Báo cáo tổng kết đề tài NCKH cấp trường: Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:69

Thêm vào BST

Báo xấu

88
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của báo cáo tổng kết đề tài NCKH cấp trường: Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam là nhằm thu nhận và nuôi trứng bò, heo đến giai đoạn trưởng thành (In vitro Maturaration_IVM); thử nghiệm khả năng sống của trứng bò, heo trưởng thành sau khi đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo tổng kết đề tài NCKH cấp trường: Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM KHOA SINH HỌC  BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG THU NHẬN TRỨNG BÒ, HEO ĐỂ CẢI THIỆN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TRỨNG TRONG ĐIỀU KIỆN VIỆT NAM Mã số: CS.2008.19.28. CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS. NGUYỄN THỊ THƯƠNG HUYỀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2009
PHẦN MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Sự phát triển của Công nghệ sinh sản nói chung và kỹ thuật đông lạnh nói riêng đã đem lại nhiều tiềm năng ứng dụng có ý nghĩa không chỉ về kinh tế mà còn có ý nghĩa về khoa học. Đặc biệt, kỹ thuật đông lạnh trứng ngoài việc ứng dụng trong điều trị vô sinh còn là nền tảng cho những nghiên cứu mới của nhân loại trong nhiều lĩnh vực: y sinh học nhằm thu nhận tế bào gốc phôi, nhân giống vật nuôi, bảo quản nguồn gen in vitro, chuyển gen, sinh sản vô tính… Ở nước ta trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu được triển khai nhằm nhân nhanh đàn bò để thực hiện “Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020” do Thủ tướng chính phủ đề ra (16/1/2008). Tuy nhiên, các nghiên cứu này còn gặp khó khăn do nguồn trứng không đủ để tiến hành các thí nghiệm nuôi chín trứng, thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization_IVF)…Nguyên nhân của vấn đề này là do hạn chế trong việc vận chuyển và chi phí. Do đó, cung cấp nguồn trứng có chất lượng cao với giá thành thấp đang được quan tâm. Heo là đối tượng động vật quan trọng cho việc nghiên cứu sinh lý và bệnh học ở người. Kỹ thuât chuyển gen đang đóng vai trò thiết yếu trong việc tạo ra heo có kiểu gen cho các hướng nghiên cứu khác: khai thác tế bào gốc phôi, cắt phôi… Xa hơn nữa, công nghệ này còn có khả năng ứng dụng trong Y sinh: cấy ghép cơ quan, nội tạng… Bảo quản lạnh giao tử và phôi từ heo có thể là một phuơng pháp thay thế hữu hiệu trong việc duy trì những cá thể sinh sản nhằm bảo tồn các kiểu gen quý hiếm. Đây là một cuộc cách mạng không chỉ với việc kiểm soát khả năng sinh sản ở heo mà còn với sự gia tăng sử dụng heo trong các ứng dụng về công nghệ Y sinh học. Hiện nay nguồn trứng chủ yếu được bảo quản bằng phương pháp đông lạnh, song tỷ lệ trứng sống sau khi rã đông theo tổng kết của các chuyên gia thế giới chưa cao (bò 30%, người 10%,). Chính điều này là làm tốn kém và hạn chế trong công việc của nhiều nước. Một trong những tác nhân giới hạn thành công của kỹ thuật đông lạnh trứng là xảy ra tổn thương lạnh trong suốt quá trình đông lạnh. Trứng rất dễ tổn thương khi tiếp xúc với nhiệt độ thấp của quá trình đông lạnh và để tránh điều này bằng cách sử dụng phương pháp thủy tinh hóa (Ruffing và cs., 1993; Martino và cs., 1996). Trên cơ sở đó, chúng tôi mạnh dạn thực hiện đề tài “Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam”. 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI - Thu nhận và nuôi trứng bò, heo đến giai đoạn trưởng thành (In vitro Maturaration_IVM)
- Thử nghiệm khả năng sống của trứng bò, heo trưởng thành sau khi đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa. 3. CÁCH TIẾP CẬN ĐỀ TÀI  Tiếp cận với nhu cầu đòi hỏi của xã hội và tầm quan trọng của vấn đề này trong cuộc sống; đồng thời các điều kiện về kiến thức, điều kiện phòng thí nghiệm cho phép ứnng dụng Công nghệ Sinh học.  Tiếp cận với các chuyên gia đầu ngành để học tập, trao đổi kỹ thuật, kinh nghiệm: Tham gia lớp học về các kỹ thuật thu nhận, nuôi, đông lạnh trứng, thụ tinh trong ống nghiệm trên đối tượng bò heo tại Viện Chăn nuôi quốc gia, Hà Nội (tháng 05/2008) do TS. Otoi (Người Nhật) và các cán bộ của viện đảm trách…  Tra cứu các tài liệu liên quan trong và ngoài nước  Tiếp cận với các kỹ thuật hiện đại: hệ thống máy đông lạnh và giải đông trứng, kỹ thuật vi thao tác, PCR… 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Phương pháp trực quan (nghiên cứu trực tiếp): thu nhận trứng và xử lý trứng, đông lạnh trứng, giải đông trứng, kiểm tra, đánh giá tỷ lệ trứng sống sau khi rã đông.  Phương pháp tổng hợp  Phương pháp so sánh 5. PHẠM VI NGHIÊN CỨU  Trứng bò từ các nguồn khác nhau: từ viện chăn nuôi quốc gia, lò mổ Vissan  Trứng heo từ lò mổ Vissan Tp. HCM 6. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  NỘI DUNG 1: Đông lạnh trứng heo trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (PP1) và trong cọng rạ (PP2)  NỘI DUNG 2: Đông lạnh trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (PP2)  NỘI DUNG 3: Đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (PP1) và trong cọng rạ (PP2) 7. SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI
Kết quả khoa học Đã tiến hành thu nhận và bảo quản nguồn trứng bò, heo thu nhận từ lò mổ bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt và trong cọng rạ. Kết quả sản phẩm Đã bảo quản được số lượng trứng vượt với chỉ tiêu đề ra trong thuyết minh:  71 cọng rạ chứa 386 trứng heo đã IVM  36 cọng rạ chứa 197 trứng bò đã IVM  70 cọng rạ chứa 365 trứng bò chưa trưởng thành  305 trứng heo đã IVM trong vi giọt  477 trứng bò chưa trưởng thành trong vi giọt Kết quả đào tạo 02 cử nhân  Phan Bá Quy: Thử nghiệm bảo quản trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (vitrification)- 2008  Nguyễn Quốc: Bảo quản trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) – 2009. (Chuẩn bị báo cáo tốt nghiệp vào ngày 25/05/2009) 01 SV nghiên cứu khoa học đạt giải nhì cấp trường Đỗ Hoàng Hùng: Thử nghiệm bảo quản trứng bò, heo bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (microdrop vitrification) – 2009. Kết quả bài báo, báo cáo đã công bố  01 bài đăng trong Hội nghị Khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM, 2008 (Bảo quản trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ)  01 bài đăng trong Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 2008 (Bảo quản trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ; đang chờ phản biện)
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ĐÔNG LẠNH TRỨNG 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Khái niệm thủy tinh hóa hay toàn bộ vật chất có trạng thái trong suốt giống thủy tinh được mô tả đầu tiên vào năm 1890, sau đó được Luyet mô tả lại vào năm 1937 (Luyet, 1937) [46]. Vào nửa cuối thập kỷ 1940, Chang đã thực hiện những nghiên cứu đầu tiên về bảo quản phôi thỏ ở nhiệt độ thấp [3]. Đến năm 1949, Polge và cs. phát hiện ra glycerol có thể giữ được sức sống của tinh trùng gia cầm khi nhiệt độ được hạ xuống -70oC [65]. Phát hiện này mở ra khả năng có thể bảo quản các loại tế bào và mô ở nhiệt độ thấp hơn. Smith (1952) đã đông lạnh phôi thỏ ở nhiệt độ -79oC và -196oC nhưng đạt kết quả không cao. Sau khi rã đông, chỉ có 1% số phôi được bảo quản còn giữ được một phôi bào có khả năng tiếp tục phân chia [76]. Năm 1976, Parkening và cs. tiến hành đông lạnh trứng chuột ở -30oC và -50oC có tỉ lệ sống đạt 51 – 56%; ở -75oC chỉ đạt 18% trứng sống [60]. Một loạt nghiên cứu của tác giả Willadsen (1977) [85], Trouson (1977) [77], Massip (1979) [52], đã cải tiến phương pháp đông lạnh và rã đông theo phương pháp giảm từng bước một, nhằm pha loãng các chất bảo quản lạnh, tăng nhanh tốc độ đông lạnh và rã đông mà vẫn bảo tồn sức sống của phôi, thu được kết quả tốt ở bò và chuột. Những cải tiến này cũng hạn chế được sự biến đổi về hình thái học của phôi. Ngày nay, việc đơn giản hóa kĩ thuật đông lạnh và rã đông theo phương pháp một bước (one – step method) do Leibo (1980) đề xuất đã thực sự thúc đẩy việc sử dụng phôi cũng như tinh trùng đông lạnh rộng rãi trong sản xuất. Hiệu quả cho thấy khi sử dụng tinh đông lạnh thì sức sống của phôi đạt trên 80% và tỉ lệ thụ thai đạt 50 – 60% [40]. Đến năm 1985, Rall và Fahy đã công bố phương pháp đông lạnh cực nhanh còn gọi là phương pháp thủy tinh hóa, bằng cách nhúng trực tiếp phôi chuột 8 tế bào vào nitơ lỏng từ nhiệt độ trên 0 oC, do đó chỉ mất vài giây để đông lạnh. Và ông đã thực hiện thành công trong trữ lạnh phôi gia súc (bò) [66]. Phương pháp này không yêu cầu những dụng cụ làm lạnh đắt tiền hay kĩ năng đặc biệt mà có thể tiến hành rất nhanh. Mặt khác, phương pháp thủy tinh hóa đơn giản hơn phương pháp đông lạnh thông thường. Từ đó, phương pháp thủy tinh hóa được sử dụng rộng rãi và bây giờ được xem như là phương pháp thay thế phương pháp đông lạnh chậm. Mặc dù, phương pháp đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa được Rall và Fahy thực hiện thành công đầu tiên trên phôi bò vào năm 1985 [66]. Tuy nhiên, quy trình này chỉ được
Kuleshova và Lopata ứng dụng đầu tiên trên trứng người vào năm 1999 [37] và sau đó vài tháng, quy trình này cũng được thực hiện đầu tiên trên phôi người đang phát triển ở giai đoạn phôi nang bởi Lane [38]. Vào ngày 20/6/1999, em bé đầu tiên trên thế giới từ phôi trữ lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa ra đời [90]. Kỹ thuật đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa áp dụng thành công trên trứng bò (Martino và cs.,1996) [51]. Trên chuột, tỷ lệ hình thái trứng sống sau quy trình đông lạnh và rã đông bằng phương pháp thủy tinh hóa là 88% (Nakagata, 1989) [55]; 80% (Shaw, 1991) [72]; 99% (Lane, 2001) [39]; 90% (Kim, 2007) [36]. Trên bò, tỷ lệ trứng sống sau đông lạnh và rã đông là 85% (Otoi,1998) [58]; 87% (Asada, 2002) [12]; 88% (Men, 2002) [53]; đặc biệt Chian (2004) thu được tỷ lệ trứng bò sống sau rã đông đạt 92% khi dùng chất bảo quản đông lạnh là 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% dimethyl sulphoside (DMSO), và đạt 98% khi dùng 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% propylene glycol (PG)...[17]. Vào năm 2005, Fujihira thực hiện quy trình đông lạnh và rã đông trứng heo bằng phương pháp thủy tinh hóa sử dụng Cryotop, với nồng độ EG trong dung dịch thủy tinh hóa là 30%, thu được tỷ lệ sống sau rã đông là 54 – 56% [24]. Trong năm này Martins R.D. và cs. đã đông lạnh trứng bò chưa chín bằng phương pháp thủy tinh hóa, sử dụng chất bảo quản là EG và sucrose, tỷ lệ trứng sống là 20% so với nhóm đối chứng là 74,6% [50]. Năm 2006, Cetin Yunus và Bastan Ayhan đã bảo quản trứng bò chưa trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa với các chất bảo quản khác nhau, tỷ lệ sống trên 20% so với nhóm đối chứng là 79,6% [18]. Somfai và cộng sự (2006) khảo sát ảnh hưởng của Cytochalasin B trên quá trình thủy tinh hóa trứng heo sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trên bề mặt kim loại. Họ sử dụng quy trình bổ sung CPA qua 2 bước (trong EG 4% khoảng 10 – 15 phút ở 37oC, sau đó trong dung dịch thủy tinh hóa cuối cùng EG 35% với 5% PVP và trehalose 0.3M) [75]. Gupta và cộng sự (2007) sử dụng quy trình thủy tinh hóa tương tự với quy trình trên. Trong thử nghiệm sử dụng trứng giai đoạn túi mầm, kết quả được cải thiện khi kết hợp sử dụng EG và DMSO, vì vậy họ sử dụng kết hợp 2 chất này trên đối tượng trứng MII. Tuy nhiên phương pháp này làm giảm đáng kể khả năng phát triển của trứng (chỉ 3.4% phát triển đến blastocyst so với lô đối chứng là 20.1%) [28]. Morató và cs. (2008) đã bào quản trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ và cryoloop cho tỷ lệ trứng sống sau giải đông tương ứng là 88,4% và 94,5% [54].
1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đã được tiến hành vào năm 1984. Phương pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 12oC/phút) sau khi khử nước cục bộ ở nhiệt độ phòng trên phôi bò đã thành công với 63,4% (33/52) phôi phát triển trong ống nghiệm sau 48 giờ và 44,2% (23/52) phôi nang thoát màng và tỷ lệ có thai sau khi cấy phôi đông lạnh – rã đông là 33,3% (7/21) [3]. Năm 1990, con bê Charolais đầu tiên được sinh ra từ phôi đông lạnh nhập khẩu [2]. Năm 2003, Lưu Công Khánh và cs. đã báo cáo thành công việc nghiên cứu ứng dụng phôi bò đông lạnh bằng glycerol [5]. - Ngày 24/05/2004, trường hợp em bé đầu tiên của Việt Nam ra đời từ trứng trữ lạnh tại bệnh viện Từ Dũ [90]. - 2008, Nguyễn Thị Thương Huyền và cs. đã bảo quản thành công trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ với tỷ lệ trứng sống so với tổng số trứng đem đông lạnh sau giải đông 58,83% [4]. - Hiện nay các nhà khoa học đang nghiên cứu về việc bảo quản trứng ở động vật hữu nhũ, nhằm mục đích tạo ngân hàng bảo quản giao tử cái (trứng) để phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn: IVF, ICSI, cloning, chuyển gen, thu nhận tế bào gốc phôi… 1.2. SINH LÝ BUỒNG TRỨNG 1.2.1. Quá trình hình thành và phát triển nang trứng Hình thành nang trứng là quá trình tiếp nối của các giai đoạn từ nang nguyên thủy phát triển thành nang sơ cấp và sau đó thành nang thứ cấp, các nang này sẽ phát triển, tích lũy dịch, phồng lên và di chuyển ra ngoài buồng trứng để chuẩn bị rụng trứng – đó là nang trứng chín (Hình 1.1). Và quá trình phát triển này ở gia súc từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn trước rụng trứng mất khoảng 180 ngày (Lussier và cs., 1987) [45]. Từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn tiền rụng trứng đường kính nang trứng bò tăng 30 đến 400 lần (từ 50m lên 15 đến 20mm). Trong quá trình này trứng hình thành màng trong suốt, tích lũy một số sản phẩm cần thiết cho sự thụ tinh và các giai đoạn đầu của sự phát triển phôi. Sau khi rụng nang trứng sẽ hình thành thể vàng. Số lượng nang trứng dự trữ trong buồng trứng ở các loài có sự khác nhau và thoái hóa dần trong quá trình phát triển của cá thể, càng lớn thì số nang trứng có hiệu quả càng ít. Ở bò, bê con lúc mới sinh ra có hơn 100.000 nang trứng và số lượng này giảm dần theo độ tuổi.
Hình 1.1. Sự hình thành và phát triển nang trứng 1.2.2. Sự hình thành và phát triển của trứng Một trứng trưởng thành và sẵn sàng cho sự thụ tinh khi nó được phóng thích từ nang trứng trưởng thành của buồng trứng. Sự trưởng thành của trứng liên quan mật thiết với sự trưởng thành của các nang trứng (Hình 1.2). Quá trình phát triển của trứng gồm 4 giai đoạn: Sự di chuyển của các tế bào mầm vào cơ quan sinh dục; Sự gia tăng số lượng tế bào mầm bằng nguyên phân; Sự giảm vật liệu di truyền bằng giảm phân; Sự trưởng thành về cấu trúc và chức năng của trứng. Trong quá trình giảm phân của trứng có 2 giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trưởng (block):  Giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trưởng lần thứ nhất: khi trứng bước vào giai đoạn prophase của giảm phân I, cho ra trứng sơ cấp ở giai đoạn túi mầm (Germinal Vesicle_GV). Các trứng sẽ vượt qua giai đoạn này khi có sự xuất hiện của đỉnh LH (Luteinizing hormone) tức khi cá thể đến tuổi trưởng thành sinh dục.  Giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trưởng lần thứ hai: khi ở giai đoạn metaphase-M của giảm phân II (MII), cho ra trứng thứ cấp ở giai đoạn MII. Trứng chỉ vượt qua được giai đoạn MII khi có sự thụ tinh của tinh trùng.
Hình 1.2. Cấu trúc của buồng trứng và nang trứng Sự trưởng thành của trứng bao gồm những biến đổi ở mức tế bào để hỗ trợ cho sự thụ tinh và thời kỳ đầu của sự phát triển phôi thai (Sirard và cs., 1989) [73]. Sự trưởng thành trứng bao gồm:  Sự trưởng thành về nhân Quá trình trưởng thành trong nhân trải qua các giai đoạn: giai đoạn phá vỡ túi mầm (Germinal Vesicle Breakdown_GVBD), cô đặc nhiễm sắc thể, hình thành thoi vô sắc, phân chia nhiễm sắc thể tương ứng với việc tách ra của thể cực thứ I và dừng ở metaphase II. Ở bò, các nang trưởng thành đạt kích thước từ 2 - 3mm, một số trứng có khả năng xảy ra hiện tượng GVBD và hoàn tất quá trình giảm phân sau đó (Lonergan và cs., 1994 [42]; Fulka và Motlik., 1986 [25]). Và khi trứng đạt đến giai đoạn metaphase II sẽ đạt đường kính là 110m. Điều này giống với trứng thu từ nang nguyên thủy hoặc sơ cấp (chưa đạt đến kích thước khảo sát là tối ưu) không thể tiếp tục hay hoàn tất quá trình giảm phân và sẽ không có khả năng trưởng thành nhân. Do đó, đây là cơ sở cho việc chọn nang để thu trứng cho việc nuôi trưởng thành in vitro nhẳm đạt kết quả cao nhất.  Sự trưởng thành về tế bào chất Sự trưởng thành của tế bào chất bao gồm sự thay đổi toàn diện cấu trúc để trứng tiến từ giai đoạn túi mầm đến giai đoạn metaphase II (Shamsuddin và cs., 1993) [70]. Trong quá trình này, các bào quan được tổ chức lại chuẩn bị cho quá trình thụ tinh và tổng hợp protein chuẩn bị cho sự phát triển của phôi. Các ti thể thay đổi theo sự lớn lên của trứng. Khi trứng có kích thước nhỏ hơn 100mm, ti thể có
dạng cầu và định vị tại trung tâm trứng. Nhưng khi trứng có đường kính 100mm, ti thể có hình trứng và di chuyển ra xa vị trí trung tâm, chúng có dạng hình túi và nằm tại vùng ngoại vi của trứng khi tế bào đạt đến kích thước 110mm. Các ti thể di chuyển dọc theo các vi ống được hình thành trong tế bào chất. Tương tự, các túi mầm sẽ di chuyển ra phía màng trong suốt khi trứng phát triển với kích thước hơn 110mm. Bộ Golgi chịu trách nhiệm hình thành các thể hạt vỏ của màng trong suốt. Và số lượng Golgi trong trứng tăng theo đường kính của nang. Có thể dễ dàng quan sát sự thay đổi vị trí của hạt vỏ trong suốt quá trình trưởng thành của tế bào chất. Cùng với sự thay đổi vị trí, sự thay đổi cấu trúc hạt vỏ là hai yếu tố có ý nghĩa đặc biệt đối với sự thụ tinh của trứng. Các thể hạt vỏ di chuyển ra phía màng trong suốt, giải phóng các chất bên trong làm cho màng trong suốt thay đổi cấu trúc, tăng kích thước nội bộ và hạn chế sự thụ tinh đa tinh trùng (polyspermy). Do vậy, sự trưởng thành về tế bào chất là yếu tố đánh giá gián tiếp khả năng của trứng khi thụ tinh, phân chia tế bào và phát triển đến giai đoạn phôi nang. 1.2.3. Cấu tạo của trứng Xung quanh trứng là lớp tế bào cumulus (granulose cell) kết hợp một cách chuyên biệt với trứng, giữa chúng có khe nối giúp duy trì quá trình trao đổi chất của trứng. Các lớp tế bào cumulus này vừa bảo vệ trứng, vừa cung cấp chất dinh dưỡng nuôi trứng. Đặc biệt là khi trứng rụng, trứng không còn nguồn cung cấp chất dinh dưỡng nào khác ngoài tế bào hạt. Tiếp đến là màng phóng xạ tỏa tròn. Bên trong màng phóng xạ là màng trong suốt của trứng, đóng vai trò rất quan trọng trong thụ tinh. Giữa màng trong suốt và màng tế bào chính là khoảng không quanh noãn. Trong màng tế bào chất là bào tương và nhân chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội của loài. Trứng chín là trứng đang ở giai đoạn metaphase II với thể cực thứ nhất. (Hình 1.3) Hình 1.3. Tế bào trứng
1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐÔNG LẠNH TRỨNG 1.3.1. Các phương pháp đông lạnh Đông lạnh trứng là sự bảo quản thành công chức năng bình thường của trứng khi giảm nhiệt độ dưới mức phản ứng hóa học bình thường xảy ra (từ 37oC, 5%CO2 (điều kiện sinh lý) xuống - 196oC (nhiệt độ không sinh lý)). Đông lạnh trứng có thể phân loại theo hai cách chung là đông lạnh cân bằng “equilibrium” với phương pháp đông lạnh chậm (slow freezing) hay đông lạnh không cân bằng “nonequilibrium” với phương pháp đông lạnh nhanh (rapid freezing) và phương pháp thủy tinh hóa (vitrification), tùy theo tốc độ làm lạnh và chất bảo quản đông lạnh sử dụng. Tuy nhiên, bản chất của các phương pháp này là giống nhau, cụ thể là đều có mục đích chung nhằm bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của tinh thể đá nội bào, sự khử nước và thay đổi mạnh mẽ nồng độ chất tan ở cả nhiệt độ cao và nhiệt độ thấp.  Phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification) Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thời gian rất nhanh. Trong suốt quá trình hạ nhiệt độ, toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế bào chuyển thành dạng khối đặc, trong suốt giống như thủy tinh (glass-like), đặc biệt không có sự hình thành tinh thể đá bên trong mẫu tế bào, cũng như môi trường bên ngoài trong quá trình làm lạnh. [50, 54] Phương pháp này loại trừ hạn chế của quá trình đông lạnh chậm là cần thiết bị phức tạp. Một thuận lợi nữa của phương pháp này là khả năng sống của tế bào cao nếu điều kiện tối ưu do không có tinh thể đá ngoại bào. Gần đây hơn, những phương pháp thủy tinh hóa cải tiến đã được phát triển, có khả năng làm lạnh và làm ấm cực nhanh nhờ giảm thiểu thể tích của dung dịch bảo quản. Phương pháp này hy vọng có khả năng bảo quản tế bào dễ bị tổn thương do đông lạnh. Trong phương pháp thủy tinh hóa, tế bào cần được xử lí theo các bước đông lạnh thông thường như cân bằng trong dung dịch bảo vệ lạnh pha loãng, ngâm trong dung dịch đông lạnh nhanh một khoảng thời gian ngắn trước khi được làm lạnh trong nitơ lỏng. Thời gian tiếp xúc trong dung dịch của phương pháp thủy tinh hóa không chỉ phụ thuộc vào dung dịch bảo vệ đông lạnh mà còn phụ thuộc vào nhiệt độ, cả tính thấm của tế bào và độc tính của chất bảo quản lạnh chịu ảnh hưởng rộng bởi nhiệt độ. Tế bào được huyền phù trong một dung dịch chất bảo quản thấm có nồng độ rất cao ở nhiệt độ phòng. Bởi vì sự hiện diện với nồng độ cao các chất bảo quản có khả năng gây độc cho tế bào nên trứng không được phép giữ lâu tại nhiệt độ này mà thay vào đó chỉ được cân bằng đông lạnh trong khoảng thời gian rất ngắn trước khi chúng được nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng. [48]
Khác với các phương pháp đông lạnh chậm và đông lạnh nhanh, trong phương pháp đông lạnh cực nhanh, thể tích của dung dịch đông lạnh nhanh được giảm đến mức tối thiểu sử dụng nhiều công cụ khác nhau. Ví dụ, tế bào được đặt ở đầu loop hay được đặt dính ở ống bảo quản lạnh (cryotube hay cryoloop), ống mao dẫn mở (cọng rạ hở “open pulled straw”), hay đông lạnh không có dụng cụ chứa (vi giọt). Mục đích của phương pháp này là làm lạnh và rã đông trứng với thể tích tối thiểu cần cho đông lạnh nhanh. Phương pháp đông lạnh cực nhanh cũng được đưa ra để cải tiến sự sống sót của tế bào sau khi rã đông bởi vì nhiệt độ tới hạn có thể vượt qua nhanh chóng trước khi tế bào bị tổn thương. Tuy nhiên chất bảo quản được dùng trong kỹ thuật này có nồng độ rất cao, có khả năng gây nên những tổn thương về cấu trúc di truyền cho tế bào. Có lẽ đây là lý do tại sao phôi sau trữ lạnh có cấu trúc và phát triển rất tốt khi nuôi trong ống nghiệm nhưng tỷ lệ thụ thai sau chuyển phôi vẫn còn rất thấp. Người ta cho rằng thành công của phương pháp phụ thuộc vào loại và cách dùng chất bảo quản lạnh, cũng như thời gian tiếp xúc với chất bảo quản lạnh trước khi chuyển thành dạng kính. Qui trình rã đông cũng phải thực hiện thật nhanh để hạn chế hiện tượng chuyển dạng từ kính sang nước đá. Hiện tại tuy chưa thể áp dụng kỹ thuật này vào thực tế nhưng tiềm năng của nó rất lớn vì tính đơn giản và những ưu điểm so với kỹ thuật làm lạnh chậm đang được sử dụng. [11, 13, 48] 1.3.2. Chất bảo quản lạnh (Cryoprotective Additive_CPA) Các chất bảo quản lạnh được sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa gần giống như trong kỹ thuật đông lạnh chậm trước đây, nhưng nồng độ sử dụng cao hơn. Trong một dung dịch dùng để thủy tinh hóa luôn bao gồm một hoặc hai chất bảo quản lạnh có khả năng thấm qua màng tế bào (permeable cryoprotectant) để khử nước bên trong tế bào và một chất bảo vệ đông lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào (non-permeable cryoprotectant) làm đối trọng, giúp quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn. [11, 13] 1.3.2.1. Các chất bảo quản thường sử dụng cho phương pháp thủy tinh hóa  Chất bảo quản lạnh có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào: ethylene glycol (được sử dụng phổ biến nhất), propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) và 1,2-propanediol (PrOH).  Ethylene glycol (EG): Phổ biến nhất và đã được sử dụng trong quy trình thủy tinh hóa. Chất này ít ảnh hưởng bởi nhiệt trong cơ chế vận chuyển qua màng, độc tính của nó sẽ xuất hiện vào khoảng 38oC. EG có độc tính thấp với phôi chuột, đặc biệt là phôi nang và khuếch tán nhanh, cân bằng nhanh chóng với tế bào qua màng trong suốt và màng tế bào. Sau khi đông lạnh trứng và phôi bằng phương pháp thủy tinh hóa bằng EG đã có sự mang thai bình thường trên động vật và người. [11]
 Dimethyl sulfoxide (DMSO): DMSO được phát hiện vào năm 1959 như là một chất bảo quản hiệu quả. Chất này xuyên qua màng dễ dàng hơn glycerol nhưng tính độc của nó lại cao hơn ở nhiệt độ cao.  Propylene glycol (PG): cũng là một chất tương tự như glycerol, nhưng nồng độ của nó được yêu cầu thấp hơn trong chất đông lạnh, và độc hơn glycerol.  Chất bảo quản lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào: sucrose, trehalose, glucose và galactose. Các saccharide khác nhau thường được sử dụng, bao gồm mono-, di- và trisaccharides. Các monosaccharide gồm fructose, glucose, và galactose. Các disaccharide như sucrose, trehalose và lactose. Những sucrose không thấm cũng tỏ ra là một chất đệm thấm lọc để giảm bớt sốc thẩm thấu, giúp đẩy nước ra khỏi tế bào. Người ta đã chứng minh được nồng độ sucrose cao (1mol/lít) thực sự không gây độc cho phôi và trứng (Kuleshova và cs., 1999) [37]. Trahelose đã được xem là chất bổ sung của chất bảo quản đông lạnh rất có hiệu quả (Begin và cs., 2003) [14]. Cả sucrose và trehalose ức chế màng tế bào bị biến đổi bởi nhiệt độ, ổn định độ bền của enzyme và màng tế bào. Trong một số trường hợp, trehalose còn là một chất bảo vệ tốt hơn cả sucrose. [11] Để đạt tỷ lệ đông lạnh cao, đòi hỏi sử dụng chất bảo quản đông lạnh nồng độ cao để làm giảm tinh thể đá. Kết quả là với nồng độ cao có thể dẫn đến sốc thẩm thấu và gây độc hóa học. Hai cách để làm giảm độc tính đến mức thấp nhất ở nồng độ cao: (i) Giảm bớt chất bảo quản đông lạnh, (ii) Tăng tốc độ làm lạnh và rã đông. [54] Trong thành phần môi trường thủy tinh hóa hiện nay, người ta thường sử dụng ethylene glycol và một chất bảo vệ đông lạnh khác cũng có khả năng thấm qua màng tế bào (thường là DMSO hoặc PrOH) kết hợp với sucrose. Sự kết hợp này vừa bảo đảm được khả năng thẩm thấu qua màng tế bào cao hơn so với khi chỉ sử dụng từng chất riêng lẻ, vừa giảm được độc tính của từng thành phần riêng lẻ tác động lên tế bào khi sử dụng chúng ở nồng độ cao. [60] 1.3.2.2. Dung dịch đệm và các đại phân tử Dung dịch chất bảo quản chứa nhiều hợp chất khác nhau có tác dụng bảo vệ tế bào trong suốt quá trình đông lạnh và rã đông. Chẳng hạn như những hợp chất gồm citrate, noãn hoàng trứng. Dung dịch bảo quản đông lạnh thường được tạo bằng cách thêm vào một lượng các hợp chất làm thành dung dịch sinh lý giống với môi trường cấy giao tử và phôi.  Dung dịch đệm
Dung dịch thủy tinh hóa là dung dịch chất bảo quản đông lạnh mà không bị đông đá khi làm lạnh đến nhiệt độ rất thấp với tốc độ làm lạnh cao. Vì vậy môi trường đệm cơ bản sử dụng cho thủy tinh hóa là đệm muối photphat hay đệm HEPES.  Các đại phân tử Các hợp chất đại phân tử được thêm vào dung dịch chất bảo quản đông lạnh: polyvinylpirrolidone (PVP) nhưng không thành công trong trong đông lạnh phôi và gây độc cao đối với phôi (Wilmut và Rowson, 1973). Polyethylene glycol (PEG) cũng được sử dụng như chất bổ sung (Rall và Fahy, 1985), hydroxyethyl starch (HES), Ficoll. Ngoài ra, còn có các protein lớn gồm albumin huyết thanh bò – Bovine Serum Albumin (BSA) hay huyết thanh bò mang thai – Fetal Bovine Serum (FBS). Một loại ít phổ biến khác là các protein giảm nhiệt – Thermal Hysteresis Proteins (THPs). [55, 66, 86] Trong tự nhiên những tế bào chứa hàm lượng protein cao sẽ hữu ích trong quá trình thủy tinh hóa. Thủy tinh hóa ngoại bào cần nồng độ chất bảo quản cao hơn nội bào. Việc thêm polymer có phân tử khối lớn: PVP, polyethylene glycol (PEG) hoặc Ficoll có khả năng đẩy mạnh thủy tinh hóa ngoại bào với nồng độ chất bảo quản đông lạnh giống như thủy tinh hóa nội bào. Hơn nữa, các polymer có thể tạo ra chất nền nhớt trong trứng (viscous matrix), ngăn cản sự hình thành tinh thể đá trong suốt quá trình đông lạnh và rã đông.Vì thế, các đại phân tử hoạt động như chất thay thế ngoại bào để làm tăng chất bảo quản đông lạnh bên ngoài, từ đó làm giảm độc cho tế bào. [55, 66] 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng trứng sau khi bảo quản bằng phương pháp thủy tinh hóa Quá trình đông lạnh gây ra nhiều tổn thương trong cấu trúc và chức năng của trứng. Trong đó, tổn thương lạnh và độc tính của các chất bảo quản là những bất lợi chính quyết định đến sự bảo quản trứng thành công. Do đó, để sống sau đông lạnh, trứng phải trải qua một chuỗi co và giãn nở thể tích. Trứng dễ bị tổn thương bởi quy trình đông lạnh: sự hình thành tinh thể đá, thẩm thấu khi loại bỏ chất bảo quản đông lạnh khỏi tế bào. Vì vậy, việc đông lạnh chúng là rất khó (Vincent và Johnson, 1992). Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp thủy tinh hóa tránh được sự hình thành đá nội bào (Intracellular Ice Formation_IIF) – ảnh hưởng đến khả năng sống của trứng sau rã đông - nhờ thay đổi thành phần nội bào từ pha lỏng sang pha rắn (Rall và Fahy, 1985; Vajta và Kuwayama, 2006). [66, 79, 81] Bên cạnh đó, phương pháp thủy tinh hóa dường như đe dọa đến sự sống sau đông lạnh do nồng độ chất bảo quản đông lạnh rất cao và yếu tố nhiệt độ thực hiện có thể gây độc cho tế bào (Hotamisligil và cs., 1996). Ngoài ra, chất lượng trứng sau thủy tinh hóa còn phụ thuộc các yếu tố như những biến đổi hình dạng, cấu trúc của trứng do quá trình đông lạnh và rã đông gây ra; đặc
điểm và giai đoạn phát triển của trứng thực hiện đông lạnh (Bernard A. và Fuller B.J., 1996). Kết quả của nhiều nghiên cứu về sự sống của trứng sau đông lạnh có thể bị tác động bởi trạng thái trưởng thành của chúng, chất lượng hay các yếu tố lý sinh trong quy trình đông lạnh đã sử dụng. Ví dụ, khi trưởng thành, chất lượng và kích thước trứng là đặc điểm quan trọng ảnh hưởng đến kết quả đông lạnh. [15, 29] Phương pháp thủy tinh hóa đã được áp dụng trên phương diện lâm sàng (Kuleshova và Lopata, 2002). Một vài điều cần lưu ý có thể dẫn tới tỷ lệ thành công thấp là chất lượng nitơ lỏng, thời gian thao tác, tốc độ đông lạnh, ảnh hưởng chất bảo quản đông lạnh…[37] 1.3.3.1. Biến đổi trong tế bào đông lạnh  Sự hình thành tinh thể đá Sự hình thành tinh thể nước đá trong và ngoài tế bào là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sức sống của tế bào trong đông lạnh. Tốc độ làm lạnh chính là yếu tố quyết định dạng tinh thể nước đá hình thành. Khi làm lạnh với tốc độ thích hợp thì tinh thể nước đá hình thành có dạng sáu cạnh, hình dạng của nó sẽ là hình cây thông không đồng dạng và hình cầu khi tốc độ làm lạnh được đẩy lên (Hình 2.4). [55, 60] Hình 1.4. Ảnh hưởng của tốc độ đông lạnh lên sự hình thành tinh thể đá Với tốc độ làm lạnh đạt đến 20.000 oC/giây, nước nguyên chất tạo băng vô định hình mà không có dạng tinh thể. Tuy nhiên, quá trình làm ấm trong giải đông sẽ xảy ra quá trình tái tạo tinh thể nước đá từ nhỏ đến lớn. Vì vậy, tốc độ nâng nhiệt chậm trong quá trình giải đông sẽ gây bất lợi cho tế bào. [55, 60]
Ở môi trường đẳng trương (áp lực thẩm thấu ở khoảng 300mOm/kg), tinh thể đá thường được hình thành ở nhiệt độ -5 đến -15oC. Tuy nhiên, tinh thể nước đá chỉ được hình thành ở nhiệt độ -10oC khi trong dung dịch có các phân tử chất rắn nhỏ. Nhiệt độ càng giảm thì tinh thể đá càng tăng. Tuy nhiên, ở nhiệt độ khoảng -130oC, tất cả các chất liệu trong dung dịch đều ở dạng hạt kết tinh hay dạng thủy tinh. Quá trình này gọi là sự kết tinh hay hiện tượng thủy tinh hóa (vitrification). Hiện tượng này xảy ra khi trong môi trường đông lạnh có các chất hòa tan cũng như các chất bảo quản có nhiệt độ đông đá thấp hơn bình thường. [55, 60]  Sự khử nước Sự khử nước của tế bào là rất cần thiết trong quá trình làm lạnh. Thông thường các tế bào sẽ có thể bị tổn thương ở nhiệt độ 15 đến -90oC. Một khi tế bào không được khử nước thì cấu trúc đá nội bào sẽ hình thành nếu nhiệt độ xuống dưới 0 oC. Tốc độ khử nước của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tính thấm nước của màng, năng lượng hoạt hóa của tính thấm và tỷ lệ diện tích bề mặt/thể tích tế bào (S/V). Những yếu tố này thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, vì vậy, chúng đóng vai trò quyết định trong xác định quá trình đông lạnh thích hợp nhất.  Độ pH của dung dịch Độ pH của dung dịch sẽ giảm theo nhiệt độ. Cân bằng acid – base của môi trường biến đổi theo hướng tăng lực ion, làm cho các phân tử protein hòa tan trong môi trường dễ bị kết tủa (salting out). Các chất bảo quản đông lạnh với bản chất hóa học của nó giữ vai trò quan trọng trong việc kiểm soát biến đổi acid – base của dung dịch. Glycerol và các glycol hoạt động như những base yếu, trong khi DMSO lại hoạt động như những base mạnh. Độ pH thích hợp nhất để duy trì hoạt động sinh lý của tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ mà tế bào được bảo quản. Người ta nhận thấy rằng, sự sống có thể tồn tại sau bảo quản ở các nhiệt độ xấp xỉ 0 oC với độ pH lớn hơn 9.  Sự hình thành bọt khí Trong quá trình bảo quản lạnh, tế bào bị tổn thương và có thể chết vì nhiều cách khác nhau do sự hình thành tinh thể đá. Thể tích nước bị đông lạnh sẽ tăng lên (tỷ trọng của nước đá thấp hơn tỷ trọng của nước) dẫn đến việc bọt khí có thể hình thành khi nhiệt độ giảm xuống. Kích thước của bọt khí thay đổi từ 25 – 100µm và tỷ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh, trong khi số lượng bọt khí tỷ lệ thuận với tốc độ làm lạnh. Bên cạnh các khí hòa tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy còn sử dụng CO2 làm đệm nhằm cân bằng acid – base. Khi làm lạnh thì các khí này không còn ở dạng hòa tan mà tách ra thành những bọt khí có khả năng gây tổn thương cho tế bào. Khi tiến hành giải đông, bọt khí có
thể được hình thành và có thể phát triển thành không bào rất lớn trong nội bào, làm tế bào phồng to quá mức và có thể bị phá hủy hoàn toàn. Sự tạo thành bọt khí xảy ra nhiều trong môi trường sử dụng đệm bicarbonate, vì vậy, sử dụng môi trường PBS có thể hạn chế số lượng bọt khí. [7, 9] 1.3.3.2. Tính an toàn khi đông lạnh trứng trưởng thành Nghiên cứu sử dụng trứng trưởng thành cho thấy khả năng sống của trứng sau đông lạnh và rã đông bị ảnh hưởng bởi một số các nhân tố. Giữa các nhân tố hình thái, sự có mặt hay vắng mặt các tế bào hạt cumulus trong suốt quá trình đông lạnh có thể tác động trực tiếp lên khả năng sống của trứng sau rã đông. Hơn nữa, tổn hại tế bào sau rã đông gần ngưỡng gây chết sẽ ảnh hưởng tới khả năng phát triển của chúng. Trứng trưởng thành không đồng nhất trong sự phân bố và tổ chức các bào quan trong bào tương có thể ảnh hưởng đến kết quả của quy trình đông lạnh. Trứng ở giai đoạn metaphase II dễ bị tổn thương lạnh do thoi vô sắc nơi nhiễm sắc thể bắt đầu xếp thẳng hàng rất nhạy cảm với nhiệt độ thấp. Làm lạnh trứng trong thời gian ngắn ở 20oC có thể gây ra sự phá vỡ không phục hồi bộ máy thoi vô sắc trong khi sự khử nước xảy ra nhanh chóng ở nhiệt độ thấp hơn 0 oC. Sự sắp xếp các vi sợi thoi vô sắc thích hợp là điều cần thiết để tách và sắp xếp đúng NST, vì vậy trứng đông lạnh càng tăng khả năng bị đa bội thể sau khi thể cực thứ 2 bị đẩy ra ngoài. Sự đứt gãy bộ xương tế bào dẫn tới bộ xương tế bào bất bình thường, giữ lại thể cực thứ hai, thay đổi cấu tạo và các bào quan. [64, 80] Các vi ống của trứng có thể bị tổn thương do chất bảo quản đông lạnh và sự thay đổi của nhiệt độ (Pickering và cs., 1990; Van Blerkom và Davis, 1994) [64, 80]. Trứng tiếp xúc với chất bảo quản đông lạnh và thay đổi nhiệt độ có thể gây ra sự khử polymer của tubulin cùng với trứng (Aman và Parks, 1994) [11]. Tổn thương thoi vô sắc giảm phân (meiotic spindle) có thể thay đổi vị trí nhiễm sắc thể và hậu quả là giới hạn khả năng thụ tinh của trứng (Eroglu và cs., 1998) [23]. Liên quan đến khả năng thụ tinh không chỉ do tổn thương thoi vô sắc mà còn do khả năng bất thường của nhiễm sắc thể (Aman và Parks, 1994) [11]. Hơn nữa, theo mô tả đầu tiên trên trứng chuột do tác giả Magistrini và Szöllösi (1980) [48], các vi ống và thoi vô sắc giảm phân của trứng của tất cả các loài động vật có vú không tập trung và không kết hợp khi trứng tiếp xúc với nhiệt độ gần 0oC trong khoảng vài phút (Parks và Ruffing, 1992; Vincent và Johnson, 1992) [61, 82]. Trứng cũng bị tổn thương khi tiếp xúc với các chất bảo quản đông lạnh khác nhau. Johnson và Pickering (1987) cho thấy trường hợp trứng tiếp xúc lâu với DMSO kết quả là không tập trung thoi sắc và nhiễm sắc thể bị phân tán [81]. Vincent và cs. (1990) cũng phát hiện ra DMSO có ảnh hưởng lên trứng. Tuy nhiên, họ đã kết luận tổn thương là do nhiệt độ, tại nhiệt độ nào đó chất bảo quản đông lạnh không thể thấm vào tế bào một cách nhanh chóng và vì vậy rất ít chất bảo quản đông lạnh trong tế bào [81]. Công bố của Shaw và Trounson (1989) cho rằng propylene glycol
gây ra hoạt hóa trinh sản (parthenogenetic) trên trứng chuột – là sự hoạt hóa nhân tạo phong tỏa trạng thái dừng ở giai đoạn metaphase II. Sự hoạt hóa này xảy ra do sự tăng nồng độ Ca2+ (mà hiện tượng này chỉ có khi tinh trùng xâm nhập vào trứng). Dòng Ca2+ tăng làm giải phóng các thể vỏ hạt của trứng, và trứng tiếp tục quá trình giảm phân để hình thành thể cực thứ 2. White và Yue (1996), Gook và cs (1995) cũng đã chứng minh trứng người cũng gặp phải hiện tượng trên sau rã đông. Xơ cứng màng trong hay hoạt hóa trứng gây ra bởi sự giải phóng các tế bào hạt vỏ này (Wolf và Hamada, 1977; Gulyas và Yuan, 1985). Các hạt vỏ được giải phóng ra ngoài thành bào tương trong suốt phản ứng màng trong suốt. Đây là phản ứng thông thường, xảy ra khi tinh trùng xâm nhập vào trứng để thụ tinh và ngăn hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng (Wassarman, 1988). Propylene glycol cũng được cho là nguyên nhân giải phóng hạt vỏ trước trưởng thành (Schalkoff và cs., 1989) và phá vỡ các vi sợi (Vincent và cs., 1992). [26, 69, 83, 84, 87] DMSO cũng tỏ ra là nguyên nhân gây xơ cứng màng trong suốt và giảm các hạt vỏ trong trứng chuột (Vincent và cs.,1990). Những nghiên cứu sau này cho thấy rằng trứng tiếp xúc với DMSO ở nhiệt độ 20 – 37oC phủ nhận tác động trên màng trong suốt, tỷ lệ thụ tinh và tổ thức thoi vô sắc. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng tự bản thân trứng gây ra xơ cứng màng trong suốt [82]. 1.4. Ứng dụng của đông lạnh trứng Đông lạnh trứng là một phương pháp dùng để lưu trữ các tế bào trứng trong thời gian dài và đang được quan tâm nhiều vì phương pháp này có nhiều ứng dụng ở cả người và động vật. 1.4.1. Ở người Đứa bé đầu tiên trên thế giới ra đời từ trứng đông lạnh được ghi nhận vào năm 1986. Cho đến năm 2004, thống kê cho thấy trên thế giới có khoảng 40 bé đông lạnh trứng ra đời và trên dưới 60 trường hợp thai đang tiến triển. Tỷ lệ thai lâm sàng từ các chu kỳ trứng đông lạnh hiện còn khá thấp và không ổn định. Người ta ước tính cần phải rã đông khoảng 100 trứng thì mới có một trường hợp mang thai thành công. Nguyên nhân của thành công thấp có thể là: (1) Cấu trúc di truyền đặc biệt của trứng, khi các nhiễm sắc thể đang trong giai đoạn phân chia và xếp trên mặt phẳng xích đạo; (2) Tổn thương của các cấu trúc nội bào do quá trình trữ lạnh-rã đông; (3) Trứng là một tế bào có kích lớn, với lượng nước bên trong chiếm khá nhiều [26]. Phương pháp đông lạnh trứng thường được sử dụng cho những trường hợp sau: Phụ nữ còn trẻ hoặc không có bạn tình mà trứng của họ có nguy cơ bị phá hủy nặng nề do chiếu xạ, hóa trị liệu; Lập ngân hàng trứng hỗ trợ cho các chương trình bệnh nhân không có noãn; Trong những trường hợp không có tinh trùng để thụ tinh cần lưu trữ trứng; Phụ nữ muốn trì hoãn tuổi sinh đẻ;
Tránh những rắc rối vể mặt luật pháp, tôn giáo của đông lạnh phôi đặc biệt ở những nước mà đông lạnh phôi không được phép thực hiện [90]. 1.4.2. Ở động vật Bảo quản giao tử cái (trứng) làm cơ sở cho các nghiên cứu, ứng dụng sâu hơn: Dùng cho các nghiên cứu về IVF để cải thiện hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm; Việc đông lạnh trứng giúp vận chuyển dễ dàng, hạn chế lây lan dịch bệnh; Thiết lập ngân hàng để lưu trữ nguồn di truyền của những động vật có nguy cơ tuyệt chủng hay quý hiếm; Trao đổi mua bán dễ dàng, đặc biệt là những loài có giá trị kinh tế cao [3, 6].
CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NỘI DUNG 1: ĐÔNG LẠNH TRỨNG HEO TRƯỞNG THÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 1 2.1.1. Thu nhận mẫu buồng trứng Chuẩn bị  Hấp vô trùng nước muối sinh lý (0,9%), nước cất, kéo, kẹp  Bổ sung penicillin (100IU/ml) và streptomycin (0,1mg/ml) vào nước muối sinh lý trước khi sử dụng, để trong bình giữ ấm khoảng 33 – 35oC. Tiến hành Dùng kéo thu nhận buồng trứng ở phía hai bên tử cung ngay khi heo vừa được mổ, rửa sạch cho vào nước muối sinh lý chuyển nhanh vể phòng thí nghiệm (PTN) trong khoảng 2-3 giờ. Tại PTN, chọn những buồng trứng có các nang nổi đều, kích thước trung bình khoảng 3- 6mm. Loại bỏ mỡ, rửa sạch máu bằng nước muối sinh lý đã bổ sung kháng sinh. Thực hiện thao tác thu trứng từ buồng trứng trong tủ thao tác 30 – 60 phút.