BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI: "ĐIỀU TRA, NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT VÀ KHÁNG DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ TỪ XẠ KHUẨN"

Chia sẻ: Pham Linh Dan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:75

Thêm vào BST

Báo xấu

108
lượt xem 24
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sức khỏe luôn là một trong nững vấn đề được chú trọng trong mỗi quốc gia.Mặc dù các thành tựu đó có được trong ngành hóa dược đã đem lại sự phong phú về chủng loại dược phâm3, nhưng việc tìm kiếm và sử dụng các loại trực tiếp các sản phẩm tự nhiên có hoạt tình sinh học trong việc chữa trị các bệnh nan y vẫn luôn là hướng được quan tâm hiên nay.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI: "ĐIỀU TRA, NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT VÀ KHÁNG DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ TỪ XẠ KHUẨN"

ð I H C QU C GIA HÀ N I VI N VI SINH V T VÀ CÔNG NGH SINH H C ========000======== BÁO CÁO K T QU TH C HI N ð TÀI KHCN ð C BI T C P ð I H C QU C GIA Tên ñ tài: ði u tra, nghiên c u m t s ho t ch t có kh năng kháng vi sinh v t và kháng dòng t bào ung thư t x khu n Mã s : QG. 09. 48 Ch trì ñ tài: TS. Nguy n Huỳnh Minh Quyên Cơ quan: Vi n Vi sinh v t & Công ngh Sinh h c Hà N i, năm 2011
M CL C PH N I. BÁO CÁO TÓM T T 3 B ng ti ng Vi t 3 B ng ti ng Anh 8 PH N II. BÁO CÁO T NG K T 12 Gi i thích ch vi t t t 13 Danh sách nh ng ngư i tham gia th c hi n ñ tài 13 Danh m c các b ng và hình 14 ðU M 15 CHƯƠNG I. T NG QUAN TÀI LI U 16 1.1 Kháng sinh 16 1.1.1. Khái ni m chung 16 1.1.2. L ch s phát tri n kháng sinh 16 1.1.3. Phân lo i kháng sinh 18 1.1.4. Kháng sinh kháng kh i u 21 1.1.5. Nhu c u phát tri n kháng sinh m i 21 1.2 X khu n 22 1.2.1. Các ñ c ñi m chung 22 1.2.2. X khu n và các ch t th sinh 23 1.3 Tình hình nghiên c u x khu n Vi t Nam 23 1.4 N i dung và m c ñích c a nghiên c u 24 CHƯƠNG II - NGUYÊN V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 25 2.1. Nguyên v t li u 25 2.1.1. ð i tư ng nghiên c u 25 2.1.2. Hóa ch t 25 2.1.3. Thi t b , d ng c s d ng trong nghiên c u 25 2.2. Phương pháp nghiên c u 25 2.2.1. Phương pháp phân l p x khu n 25 2.2.2. Các vi sinh v t ki m ñ nh 26 2.2.3. Sàng l c x khu n sinh kháng sinh 27 2.2.4. Chi t b ng ethyl-acetate 28 2.2.5. S c ký các ch t chi t thu ñư c 28 2.2.6. Sàng l c ch ng x khu n sinh anthracycline 29 2.2.7. Phép th ñ c t bào 30 1
2.2.8. Các phương pháp phân lo i x khu n 30 CHƯƠNG III. K T QU VÀ TH O LU N 32 3.1. ða d ng sinh h c các ch ng x khu n thu th p ñư c Vư n Qu c gia Cát Bà 32 3.2. Sàng l c x khu n sinh kháng sinh 33 3.3. Hi u qu tách chi t d ch nuôi c y các ch ng x khu n ch n l c ñư c 35 3.4. Phân tích s c ký d ch nuôi các ch ng x khu n chi t trong ethyl acetate 36 3.4.1. S c ký b n m ng (TLC) 36 3.4.2. S c ký l ng hi u năng cao (HPLC) 38 3.5. ð c ñi m nh n d ng c a các ch ng x khu n ch n l c ñư c 42 3.5.1. ð c ñi m hình thái c a các ch ng thu c Streptomyces 42 3.5.2. Gi i trình t rDNA 16S ñ i v i các ch ng x khu n thu c chi Nonomuraea 44 3.6. Sàng l c kh năng sinh anthracyline c a các ch ng x khu n ch n l c ñư c 45 3.7. Các nghiên c u liên quan ñ n các ch ng có ho t tính ñ c t bào 46 3.7.1. Ho t tính gây ñ c t bào 46 3.7.2. Phân tích HPLC d ch nuôi chi t trong ethyl acetate c a các ch ng có ho t tính ñ c t bào 47 K T LU N VÀ KI N NGH 53 TÀI LI U THAM KH O 55 PH L C 62 2
PH N I. BÁO CÁO TÓM T T 1. Tên ñ tài: ði u tra, nghiên c u m t s ho t ch t có kh năng kháng vi sinh v t và kháng dòng t bào ung thư t x khu n 2. Mã s :QG.09.48 3. Th i gian th c hi n: 2 năm (2009 - 2011) ð i h c Qu c gia Hà n i 4. C p qu n lý: 5. Ch trì ñ tài: TS. Nguy n Huỳnh Minh Quyên Vi n Vi sinh v t và Công ngh sinh h c - ðHQGHN ði n tho i: 37547694; Fax: 37547407; Email: quyennhm@vnu.edu.vn - TS. Nguy n Quỳnh Uy n 6. Cán b tham gia: TS. ðinh Thúy H ng - CN. Lê Phương Chung - - ThS. Phan Th Hà - CN. Lê H ng Anh 7. M c tiêu và n i dung nghiên c u Nghiên c u này nh m tìm hi u s ña d ng sinh h c và sàng l c các ch ng x khu n có ho t tính kháng vi sinh v t trong b sưu t p các ch ng x khu n thu th p t ñ o Cát Bà, m t vư n qu c gia có ña d ng sinh h c cao Vi t Nam. Các ch t kháng sinh do các ch ng l a ch n sinh ra ñư c ti p t c nghiên c u nh m tìm ki m b n ch t c a chúng. C th là: - Phân l p x khu n t m u ñ t và lá m c ñ o Cát Bà, H i Phòng qua ñó ñánh giá m c ñ ña d ng c a ñ i tư ng - Sàng l c các ch ng có ho t tính kháng sinh cao - Tách chi t sơ b thu các ch t có ho t tính kháng sinh t các ch ng ch n l c ñư c - Nghiên c u tính ch t c a các ch t kháng sinh thu ñư c b ng s c ký b n m ng (TLC) và s c ký l ng hi u năng cao (HPLC). - Phân lo i, ñ nh danh các ch ng x khu n (b ng mô t hình thái ho c b ng gi i trình t gene 16S c a rDNA) có ho t tính kháng sinh cao. 3
- Th nghi m ho t tính kháng các dòng t bào ung thư ngư i c a ch t chi t t d ch nuôi c a m t s ch ng có ti m năng - Phân tích HPLC ch t chi t t d ch nuôi c a các ch ng có ho t tính kháng t bào ung thư làm cơ s cho nghiên c u b n ch t c a các h p ch t ñó. 8. Các k t qu ñ t ñư c 8.1. K t qu v m t khoa h c - 424 ch ng x khu n (g m 353 ch ng t m u ñ t và 71 ch ng t m u lá cây m c) thu th p t i vư n Qu c gia ñã ñư c phân lo i (b ng quan sát hình thái k t h p v i ñ c trình t gene rDNA 16S) cho th y g n 70% thu c chi Streptomyces, còn l i thu c nhóm x khu n hi m. Các chi x khu n hi m có t l cao trong b sưu t p này là Micromonospora (hơn 7% trong t ng s 424 ch ng), Nonomuraea (4%) và Nocardia (g n 3%). - 424 ch ng x khu n này ñã ñư c sàng l c ho t tính kháng sinh v i 4 vi sinh v t ki m ñ nh ñ i di n cho 3 nhóm vi sinh v t l n là vi khu n (Gram âm: Escherichia coli, Gram dương: Micrococcus luteus), n m men (Candida albicans) và n m s i (Fusarium oxysporium). - 115 ch ng trong s 424 ch ng nói trên ñã bi u hi n ho t tính kháng ít nh t m t trong b n vi sinh v t ki m ñ nh. - V i 115 ch ng có ho t tính này có 2 ch ng (A1073, A1393) kháng c 4 ch ng vi sinh v t ki m ñ nh, 7 ch ng (A232, A390, A1018, A1022, A1041, A1043 và A1470) kháng v i 3 ch ng ki m ñ nh, 8 ch ng (A45, A149, A154, A160, A396, A410, A427 và A444) có ho t tính kháng 2 vi sinh v t ki m ñ nh. Xét v ñ i tư ng b kháng thì 14 ch ng có ho t tính kìm hãm vi khu n Gram âm (E. coli), 14 ch ng kìm hãm vi khu n Gram dương (M. luteus); 11 ch ng có ho t tính kháng c hai nhóm vi khu n; 12 ch ng có ho t tính kháng n m s i (F. oxysporium) và ch 6 ch ng có ho t tính kháng n m men (C. albicans). Như v y t ng c ng có 17 ch ng có ho t tính kháng ít nh t 2 vi sinh v t ki m ñ nh ñã ñư c l a ch n cho các nghiên c u ti p theo. ði u thú v là 17 ch ng này ch thu c 2 chi Streptomyces (10 ch ng) và Nonomuraea (7 ch ng). - 17 ch ng ñã ñư c nuôi c y thu d ch nuôi và d ch nuôi ñã ñư c chi t b ng ethyl acetate ñ thu các h p ch t có ho t tính sinh h c. Hi u qu chi t ch t tan trong ethyl acetate (t 1 lít d ch nuôi c y) dao ñ ng t 30mg (ch ng A154) ñ n 2152mg (ch ng A444). 4
So v i ch t khô thì ch t chi t ñư c chi m t 0,51% (ch ng A154) ñ n 14,89% (ch ng A396). - Các ch t tan trong ethyl acetate c a d ch nuôi 17 ch ng x khu n ñã ñư c phân tích s c ký b n m ng (TLC) ñ so sánh v i ba kháng sinh là chloramphenicol, kitasamycin, erythromycin và v i d ch nuôi c a ch ng ñ i ch ng sinh anthracycline (A16). S băng thu ñư c sau s c ký dao ñ ng t 1 ñ n 4 băng. Có 8 ch ng (A149, A154, A160, A232, A410, A427, A1073, A1393) ch cho 1 băng, 3 ch ng (A396, A444, A1018) cho ph có 2 băng, 4 ch ng (A45, A1041, A1043, A1470) cho ph 3 băng và 2 ch ng (A390, A1022) cho ph 4 băng. So v i các kháng sinh chu n thì th y ch t chi t t d ch nuôi c a ch ng A396 là có băng tương ng v i chloramphenicol; ch t chi t t d ch nuôi ch ng A45 và A410 có băng trùng v i băng c a erythromycin, không có m u nào có băng tương ñ ng v i các băng c a kháng sinh kitasamycin. So v i d ch nuôi c a ch ng ñ i ch ng sinh anthracycline, các m u A1018 và A1022 có ph s c ký r t g n v i ñ i ch ng này. - Các ch t tan trong ethyl acetate c a 17 ch ng l a ch n ñư c ñư c ti p t c phân tích qua s c ký l ng hi u năng cao (HPLC) v i các ñi u ki n s c ký như v i các kháng sinh chu n. K t qu cho th y ngoài ch ng A396 có ñ nh tương t v i ñ nh thu ñư c t chloramphenicol, t t c các m u còn l i không tìm th y m i tương quan nào so v i các kháng sinh ñ i ch ng. - M t trong nh ng nghiên c u n a ñư c th c hi n v i 17 ch ng ch n l c ñư c là th c hi n th nghi m bi n ñ i màu ph thu c pH. ðây là phép th ñ c hi u ñ i v i các ch ng sinh kháng sinh thu c nhóm anthracycline. Qua ñó nh n th y có hai ch ng có bi u hi n dương tính v i phép th này là A1018 và A1073. - Như v y v i các bư c nghiên c u liên quan, t 17 ch ng có ho t tính kháng sinh tương ñ i cao, 3 ch ng ñư c l a ch n th nghi m ho t tính gây ñ c t bào ung thư ngư i là A1018 (có ph TLC và ph n ng ñ i màu pH tương t ch ng ñ i ch ng), A1022 (có ph TLC tương t ñ i ch ng) và A1073 (ph n ng ñ i màu pH). - B ng th nghi m v i ba dòng t bào ung thư ngư i là ung thư gan, ph i và cơ vân tim, các h p ch t chi t t d ch nuôi c a c ba ch ng ch n l c ñư c c a ñ tài ñ u có tác d ng dương tính v i c ba dòng t bào ung thư. So sánh v ch s IC50 (n ng ñ gây ch t 50% t bào ung thư, t c ch s này càng nh thì hi u qu gây ñ c t bào càng l n) thì th y trong ba m u nghiên c u ch t chi t t d ch chi t c a ch ng A1073 có ch s này th p nh t và th p g n b ng ñ i ch ng dương (m t trong nh ng ch t có kh năng 5
di t t bào) c a phép th ; th p b ng so v i ch ng ñ i ch ng sinh anthracycline và th p hơn ñáng k so v i hai ch ng còn l i. ðây là m t trong nh ng k t qu n i b t nh t c a ñ tài, làm ti n ñ cho các hư ng nghiên c u ti p theo. - Ch t tan trong ethyl acetate c a d ch nuôi 3 ch ng có ho t tính kháng t bào ung thư nói trên ñã ñư c phân tích HPLC v i cùng m t ñi u ki n s c ký v i các ñ i tư ng tương t hi n ñang ñư c th c hi n t i Phòng thí nghi m Vi sinh v t h c phân t , Trung tâm công ngh sinh h c qu c t , ð i h c T ng h p Osaka. Qua phân tích k t qu sau s c ký các ch t chi t ñư c t d ch nuôi ch ng A1018 cho 8 ñ nh khác nhau, t ch ng A1022 cho 5 ñ nh khác nhau và ch ng A1073 cho 6 ñ nh khác nhau. Các d li u liên quan hi n ñang ñư c so sánh phân tích v i cơ s d li u hi n có t i cơ s nói trên nh m tìm ki m b n ch t c a các ch t ñó. ðây là m t k t qu th hi n s h p tác qu c t c a ñ tài. 8.2. K t qu ñào t o ð tài ñã góp ph n ñào t o 01 Th c s chuyên ngành công ngh sinh h c thu c chương trình ñào t o liên k t qu c t v i ð i h c Liege, Vương qu c B v i tên ñ tài là: “Biodiversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island, Vietnam”. H c viên Nguy n Phương Chung ñã b o v thành công lu n văn v i k t qu xu t s c trư c H i ñ ng ngày 24 tháng 2 năm 2011. 8.3. Bài báo K t qu c a ñ tài ñã ñư c ñúc k t thành 02 bài báo: • Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island, Vietnam. T p chí Công ngh sinh h c (ñã nh n ñăng). • Bư c ñ u nghiên c u sàng l c kháng sinh ch ng ung thư t x khu n thu th p vư n Qu c gia Cát Bà, T p chí Khoa h c và Công ngh , ð i h c Qu c gia Hà N i (ñã nh n ñăng). 9. Tình hình s d ng kinh phí - T ng kinh phí c a ñ tài ñư c duy t: 100.000.000 VNð - T ng kinh phí c a ñ tài ñã quy t toán: 100.011.400 VNð, bao g m các m c: + Chi phí thuê mư n: 40.000.000 + Chi phí nghi p v chuyên môn: 49.084.000 + Photo tài li u, văn phòng ph m: 4.235.000 6
+ H i h p: 1.500.000 + Thông tin liên l c: 442.000 + Chi khác (l phí c a ñơn v DT): 4.750.000 Xác nh n c a cơ quan Ch trì ñ tài Xác nh n c a ð i h c Qu c gia 7
SUMMARY Investigation and study some substances which have antibiotic 1. Project title: activities against microorganisms and cancer cell lines from actinomycetes 2. Code: QG.09.48 3. Duration: 2009 – 2011 4. Organizer: Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi (VNUH) 5. Project leader: Dr. Nguyen Huynh Minh Quyen Dr. Nguy n Quỳnh Uy n 6. Key participants: Dr. ðinh Thúy H ng BSc. Lê Phương Chung MSc. Phan Th Hà BSc. Lê H ng Anh 7. Objectives and study contents Objective: This project was carried out to study biodiversity and to screen antibiotics from actinomycete strains collected from a national park with high biodiversity in Vietnam, named Catba National Park. The antibiotics produced by these strains were studied further in order to find out their nature. Study contents: • Isolating actinomycete strains from soil and litter samples on Catba island (Hai Phong) and then evaluating their biodiversity • Screening the strains possessing high antibiotic activities • Primary extracting the antibiotics from these strains • Studying the properties of these antibiotics by use thin layer chromatography (TLC) and high pressure liquid chromatography (HPLC) • Classifying and identifying the strains possessing high antibiotic activities by use their morphology and the sequences of 16S rDNA gene • Testing cytotoxic activity of some potential strains • HPLC analyses of the extracts from the strains capable of producing anticancer agents to obtain data base in order to study their nature. 8. The obtained results 8
• 424 actinomycete strains, including 353 strains from soil and 71 strains form litter samples, were collected at Cat Ba island and then were classified. As the result through their observation morphology and the sequences of 16S rDNA gene, the genus Streptomyces occupied about 70%, the rare actinomycetes were the rest. Among the latter, Micromonospora occupied more than 7%, Nonomuraea appeared about 4% and Nocardia was 3% in total. • 424 above strains were screened their antibiotic activity against 4 tested microorganisms, representative for bacteria (Negative Bacterium: Escherichia coli; Positive Bacterium: Micrococcus luteus), yeast (Candida albicans) and fungi (Fusarium oxysporium). • Of 424 strains above, 115 strains out were shown antimicrobial activity against at least one of the 4 testes microrganisms. • Among these 115 strains, 2 strains (A1073, A1393) were shown activity against all of the 4 tested microrganisms, 7 strains (A232, A390, A1018, A1022, A1041, A1043 và A1470) against 3, 8 strains (A45, A149, A154, A160, A396, A410, A427 và A444) against 2 testes microrganisms. Regarding the tested microorganisms, 14 strains were shown inhibitory activity to Negative bacterium (E. coli), 14 strains were shown inhibitory activity to Positive bacterium (M. luteus); 11 strains were shown activity against both of these; 12 strains were shown activity against fungi (F. oxysporium) and just only 6 strains were shown activity against yeast (C. albicans). In general, 17 strains in total possessing activity against at least 2 tested microoragnisms were selected for further study. Interestingly, 17 these strains jsut belonged to 2 genus Streptomyces (10 strains) and Nonomuraea (7 strains). • 17 strains were cultured to get their cultured broths and the cultured broths were extracted by ethyl acetate in order to obtain bioactive compounds. The yeild of extracted substances soluble in ethyl acetate (from 1 liter cultured broth) was variable from 30mg (strains A154) to 2152mg (strains A444). In comparison with their respective dry mass, extracted subtances occupied from 0,51% (strains A154) to 14,89% (strains A396). • The substances soluble in ethyl acetate of the cultured broths of 17 actinomycete strains were analysed by thin layer chromatography (TLC) to compare their profile with that of three standard antibiotics (chloramphenicol, kitasamycin, 9
erythromycin) and the cultured broth of control strain, capable of producing anthracycline (A16). The bands obtained after chromatography were varied from 1 to 4 bands. 8 strains (A149, A154, A160, A232, A410, A427, A1073, A1393) were shown 1 band, 3 strains (A396, A444, A1018) were shown 2 bands, 4 strains (A45, A1041, A1043, A1470) - 3 bands and 2 strains (A390, A1022) - 4 bands. In comparison with the standard antibiotics, the substances extracted from the cultured broth of strain A396 were shown the similar band to chloramphenicol; substances extracted from the cultured broth of the strains A45 and A410 were shown the same band of erythromycin, none of them were shown the band similar to the bands of antibiotic kitasamycin. In comparison with cultured broth of control strain producing anthracycline, samples A1018 and A1022 were shown the chromatography profile very close with this of the control. • The substances soluble in ethyl acetate of the 17 selected strains were analysed by high performance pressure chromatography (HPLC) in the same condition as that of the standard antibiotics. Except strain A396, which was shown the peak similar to that of chloramphenicol, the rest of the samples were not shown any connection with the control antibiotics. • Furthermore 17 selected strains tested to change the colour based on the enviromental pH. This is a specific test for strains producing antibiotic of group anthracycline. Two strains A1018 and A1073 were shown positive results in this test. • 3 strains out of 17 strains above (A1018 (the TLC profile and change the coulour based on pH were similar to that of the control strain), A1022 (TLC profile is similar to that of the control) and A1073 (change the coulour based on pH)) with relatively high antibiotic activity, were selected to test cytotoxicity against human cancer cell lines. Crude extracts of three strains above exhibited significant cytotoxic activity against hepatocellular carcinoma, lung cancer, and rhabdosarcoma human cell lines. • By testing with hepatocellular carcinoma, lung cancer, and rhabdosarcoma human cell lines, the substances extracted from the cultured broths of three selected strains exhibited positive results against all of these cell lines. By the comparison of IC50 value (i.e., the concetration of agents kills 50% cancer cells in number, which means the smaller this value is, the higher the cytotoxicity is), the substance 10
extracted from strain A1073 was shown the lowest value and this value is very close to that of the positive control of this test. This value is also as low as that of the control strain producing anthracycline and significant lower in comparison with the rest of the two strains. This is one of the outstanding results of the project and this provides the base to develop further research. • Substances soluble in ethyl acetate of the cultured broths of 3 strains above were analysed by HPLC at the same chromatography condition for similar subjects at Molecular Microbiology Lab, International Center for Biotechnology, Osaka University. HPLC analyses of ethyl acetate crude extracts of the three strains A1022, A1018 revealed relatively high complexity, possessing 5 peaks, 8 peaks and 6 peaks, respectively. Their data base is going to compare with that available at this Lab in order to find out the nature of these substances. This is one of international collaboration of the project. 9.1. Education results The project contributes to educating 01 Master student, field Biotechnology, belonged to international program jointed with University of Liege, Belgium. The dissertation is: “Biodiversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island, Vietnam”. The master students Nguy n Phương Chung did defend successfully on Feb 24th, 2011. 9.2. Publication: All of the results above resulted in 02 publications: • Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island, Vietnam. Journal of Biotechnology (accepted). • Primary screening anticancer antibiotic from actinomycetes isolated at Cát Bà National Park, Journal of Science, Natural Sciences and Technology, Vietnam National Unversity, Hanoi (accepted). Xác nh n c a cơ quan Ch trì ñ tài Xác nh n c a ð i h c Qu c gia 11
PH N II. BÁO CÁO T NG K T 12
GI I THÍCH CH VI T T T DMSO: Dimethyl Sulfoxide DNA: Deoxyribonucleic acid EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay HPLC: High-performance liquid chromatography rDNA 16 S: gene 16S c a DNA ribosome ñ m có 10mM Tris-HCl và 1mM EDTA, pH8,0 TE: TLC: Thin layer Chromatography DANH SÁCH NH NG NGƯ I THAM GIA TH C HI N ð TÀI 1. Ch trì: TS. Nguy n Huỳnh Minh Quyên 2. Nh ng ngư i th c hi n: TS. Nguy n Quỳnh Uy n - TS. ðinh Thúy H ng - CN. Lê Phương Chung - - ThS. Phan Th Hà - CN. Lê H ng Anh 13
DANH M C CÁC B NG VÀ HÌNH Danh m c b ng B ng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo c u trúc hóa h c B ng 2.1 ði u ki n phân tích HPLC c a các ch t chu n B ng 3.1 Sơ b phân lo i các ch ng x khu n phân l p ñư c B ng 3.2. Ho t tính kháng vi sinh v t c a 17 ch ng x khu n ch n l c ñư c B ng 3.3. Hi u qu tách chi t d ch nuôi các ch ng x khu n ch n l c ñư c B ng 3.4. T ng k t k t qu phân tích HPLC ch t chi t t các ch ng x khu n ch n l c ñư c B ng 3.5. Các ñ c ñi m nh n d ng c a 10 ch ng thu c chi Streptomyces B ng 3.6. K t qu xác ñ nh ho t tính gây ñ c t bào B ng 3.7. T ng k t k t qu phân tích HPLC ch t chi t t 3 ch ng có ho t tính gây ñ c t bào ung thư Danh m c hình Hình 1.1 Kháng sinh ñư c phát hi n qua các năm Hình 1.2 S ti n hóa c a penicillin G Hình 1.3. C u trúc hóa h c c a daunorumycin (DNR) và idarumycin (IDA) Hình 3.1. ðánh giá ho t tính kháng vi sinh v t c a các ch ng x khu n Hình 3.2. Ph TLC ch t chi t t d ch ngo i bào c a các ch ng x khu n ch n l c ñư c Hình 3.3. Ph HPLC c a chloramphenicol (A) và ch t chi t t ch ng A396 (B) Hình 3.4. Hình thái khu n l c m t s ch ng Streptomyces Hình 3.5. H s i mang bào t c a m t s ch ng Streptomyces Hình 3.6. Cây ch ng lo i phát sinh trình t rDNA 16S cho th y v trí c a 7 ch ng x khu n hi m trong chi Nonomuraea Hình 3.7. S thay ñ i màu s c theo pH môi trư ng c a các ch ng A1018 và A1073 Hình 3.8. S c ký ñ HPLC ch t chi t t d ch nuôi ch ng A1018 Hình 3.9. S c ký ñ HPLC ch t chi t t d ch nuôi ch ng A1022 Hình 3.10. S c ký ñ HPLC ch t chi t t d ch nuôi ch ng A1073 14
ðU M S c kh e luôn là m t trong nh ng v n ñ ñư c chú tr ng nh t trong m i qu c gia. M c dù các thành t u có ñư c trong ngành hoá dư c ñã ñem l i s phong phú v ch ng lo i dư c ph m, nhưng vi c tìm ki m và s d ng tr c ti p các s n ph m t nhiên có ho t tính sinh h c trong vi c ch a tr các b nh nan y v n luôn là hư ng ñư c quan tâm hi n nay. Trong m t t ng k t v các lo i dư c ph m hi n ñang lưu hành trên th gi i, Newman và c ng s (2003) ñã cho bi t t năm 1981 ñ n năm 2002 trong t ng s 868 lo i thu c ñư c phép ñưa vào s d ng thì có ñ n 58% là có ngu n g c t nhiên. ð c bi t con s này là 62% ñ i v i thu c dùng trong ñi u tr b nh ung thư. V i ngu n vi sinh v t vô cùng phong phú và ña d ng, Vi t nam có cơ s ñ phát tri n ngành công ngh sinh h c theo hư ng ng d ng y-dư c này. ðây cũng là m t bài toán ñ t ra cho ngành dư c nư c nhà trư c tình hình thu c nh p ngo i chi m v trí áp ñ o trên th trư ng và trong các b nh vi n l n. ð cung c p ngu n nguyên li u h tr cho ngành dư c, các nghiên c u v ñ c tính sinh h c t vi sinh v t có tác d ng ch a tr b nh c n ph i ñư c chú tr ng, nh m t o ti n ñ cho vi c phát tri n dư c ph m m i v i tính năng ñi u tr cao và ít tác d ng ph không mong mu n. S suy thoái môi trư ng s ng Vi t nam hi n nay là nguyên nhân d n ñ n ña d ng hoá các tác nhân gây b nh. Các b nh viêm nhi m và b nh ung thư hi n ñang là ñ i tư ng c n thi t ñ các nhà nghiên c u ñ t m c tiêu tìm ki m các ch t có công d ng c ch t ngu n vi sinh v t n i ñ a. Thay ñ i khí h u, ô nhi m môi trư ng s ng là nh ng y u t gây tác ñ ng tr c ti p ñ n s c kh e c a con ngư i. Theo d báo toàn c u, t i m t s vùng trên th gi i, trong ñó có Vi t nam, t l ngư i m c b nh viêm nhi m thông thư ng hay các b nh nguy hi m như ung thư, tim m ch... ngày càng gia tăng (Ashutosh K., 2008; Goodfellow M., 1998). Do v y, vi c nghiên c u ñ tìm ki m các ch t có ho t tính ch a tr b nh t các ngu n g c t nhiên là m t trong nh ng hư ng nghiên c u tr ng tâm c a ngành công ngh sinh h c t i nhi u qu c gia, ñ c bi t các nư c phát tri n. ð n m b t ñư c nh ng k thu t tiên ti n trong lĩnh v c này và t ng bư c hoà nh p v i s phát tri n chung, ñ ng th i ñ ñáp ng nhu c u trong vi c b o v s c kho c ng ñ ng, Vi t nam c n chú tr ng khai thác ngu n ña d ng vi sinh v t c a mình làm nguyên li u ñ phát tri n dư c ph m. Vì l ñó chúng tôi ñã ñ xu t và ñã ñư c ð i h c qu c gia Hà N i phê duy t th c hi n ñ tài: “ði u tra, nghiên c u m t s ho t ch t có kh năng kháng vi sinh v t và kháng dòng t bào ung thư t x khu n” 15
CHƯƠNG I. T NG QUAN TÀI LI U 1. 1 Kháng sinh 1.1.1. Khái ni m chung Theo ñ nh nghĩa truy n th ng thì kháng sinh (còn ñư c g i là tr sinh) là nh ng ch t có kh năng tiêu di t vi khu n hay kìm hãm s phát tri n c a vi khu n m t cách ñ c c p ñ phân t , thư ng là m t v trí quan tr ng c a vi hi u. Nó có tác d ng lên vi khu n khu n hay m t ph n ng trong quá trình phát tri n c a vi khu n. Theo ñ nh nghĩa hi n nay, kháng sinh ñư c hi u là các h p ch t hóa h c do vi sinh v t sinh ra và n ng ñ th p chúng có th kìm hãm s sinh trư ng ho c tiêu di t (các) vi sinh v t khác (Nduka, 2007). Hi n nay các ch t có ho t tính sinh h c có kh năng di t khu n g m các ch t kháng sinh truy n th ng, các s n ph m trao ñ i ch t như các acid lactic do các vi khu n lactic sinh ra, các ch t phân gi i như lysozyme, các lo i ngo i ñ c t có b n ch t protein, các bacteriocin…. Các “vũ khí sinh h c” này ñư c quan tâm ñ c bi t do tính ña d ng và c do chúng có nhi u trong t nhiên (Margaret & Milind, 2007). Th c, ñ ng v t b c cao cũng có kh năng sinh “kháng sinh” tuy nhiên các h p ch t này n m ngoài ñ nh nghĩa nói trên. Tương t như v y, m c dù cũng do vi sinh v t sinh ra nhưng bacteriocin cũng không ñư c coi là kháng sinh không ch vì chúng có kh i lư ng phân t không l n như các ch t kháng sinh thông thư ng khác mà còn do chúng ch y u nh hư ng ñ n các vi sinh v t g n v i vi sinh v t s n sinh ra bacteriocin. So v i bacteriocin, các ch t kháng sinh ña d ng v b n ch t hóa h c và t n công các vi sinh v t không có quan h h hàng. ði m khác bi t quan tr ng n a là trong khi thông tin di truy n c a các ch t kháng sinh thư ng n m trên m t vài gen thì bacteriocin ch c n gen ñơn. (Nduka, 2007). ð n nay ñã có kho ng 16.500 kháng sinh ñư c phát hi n t vi sinh v t, và hàng năm hàng ch c kháng sinh m i ñư c phát hi n (Hopwood, 2007). 1.1.2 L ch s phát tri n kháng sinh Kháng sinh là thu c ñư c con ngư i dùng ch y u ñ ch ng các b nh truy n nhi m. Các b nh truy n nhi m chi m ph n r t l n trong các b nh c a con ngư i và ñ ng v t. Cho ñ n n a sau c a th k 19 ngư i ta ñã phát hi n ra r ng vi sinh v t chính là th ph m gây ra hàng lo t các b nh truy n nhi m. Do ñó li u pháp hóa h c nh m vào các vi sinh v t gây b nh ñã ñư c phát tri n thành li u pháp ñi u tr chính. 16
Vào năm 1928, Fleming phát hi n ra penicillin và kháng sinh này ñã ñư c dùng trong ñi u tr vào nh ng năm 1940. Ngay sau ñó penicillin ñã tr thành m t kháng sinh n i ti ng vì ñã c u s ng nhi u chi n binh trong chi n tranh th gi i II (Saga & Yamaguchi, 2008). T nh ng năm 1940 ñ n cu i nh ng năm 1960, nhi u kháng sinh m i ñư c xác ñ nh h u h t t x khu n, và ñó tr thành th i kỳ vàng son c a hóa li u pháp kháng sinh (Hình 1.1). Hình 1.1 Kháng sinh ñư c phát hi n qua các năm (Hopwood, 2007). Năm 1944, streptomycin ñư c phát hi n t vi khu n ñ t Streptomyces griseus. Sau ñó ñ n chloramphenicol, tetracycline, các kháng sinh thu c nhóm macrolide và glycopeptide (t c vancomycin) ñư c phát hi n t vi khu n ñ t. Các kháng sinh t ng h p như nalidixic acid, thu c ch ng vi sinh v t có b n ch t quinolone ñã ñư c t o ra vào năm 1962. Vi c c i ti n trong t ng l p kháng sinh ti p t c thu ñư c ph kháng vi sinh v t r ng hơn, ho t tính kháng vi sinh v t cao hơn ví d như các kháng sinh β-lactam. L p β-lactam g m penicillin, cephem, carbapenem và monobactam. Penicillin ban ñ u có tác d ng hi u qu lên vi khu n Gram dương như Staphylococcus aureus. Sau ñó, S. aureus sinh ra các enzyme phân gi i penicillin- penicillinase, nên ngư i ta phát tri n methicillin. Bên c nh ñó, ñ m r ng ph tác d ng c a ampicillin (là kháng sinh ch ng vi khu n Gram âm Enterobacteriaceae) ngư i ta ñã phát tri n ñư c piperacillin có th kháng ñư c c Pseudomonas aeruginosa (Hình 1.2). 17
Hình 1.2 S ti n hóa c a penicillin G (Saga et al, 2008) Vi c phát hi n, phát tri n và s d ng các kháng sinh trong ñi u tr t h k 20 ñã làm gi m ñáng k t l ch t do nhi m khu n. Tuy nhiên t 1980 s kháng sinh m i ñư c ñưa vào ñi u tr gi m h n do chi phí cho vi c phát tri n và th nghi m thu c m i ngày càng l n. Bên c nh ñó, m t hi n tr ng ñáng báo ñ ng là ngày càng tăng các vi sinh v t gây b nh kháng v i các kháng sinh hi n có. Hi n nay, vi c kháng c a vi khu n ph i ñư c kh c ph c b ng vi c phát hi n ra các thu c m i. Tuy nhiên vi sinh v t càng ngày càng nhanh kháng thu c và t c ñ ñó l i nhanh hơn t c ñ t o ñư c thu c m i c a con ngư i. Do v y, các nghiên c u c n ph i t p trung vào làm th nào ñ vư t qua tính kháng thu c kháng sinh cũng như phát hi n các kháng sinh m i có các cơ ch ho t ñ ng khác nhau (Fred, 2006). 1.1.3 Phân lo i kháng sinh Có m t s phương pháp phân lo i kháng sinh. M t trong nh ng phương pháp ñó là d a vào ki u ho t ñ ng t c là kháng sinh ñó tác ñ ng lên vách t bào, kìm hãm protein… Tuy nhiên có khi m t kháng sinh l i có nhi u cơ ch ñ ng th i cùng tác ñ ng nên cách phân lo i này khó áp d ng. M t s trư ng h p kháng sinh ñư c phân lo i d a trên vi sinh v t s n sinh ra kháng sinh ñó. Nhưng khi ñó có trư ng h p m t vi sinh v t có th sinh ra m t s kháng sinh như Streptomyces sp. có th sinh penicillin N và cephalosporin. Ngư c l i m t kháng sinh cũng có th do nhi u vi sinh v t sinh ra. Kháng sinh cũng ñã ñư c phân lo i d a theo con ñư ng sinh t ng h p. Ph tác ñ ng cũng ñư c dung, ví d như tác 18
ñ ng lên vi khu n, n m, nguyên sinh ñ ng v t… Tuy nhiên m t lo i/nhóm kháng sinh như aminoglycoside l i có th có ph tác d ng khác nhau (Nduka, 2007; Tortora et al, 2010). Cách phân lo i nêu dư i ñây là d a trên c u trúc hóa h c c a kháng sinh và theo ñó kháng sinh ñư c phân thành 13 nhóm (B ng 1.1) (Nduka, 2007). B ng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo c u trúc hóa h c Nhóm hóa h c Ví d Aminoglycoside Streptomycin Ansamacrolide Rifamycin Beta-lactam Penicillin Chloramphenicol và các ch t tương Chloramphenicol t Linocosaminide Linocomycin Macrolide Erythromycin Nucleoside Puromycin Puromycin Curamycin Peptide Neomycin Phenazine Myxin Polyene Amphothericin B Polyether Nigericin Tetracycline Tetracycline Nh ư ñ ã ñ c p trên có nhi u cách phân lo i kháng sinh và không có cách nào th a mãn toàn b các yêu c u v phân lo i. Do v y, cách phân lo i d a trên c u trúc hóa h c nêu ñây cũng ch mang tính ch t tương ñ i và các ví d nêu ra là ñ d dàng nh n bi t nhóm có kháng sinh ñó mà thôi. Sau ñây là m t s nhóm kháng sinh thông d ng: a. Aminoglycoside là nhóm các kháng sinh mà các ñư ng amino ñư c liên k t b ng liên k t glycoside. Streptomycin và gentamicin là các ví d ñi n hình c a nhóm này. Streptomycin v n còn là thu c thay th trong ñi u tr b nh lao, nhưng do s phát tri n tính kháng thu c nhanh chóng và các nh hư ng ñ c h i nghiêm tr ng ñã làm h n ch vi c s d ng kháng sinh này. Các aminoglycoside kìm hãm t ng h p protein nhi u vi khu n Gram âm và m t s vi kh n Gram dương. ðôi khi chúng ñư c dùng k t h p v i penicillin. 19