Bài thuyết trình: Ứng dụng kĩ thuật phân tử trong xét nghiệm nông nghiệp

Chia sẻ: Nguyễn Phong | Ngày: | Loại File: PPTX | Số trang:36

Thêm vào BST

Báo xấu

94
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài thuyết trình: Ứng dụng kĩ thuật phân tử trong xét nghiệm nông nghiệp trình bày giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR, nguyên lí hoạt động của PCR, một số ứng dụng của PCR trong nông nghiệp hiện nay. Để nắm vững nội dung chi tiết mời các bạn cùng tham khảo tài liệu. Hi vọng tài liệu sẽ giúp ích cho các bạn trong quá trình học tập cũng như nghiên cứu của mình.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài thuyết trình: Ứng dụng kĩ thuật phân tử trong xét nghiệm nông nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG KĨ THUẬT PHÂN TỬ TRONG XÉT NGHIỆM NÔNG NGHIỆP Chủ nhiệm bộ môn: LÊ NGỌC TRIỆU
Danh sách thành viên
Đặt vấn đề  Nhờ phát minh kĩ thuật PCR mà ngành sinh học phân tử và nhiều ngành khoa học khác có sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử được tiếp cận với một phương pháp mới đem lại kết quả có ý nghĩa to lớn, trong đó có các nghiên cứu về các lĩnh vực y tế, khoa học đời sống. PCR là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có độ nhậy và tính đặc hiệu rất cao; do đó, PCR rất thích hợp cho xét nghiệm chẩn đoán trong lĩnh vực y học, pháp y, bệnh lí cây trồng  NHƯ VẬY:  TẠI SAO LẠI LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BẰNG KĨ THUẬT PCR ?  CƠ SỞ NÀO ĐỂ THIẾT KẾ CÁC MỒI ĐẶC HIỆU CHO MỘT PHẢN ỨNG TRONG MỘT CHUẨN ĐOÁN ?  TRÊN ĐỐI TƯỢNG LÀ VIRUS CẦN CÓ NHỮNG LƯU Ý GÌ TRONG PHẢN ỨNG ?  Ý NGHĨA CỦA VIỆC CHUẨN ĐOÁN BẰNG XÉT NGHIỆM NÀY TRONG NÔNG NGHIỆP ?
I. Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR II. Nguyên lí hoạt động của PCR III. Một số ứng dụng của PCR trong nông nghiệp hiện nay
I.Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR  Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu trong tế bào, nhà hóa sinh người Mĩ Karry Mullis đã phát minh ra kĩ thuật tổng hợp gen trong ống nghiệm (PCR) vào năm 1985. PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase. 
 Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn trong 1 chu kì: Giai đoạn biến tính (denaturation) Giai đoạn bắt cặp (annealing) Giai đoạn kéo dài (elongaction) Chu kì này được lặp đi lặp lại từ 20 40 lần và cho ra các sản phẩm cuối cùng của PCR là các đoạn DNA hoặc RNA phiên bản. Số lượng các bản sao này được tính theo hàm số mũ. Máy PCR
II.Nguyên lí hoạt động của PCR 1. Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR ( PCR mix):  DNA khuôn  Taq. DNA polymerase.  d NTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).  Primer ( oligonucleotide).  PCR buffer. 2. Ba giai đoạn phản ứng PCR thực hiện trên máy luân nhiệt (Thermalcycles) Giai đoạn biến tính (denaturation): 92 – 98 độ C - Giai đoạn bắt cặp (annealing) 45 thoi gian 20s2phut - Giai đoạn kéo dài (elongaction) nhiệt độ 6872
Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR trong việc lấy mẫu đem phân tích Các bệnh phẩm y học Ly trích pre nucleic acide Ly trích acide nucleic tinh khiết PCR ( RT PCR) Thực hiện xét nghiệm chẩn Phân tích phát hiện sản phẩm đoán bằng PCR PCR bằng quang phổ hay điện di
Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR  1. Lấy mẫu: ADN có thể tách chiết từ Có thể là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các đối tượng những mẫu khác nhau, như máu tươi, máu nghiên cứu. DNA mẫu có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp chất. khô, tế bào niêm mạc, nước xúc miệng, tóc, Lượng DNA được sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (từ 1mg xuống còn 100µg) vì thế người ta sử dụng polymerase cho hiệu quả da, phân, v.v... Mẫu có thể lấy tại chỗ hoặc gửi từ xa hàng nghìn kilômet, mất nhiều cao . Kí hiệuLấy mẫu đem ngày, trong phong bì bình thường, qua bưu phân tích điện, không cần bảo quản lạnh.
 2. Tách chiết ADN: Nhiều quy trình tách chiết ADN khác nhau của thế giới đã được nghiên cứu, thử nghiệm và thích ứng với điều kiện nước ta. Do vậy, góp phần giảm giá thành, tiết kiệm kinh phí. Với mỗi loại mẫu có một quy trình tách chiết thích hợp riêng. Đảm bảo chất lượng và số lượng ADN từ những lượng mẫu nhỏ. Tách chiết ADN Tinh sạch ADN
 3. Nhân ADN đặc hiệu:  Đây là khâu quan trọng nhất của quy trình. Các hỗn hợp hoá chất khác nhau và các chu trình nhiệt khác nhau đã được thử nghiệm cho từng cặp mồi. Trên cơ sở đó, đã tối ưu hoá thành phần của từng hỗn hợp, từng chu trình nhiệt cho từng cặp mồi, dựa vào những hoá chất sẵn có trên thị trường trong nước Nhân ADN đặc hiệu
 4. Điện di: Điện di được dùng để tách biệt các đoạn ADN có độ dài ngắn khác nhau. Độ tách biệt này phụ thuộc nhiều yếu tố. Các yếu tố đã được lựa chọn và tối ưu hoá trên cơ sở vật liệu sẵn có, hạ giá thành đáng kể và tăng độ phân giải lên hàng trăm lần, giúp phân biệt rõ các đoạn ADN chỉ chênh lệch nhau bốn nucleotid. Điện di
 5. Nhuộm màu ADN: Chất lượng điện di và kết quả nhân ADN đặc hiệu chỉ có thể hiện rõ trên bản gel với quy trình nhuộm ADN được tối ưu hoá và phương pháp nhuộm thích hợp được lựa chọn. Ngoài ra, kinh nghiệm và kỹ năng của kỹ thuật viên cũng rất cần thiết, góp phần hạ giá thành chung Nhuộm màu ADN
 6. Phân tích kết quả: Bản gel sau khi nhuộm xong sẽ có dạng như hình trên. Các đoạn ADN có độ dài khác nhau hiện rõ trên bản gel, có thể quan sát bằng mắt thường và đo đếm. Trong một số trường hợp, có thể xác định trình tự ADN để có kết luận cuối cùng. Hàng nghìn bản gel như thế đã được phân tích và hiện được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm. Phân tích kết quả
TẠI SAO LẠI LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BẰNG KĨ THUẬT PCR ? Ý NGHĨA TRONG NÔNG NGHI ü Độ tinh sach của mẫu không cần cao ỆP ? ü Dễ thực hiện ü Rẽ tiền và thời gian thực hiện ngắn ü Độ chính xác cao đáng tin cậy ü Trong nông nghiệp hiện đại có nhiều loại bệnh cần phải được chuẩn đoán sớm ngay tại vườn ươm hay trên nguồn hạt giống để loại bỏ tác nhân gây hại trước khi được đưa ra trồng trọt và sản suất đại trà mặt khác trên những đối tượng nghi ngờ đã bị lây nhiễm mầm bệnh có thể loại trừ sớm để tránh việc lây lan nhầm giảm thiểu thiệt hại đến mức thấp nhất. Vì thế những ưu thế của kĩ thuật này giúp đưa ra kết quả một cách chính xác và kịp thời để có thể giải quyết mầm móng các nguồn bệnh.
CƠ SỞ NÀO ĐỂ THIẾT KẾ CÁC MỒI ĐẶC HIỆU CHO MỘT PHẢN ỨNG TRONG MỘT CHUẨN  ĐOÁN ? Khi nhiệt độ hạ xuống đến nhiệt độ gắn mồi, một mồi sẽ gắn đặc hiệu vào mạch mang nghĩa trong khi một mồi khác sẽ gắn vào mạch đối nghĩa. Trong đó, mồi là các trình tự oligonucleotide ngắn có thể bám đặc hiệu vào một vùng trình tự nhất định. Mồi sẽ là điểm khởi đầu để các polymerase có thể thực hiển tổng hợp mạch bổ sung mới cũng như xác định đoạn ADN được khuếch đại. Do đó, việc thiết kế mồi sẽ quyết định mức độ đặc hiệu và năng suất của phản ứng.  Việc thiết kế mồi đặc hiệu cho một phản ứng đựa vào trình tự bảo tồn nằm trong vùng bảo tồn genome của sinh vật, trình tự bảo tồn thể hiện đặc trưng riêng biệt cho từng sinh sinh vật cụ thể mà dựa vào đó có thể thiết kế các mồi đặc hiệu cho từng loài sinh vật. Trình tự đích quan trọng trong phát hiện vi sinh vật Trình tự vừa có vùng bảo tồn cao cho một nhóm vi sinh Thiết kế mồi đặc hiệu cho vật và vừa có vùng biến động đặc trưng cho từng loài riêng biệt. loài
TRÊN ĐỐI TƯỢNG LÀ VIRUS CẦN CÓ NHỮNG LƯU Ý GÌ TRONG PHẢN ỨNG ?  Hoạt tính RNase H: hoạt tính RNase cho phép phá hủy đặc hiệu RNA trong phức hợp (RNA RNA bổ trợ), hiện tượng này không có lợi cho PCR nếu quá trình phá hủy khuôn mẫu RNA cạnh tranh với quá trình tổng hợp DNA khi tạo sợi DNA đầu tiên. Nói cách khác nếu trong phản ứng test virus ta bổ sung thêm RNase thì phản ứng chuyển RNA sẽ không đạt kết quả  Enzmye phiên mã ngược ( ReverseTransciptase): các enzyme ReverseTransciptase phụ thuộc RNA, xúc tác quá trình tổng hợp RNA>DNA đầu tiên sau đó DNApolimerase mới thực hiện phản ứng tổng hợp chuỗi DNA của virus.
MỘT VÍ DỤ VỀ XÉT NGHIỆM VIRUS DÂU TÂY(Strawberry)  Bảy virus rệp truyền qua đường được tái chuyển trong dâu tây: - Strawberry crinkle virus (SCV) - SMYEV - Strawberry mottle virus (SMoV) - Strawberry vein banding virus (SVBV) - Strawberry pseudo mild yellow edge virus (SPMYEV) - Strawberry chlorotic fleck virus (SCFV) - Strawberry latent C virus (SLCV) Trong đó: SCV, SMYEV, SMoV, và SVBV đã được coi là bốn virus quan trọng nhất về kinh tế của dâu tây. A: xuất hiện hóa đỏ trên toàn vườn, tang trưởng không đều B: các dãi đỏ lây lan C: cận cảnh sự hóa đỏ, còi cọc, méo mó quả nhỏ của dâu
 Các triệu chứng suy giảm trong cây dâu tây: A: mạch dẫn hóa đỏ B: lá biến dạng, mạch dẫn hóa đỏ, tổn thương trên cuống lá  Ảnh điên di phân tích kết quả test virus trên một số chủng dâu tây phổ biến tại Đà Lạt