phương pháp giảng dạy Thực hành tại phòng thí nghiệm. 4. Đánh giá môn học - Bài báo cáo, kiểm tra trên lớp 2
- Thi thực hành 6. Tài liệu tham khảo - Bộ Y tế (2012), Hóa phân tích, tập 2, NXB giáo dục. - Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh (2012), Giáo trình Hóa phân tích 2. - Đại học Y Dược Cần Thơ (2012), Giáo trình Hóa phân tích 2. - Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh (2012), Giáo trình Thực tập Hóa phân tích 2. - Đại học Y Dược Cần Thơ (2012), Giáo trình Thực tập Hóa phân tích 2. 5. Đề cương môn học STT Tên bài học Số tiết 1 Khảo sát phổ UV – Vis của dung dịch kali permanganat trong 4 môi trường acid 2 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi và pH đến sự hấp thụ của 4 benzen và phenol trong quang phổ UV – Vis 3 Định lượng đồng thời hai chất màu (Phương pháp quang phổ UV 4 – Vis) 4 Định lượng nitrit (Phương pháp quang phổ UV-Vis) 4 5 Tách và định tính các sulfonamid (Phương pháp sắc ký lớp 4 mỏng) 6 Định lượng Paracetamol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu 4 năng cao 7 Thi kết thúc học phần 6 Tổng 30 6. Nội dung bài giảng chi tiết 3
BÀI 1: KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH PHỔ UV-VIS CỦA DUNG DỊCH KALIPERMANGANAT TRONG MÔI TRƯỜNG ACID Mục tiêu học tập - Ứng dụng định luật Lambert – Beer trong việc định lượng thành phần hoạt chất dựa vào hệ số hấp thu mol và đường thẳng hồi quy. - Nhận diện máy UV-VIS hai chùm tia. Ứng dụng kỹ thuật quét phổ và đo điểm của máy UV-VIS hai chùm tia. I. NGUYÊN TẮC: - Dựa vào tính năng quét phổ để xác định λmax của KMnO4/H2SO4 0,1N từ 400 – 650 nm. - Đo độ hấp thu của các dung dịch chuẩn tại λmax - Từ đó tính toán hệ số hấp thu mol của tất cả các dung dịch ở λmax này. Áp dụng định luật Lambert – Beer để tính toán nồng độ của mẫu thử. II. HÓA CHẤT SỬ DỤNG - Dung dịch KMnO4 0,1N pha trong H2SO4 0,1N. - Dung dịch H2SO4 0,1N. III. TIẾN HÀNH 1. Xây dựng đường cong chuẩn: - Pha dung dịch trung gian S1 0,01N: KMnO4 0,1N trong H2SO4 0,1N 10ml H2SO4 0,1N vđ 100ml - Từ dung dịch trung gian S1 0,01N pha tiếp các dung dịch chuẩn từ 1-5 như sau: 4
Cách pha Dung dịch Nồng độ KMnO4 Lấy dung dịch S1 (ml) Thêm H2SO4 0,1N vđ (ml) 1 0,5 x 10-3 N 2,5 50 2 1,0 x 10-3 N 5 50 3 1,5 x 10-3 N 7,5 50 4 2,0 x 10-3 N 10 50 5 2,5 x 10-3 N 12,5 50 2. Định lượng: - Chọn Method wavelength scan để quét phổ: quét phổ UV-VIS từ 400nm đến 650nm để tìm λmax - Chọn Method photometry: chỉnh chiều dài sóng về λmax đã tìm được bên trên. - Đọc độ hấp thu (A) tương ứng với 5 nồng độ (C) của 5 dung dịch chuẩn từ 1 – 5 thử nghiệm (cốc đo 1cm, dùng mẫu trắng là H2SO4 0,1N) - Đọc độ hấp thu (Ax) tương ứng dung dịch thử nghiệm X mà bộ môn pha. Xây dựng đường cong chuẩn độ của A theo C bằng chương trình Excel IV.TÍNH TOÁN KẾT QUẢ Xác định nồng độ X bằng 2 cách: - Tính hệ số hấp thu mol và áp dụng công thức định luật Lambert – Beer. - Vẽ đường thẳng hồi quy A=f(C) rồi ngoại suy ra nồng độ chất cần khảo sát. V. CÂU HỎI 1. Có thể định lượng KMnO4 trong môi trường trung tính hay kiềm được không? Tại sao? 2. Nêu điều kiện cần và đủ để một chất có hấp thu UV-VIS 3. Nếu tìm dung dịch X có nồng độ ngoài khoảng C1 – C5 được không? Tại sao? 4. Tại sao quét phổ từ 450nm – 650nm mà không phải vùng khác? 5
BÀI 2: KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI VÀ pH ĐẾN SỰ HẤP THU CỦA BENZEN VÀ PHENOL TRONG PHỔ UV-VIS Mục tiêu học tập: - Trình bày được các định nghĩa về nhóm mang màu (chromophore), nhóm trợ màu (auxochrome), hiệu ứng dịch chuyển sang đỏ (bathochrome), hiệu ứng dịch chuyển sang xanh (hypsochrome), hiệu ứng giảm màu (hypochrome), hiệu ứng tăng màu (hyperchrome)… - Thực hiện các phép đo quang phổ tử ngoại của một số chất ở các môi trường khác nhau. I. NGUYÊN TẮC: Phổ điện tử là 1 đường cong trình bày những biến đổi cường độ hấp thu (A) của chất khảo sát theo độ dài song (λ). Dạng phổ phụ thuộc vào bản chất của chất khảo sát, môi trường… Ví dụ: - Phổ hấp thu UV-VIS của Benzen thể hiện 3 dãy hấp thu được định tính như sau: dãy E λmax = 202 nm εM = 7000 M-1cm-1 Chuyển dịch π  π* dãy B λmax = 254 nm εM = 200 M-1cm-1 - Phổ hấp thu UV-VIS của Phenol sẽ gây ra những hiệu ứng dịch chuyển sang đỏ hoặc dịch chuyển sang xanh của những dãy này. II. THUỐC THỬ: - Benzen (C6H6) - Phenol (C6H5OH) - NaOH 0,1N - Cyclohexan *Chú ý: cẩn thận khi pha chế Phenol (gây phỏng da) III. TIẾN HÀNH: - Đánh số dung dịch cho 6 bình định mức (BĐM) theo bảng sau và tính toán nồng độ dung dịch thu được 6
Dung dịch số 1 2 3 2A 3A 3B Thể tích BĐM (ml) 25 25 25 50 50 50 25 μl 25 μl 25 μl 0,5ml dd 0,5ml dd 0,5ml dd Thêm vào Benzen Phenol Phenol bình 2 bình 3 bình 3 Cyclo Cyclo Cyclo NaOH Điền đến vạch với Nước cất Nước cất hexan hexan hexan 0,1N Nồng độ (mcg/ml) ? ? ? ? ? ? *Chú ý: Lấy thể tích μl: bằng micropipet 10-100 μl và 100-1000 μl. - Đo phổ UV-VIS của các dung dịch 1, 2A, 3A, 3B trong khoảng bước sóng từ 200 – 400nm. Sau đó nhận xét sự dịch chuyển và các hiệu ứng thể hiện trên phổ đồ của các dung dịch chứa benzene và phenol trong các dung môi khác nhau như sau: + Benzen/cyclohexan (dung dịch 1) + Phenol/cyclohexan (dung dịch 2A) + Phenol/nước ( dung dịch 3A) + Phenol/dung dịch NaOH 0,1N (dung dịch 3B) IV. TRÌNH BÀY KẾT QUẢ: - Ghi nhận phổ của benzene/cyclohexan từ 200 – 400nm - Ghi nhận phổ của phenol từ 200 – 400nm trong các dung môi sau: + Trong nước + Trong cyclohexan + Trong dung dịch NaOH 0,1N - Xác định bước song hấp thu cực đại (λmax) trong các dung dịch đo, nhận xét kết quả. V. CÂU HỎI 1. Tên và công thức của các chất khảo sát 2. Phổ UV-VIS của dung dịch 1 và dung dịch 2A thấy có chuyển dịch gì? Giải thích? 3. Phổ UV-VIS của dung dịch 2A và dung dịch 3A, 3B thấy có chuyển dịch gì? Giải thích? 4. Cho biết λmax của các dung dịch 1, 2A, 3A, 3B? 5. Cốc đo sử dụng trong bài thực tập này làm bằng vật liệu gì? Giải thích? 7
BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HAI CHẤT MÀU BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-VIS Mục tiêu học tập - Thực hiện được việc định lượng đồng thời hai hoạt chất có màu trong dung dịch bằng áp dụng định luật cộng tính mật độ quang trong phương pháp quang phổ UV-VIS. I. NGUYÊN TẮC: Có thể định lượng đồng thời 2 hoạt chất có màu trong dung dịch bằng cách xác định độ hấp thu của hỗn hợp tại 2 bước sóng khác nhau, tuy nhiên những chất này trong dung dịch phải đáp ứng những yêu cầu sau: - Phổ hấp thu của 2 chất này chỉ chồng nhau lên từng phần - Bước sóng được lựa chọn định lượng phải trùng với cực đại hấp thu - Không có tương tác hóa học giữa 2 chất. - λmax của các chất phân tích phải cách nhau ít nhất 20nm II. HÓA CHẤT - K2Cr2O7 2.10-2M trong hỗn hợp 2 acid H2SO4 và H3PO4 0,7M - KMnO4 4.10-3M trong hỗn hợp 2 acid H2SO4 và H3PO4 0,7M - Hỗn hợp 2 acid H2SO4 và H3PO4 0,7M III. TIẾN HÀNH: 1. Pha dung dịch: - Dung dịch (1): 50ml dung dịch K2Cr2O7 2.10-3M trong hỗn hợp 2 acid H2SO4 và H3PO4 0,7M từ dung dịch gốc K2Cr2O7 2.10-2M đã pha sẵn. - Dung dịch (2): 50ml dung dịch KMnO4 4.10-4M trong hỗn hợp 2 acid H2SO4 và H3PO4 0,7M từ dung dịch KMnO4 4.10-3M đã pha sẵn. - Dung dịch (3): hỗn hợp đồng thể tích (1) và (2) 2. Đo quang: - Chọn chế độ quét phổ: quét phổ UV-VIS từ 400 – 650 nm dung dịch (1) và (2) để tìm λmax1 của dung dịch 1 và λmax2 của dung dịch 2. - Chọn chế độ đo điểm: chỉnh bước sóng về λmax1 và λmax2 đã tìm được ở trên. Đo độ hấp thu của dung dịch 1, 2, 3 tại λmax1 và λmax2 - Xác định hệ số hấp thu mol , , , của dung dịch 1, 2 tại λmax1 và λmax2 theo định luật Lambert-Beer A=C.ε.l 8
IV.TÍNH TOÁN KẾT QUẢ:  Như vậy, nồng độ của mỗi chất có thể suy ra từ độ hấp thu đo được dựa theo định luật cộng tính của mật độ quang. Thật vậy, người ta có các phương trình: Trong đó: - , , , : hệ số hấp thu mol của chất 1 và 2 ở bước sóng λmax1 và λmax2, được tính theo độ hấp thu của dung dịch có nồng độ đã biết - , : mật độ quang của hỗn hợp (dung dịch X) được đọc ở 2 độ dài sóng λmax1 và λmax2. - C1, C2: nồng độ mỗi chất trong hỗn hợp (dung dịch X)  Xác thực định luật cộng tính ở 2 bước sóng này bằng cách dùng giá trị độ hấp thu của hỗn hợp dung dịch ở các thể tích bằng nhau. Bảng 3.1 Xác thực định luật cộng tính của độ hấp thu ở λ1 và λ2 Độ hấp thu tại λ1 λ2 ½ A của dung dịch 1 ½ A của dung dịch 2 A của hỗn hợp V. CÂU HỎI 1. Có thể định lượng 2 chất này trong môi trường kiềm được không? Tại sao? 2. Có thể áp dụng định luật cộng tính để áp dụng hỗn hợp 5 thành phần? 3. Có thể áp dụng phương pháp nào khác để định lượng hỗn hợp 2 thành phần? 9
BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG DUNG DỊCH NITRIT BẰNG QUANG PHỔ KẾ TỬ NGOẠI Mục tiêu học tập - Trình bày nguyên tắc của phép đo trong vùng tử ngoại - Viết được cơ chế phản ứng Diazo hóa - Thực hiện phản ứng Diazo hóa và tính được kết quả I. NGUYÊN TẮC: Acid Nitro tạo với acid sulfanilic 1 diazoic có thể hấp thu trong quang phổ tử ngoại. Phản ứng xảy ra như sau: II. THUỐC THỬ: - Dung dịch NaNO2: 0,2 g/l (trong nước cất 2 lần). Bảo quản trong tủ lạnh tối đa 7 ngày. - Dung dịch Sulfanilic 6g/l. Bảo quản trong tủ lạnh tối đa 3 ngày. - HCl 4N III. TIẾN HÀNH: 1. Pha dung dịch: - Điều chế dung dịch chuẩn NaNO2 0,02 g/l và Sulfanilic 0,6 g/l Dung dịch chuẩn NaNO2 0,2 g/l 20ml Nước cất vđ 200ml NaNO2 0,02 g/l Dung dịch chuẩn acid A.sulfanilic 6 g/l 5ml Nước cất vđ 50ml sulfanilic 0,6 g/l 2. Khảo sát sự biến đổi theo thời gian: Phải tuân theo thứ tự của thuốc thử thêm vào (nếu HCl thêm vào trước A.sulfanilic thì 1 phần Nitrit có thể bị oxy hóa thành Nitrat và do vậy sẽ không định lượng được). - Điều chế 1 mẫu chứng (xem phần III, mục c, bình số 8) - Điều chế mẫu chuẩn độ: trong bình định mức 100ml thêm vào 10
Nước cất 2 lần 50ml Dung dịch chuẩn độ NaNO2 0,02 g/l 20ml Acid sulfanilic 0,6 g/l 2ml - Thêm nước cất 2 lần vào bình định mức đến khoảng 90ml tổng thể tích. - Điều chỉnh quang phổ kế đến λ = 270nm (λ này rất gần với sự hấp thu nhóm chức N=N) - Chuẩn bị cốc đo dày 1cm chứa mẫu chứng và điều chỉnh độ hấp thu Abs = 0. Sau đó, thêm 2ml HCl 4N vào bình định mức 100ml. (Phản ứng bắt đầu khởi động từ lúc thêm HCl 4N). Điền nước cất đến vạch 100ml. Lắc đều, mở máy đo lập tức, đọc độ hấp thu trong cốc dày 1cm. - Cứ mỗi phút đọc độ hấp thu 1 lần trong phút đầu tiên, rồi cứ 5 phút đọc 1 lần cho đến khi phản ứng bền (= độ hấp thu không đổi). - Vẽ đường cong động học trên giấy kẻ ô ly. Suy ra thời gian cần thiết để phản ứng bền hoàn toàn. 3. Phổ hấp thu: Mẫu thử: Sau khi thực hiện sự biến đổi của phản ứng theo thời gian (thời gian mà độ hấp thu đạt đến tối đa), dùng cùng mẫu chứng bên trên để điều chỉnh Abs = 0. 4. Định lượng dung dịch có nồng độ (X) Bình 1 2 3 4 5 6 X Chứng dd NaNO2 để định lượng (ml) 5 dd chuẩn độ NaNO2 0,02g/l (ml) 2 5 10 15 20 25 dd acid sulfanilic 0,6g/l (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 dd HCl 4N (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 Nước cất 2 lần vđ (ml) 100 100 100 100 100 100 100 100 Đọc độ hấp thu ở λmax sau khi đợi thời gian tối đa để phản ứng biến đổi. IV. TÍNH TOÁN KẾT QUẢ Vẽ đường cong chuẩn độ biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp vào nồng độ Nitrit A=f(C μg/ml), suy ra nồng độ của dung dịch X (μg/ml) 11
V. CÂU HỎI 1. Thứ tự pha chế thuốc thử trong bảng trên không theo đúng được không? 2. Sử dụng phương pháp Time scan với mục đích gì? 3. Ở giai đoạn định lượng dung dịch có nồng độ X, tại sao sau khi bổ sung nước cất vừa đủ thì phải chờ thời gian t bằng tmax vừa xác định mới tiến hành đo độ hấp thu? 12
BÀI 5: TÁCH VÀ ĐỊNH TÍNH CÁC SULFONAMID (PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG) Mục tiêu học tập - Trình bày nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng - Thực hiện được các thao tác triển khai sắc ký lớp mỏng I. NGUYÊN TẮC - SKLM là phương pháp phân tích cho phép tách và định tính những lượng nhỏ hợp chất hữu cơ. - Việc tách những sản phẩm được thực hiện dựa vào sự khác biệt về tốc độ rửa giải của 1 dung môi thích hợp (chất rửa giải, hệ thống dung môi, pha động) trên một giá mang chất hấp phụ rắn (pha tĩnh) đối với các thành phần của một hỗn hợp. II. HÓA CHẤT - Các sulfonamid đối chiếu: sulfoguanidin, sulfamethoxazol, sulfanilamide, sulfaxylum. - Dung môi khai triển: chloroform-methnol (3-1), ngoài ra còn có thể sử dụng các hệ khai triển khác. - Thuốc thử phát hiện: PDAB (Para Dimethyl Amino Benzoic) III. TIẾN HÀNH 1. Chuẩn bị vật liệu - Bản mỏng Silicagel GF254 (Merck) 3cm x 10cm - Bình khai triển SKLM - Ống đong 50ml (dùng pha hệ dung môi chung cho cả nhóm), đũa khuấy - Mao quản - Giấy bão hòa bình sắc ký - Chuẩn bị bình khai triển: rửa sạch bình, làm khô và bão hòa dung môi khai triển trong bình 2. Chiết Sulfonamid Nghiền kỹ 5 viên sulfamid trong cối, chiết bằng ethanol. Lọc, cho vào becher, làm bay hơi trên cách thủy. Cắn được dùng để chấm lên bản mỏng. 3. Triển khai sắc ký: - Chấm các vết Sulfonamid, hỗn hợp những sản phẩm đã biết (vết chấm trùng), Sulfonamid cần xác định. (mỗi loại lấy bằng 1 ống mao quản khác nhau) 13
- Đặt bản mỏng vào bình khai triển, những vết này phải được nằm trên mức dung môi trong bình. Đậy bình lại và triển khai đến mức khoảng 10cm trên vết chấm, lấy ra và vạch tức khắc đường dung môi. 4. Phát hiện - Để khô bản đã triển khai ngoài không khí, sau đó phun thuốc thử PDAB thấy vết có màu vàng. - Tính Rf của mỗi vết. Định danh hỗn hợp và xác định tên của từng vết chấm. IV. CÂU HỎI 1. Viết cơ chế tạo màu của Sulfonamid và PDAB 2. Slicagel dùng trong sắc ký lớp mỏng phải là loại Silicagel gì? Thành phần? 14
BÀI 6: ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL VÀ CAFEIN TRONG CHẾ PHẨM (PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO) Mục tiêu học tập - Hiểu được ý nghĩa của các thong số trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - Hiểu được các tính năng của đầu dò dãy diod quang (Photodiode Arry Detector, PDA), UV-VIS - Thực hành định lượng được paracetamol và cafein bằng phương pháp HPLC theo Dược điển Việt Nam IV I. NGUYÊN TẮC: Hỗn hợp Paracetamol và Cafein trong dược phẩm sau khi chiết có thể tách và định lượng bằng phương pháp HPLC với bộ phận phát hiện UV-VIS (hoặc bộ phận phát hiện PDA) do cấu trúc của 2 hoạt chất này có các nối đôi lien hợp, có các nhóm mang màu. II. ĐỐI TƯỢNG, CHẤT ĐỐI CHIẾU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI, TRANG THIẾT BỊ - Viên nén HAPACOL EXTRA chứa 500mg Paracetamol và 65mg Cafein do công ty cổ phần dược Hậu Giang sản xuất - Chất đối chiếu: Paracetamol Cafein Nơi cung cấp Viện Kiểm Nghiệm Thuốc TPHCM Số lô Nước (%) 0,32 0,16 Hàm lượng tính trên chế phẩm khan (%) 99,53 100,11 Bảo quản 5oC, tránh ánh sáng - Hóa chất, dung môi:  Acid acetic bang đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck, Đức)  Methanol đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC (Merck, Đức)  Nước cất đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC (độ dẫn điện 18MΏ) - Trang thiết bị: 15
 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi Chromaster L-5000 (Nhật)  Cột sắc ký: Cột pha đảo RP18  Màng lọc Sartorius RC – Vliesverstaerkt 0,45μm (Sartorius, Đức)  Hệ thống lọc pha động dưới áp suất giảm III. TIẾN HÀNH 1. Chuẩn bị pha động: Sử dụng ống đong pha 500ml pha động gồm nước-methanol-acid acetic bang (40-36-4), trộn đều, lọc dưới áp suất giảm qua màng lọc 0,45μm. Khử khí pha động bằng siêu âm trong 10 phút. 2. Chuẩn bị các mẫu đối chiếu và mẫu thử: - Chuẩn bị dung dịch đối chiếu gốc: (Bình 1) (Bộ môn pha) + Cân chính xác khoảng 100mg Paracetamol đối chiếu và 13 mg Cafein đối chiếu vào bình định mức 50ml (bình 1). Thêm khoảng 35ml methanol, lắc ký, sau đó đem siêu âm. Điền methanol đến vạch. Dung dịch thu được có nồng độ Paracetamol là 2000 μg/ml và nồng độ Cafein là 260 μg/ml. - Chuẩn bị dung dịch mẫu đối chiếu để bơm vào máy: (Bình 2) + Hút 2ml dung dịch 1 cho vào bình định mức 20ml (bình 2). Điền pha động đến vạch, lắc kỹ. Lọc qua màng lọc milipore 0,45μm. Dung dịch mẫu đối chiếu bơm vào máy có nồng độ paracetamol là 200 μg/ml và nồng độ Cafein là 26 μg/ml - Chuẩn bị dung dịch mẹ của mẫu thử: + Cân 20 viên nén. Tính khối lượng trung bình của 1 viên. Nghiền trộn 20 viên này bằng cối chày cho đến khi thu được một hỗn hợp bột mịn và đồng nhất. Cân chính xác khoảng một lượng bột bằng 1/5 khối lượng trung bình một viên nén, cho vào bình định mức 50ml (bình 3), hòa tan với methanol bằng cách lắc kỹ rồi siêu âm trong 10 phút. Điền methanol đến vạch. Lắc đều. + Mẫu thử của bình 3 có nồng độ Paracetamol xấp xỉ 2000 μg/ml trong methanol và nồng độ Cafein xấp xỉ 260 μg/ml trong methanol - Chuẩn bị dung dịch mẫu thử để bơm vào máy: (bình 4) + Lọc bình 3 qua giấy. Bỏ khoảng 10-20ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 2ml dịch lọc pha loãng trong bình định mức 20ml (bình 4) với pha động. Lọc qua màng lọc milipore 0,45μm. Mẫu thử của bình 4 có nồng độ paracetamol là 200 μg/ml và nồng độ Cafein xấp xỉ 26 μg/ml. - Hệ thống và điều kiện sắc ký + Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi Chromaster L-5000 (Nhật) + Pha động: nước – methanol – acid acetic băng (40:36:4) + Phenomenex Lunar RP C18 250 x 4,6 mm, 5 μm 16
+ Bước sóng phát hiện: 273 nm + Tốc độ dòng: 1ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 20μl - Tiến hành sắc ký, đánh giá các thông số sắc ký + Lần lượt bơm dung dịch mẫu đối chiếu và mẫu thử. Mỗi mẫu 6 lần + Ghi lại các thông số sắc ký như thời gian lưu, diện tích đỉnh, chiều cao đỉnh, hệ số dung lượng, hệ số chọn lọc, số đĩa lý thuyết, độ phân giải, hệ số bất đối của dung dịch mẫu đối chiếu và mẫu thử. + Xử lý thống kê các giá trị thu được: Giá trị trung bình: Độ lệch chuẩn (Standard deviation, SD): Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation, RSD) Yêu cầu: RSD của các thông số trong cả 2 dung dịch mẫu đối chiếu và mẫu thử phải nhỏ hơn 2%  Với PDA detector: xác định các yếu tố sau đây: + Sắc ký đồ 2 chiều của Paracetamol và Cafein + Sắc ký đồ 2 chiều của Paracetamol và Cafein + Phổ UV tương ứng của peak Paracetamol và peak Cafein + Sắc ký đồ ứng với λ max cực đại của Paracetamol và Cafein  Một số lưu ý: + Tất cả các dung dịch trước khi đưa vào hệ thống sắc ký đều phải được lọc qua màng lọc 0,45 μm + Pha động phải được khử bằng siêu âm trước khi tiến hành sắc ký + Trước khi tiến hành phân tích mẫu cần phải cân bằng hệ thống ít nhất 30 phút bằng pha động. Giữa các lần tiêm mẫu nên rửa kim bằng methanol. + Sau khi phân tích xong phải rửa cột bằng nước cất dùng cho HPLC trong 60’ và sau đó là methanol trong 30’, tốc độ dòng 1ml/phút. + Cột sắc ký nên được bảo quản trong hỗn hợp dung môi methanol:nước (60:40) hoặc Acetonitril:nước (9:1) IV.TÍNH KẾT QUẢ: Hàm lượng (mg) hoạt chất trong viên được tính theo công thức sau: 17
Với ST : diện tích đỉnh của hoạt chất trong dung dịch mẫu thử SC: diện tích đỉnh của hoạt chất trong dung dịch mẫu chuẩn P : khối lượng trung bình viên (mg) M : khối lượng bột thuốc cân được (mg) C : nồng độ hoạt chất trong dung dịch mẫu chuẩn (μg/ml) V. CÂU HỎI 1. Kiểu rửa giải của pha động trong bài thực tập thuộc loại đẳng dòng (isocratic) hay gradient? 2. Dung môi sử dụng để triển khai HPLC thuộc loại gì? Có sử dụng dung môi này để chiết xuất được không? 3. Nước cất sử dụng HPLC có thể bảo quản trong vài tuần mới sử dụng được không? 4. Cần chú ý các thông số nào khi thực hiện HPLC? 18
Họ tên SV: BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH 1/…………………………… MÔN: HÓA PHÂN TÍCH 1 2/…………………………… TÊN BÀI: 3/…………………………… ……………………………….………...… Tiểu nhóm:…………………. Nhóm:……………………… ……………………………….………...… Lớp:………………………... (Nộp bài cuối buổi thực hành) 1. Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị (liệt kê các dụng cụ, thiết bị, ghi rõ thể tích của dụng cụ nếu có, ghi rõ tên và model của thiết bị nếu có) ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... 2. Chuẩn bị hóa chất (liệt kê các hóa chất, ghi rõ nồng độ nếu có) ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... 3. Kết quả (ghi rõ công thức và cách tính toán) ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... 19
............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... 4. Trả lời câu hỏi/ bài tập ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... 20