Đặc điểm và phân bố mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng và ít tinh trùng

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

90
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm phân tích đặc điểm và phân bố mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng và ít tinh trùng. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đặc điểm và phân bố mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng và ít tinh trùng

TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 ĐẶC ĐIỂM VÀ PHÂN BỐ MẤT ĐOẠN NHỎ NHIỄM SẮC THỂ Y Ở BỆNH NHÂN VÔ SINH NAM KHÔNG CÓ TINH TRÙNG VÀ ÍT TINH TRÙNG TrÇn Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang*; Quản Hoàng Lâm* Ngô Trường Giang*; Nguyễn Thị Việt Hà* TÓM TẮT Phân tích mất đoạn gen của vùng yếu tố vô tinh trùng (TT) của nhiễm sắc thể (NST) Y bằng phương pháp PCR là một công cụ sàng lọc quan trọng trong điều trị vô sinh nam. Nghiên cứu sử dụng phương pháp multiplex PCR để phân tích mất đoạn nhỏ NST Y sử dụng 19 trình tự mồi phát hiện (STSs) thuộc ba gen của vùng yếu tố vô TT hoÆc Ýt TT. 323 bệnh nhân (BN) đối tượng nam không có TT có NST bình thường được phân tích. Kết quả: phát hiện 17/323 nam giới vô sinh (5,26%) bị mất đoạn nhỏ NST Y. Trong đó, 3 BN mất đoạn AZFa, 1 BN mất đoạn AZFb, 11 BN mất đoạn AZFc+d, 1 BN mất đoạn AZFa+b+c và 1 BN mất đoạn AZFa+b+c+d. Hai tổ hợp multiplex PCR được thiết kế sử dụng 8 trình tự mồi (STSs) có thể phát hiện một cách hiệu quả các mất đoạn phổ biến trên NST Y ở đối tượng vô sinh nam. * Từ khoá: Vô sinh nam; Vô tinh trùng; Mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y. CHARACTERISTICS AND DISTRIBUTION OF MICRODELETIONS ON Y CHROMOSOME in infertile azoospermia men Summary Analysis of the microdelection in azoospermia factor (AZF) region of Y chromosome by PCR is an important screening tool in treatment of infertile males. In the present study, the Y chromosome microdeletions were analyzed by PCR, using primers corresponding to 19 sequence tagged sites (STSs) on three genes of the AZF region. A total of 323 azoospermic male showing normal karyotype were included in the study. Results: Y chromosome microdeletions were observed in 17 out of 323 (5.26%) infertile males. Of the seventeen subjects, 3 had deletions in AZFa, 1 in AZFb, 11 in AZFc+d, 1 in AZFa+b+c regions and 1 in AZFa+b+c+d. Two multiplex PCRs were designed using 8 STSs markers, which could detect efficiently almost Y chromosome microdeletions in infertile males. * Key words: Male infertile; Azoospermia; Micro-deletions in the Y-chromosome. ĐẶT VẤN ĐỀ Tỷ lệ vô sinh chiếm khoảng 5 - 10% các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản. Khoảng 40% do nam giới, 40% do nữ và 20% còn lại do cả hai [3]. Trong số các trường hợp vô sinh nam, tỷ lệ không có TT chiếm khoảng 10 - 15%. Khoảng 10% trường hợp vô sinh không có TT không rõ nguyên nhân. Phân tích di truyền cho thấy 3 vùng không chồng nhau trên NST Y gọi là vùng yếu tố vô TT AZFa, AZFb và AZFc [10]. Mất đoạn nhỏ một trong số các gen này có thể liên quan đến suy giảm sinh tinh và vô sinh nam [1, 4, 6, 8]. * Học viện Quân y Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Hoàng Văn Lương GS. TS. Nguyễn Đình Tảo 1 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 Những nghiên cứu tần số mất đoạn nhỏ NST Y ở các chủng tộc trên thế giới cho thấy kết quả mất đoạn nhỏ NST Y ở nam giới không TT và ít TT không rõ nguyên nhân dao động từ 1 - 55%. Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về mất đoạn nhỏ NST Y trên BN vô sinh nam ở Việt Nam. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm: Phân tích đặc điểm và phân bố mất đoạn nhỏ NST Y ở BN nam không có TT. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tƣợng nghiên cứu. 323 nam giới vô sinh, không TT hoÆc Ýt TT, có vợ bình thường, đến khám tại Trung tâm Công nghệ Phôi, Học viện Quân y, Bộ môn Y sinh học - Di truyền, Đại học Y Hà Nội và Viện Nam học và Hiếm muộn Hà Nội trong thời gian 2010 - 2011. Sau khám xét lâm sàng, xét nghiệm hormon và kiểm tra hệ thống sinh dục, lựa chọn nam vô sinh không có TT làm đối tượng nghiên cứu. Lấy tinh dịch xét nghiệm sau khi kiêng sinh hoạt tình dục trong vòng 7 ngày. Phân tích các mẫu tinh dịch theo tiêu chí của Tổ chức Y tế Thế giới. * Tiêu chí loại trừ: vô sinh thứ phát, có bất thường cơ quan sinh dục, bất thường NST. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. Mô tả cắt ngang. * Tách AND: Sử dụng kit ADN Blood Minikit (Qiagen) để tách ADN theo quy trình hướng dẫn của nhà sản suất. Kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch mẫu ADN thu được bằng hệ thống Nano-Drop 1000, USA. Kiểm tra các mẫu đạt nồng độ, độ tinh sạch sẽ được dùng cho phản ứng PCR. * Lựa chọn các cặp mồi nhân đoạn gen AZF: - Tiêu chí lựa chọn: mồi nhân trình tự đặc hiệu trên vùng AZF thuộc nhánh dài NST Y. Mỗi vùng AZF a, b, c có ít nhất hai trình tự mồi, đặc biệt các vị trí hay xảy ra đứt gãy, mất đoạn gen. Các mồi có nhiệt độ gắn mồi tương đương nhau. Chúng tôi lựa chọn được 19 cặp mồi nhân vùng gen AZZF và 1 cặp mồi SRY nhân đoạn gen trên nhánh ngắn NST Y làm nội chứng dương. * Multiplex PCR: Dựa vào kích thước sản phẩm PCR, chúng tôi tổ hợp các mồi trên vào 5 ống phản ứng để chạy multiplex PCR. Mỗi phản ứng bao gồm 9 μl mastermix, 2 - 3 μl ADN khuôn, 0,25 - 0,5 μl mỗi mồi, nước cất vừa đủ đến 15 μl. Phản ứng thực hiện qua 35 chu kỳ. Chu trình nhiệt cho mỗi chu kỳ như sau: 940C trong 45 giây, 570C trong 45 giây và 720C trong 1 phút. Chương trình được đặt biến tính lần đầu trước ở 940C trong 11 phút và cuối cùng nối dài 720C trong 6 phút. SRY (472 bp) SRY (472 bp) SRY (472 bp) DBY (689 bp) SRY (472 bp) sY254 (350 bp) sY84 (326 bp) sY143 (311 bp) SRY (472 bp) USP9Y (249 bp) sY86 (320 bp) sY134 (301 bp) sY128 (228 bp) sY157 (285 bp) sY81 (209 bp) sY127 (274 bp) sY153 (139 bp) sY130 (173 bp) AZFa (220 bp) sY133 (177 bp) sY124 (109 bp) sY121 (190 bp) sY255 (126 bp) sY152 (125 bp) * Điện di: 2 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, trong 1 giờ với hiệu điện thế 100 V và cường độ dòng điện 100 mA, nhuộm ethidium bromide, soi UV, chụp hình và phân tích. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Sử dụng phản ứng multiplex PCR khảo sát mất đoạn nhỏ NST Y vùng AZF trên 329 BN vô sinh nam không có TT, kết quả như sau: 1. Tỷ lệ mất đoạn vùng AZF ở BN vô sinh nam. Với 323 BN vô sinh nam được kiểm tra không có bất thường về kiểu nhân, tiến hành phân tích ADN, chạy multiplex PCR với 19 cặp mồi nêu trên. Kết quả cho thấy: trong tổng số 323 BN được xét nghiệm ADN, 17 BN (5,26%) bị mất đoạn trên vùng AZF. Đối chiếu với kết quả của một số tác giả khác trong khu vực và trên thế giới chúng tôi thấy: Bảng 1: Tỷ lệ mất đoạn của nghiên cứu này so với một số nghiên cứu khác. TÁC GIẢ Martinez M.C, 2000 (Tây Ban Nha) [6] Canan F, 2004 (Thổ Nhĩ Kỳ) [3] A Zhou Can, 2006 (Trung Quốc) [2] Anurag Mitra, 2008 (Ấn Độ) [1] Nghiên cứu này n SỐ STSs TỶ LỆ (%) 57 10 14 47 6 4,26 220 6 15 170 6 5,29 323 20 5,26 Tỷ lệ mất đoạn NST dao động trong các nghiên cứu khác nhau. Tuy nhiên, tỷ lệ này trong nghiên cứu của chúng tôi nằm ở giá trị trung bình so với các nghiên cứu khác của các nước trong cùng khu vực cũng như châu Âu, cho thấy việc lựa chọn cặp mồi để phát hiện mất đoạn nhỏ phù hợp với đối tượng nam vô sinh không TT ở người Việt Nam. 2. Phân bố mất đoạn theo từng vùng AZFa, AZFb, AZFc. Bảng 2: Phân bố tỷ lệ mất đoạn trên từng vùng AZF của nghiên cứu này và một số nghiên cứu khác. NGHIÊN CỨU NÀY MATINEZ (TÂY BAN NHA) [6] CANAN F. THỔ NHĨ KỲ [3] A ZHOU CAN (TRUNG QUỐC) [2] ANURAG (ẤN ĐỘ) [1] Mất đoạn vùng AZFa 3 (17,65%) 0 0 5 2 Mất đoạn vùng AZFb 1 (5,88%) 1 1 8 1 Mất đoạn vùng AZFc 0 3 0 19 3 Mất đoạn vùng AZFd 0 - - 0 - (2) (3) (4) 5) (6) PHÂN BỐ (1) 3 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 Mất đoạn vùng AZFa+b 0 0 0 0 0 Mất đoạn vùng AZFb+c 0 4 1 0 3 Mất đoạn vùng AZFc+d 11 (64,71%) - - 1 - Mất đoạn vùng AZFa+b+c 1 (5,88%) 0 - 0 - Mất đoạn vùng AZFa+b+c+d 1 (5,88%) - - 0 - Tổng số 17/323 8/57 2/47 33/220 9/170 Mất đoạn AZFc+d thường đi cùng nhau và chiếm tỷ lệ cao nhất. Điều này có thể lý giải vì vùng AZFd là vùng chồng lấn AZFb và c, do đó, một số tác giả gộp vùng AZFb với c thành một vùng AZFc. Chỉ 2 BN mất đoạn trên cả 3 vùng AZFa+b+c hoặc 4 vïng AZFa+b+c+d. Mir Davood Omrami và CS [7] nghiên cứu, trên 99 BN không có TT và ít TT sử dụng 20 cặp mồi khác nhau bằng kỹ thuật multiplex PCR đã phát hiện 17 BN mất đoạn gen. Trong đó, 15 BN có một mất đoạn, 6 BN có hai mất đoạn và 3 BN mất ba đoạn. Những mất đoạn chủ yếu ở vùng AZFc (21/17 BN). Nghiên cứu của chúng tôi: điểm tương đồng về tỷ lệ mất đoạn AZFc+d là chủ yếu [1, 2, 3]. Tuy nhiên, tỷ lệ mất đoạn AZFa trong nghiên cứu này cao hơn các nghiên cứu khác là do đối tượng tham gia nghiên cứu chưa đại diện tiêu biểu cho cộng đồng dân cư trên toàn quốc, thông thường, các trường hợp đến khám và điều trị tại các trung tâm đã từng khám và điều trị ở nhiều nơi khác nhưng không đạt kết quả mong muốn. 3. Phân bố mất đoạn theo từng STS. Bảng 3: Phân bố tỷ lệ BN vô sinh nam theo từng STS nghiên cứu. a b d c sY AZFa 81 84 86 DBY UPSP9Y 121 124 127 128 130 133 134 143 152 153 254 255 157 Tổng 0 0 3 1 0 0 2 0 2 0 2 1 1 0 15 14 14 14 14 (n = 83) Thống kê theo từng STS nghiên cứu ở từng vùng AZF thấy: các mất đoạn ở sY152, sY153, sY254, sY255, sY157 chiếm tỷ lệ cao nhất, 71/83 BN mất đoạn các loại, tiếp đến là mất đoạn ở sY84, sY127, sY121, sY130, sY133, s134, còn lại không phát hiện thấy mất đoạn ở các sY khác. 4 A Zhou-Cun [2] nghiên cứu trên 358 trường hợp, trong đó, 256 BN không TT và 102 BN ít TT phát hiện 319 BN không có bất thường nhiễm sắc, 220 BN không TT và 99 BN ít TT, sử dụng 12 cặp mồi sàng lọc mất đoạn nhỏ NST Y, 46 BN (14,4%) có mất đoạn. 33/220 BN không TT (15%) mất đoạn. Trong đó, tỷ lệ mất đoạn cao nhất liên quan TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 đến các sY: 152/254/255 (20/33 BN). Tiếp theo, sY84 (127/134 BN), sY86 chỉ gặp 1 BN. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ mất đoạn AZFc liên quan đến các sY: 152/153/254/255/157 là cao nhất. Canan Figen Sargın và CS (2004) [3], nghiên cứu trên 60 BN, 48 BN không TT, 13 BN ít TT, phát hiện thấy 3 BN (3,3%) có mất đoạn. Trong đó, 1 BN mất đoạn liên quan sY127/254 và 1 sY84/134 và 1 sY86. Nhiều nghiên cứu cũng thấy mất đoạn hoàn toàn vùng AZFa chắc chắn sẽ dẫn tới hội chứng SCOS [1, 4, 6, 8]. Ở những BN này, việc chọc hút hay sinh thiết mào tinh để lấy TT hoàn toàn vô ích. Do vậy, nên khuyên những BN này nhận con nuôi thay vì theo đuổi các phương pháp điều trị. Đối với trường hợp chỉ mất đoạn vùng AZFb sẽ gây hiện tượng kìm hãm quá trình sinh tinh, trường hợp BN mất đoạn AZFb+c dẫn tới hội chứng SCOS hoặc hiện tượng kìm hãm sinh tinh [4]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, 1 trường hợp mất cả hai STS sY127, sY134 của vùng AZFb. Đối với BN bị mất AZFb hoặc AZFb/c không thấy TT khi áp dụng kỹ thuật TESE. Hopp và CS [4] đã chứng minh, đối với những mất đoạn trên AZFa, AZFb, AZFb+c, không có khả năng tách TT khi sử dụng kỹ thuật TESE, trong khi đó, đối với mất đoạn trên AZFc, khả năng tách TT từ tinh hoàn thành công lên đến 75%. Tương đồng với những kết quả nghiên cứu trên, Krausz [5] đã phát hiện 50% xuất hiện TT ở trường hợp mất đoạn thuộc vùng AZFc và những mất đoạn thuộc vùng AZFa, AZFb hiếm khi tách được TT từ tinh hoàn. Vì vậy, phát hiện các mất đoạn AZF khác nhau liên quan đến tiên lượng và chỉ định điều trị. Giữa tỷ lệ mất đoạn nhỏ được phát hiện và STS được sử dụng trong nghiên cứu có mối quan hệ chặt chẽ với nhau. Vì vậy, nghiên cứu thêm để đưa ra bộ STS phù hợp nhằm có được kết quả cao là điều cần thiết [9]. Dưới đây là một số kết quả điện di trong nghiên cứu: Hình 1: Ảnh điện di của BN phát hiện mất đoạn ở sY84, sY86. 5