Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung thư

Chia sẻ: Minh Nguyet | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:81

Thêm vào BST

Báo xấu

106
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của đề tài là nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide có tính khả thi và tính kinh tế cao; nghiên cứu độc tính cấp và bán cấp của cyclophosphamide, kiểm nghiệm cyclophosphamide theo tiêu chuẩn Dược điểm Anh ; Nghiên cứu bào chế thuốc cyclophosphamide pha tiêm trên dây chuyền GMH, thuốc bào chế xong phải đạt tiêu chuẩn thuốc tiêm của Dược điển Anh BP 2001, Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung thư

viÖn ho¸ häc viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam 18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt - CÇu GiÊy - Hµ Néi B¸o c¸o tæng kÕt khoa häc kü thuËt ®Ò tµi: "nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide lµm thuèc ®iÒu trÞ ung th−" GS. TSKH. TrÇn V¨n Sung 6500 10/9/2007 Hµ Néi, 4 - 2006 B¶n quyÒn 2006 thuéc VHH - VAST §¬n xin sao chÐp toµn bé hoÆc tõng phÇn tµi liÖu nµy ph¶i göi ®Õn ViÖn tr−ëng VHH - VAST trõ tr−êng hîp sö dông cho môc ®Ých nghiªn cøu.
viÖn ho¸ häc viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam 18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt - CÇu GiÊy - Hµ Néi B¸o c¸o tæng kÕt khoa häc kü thuËt ®Ò tµi: "nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide lµm thuèc ®iÒu trÞ ung th−" GS. TSKH. TrÇn V¨n Sung Hµ Néi, 4 - 2006 B¶n th¶o viÕt xong 1/ 2006. Tµi liÖu nµy ®−îc chuÈn bÞ trªn c¬ së kÕt qu¶ thùc hiÖn §Ò tµi cÊp Nhµ n−íc, m· sè KC 10. 25
Danh s¸ch c¸n bé tham giathùc hiÖn ®Ò tµi Hä vµ tªn C¬ quan c«ng t¸c Chñ nhiÖm ®Ò tµi 1. GS.TSKH. TrÇn V¨n Sung ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH vµ CNVN C¸n bé tham gia nghiªn cøu 1. PGS. TS. NguyÔn H÷u §Þnh Khoa Ho¸ Tr−êng §HKHTN, §HQG Hµ Néi 2. ThS. NguyÔn ViÖt Th¾ng nt 3. ThS. TrÇn V¨n Léc ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH vµ CNVN 4. ThS. TrÇn V¨n ChiÕn nt 5. ThS. TrÇn §øc Qu©n nt 6. CN. Ph¹m ThÞ Ninh nt 7. TS. TrÞnh ThÞ Thuû nt 8. TS. NguyÔn ThÞ Hoµng Anh nt 9. TS. NguyÔn Thanh §¹m BÖnh ViÖn K Hµ Néi 10. ThS. NguyÔn TuyÕt Mai nt 11. DS. Lª TiÕn Dòng XN D−îc phÈm TW I 12. TS. Phïng ThÞ Vinh ViÖn KiÓm nghiÖm
Môc lôc Tr 1. Bµi tãm t¾t 1 2. PhÇn chÝnh b¸o c¸o 3 2.1. PhÇn tæng quan 3 2.1.1. Cyclophosphamide 3 2.1.1.1. C¬ chÕ t¸c dông cña cyclophosphamide 3 2.1.1.2. Tæng hîp cyclophosphamide 5 2.1.1.3. Tiªu chuÈn cña cyclophosphamide ®−îc m« t¶ trong c¸c D−îc 9 ®iÓn 2.1.1.4. T×nh h×nh nghiªn cøu, sö dông cyclophosphamide t¹i ViÖt 11 Nam 2.1.1.5. C¸c d¹ng s¶n phÈm chÝnh cña cyclophosphamide vµ nhu cÇu 13 vÒ thuèc cyclophosphamide 2.1.2. TrÝch dÉn néi dung thuyÕt minh cña §Ò tµi 14 2.2. C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu cña §Ò tµi 19 2.2.1. Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide 19 Quy tr×nh tinh chÕ s¶n phÈm cyclophosphamide 28 2.2.2. Nghiªn cøu kh¼ng ®Þnh cÊu tróc ho¸ häc cña s¶n phÈm 29 cyclophosphamide tæng hîp ®−îc 2.2.3. KiÓm nghiÖm s¶n phÈm cyclophosphamide theo tiªu chuÈn 32 D−îc ®iÓn Anh, BP 2001 2.2.4. Nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ b¸n cÊp cña s¶n phÈm 33 cyclophosphamide 2.2.5. Nghiªn cøu bµo chÕ thuèc cyclophosphamide pha tiªm 36 2.2.6. Nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng thuèc cyclophosphamide pha 39 tiªm 2.2.6.1. §Ò c−¬ng nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng 39 2.2.6.2. KÕt qu¶ nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng 42 2.2.7. Nghiªn cøu ®é bÒn cña cyclophosphamide 48 2.2.7.1. Nghiªn cøu ®é bÒn cña nguyªn liÖu cyclophosphamide 48 Nghiªn cøu ®é bÒn cña cyclophosphamide ë trong dung dÞch 2.2.7.2. 49 n−íc 2.2.8. C¸c kÕt qu¶ kh¸c 50
3. KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ 51 B¸o c¸o quyÕt to¸n tµi chÝnh Lêi c¶m ¬n Tµi liÖu tham kh¶o 55
1. Bµi tãm t¾t 1.1. §Æt vÊn ®Ò HiÖn nay ViÖt Nam vÉn ph¶i nhËp khÈu mét l−îng lín thuèc cyclophosphamide ®Ó ®iÒu trÞ ung th− vµ mét sè bÖnh kh¸c cã nguyªn nh©n tù miÔn. Theo dù tÝnh, hµng n¨m sè tiÒn ®Ó nhËp khÈu cyclophosphamide riªng cho nhu cÇu ch÷a bÖnh ung th− lµ kho¶ng 26 tØ ®ång. §Ò tµi "Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide lµm thuèc ®iÒu trÞ ung th−" cã m· sè KC 10.25 ®Æt ra c¸c môc ®Ých sau ®©y: • Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide cã tÝnh kh¶ thi, vµ tÝnh kinh tÕ cao. • Nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ b¸n cÊp cña cyclophosphamide; KiÓm nghiÖm cyclophosphamide theo tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh BP 2001. • Nghiªn cøu bµo chÕ thuèc cyclophosphamide pha tiªm trªn d©y chuyÒn GMP. Thuèc bµo chÕ xong ph¶i ®¹t tiªu chuÈn thuèc tiªm cña D−îc ®iÓn Anh BP 2001. • Nghiªn cøu ®¸nh gi¸ l©m sµng giai ®o¹n I thuèc cyclophosphamide tæng hîp ®−îc trªn bÖnh nh©n ung th−. 1.2. Nguyªn liÖu vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu: 1.2.1. Nguyªn liÖu: C¸c ho¸ chÊt ®−îc sö dông cã ®é tinh khiÕt P. A. cña h·ng Merck, CHLB §øc. 1.2.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu: • C¸c ph−¬ng ph¸p dïng ®Ó ph©n tÝch cÊu tróc cña cyclophosphamide tæng hîp ®−îc lµ hiÖn ®¹i vµ phï hîp nh− phæ MS, LC/MS, IR vµ NMR (1H -, 13C - NMR) ®−îc thùc hiÖn t¹i ViÖn Ho¸ häc, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam. • C¸c ph−¬ng ph¸p tæng hîp ®−îc dùa theo patent cña §øc, Liªn minh Ch©u ¢u, Mü cã kÕt hîp víi c¸c tµi liÖu tham kh¶o kh¸c, ®−îc thùc hiÖn t¹i tr−êng §HKHTN - §HQG Hµ Néi vµ ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH vµ CNVN. 1
• C¸c ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu vÒ y d−îc ®−îc sö dông lµ nh÷ng ph−¬ng ph¸p quy chuÈn cña Bé Y tÕ, ®−îc thùc hiÖn t¹i c¸c c¬ quan khoa häc do Bé Y tÕ chØ ®Þnh nh− ViÖn KiÓm nghiÖm, xÝ nghiÖp D−îc phÈm TW I vµ bÖnh viÖn K Hµ Néi. 1.3. C¸c kÕt qu¶ ®· ®¹t ®−îc: • §· tiÕn hµnh nghiªn cøu vµ ®Ò ra ®−îc quy tr×nh kh¶ thi cã hiÖu qu¶ kinh tÕ vµ øng dông quy tr×nh nµy ®Ó tæng hîp 4250 gam cyclophosphamide. • §· ®−a ra ®−îc bé phæ chuÈn cña cyclophosphamide tæng hîp ®−îc gåm: IR, MS, LC/ MS, 1H -, 13C - NMR. • S¶n phÈm cyclophosphamide tæng hîp ra ®· ®−îc nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ ®éc tÝnh b¸n cÊp, ®−îc ph©n tÝch, kiÓm nghiÖm theo tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh BP 2001. TÊt c¶ c¸c tiªu chÝ ®Òu ®¹t. • Cyclophosphamide ®· ®−îc bµo chÕ thµnh thuèc bét pha tiªm trªn d©y chuyÒn GMP cña xÝ nghiÖp D−îc phÈm TW I. Thuèc vµ n−íc cÊt pha tiªm ®¹t tiªu chuÈn BP 2001. • Thuèc cyclophosphamide ®· ®−îc nghiªn cøu l©m sµng giai ®o¹n I ®èi víi bÖnh nh©n ung th− t×nh nguyÖn t¹i bÖnh viÖn K Hµ Néi. KÕt qu¶: Víi liÒu 750 mg/ m2 da c¬ thÓ c¸c bÖnh nh©n ®Òu cã ®¸p øng mét phÇn. LiÒu 750 mg/ m2 da c¬ thÓ lµ liÒu sö dông an toµn. 1.4. KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ • §Ò tµi ®· hoµn thµnh tèt c¸c môc tiªu ®· ®Ò ra vµ theo ®óng tiÕn ®é. • Thanh quyÕt to¸n tµi chÝnh theo ®óng dù to¸n vµ quy ®Þnh cña nhµ n−íc. • §Ò nghÞ Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ xem xÐt phª duyÖt giai ®o¹n tiÕp theo cña §Ò tµi ®Ó nghiªn cøu l©m sµng giai ®o¹n II vµ III nh»m ®¸nh gi¸ hiÖu qu¶ chèng ung th− cña thuèc vµ ®−a ra s¶n xuÊt, ®¸p øng nhu cÇu trong n−íc, thay thÕ thuèc nhËp khÈu. 2
2. PhÇn chÝnh b¸o c¸o 2.1. PhÇn tæng quan 2.1.1. Cyclophosphamide Cyclophosphamide cã tªn khoa häc lµ (RS)-2-[bis(2-chloroethyl) amino] tetrahydro-2H-1,3,2-oxazo phosphorine 2-oxide hoÆc N,N-bis-[2-chloroethyl] N,O- trimethylendiamidophosphat (I); c«ng thøc tæng lµ C7H15Cl2N2O2P. H2O, khèi l−îng ph©n tö lµ 279,1. C«ng thøc cÊu t¹o lµ: Cl H2C O O N P . H2O Cl H2C HN I Tinh thÓ cyclophosphamide cã mµu tr¾ng hoÆc gÇn tr¾ng, tan trong n−íc, rÊt dÔ tan trong cån, tan võa ph¶i trong ete. 2.1.1.1. C¬ chÕ t¸c dông cña cyclophosphamide Cyclophosphamide ®−îc sö dông nhiÒu trong l©m sµng víi mét phæ t¸c dông réng vµ hiÖu qu¶ ®èi víi c¸c bÖnh ung th− ë ng−êi. Ngoµi lý do vÒ t¸c dông ®iÒu trÞ, cyclophosphamide cßn cã c¬ chÕ t¸c dông rÊt ®éc ®¸o vµ tÝnh chän läc trong ®iÒu trÞ. HiÖn nay cyclophosphamide lµ lo¹i thuèc chèng ung th− ®−îc sö dông nhiÒu nhÊt trong ®iÒu trÞ ho¸ chÊt liÒu cao víi tæng liÒu l−îng dïng lµ 500 -700mg/m2 da ng−êi trong 1 ®Õn 4 ngµy. Lµ mét lo¹i ho¹t chÊt dÔ mÊt nit¬, cyclophosphamide ®ãng vai trß ankyl ho¸ ADN lµm cho ADN kh«ng th¸o rêi ®−îc, do vËy kh«ng t¹o thµnh ARN do ®ã dÉn tíi viÖc t¸i s¶n xuÊt tÕ bµo bÞ k×m h·m, tr−íc hÕt lµ ®èi víi 3
c¸c hÖ tÕ bµo ph¸t triÓn nhanh nh− c¸c tuyÕn tiÕt, da, tuû x−¬ng vµ ®Æc biÖt lµ c¸c u ¸c tÝnh [1,2]. C¸c hîp chÊt cã tÝnh ankyl ho¸ sÏ tÊn c«ng vµo qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt cña a xÝt nucleic vµ k×m h·m sù ph¸t triÓn hoÆc tiªu diÖt nh÷ng tÕ bµo bÞ bÖnh. Tuy nhiªn, chóng còng tÊn c«ng c¶ tÕ bµo lµnh vµ ë liÒu hiÖu dông chóng còng cã ®éc tÝnh ®¸ng kÓ. Theo t¸c gi¶ Charlotte le Roux vµ céng sù th× c¬ chÕ alkyl ho¸ cña cyclophosphamide ®−îc lý gi¶i nh− sau [6]: O O HO O O -H + O P CH 2 Cl P CH2 CH2 Cl P + CH2 CH2 Cl H 2N N +H NH N H 2N N CH 2 Cl CH2 CH2 Cl CH2 CH2 Cl Cyclophosphamide (I) (A) - - Cl O O O O O O O P + Nu - - Cl - P - O CH2 CH2 Nu P CH2 CH2 Nu + Nu P H 2N N H 2N N H 2N N CH2 CH2 Nu CH2 CH2 Cl H 2N N CH 2 CH2 Nu CH2 CH 2 Cl (B) Trong c¬ thÓ cyclophosphamide gi¶i phãng ra chÊt phosphoramidat (A) mét t¸c nh©n alkyl ho¸ cã ho¹t tÝnh sinh häc. Ho¹t tÝnh sinh häc cña chÊt (A) ®−îc gi¶i thÝch qua d·y ph¶n øng bao gåm: ®ãng vßng néi ph©n tö; më vßng nucleophil. Qu¸ tr×nh nµy lÆp l¹i hai lÇn dÉn ®Õn s¶n phÈm cuèi cïng ®−îc alkyl ho¸ hai lÇn (B). Tuy nhiªn, c¬ chÕ chÝnh x¸c cña qu¸ tr×nh alkyl ho¸ cña chÊt (A) vÉn lµ vÊn ®Ò cßn Ýt ®−îc biÕt. C¸c b−íc theo tr×nh tù trªn bao gåm c¸c chÊt azinidin trung gian ®· ®−îc minh chøng b»ng c¸c thÝ nghiÖm ®¬tªr« ho¸. Nh−ng liÖu chÊt (A) sÏ tham gia ph¶n øng alkyl ho¸ nguyªn vÑn hay liªn kÕt P-N sÏ bÞ c¾t tr−íc khi alkyl ho¸ th× hiÖn vÉn cßn tranh c·i [6]. Theo nguyªn lý vÒ ''d¹ng vËn chuyÓn" (transport) vµ '' d¹ng ho¹t tÝnh '' (active form) cña mét biÖt d−îc ®èi víi c¸c chÊt cã t¸c dông ankyl ho¸ th× mét ho¹t chÊt cÇn ®−îc ®−a vµo c¬ thÓ ë ''d¹ng vËn chuyÓn'' tøc lµ ë d¹ng ch−a cã ho¹t tÝnh. D¹ng nµy sÏ chuyÓn thµnh ''d¹ng ho¹t tÝnh'' trong c¬ thÓ vµ nÕu cã thÓ th× ngay t¹i vÞ trÝ 4
cÇn ®iÒu trÞ cã nghÜa lµ lµm t¨ng ®é chän läc cña thuèc. VÝ dô: §èi víi c¸c chÊt dÔ bÞ lo¹i nit¬ th× hîp chÊt chøa nhãm oxit nit¬ (N→O) lµ mét '' d¹ng vËn chuyÓn'' thùc thô. Nguyªn lý nµy ®· ®−îc ¸p dông víi lo¹i thuèc ch÷a ung th− tiÒn liÖt tuyÕn lµ stilbeoestroldiphosphate. Nh− ®· biÕt th× trong c¬ thÓ ng−êi bÖnh, t¹i bé phËn bÞ ung th− cã tån t¹i mét enzym d¹ng phosphamidasa vµ phosphatasa cã thÓ thuû ph©n ®−îc liªn kÕt phosphamide vµ este cña axit phosphoric. Víi ý t−ëng lµ: ®é chän läc cña thuèc sÏ t¨ng ®¸ng kÓ, nÕu ''d¹ng ho¹t tÝnh'' ®−îc t¹o thµnh trùc tiÕp t¹i vÞ trÝ cÇn ®iÒu trÞ, ng−êi ta ®· tæng hîp ra chÊt phosphamide este II ®Ó nghiªn cøu ®éng d−îc häc cña cyclophosphamide. Cl H2C NH R1 N P O Cl H2C O R2 II 2.1.1.2. Tæng hîp cyclophosphamide Cyclophosphamide ®· ®−îc Arnold, Bourseaux vµ Hirsch [3,4] t×m ra lÇn ®Çu tiªn n¨m 1956 trong phßng nghiªn cøu cña nhµ m¸y Asta víi ký hiÖu lµ B518. ViÖc tæng hîp ra chÊt nµy lµ kÕt qu¶ cña sù mong muèn ¸p dông nguyªn lý ''d¹ng vËn chuyÓn" vµ '' d¹ng ho¹t tÝnh ''. Cyclophosphamide ®−îc sö dông trong ®iÒu trÞ ung th− tõ n¨m 1958 hoÆc 1970 [1]. Ngoµi ra, cyclophosphamide cßn ®−îc sö dông nh− mét chÊt øc chÕ miÔn dÞch ®Ó ®iÒu trÞ c¸c bÖnh tù miÔn nh− nh−îc c¬, thÊp khíp, lupót ban ®á vµ ®Æc biÖt ®Ó chèng th¶i ghÐp trong c¸c ca ghÐp t¹ng [19, 24, 25]. Arnold, Bourseaux vµ Brock [7] ®· nghiªn cøu mèi quan hÖ gi÷a cÊu tróc vµ ho¹t tÝnh kh¸ng ung th− cña hîp chÊt nµy. KÕt qu¶ thu ®−îc ë chÊt cyclophosphamide lµ rÊt kh¶ quan vÒ mÆt d−îc lý vµ l©m sµng [4]. C¬ chÕ biÕn ®æi cña cyclophosphamide trong c¬ thÓ ®· ®−îc C.L. Roux vµ céng sù tiÕp tôc nghiªn cøu [6]. 5
Mét dÉn xuÊt kh¸c cña cyclophosphamide cã nhãm thÕ ë m¹ch vßng còng ®· ®−îc tæng hîp ®Ó nghiªn cøu ho¹t tÝnh chèng ung th− [7, 8, 25]. Cyclophosphamide cßn ®−îc sö dông lµm ®éc tè cho s¬n chèng hµ dïng cho c¸c tµu biÓn [9]. Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, tÝnh chÊt d−îc lý cña cyclophosphamide vÉn cßn ®−îc tiÕp tôc nghiªn cøu [10,11,12]. KÓ tõ khi t×m ra cyclophosphamide vµo n¨m 1956 vµ b¶n quyÒn s¸ng chÕ (patent) ®Çu tiªn ®−îc chÊp nhËn vµo n¨m 1957 [26] cho ®Õn nay vÉn lu«n cã c¸c b¶n quyÒn s¸ng chÕ míi vÒ tæng hîp cyclophosphamide ®−îc ®¨ng ký. B¶n quyÒn s¸ng chÕ gÇn ®©y nhÊt mµ chóng t«i cã ®−îc lµ cña Ulf Niemeyer vµ céng sù vµo cuèi n¨m 2001 [28]. Nh×n chung c¸c patent vÒ tæng hîp cyclophosphamide ®Òu dùa theo s¬ ®å nh− sau: O OH O R1 R1 P N R4 Triethylamin HN Y + + POCl3 R2 R2 N Y dung m«i N R3 R3 1 2 3 víi R1 vµ R2 lµ chloroethyl, R3 vµ R4 lµ H. Ng−êi ta th−êng ¸p dông gi¶i ph¸p kü thuËt tiªn tiÕn ®−îc gäi lµ "ph¶n øng hai b−íc trong cïng mét nåi ph¶n øng" (two- stage one-pot reaction). Lîi thÕ cña gi¶i ph¸p kü thuËt nµy lµ: − HiÖu suÊt tæng cña ph¶n øng cao − Kh«ng ph¶i t¸ch s¶n phÈm trung gian − Chi phÝ cho thiÕt bÞ ph¶n øng thÊp − Gi¶m thêi gian s¶n xuÊt − Tiªu thô Ýt nguyªn liÖu ®Çu − Kh«ng ph¶i ch¹y s¾c ký hoÆc c¸c b−íc tinh chÕ kh¸c − Gi¶m l−îng chÊt th¶i g©y ®éc h¹i tíi m«i tr−êng §Ó thùc hiÖn kü thuËt nµy, ng−êi ta cho phosphoryl halogenid vµ hai chÊt amin lµ bis 2- chloroethyl amin vµ n- propylamin- 3- ol t¸c dông víi nhau trong mét dung m«i h÷u c¬ tr¬ víi mét chÊt kiÒm hç trî, tr¸nh sù cã mÆt cña n−íc vµ alcol, 6
kh«ng cÇn t¸ch c¸c s¶n phÈm trung gian. C¸c t¸c nh©n ®−îc cho lÇn l−ît vµo b×nh ph¶n øng. §iÒu ®Æc biÖt quan träng ë ®©y lµ h¹n chÕ tèi ®a ¶nh h−ëng cña n−íc hoÆc h¬i Èm ®èi víi c¸c t¸c nh©n, ®Æc biÖt lµ POCl3. NÕu cã mÆt n−íc trong m«i tr−êng ph¶n øng th× sÏ cã nhiÒu s¶n phÈm phô vµ hiÖu suÊt thu ®−îc cyclophosphamide bÞ gi¶m nhanh chãng. Vµ nh− vËy s¶n phÈm chØ kÕt tinh ®−îc sau khi ph¶i cã thªm b−íc tinh chÕ vÝ dô ch¹y s¾c ký cét. Nh÷ng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide tr−íc n¨m 2001 ch−a ®¸nh gi¸ ®−îc hÕt møc ®é ¶nh h−ëng cña n−íc ®èi víi ph¶n øng nµy. Ngoµi n−íc ra, th× c¸c alcol còng kh«ng ®−îc cã mÆt trong m«i tr−êng ph¶n øng. Ng−êi ta ®· chøng minh ®−îc r»ng: sù cã mÆt l−îng vÕt methanol hoÆc ethanol trong dung m«i sÏ t¹o ra nhiÒu ph¶n øng phô vµ lµm gi¶m hiÖu suÊt. Ph¶n øng ®−îc thùc hiÖn trong mét dung m«i hoÆc mét hçn hîp dung m«i h÷u c¬ tr¬. Cã thÓ sö dông c¸c dung m«i nh−: dichlorometan, 1,2- dichloroetan, chloroform, dioxan, acetonitril, tetrahydrofuran vµ toluen. Nång ®é cña hçn hîp ph¶n øng, tøc lµ tû lÖ gi÷a c¸c chÊt 1, 2, 3, víi thÓ tÝch dung m«i cã thÓ dao ®éng tõ 0,1 ®Õn 6 mol/ lit. C¸c amin 1 vµ 2 ®−îc sö dông theo tû lÖ mol t−¬ng ®−¬ng nhau. NÕu amin 2 Ýt h¬n amin 1 5% hoÆc nhiÒu h¬n 20% còng kh«ng cã vÊn ®Ò g×. ChÊt kiÒm hç trî (®Ó kÐo axit ra khái hçn hîp ph¶n øng) cã thÓ lµ triethylamin, pyridin, hoÆc natri cacbonat. Nh×n chung, tû lÖ mol gi÷a c¸c amin víi chÊt kiÒm lµ t−¬ng ®−¬ng nhau. VÝ dô: NÕu amin 2 (n- propylamin- 3- ol) tham gia ph¶n øng ë d¹ng muèi th× cÇn hai ®−¬ng l−îng chÊt kiÒm hç trî, cßn nÕu nã ë d¹ng kiÒm tù do th× chØ cÇn mét ®−¬ng l−îng chÊt kiÒm hç trî lµ ®ñ. Ph¶n øng ng−ng tô cña POCl3 víi amin lµ ph¶n øng to¶ nhiÖt. §Ó kiÓm so¸t ®−îc nhiÖt ®é ph¶n øng ta ph¶i cho c¸c t¸c nh©n vµo tõ tõ vµ ph¶i lµm l¹nh hçn hîp 7
ph¶n øng. Cã nhiÒu c¸ch kh¸c nhau khi cho c¸c t¸c nh©n vµo b×nh ph¶n øng ®−îc m« t¶ trong c¸c b¶n quyÒn s¸ng chÕ. VÝ dô: Cã thÓ nhá giät tõ tõ POCl3 vµo mét amin ë d¹ng kiÒm tù do; hoÆc chÊt kiÒm hç trî nh− triethylamin ®−îc cho tõ tõ vµo hçn hîp gåm POCl3 vµ mét amin ë d¹ng muèi. ë giai ®o¹n ®Çu cña ph¶n øng nhiÖt ®é nh×n chung ®−îc gi÷ trong kho¶ng tõ - 40 oC ®Õn 20 oC, trong nhiÒu tr−êng hîp ng−êi ta gi÷ ph¶n øng ë nhiÖt ®é gi÷a - 20 oC ®Õn ± 10 oC. NhiÖt ®é cã thÓ t¨ng tíi 100 oC sau khi ®· ph¶n øng ®−îc mét nöa, hoÆc t¨ng ®Õn nhiÖt ®é s«i cña dung m«i nÕu cÇn thiÕt b»ng c¸ch ®un nãng. Trong mét tr−êng hîp kh¸c ng−êi ta còng cã thÓ tiÕn hµnh nh− sau: • B−íc mét: Cho chÊt bis- 2- chloroethylamin vµo b×nh, sau ®ã cho tõ tõ n- propylamin- 3- ol cïng víi chÊt kiÒm hç trî (vÝ dô: triethylamin) vµo b×nh. ChÊt n- propylamin- 3- ol cã thÓ ®−a vµo b×nh ph¶n øng ë d¹ng muèi vµ trong dung m«i; chÊt bis- 2- chloroethylamin vµ kiÒm hç trî sÏ lÇn l−ît ®−îc ®−a tõ tõ vµo b×nh, hoÆc còng cã thÓ ®−îc cho ch¶y cïng mét lóc vµo b×nh tõ hai ng¶ sao cho chÊt kiÒm hç trî lu«n lu«n d− so víi bis- 2- chloroethylamin. • B−íc hai: POCl3 cã thÓ ®−îc cho tõ tõ cïng víi chÊt kiÒm hç trî vµo hçn hîp ph¶n øng cña b−íc mét, hoÆc ng−îc l¹i, hçn hîp cña b−íc mét ®−îc cho tõ tõ vµo dung dÞch POCl3 vµ chÊt kiÒm hç trî. Nh»m gi¶m thiÓu tèi ®a l−îng n−íc trong hçn hîp ph¶n øng th× tÊt c¶ c¸c ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ ph¶n øng ®Òu ph¶i kh« tuyÖt ®èi. VÝ dô: ph¶i sÊy nãng thiÕt bÞ ph¶n øng ®Ó lo¹i h¬i n−íc, lµm khan dung m«i vµ c¸c t¸c nh©n tr−íc lóc ph¶n øng. POCl3 ph¶i cÊt l¹i trong ®iÒu kiÖn kh« tr−íc khi dïng. Hµm l−îng n−íc tr−íc lóc ph¶n øng kh«ng ®−îc v−ît qu¸ 0,5%, tèt h¬n c¶ lµ trong kho¶ng tõ 0,001% ®Õn 0,1%. C¸c s¶n phÈm phô sÏ ®−îc h¹n chÕ nÕu hçn hîp ph¶n øng ®−îc xö lý víi c¸c chÊt phô gia tr−íc khi ph¶n øng. C¸c chÊt phô gia nµy cã thÓ lµ: R©y ph©n tö; oxit nh«m ë c¸c d¹ng kh¸c nhau, chlorua canxi (d¹ng khan hoÆc ngËm n−íc), P2O5 vµ 8
MgCl2. L−îng chÊt phô gia nh×n chung dao ®éng trong kho¶ng 5 ®Õn 150 gam/ mol chÊt bis- 2- chlor ethylamin. Hçn hîp ph¶n øng cã thÓ ë d¹ng dung dÞch hoÆc huyÒn 1 phï vµ th−êng ®−îc khuÊy tõ cho ®Õn 3 giê tr−íc lóc ph¶n øng ng−ng tô ®−îc 2 b¾t ®Çu b»ng viÖc cho thªm chÊt kiÒm hç trî hoÆc POCl3 vµo b×nh. Sau khi ph©n tö chlor thø nhÊt hoÆc thø hai cña POCl3 ®· ph¶n øng, ng−êi ta cã thÓ läc t¸ch muèi t¹o thµnh hoÆc röa hçn hîp ph¶n øng, sau ®ã cho ph¶n øng tiÕp tôc b»ng c¸ch bæ sung thªm amin vµ chÊt kiÒm hç trî. Xö lý hçn hîp ph¶n øng sau khi ph¶n øng kÕt thóc ®−îc b¾t ®Çu b»ng viÖc läc t¸ch muèi, hoÆc/ vµ röa víi n−íc ë c¸c ®é pH kh¸c nhau. CÇn chó ý tr¸nh sù thuû ph©n hoÆc tan vµo n−íc cña s¶n phÈm b»ng c¸ch cho thêi gian tiÕp xóc víi pha n−íc ng¾n vµ lµm l¹nh hçn hîp. Cã thÓ xö lý hçn hîp ph¶n øng theo ph−¬ng ph¸p khan, nghÜa lµ trung hoµ hçn hîp ph¶n øng b»ng khÝ HCl cho tíi pH = 4 - 6. Ngoµi ra, sö dông c¸c axit yÕu nh− axit acetic, axit oxalic còng ®em l¹i kÕt qu¶. 2.1.1.3. Tiªu chuÈn cña cyclophosphamide ®−îc m« t¶ trong c¸c D−îc ®iÓn • Trong D−îc ®iÓn ViÖt Nam, lÇn xuÊt b¶n thø 3, Nhµ xuÊt b¶n Y häc, n¨m 2002 chóng t«i kh«ng thÊy cã cyclophosphamide. • Trong D−îc ®iÓn Anh BP 2001 trang 510, nh÷ng tiªu chuÈn chÝnh cña cyclophosphamide ®−îc m« t¶ nh− sau: − Cyclophosphamide cã hµm l−îng kh«ng d−íi 98,0% vµ kh«ng qu¸ ®−¬ng l−îng cña 102,0% (RS)- 2- [bis (2- chloroethyl) amino] tetrahydro- 2H- 1, 3, 2- oxaphosphorin- 2- oxit tÝnh theo chÊt khan. − Lµ bét tinh thÓ mµu tr¾ng hoÆc gÇn tr¾ng, tan trong n−íc, tan hoµn toµn trong cån, tan Ýt trong ete. − §iÓm nãng ch¶y 51 oC. Chªnh lÖch ®iÓm nãng ch¶y kh«ng ®−îc qu¸ 2 o C. 9
− pH: Dung dÞch cña 0,50 gam cyclophosphamide trong 25 ml n−íc ®· khö CO2 sÏ cã pH tõ 4,0 ®Õn 6,0, ®o ngay sau khi pha. − Cl- (chlorid): Hoµ tan 0,15 gam cyclophosphamide trong 15 ml n−íc ®· khö CO2. Hµm l−îng ion Cl- cña dung dÞch võa pha chÕ kh«ng ®−îc v−ît qu¸ 330 ppm. − PO43- (phosphat): Hoµ tan 0,10 gam cyclophosphamide trong 100 ml n−íc ®· khö CO2. Hµm l−îng ion phosphat cña dung dÞch kh«ng ®−îc v−ît qu¸ 100 ppm. − Kim lo¹i nÆng: Kh«ng ®−îc qu¸ 20 ppm tÝnh theo ch×. − N−íc: Tõ 6,0 ®Õn 7,0% x¸c ®Þnh víi l−îng 0,300 gam cyclophosphamide theo ph−¬ng ph¸p b¸n vi l−îng. • D−îc ®iÓn ch©u ¢u (EP 1997) trang 697: còng ®−a ra c¸c ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh vµ c¸c tiªu chuÈn cña cyclophosphamide t−¬ng tù nh− D−îc ®iÓn Anh BP 2001. • D−îc ®iÓn Mü (USP 25) trang 491 n¨m 2002: − Cyclophosphamide cã hµm l−îng kh«ng d−íi 97,0% vµ kh«ng nhiÒu qu¸ 103,0% tÝnh theo s¶n phÈm khan. − L−u ý: RÊt thËn träng khi lµm viÖc víi cyclophosphamide v× ®ã lµ chÊt g©y ®éc tÕ bµo m¹nh. − §ãng gãi vµ b¶o qu¶n: B¶o qu¶n trong thïng kÝn, ë nhiÖt ®é trong kho¶ng tõ 2 oC ®Õn 30 oC. − pH: n»m gi÷a 3,9 vµ 7,1 trong mét dung dÞch (1 trong 100), ®o 30' sau khi pha. − N−íc: Tõ 5,7 ®Õn 6,8%. 10
− Kim lo¹i nÆng: Hoµ tan 1,0 gam cyclophosphamide trong 25 ml n−íc, nÕu cÇn thiÕt th× läc l¹i dung dÞch. Hµm l−îng kim lo¹i nÆng kh«ng ®−îc v−ît qu¸ 0,002%. • D−îc ®iÓn NhËt B¶n JP XIII trang 314: − Cyclophosphamide cã hµm l−îng kh«ng d−íi 97,0% − Tinh thÓ tr¾ng hoÆc bét tinh thÓ. − Tan rÊt tèt trong axit acetic b¨ng, tan hoµn toµn trong cån, trong anhydrit acetic vµ trong CHCl3, tan trong n−íc vµ ete. − §iÓm nãng ch¶y 45 oC - 53 oC. − Mµu s¾c dung dÞch: Hoµ tan 0,20 gam cyclophosphamide trong 10 ml n−íc, dung dÞch ph¶i trong suèt vµ kh«ng mµu. − Cl-: KiÓm tra víi dung dÞch cña 0,40 gam cyclophosphamide ë nhiÖt ®é kh«ng qu¸ 20 oC. Dung dÞch chuÈn lµ: 0,40 ml 0,01 mol/ lit axit HCl. Hµm l−îng ion Cl- kh«ng qu¸ 0,036%. − Kim lo¹i nÆng: KiÓm tra víi 1,0 gam cyclophosphamide. Dung dÞch so s¸nh ®−îc pha víi 2,0 ml dung dÞch ch× tiªu chuÈn. Hµm l−îng kim lo¹i nÆng kh«ng qu¸ 20 ppm. − N−íc: Tõ 5,7 ®Õn 7,0% (0,5 gam, chuÈn ®é trùc tiÕp). − §ãng thïng vµ b¶o qu¶n: Thïng kÝn, b¶o qu¶n ë d−íi 30 oC. 2.1.1.4. T×nh h×nh nghiªn cøu, sö dông cyclophosphamide t¹i ViÖt Nam Khoa Ho¸ häc tr−êng §¹i häc Tæng hîp Hµ Néi ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu c¸c ph−¬ng ph¸p ®iÒu chÕ vµ c¬ chÕ t¸c dông cña c¸c hîp chÊt c¬ phèt pho nh»m phôc vô n«ng nghiÖp vµ y tÕ [13-15]. Cyclophosphamide ®· qua b−íc nghiªn cøu c¬ b¶n trong ®Ò tµi ''Tæng hîp mét sè hîp chÊt c¬ kim cã ho¹t tÝnh sinh lý m¹nh'' cÊp Bé §¹i häc, Trung häc 11
chuyªn nghiÖp, m· sè 149/Q§ ngµy 01/3/1972, nghiÖm thu ngµy 30/10/1975 vµ ®Ò tµi cÊp nhµ n−íc '' Tæng hîp c¸c chÊt chèng virus'' m· sè 510801, Hµ Néi 2002. HiÖn nay cyclophosphamide ®· vµ ®ang ®−îc sö dông trong ch−¬ng tr×nh ®a hoÆc ®¬n ho¸ trÞ liÖu ®Ó ch÷a c¸c chøng bÖnh sau: • C¸c bÖnh b¹ch cÇu: BÖnh b¹ch cÇu d¹ng lymph« bµo vµ dßng tuû bµo cÊp hay m·n. • U h¹ch ¸c tÝnh: BÖnh Hodgkin, ung th− h¹ch kh«ng Hodgkin, u t−¬ng bµo. • U t¹ng ®Æc ¸c tÝnh cã di c¨n vµ kh«ng di c¨n: Ung th− buång trøng, ung th− cæ tö cung, néi m¹c tö cung, ung th− tinh hoµn, ung th− vó, ung th− phæi tÕ bµo nhá, u nguyªn bµo thÇn kinh, u nguyªn bµo vâng m¹c, sarcoma Ewing. • C¸c bÖnh tù miÔn tiÕn triÓn: Viªm khíp d¹ng thÊp, bÖnh khíp do vÈy nÕn, lupus ban ®á hÖ thèng, s¬ cøng b×, viªm m¹ch m¸u hÖ thèng (kÌm héi chøng thËn h−), mét sè thÓ viªm cÇu thËn (kÌm héi chøng thËn h−), bÖnh nh−îc c¬ nÆng, thiÕu m¸u t¸n huyÕt tù miÔn, bÖnh ng−ng kÕt tè l¹nh. • §iÒu trÞ øc chÕ miÔn dÞch trong ghÐp t¹ng. Cyclophosphamide cã thÓ dïng ®−îc c¶ hai ®−êng uèng hoÆc tiªm. Sau khi uèng, thuèc ®−îc hÊp thô tíi 75% qua ®−êng tiªu ho¸, nã ph©n bè réng r·i ë kh¾p c¸c m« vµ ®i qua hµng rµo m¸u n·o. Cyclophosphamide cßn ®i qua c¶ rau thai vµ s÷a mÑ. Thêi gian b¸n huû cña cyclophosphamide lµ tõ 4 ®Õn 8 giê. Thuèc ®¹t nång ®é ®Ønh trong huyÕt thanh trong vßng 1 giê sau khi uèng. Nã ®−îc th¶i trõ qua n−íc tiÓu ë d¹ng kh«ng biÕn ®æi d−íi 10% vµ d¹ng chuyÓn ho¸ tõ 85- 90%. Cyclophosphamide cã thÓ g©y ra c¸c t¸c dông phô. Tuy nhiªn c¸c t¸c dông ngo¹i ý th−êng phô thuéc vµo liÒu dïng vµ hÇu hÕt c¸c tr−êng hîp bÞ t¸c dông phô ®Òu cã thÓ håi phôc ®−îc. C¸c t¸c dông phô cã thÓ cã cña cyclophosphamide: + VÒ huyÕt häc: Gi¶m b¹ch cÇu kÌm theo nguy c¬ bÞ nhiÔm trïng; gi¶m tiÓu cÇu kÌm t¨ng nguy c¬ xuÊt huyÕt; thiÕu m¸u kÌm gi¶m Hemoglobine (trªn 2g/ 100ml so víi gi¸ trÞ ban ®Çu). 12
+ VÒ tiªu ho¸: Buån n«n vµ ãi möa + §−êng niÖu sinh dôc: Viªm bµng quang + §èi víi gan: Ýt gÆp + Rông tãc 2.1.1.5. C¸c d¹ng s¶n phÈm chÝnh cña cyclophosphamide vµ nhu cÇu vÒ thuèc cyclophosphamide • Trªn thÞ tr−êng trong n−íc vµ quèc tÕ hiÖn nay cã c¸c th−¬ng phÈm chÝnh chøa ho¹t chÊt cyclophosphamide nh− sau: − Endoxan d¹ng viªn bao vµ d¹ng bét pha tiªm cña h·ng Asta Medica [17], − Cytoxan d¹ng viªn nÐn vµ bét pha tiªm cña h·ng Bristol - Myers Squibb. − Neosar d¹ng bét pha tiªm cña h·ng Pharmacia & Upjohn. • Theo thèng kª cña Bé Y tÕ, hµng n¨m n−íc ta cã kho¶ng 150.000 ng−êi míi m¾c bÖnh ung th− cÇn ®−îc ®iÒu trÞ [16]. Sè l−îng bÖnh nh©n ngµy cµng t¨ng do tû lÖ sèng kÐo dµi cña nh÷ng bÖnh nh©n ung th− ®· m¾c tõ 3 ®Õn 5 n¨m. Trong sè ®ã kho¶ng 30% cÇn ®−îc ®iÒu trÞ tiÕp ë giai ®o¹n cuèi vµ giai ®o¹n di c¨n. Nh− vËy, trong 1 n¨m cã kho¶ng 50.000 bÖnh nh©n cÇn dïng cyclophosphamide ®¬n ®éc hay phèi hîp víi c¸c lo¹i thuèc kh¸c. Mçi ®ît ®iÒu trÞ cÇn sö dông 500mg/ m2 da; trung b×nh cÇn 6 ®ît ®iÒu trÞ cho mét bÖnh nh©n. DiÖn tÝch bÒ mÆt da trung b×nh cña ng−êi ViÖt Nam lµ 1,6m2. Nh− vËy: + Mét ®ît ®iÒu trÞ cÇn : 500mg/m2 da x 1,6 m2 = 800mg + S¸u ®ît ®iÒu trÞ cÇn: 800mg/m2 da x 6 = 4800mg + Sè thuèc cÇn dïng cho ViÖt Nam trong 1 n¨m sÏ lµ: 4800mg x 50.000 ng−êi = 240.000.000mg (240kg). 13
Gi¸ thuèc hiÖn nay cña §øc lµ: ≈ 45.000®/ 200mg; cña Hµn Quèc lµ: ≈ 22.000®/ 200mg. Nh− vËy nÕu chØ tÝnh theo gi¸ thuèc cña Hµn Quèc th× sè tiÒn ViÖt Nam cÇn ph¶i chi ®Ó mua thuèc ®· lµ: 22.000® x 240.000.000 : 200 = 26.400.000.000® (hai m−¬i s¸u tû bèn tr¨m triÖu ®ång). Sè liÖu trªn cho thÊy, cÇn gÊp rót tæ chøc nghiªn cøu s¶n xuÊt cyclophosphamide trong n−íc ®Ó ®iÒu trÞ ung th− vµ c¸c bÖnh kh¸c. Ngoµi viÖc sö dông ®Ó ®iÒu trÞ ung th− th× cyclophosphamide cßn ®−îc dïng nhiÒu ®Ó ®iÒu trÞ c¸c bÖnh kh¸c nh− chèng th¶i ghÐp (dïng cho c¸c ca ghÐp gan, thËn, da, v.v...), c¸c bÖnh thuéc vÒ øc chÕ miÔn dÞch nh− lupót ban ®á, vÈy nÕn, viªm khíp thÓ nhÑ .... §iÒu ®Æc biÖt quan träng n÷a lµ: cyclophosphamide cã thÓ ®−îc bµo chÕ b»ng c¸ch ®ãng viªn nÐn dïng ®−êng uèng gi¸ rÎ, dÔ b¶o qu¶n vµ vËn chuyÓn ®Ó phôc vô ®ång bµo vïng s©u, vïng xa, ng−êi nghÌo bÞ m¾c bÖnh ung th− vµ mét sè bÖnh kh¸c. 2.1.2. TrÝch dÉn néi dung thuyÕt minh cña ®Ò tµi • Giíi thiÖu vÒ chñ nhiÖm ®Ò tµi vµ c¬ quan qu¶n lý ®Ò tµi: Tªn ®Ò tµi: "Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide lµm thuèc ®iÒu trÞ ung th−" M∙ sè: KC.10. 25 Thêi gian thùc hiÖn: 24 th¸ng (Tõ 1/ 1/ 2004 ®Õn 31/ 12 / 2005) CÊp qu¶n lý: Nhµ n−íc Kinh phÝ: Tæng sè: 2.900 triÖu ®ång Trong ®ã, tõ Ng©n s¸ch SNKH: 1.900 triÖu ®ång Thuéc ch−¬ng tr×nh: Khoa häc vµ C«ng nghÖ träng ®iÓm cÊp nhµ n−íc giai ®o¹n 2001-2005: "Khoa häc vµ C«ng nghÖ phôc vô b¶o vÖ vµ ch¨m sãc søc kháe céng ®ång". Chñ nhiÖm ®Ò tµi: Hä vµ tªn: TrÇn V¨n Sung Häc hµm/häc vÞ: GS. TSKH. Chøc danh khoa häc: Nghiªn cøu viªn cao cÊp (NCVCC) §iÖn tho¹i: (CQ)/ 04-7564794; (NR) 04-8570894; Fax: 04-8361283; Mobile: 0913210527 14
E-mail: tvs@ich.ncst.ac.vn §Þa chØ c¬ quan: ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH & CNVN 18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt, CÇu GiÊy, Hµ Néi §Þa chØ nhµ riªng: Sè nhµ 35, Ngâ 198, phè Th¸i Hµ, Hµ Néi C¬ quan chñ tr× ®Ò tµi: ViÖn Ho¸ häc, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam §iÖn tho¹i: 04-7564312; Fax: 04- 8361283 E-mail: vpvhoa@ich.ncst.ac.vn §Þa chØ: 18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt, QuËn CÇu GiÊy, Hµ Néi Môc tiªu cña ®Ò tµi: X©y dùng ®−îc quy tr×nh c«ng nghÖ tæng hîp vµ tinh chÕ thuèc cyclophosphamide ®¹t tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh (BP- 2001). • Néi dung nghiªn cøu: + Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp vµ tinh chÕ cyclophosphamide + KiÓm tra ®é tinh khiÕt cña c¸c ho¸ chÊt, dung m«i sö dông + Tinh chÕ c¸c ho¸ chÊt, dung m«i sö dông + Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp vµ tinh chÕ s¶n phÈm trung gian I + Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp vµ tinh chÕ s¶n phÈm trung gian II + Nghiªn cøu quy tr×nh ®iÒu chÕ cyclophosphamide trong c¸c ®iÒu kiÖn ph¶n øng kh¸c nhau (dung m«i, t¸c nh©n) + Nghiªn cøu tinh chÕ cyclophosphamide trong c¸c ®iÒu kiÖn kh¸c nhau. + X¸c ®Þnh cÊu tróc vµ kiÓm tra ®é tinh khiÕt cña cyclophosphamide: KiÓm tra ®é tinh khiÕt b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p s¾c ký nh− s¾c ký líp máng, s¾c ký khÝ, s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC), s¾c ký láng g¾n khèi phæ (LC/ MS) vµ ph©n tÝch nguyªn tè. + X¸c ®Þnh cÊu tróc cña cyclophosphamide b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p phæ nh− IR, MS, NMR, so s¸nh víi phæ cña chÊt chuÈn. 15