TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br />
<br />
ĐẶC ĐIỂM VÀ PHÂN BỐ MẤT ĐOẠN NHỎ NHIỄM SẮC THỂ Y Ở<br />
BỆNH NHÂN VÔ SINH NAM KHÔNG CÓ TINH TRÙNG VÀ<br />
ÍT TINH TRÙNG<br />
TrÇn Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang*; Quản Hoàng Lâm*<br />
Ngô Trường Giang*; Nguyễn Thị Việt Hà*<br />
TÓM TẮT<br />
Phân tích mất đoạn gen của vùng yếu tố vô tinh trùng (TT) của nhiễm sắc thể (NST) Y bằng<br />
phương pháp PCR là một công cụ sàng lọc quan trọng trong điều trị vô sinh nam. Nghiên cứu sử<br />
dụng phương pháp multiplex PCR để phân tích mất đoạn nhỏ NST Y sử dụng 19 trình tự mồi phát<br />
hiện (STSs) thuộc ba gen của vùng yếu tố vô TT hoÆc Ýt TT. 323 bệnh nhân (BN) đối tượng nam<br />
không có TT có NST bình thường được phân tích. Kết quả: phát hiện 17/323 nam giới vô sinh<br />
(5,26%) bị mất đoạn nhỏ NST Y. Trong đó, 3 BN mất đoạn AZFa, 1 BN mất đoạn AZFb, 11 BN mất<br />
đoạn AZFc+d, 1 BN mất đoạn AZFa+b+c và 1 BN mất đoạn AZFa+b+c+d. Hai tổ hợp multiplex PCR<br />
được thiết kế sử dụng 8 trình tự mồi (STSs) có thể phát hiện một cách hiệu quả các mất đoạn phổ<br />
biến trên NST Y ở đối tượng vô sinh nam.<br />
* Từ khoá: Vô sinh nam; Vô tinh trùng; Mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y.<br />
<br />
CHARACTERISTICS AND DISTRIBUTION OF MICRODELETIONS<br />
ON Y CHROMOSOME in infertile azoospermia men<br />
Summary<br />
Analysis of the microdelection in azoospermia factor (AZF) region of Y chromosome by PCR is<br />
an important screening tool in treatment of infertile males. In the present study, the Y chromosome<br />
microdeletions were analyzed by PCR, using primers corresponding to 19 sequence tagged sites<br />
(STSs) on three genes of the AZF region. A total of 323 azoospermic male showing normal karyotype<br />
were included in the study. Results: Y chromosome microdeletions were observed in 17 out of 323<br />
(5.26%) infertile males. Of the seventeen subjects, 3 had deletions in AZFa, 1 in AZFb, 11 in AZFc+d, 1 in<br />
AZFa+b+c regions and 1 in AZFa+b+c+d. Two multiplex PCRs were designed using 8 STSs markers,<br />
which could detect efficiently almost Y chromosome microdeletions in infertile males.<br />
* Key words: Male infertile; Azoospermia; Micro-deletions in the Y-chromosome.<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Tỷ lệ vô sinh chiếm khoảng 5 - 10% các<br />
cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản. Khoảng<br />
40% do nam giới, 40% do nữ và 20% còn<br />
lại do cả hai [3]. Trong số các trường hợp vô<br />
sinh nam, tỷ lệ không có TT chiếm khoảng<br />
<br />
10 - 15%. Khoảng 10% trường hợp vô sinh<br />
không có TT không rõ nguyên nhân. Phân<br />
tích di truyền cho thấy 3 vùng không chồng<br />
nhau trên NST Y gọi là vùng yếu tố vô TT<br />
AZFa, AZFb và AZFc [10]. Mất đoạn nhỏ một<br />
trong số các gen này có thể liên quan đến<br />
suy giảm sinh tinh và vô sinh nam [1, 4, 6, 8].<br />
<br />
* Học viện Quân y<br />
Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Hoàng Văn Lương<br />
GS. TS. Nguyễn Đình Tảo<br />
<br />
1<br />
<br />
TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br />
<br />
Những nghiên cứu tần số mất đoạn nhỏ<br />
NST Y ở các chủng tộc trên thế giới cho<br />
thấy kết quả mất đoạn nhỏ NST Y ở nam<br />
giới không TT và ít TT không rõ nguyên<br />
nhân dao động từ 1 - 55%. Tuy nhiên, chưa<br />
có nhiều nghiên cứu về mất đoạn nhỏ NST<br />
Y trên BN vô sinh nam ở Việt Nam. Nghiên<br />
cứu này được thực hiện nhằm: Phân tích<br />
đặc điểm và phân bố mất đoạn nhỏ NST Y<br />
ở BN nam không có TT.<br />
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN CỨU<br />
1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br />
323 nam giới vô sinh, không TT hoÆc Ýt<br />
TT, có vợ bình thường, đến khám tại Trung<br />
tâm Công nghệ Phôi, Học viện Quân y, Bộ<br />
môn Y sinh học - Di truyền, Đại học Y Hà<br />
Nội và Viện Nam học và Hiếm muộn Hà Nội<br />
trong thời gian 2010 - 2011. Sau khám xét<br />
lâm sàng, xét nghiệm hormon và kiểm tra<br />
hệ thống sinh dục, lựa chọn nam vô sinh<br />
không có TT làm đối tượng nghiên cứu. Lấy<br />
tinh dịch xét nghiệm sau khi kiêng sinh hoạt<br />
tình dục trong vòng 7 ngày. Phân tích các<br />
mẫu tinh dịch theo tiêu chí của Tổ chức Y tế<br />
Thế giới.<br />
* Tiêu chí loại trừ: vô sinh thứ phát, có bất<br />
thường cơ quan sinh dục, bất thường NST.<br />
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br />
Mô tả cắt ngang.<br />
<br />
* Tách AND:<br />
Sử dụng kit ADN Blood Minikit (Qiagen)<br />
để tách ADN theo quy trình hướng dẫn của<br />
nhà sản suất. Kiểm tra nồng độ, độ tinh<br />
sạch mẫu ADN thu được bằng hệ thống<br />
Nano-Drop 1000, USA. Kiểm tra các mẫu<br />
đạt nồng độ, độ tinh sạch sẽ được dùng<br />
cho phản ứng PCR.<br />
* Lựa chọn các cặp mồi nhân đoạn gen<br />
AZF:<br />
- Tiêu chí lựa chọn: mồi nhân trình tự<br />
đặc hiệu trên vùng AZF thuộc nhánh dài<br />
NST Y. Mỗi vùng AZF a, b, c có ít nhất hai<br />
trình tự mồi, đặc biệt các vị trí hay xảy ra<br />
đứt gãy, mất đoạn gen. Các mồi có nhiệt độ<br />
gắn mồi tương đương nhau. Chúng tôi lựa<br />
chọn được 19 cặp mồi nhân vùng gen AZZF<br />
và 1 cặp mồi SRY nhân đoạn gen trên nhánh<br />
ngắn NST Y làm nội chứng dương.<br />
* Multiplex PCR:<br />
Dựa vào kích thước sản phẩm PCR,<br />
chúng tôi tổ hợp các mồi trên vào 5 ống<br />
phản ứng để chạy multiplex PCR. Mỗi phản<br />
ứng bao gồm 9 μl mastermix, 2 - 3 μl ADN<br />
khuôn, 0,25 - 0,5 μl mỗi mồi, nước cất vừa<br />
đủ đến 15 μl. Phản ứng thực hiện qua 35<br />
chu kỳ. Chu trình nhiệt cho mỗi chu kỳ như<br />
sau: 940C trong 45 giây, 570C trong 45 giây<br />
và 720C trong 1 phút. Chương trình được đặt<br />
biến tính lần đầu trước ở 940C trong 11 phút<br />
và cuối cùng nối dài 720C trong 6 phút.<br />
<br />
SRY (472 bp)<br />
<br />
SRY (472 bp)<br />
<br />
SRY (472 bp)<br />
<br />
DBY (689 bp)<br />
<br />
SRY (472 bp)<br />
<br />
sY254 (350 bp)<br />
<br />
sY84 (326 bp)<br />
<br />
sY143 (311 bp)<br />
<br />
SRY (472 bp)<br />
<br />
USP9Y (249 bp)<br />
<br />
sY86 (320 bp)<br />
<br />
sY134 (301 bp)<br />
<br />
sY128 (228 bp)<br />
<br />
sY157 (285 bp)<br />
<br />
sY81 (209 bp)<br />
<br />
sY127 (274 bp)<br />
<br />
sY153 (139 bp)<br />
<br />
sY130 (173 bp)<br />
<br />
AZFa (220 bp)<br />
<br />
sY133 (177 bp)<br />
<br />
sY124 (109 bp)<br />
<br />
sY121 (190 bp)<br />
<br />
sY255 (126 bp)<br />
<br />
sY152 (125 bp)<br />
<br />
* Điện di:<br />
<br />
2<br />
<br />
TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br />
<br />
Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, trong 1 giờ với hiệu điện thế 100 V và<br />
cường độ dòng điện 100 mA, nhuộm ethidium bromide, soi UV, chụp hình và phân tích.<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br />
Sử dụng phản ứng multiplex PCR khảo sát mất đoạn nhỏ NST Y vùng AZF trên 329 BN<br />
vô sinh nam không có TT, kết quả như sau:<br />
1. Tỷ lệ mất đoạn vùng AZF ở BN vô sinh nam.<br />
Với 323 BN vô sinh nam được kiểm tra không có bất thường về kiểu nhân, tiến hành<br />
phân tích ADN, chạy multiplex PCR với 19 cặp mồi nêu trên. Kết quả cho thấy: trong tổng<br />
số 323 BN được xét nghiệm ADN, 17 BN (5,26%) bị mất đoạn trên vùng AZF.<br />
Đối chiếu với kết quả của một số tác giả khác trong khu vực và trên thế giới chúng tôi thấy:<br />
Bảng 1: Tỷ lệ mất đoạn của nghiên cứu này so với một số nghiên cứu khác.<br />
TÁC GIẢ<br />
Martinez M.C, 2000 (Tây Ban Nha) [6]<br />
Canan F, 2004 (Thổ Nhĩ Kỳ) [3]<br />
A Zhou Can, 2006 (Trung Quốc) [2]<br />
Anurag Mitra, 2008 (Ấn Độ) [1]<br />
Nghiên cứu này<br />
<br />
n<br />
<br />
SỐ STSs<br />
<br />
TỶ LỆ (%)<br />
<br />
57<br />
<br />
10<br />
<br />
14<br />
<br />
47<br />
<br />
6<br />
<br />
4,26<br />
<br />
220<br />
<br />
6<br />
<br />
15<br />
<br />
170<br />
<br />
6<br />
<br />
5,29<br />
<br />
323<br />
<br />
20<br />
<br />
5,26<br />
<br />
Tỷ lệ mất đoạn NST dao động trong các nghiên cứu khác nhau. Tuy nhiên, tỷ lệ này<br />
trong nghiên cứu của chúng tôi nằm ở giá trị trung bình so với các nghiên cứu khác của<br />
các nước trong cùng khu vực cũng như châu Âu, cho thấy việc lựa chọn cặp mồi để phát<br />
hiện mất đoạn nhỏ phù hợp với đối tượng nam vô sinh không TT ở người Việt Nam.<br />
2. Phân bố mất đoạn theo từng vùng AZFa, AZFb, AZFc.<br />
Bảng 2: Phân bố tỷ lệ mất đoạn trên từng vùng AZF của nghiên cứu này và một số<br />
nghiên cứu khác.<br />
NGHIÊN<br />
CỨU NÀY<br />
<br />
MATINEZ<br />
(TÂY BAN<br />
NHA) [6]<br />
<br />
CANAN F.<br />
THỔ NHĨ<br />
KỲ [3]<br />
<br />
A ZHOU CAN<br />
(TRUNG<br />
QUỐC) [2]<br />
<br />
ANURAG<br />
(ẤN ĐỘ) [1]<br />
<br />
Mất đoạn vùng AZFa<br />
<br />
3 (17,65%)<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
5<br />
<br />
2<br />
<br />
Mất đoạn vùng AZFb<br />
<br />
1 (5,88%)<br />
<br />
1<br />
<br />
1<br />
<br />
8<br />
<br />
1<br />
<br />
Mất đoạn vùng AZFc<br />
<br />
0<br />
<br />
3<br />
<br />
0<br />
<br />
19<br />
<br />
3<br />
<br />
Mất đoạn vùng AZFd<br />
<br />
0<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
0<br />
<br />
-<br />
<br />
(2)<br />
<br />
(3)<br />
<br />
(4)<br />
<br />
5)<br />
<br />
(6)<br />
<br />
PHÂN BỐ<br />
<br />
(1)<br />
<br />
3<br />
<br />
TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br />
<br />
Mất đoạn vùng AZFa+b<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
Mất đoạn vùng AZFb+c<br />
<br />
0<br />
<br />
4<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
3<br />
<br />
Mất đoạn vùng AZFc+d<br />
<br />
11 (64,71%)<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
1<br />
<br />
-<br />
<br />
Mất đoạn vùng AZFa+b+c<br />
<br />
1 (5,88%)<br />
<br />
0<br />
<br />
-<br />
<br />
0<br />
<br />
-<br />
<br />
Mất đoạn vùng AZFa+b+c+d<br />
<br />
1 (5,88%)<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
0<br />
<br />
-<br />
<br />
Tổng số<br />
<br />
17/323<br />
<br />
8/57<br />
<br />
2/47<br />
<br />
33/220<br />
<br />
9/170<br />
<br />
Mất đoạn AZFc+d thường đi cùng nhau<br />
và chiếm tỷ lệ cao nhất. Điều này có thể lý<br />
giải vì vùng AZFd là vùng chồng lấn AZFb<br />
và c, do đó, một số tác giả gộp vùng AZFb<br />
với c thành một vùng AZFc. Chỉ 2 BN mất<br />
đoạn trên cả 3 vùng AZFa+b+c hoặc 4 vïng<br />
AZFa+b+c+d.<br />
Mir Davood Omrami và CS [7] nghiên<br />
cứu, trên 99 BN không có TT và ít TT sử<br />
dụng 20 cặp mồi khác nhau bằng kỹ thuật<br />
multiplex PCR đã phát hiện 17 BN mất đoạn<br />
gen. Trong đó, 15 BN có một mất đoạn,<br />
<br />
6 BN có hai mất đoạn và 3 BN mất ba đoạn.<br />
Những mất đoạn chủ yếu ở vùng AZFc<br />
(21/17 BN). Nghiên cứu của chúng tôi: điểm<br />
tương đồng về tỷ lệ mất đoạn AZFc+d là chủ<br />
yếu [1, 2, 3]. Tuy nhiên, tỷ lệ mất đoạn AZFa<br />
trong nghiên cứu này cao hơn các nghiên<br />
cứu khác là do đối tượng tham gia nghiên<br />
cứu chưa đại diện tiêu biểu cho cộng đồng<br />
dân cư trên toàn quốc, thông thường, các<br />
trường hợp đến khám và điều trị tại các trung<br />
tâm đã từng khám và điều trị ở nhiều nơi<br />
khác nhưng không đạt kết quả mong muốn.<br />
<br />
3. Phân bố mất đoạn theo từng STS.<br />
Bảng 3: Phân bố tỷ lệ BN vô sinh nam theo từng STS nghiên cứu.<br />
a<br />
<br />
b<br />
<br />
d<br />
<br />
c<br />
<br />
sY<br />
<br />
AZFa<br />
<br />
81<br />
<br />
84<br />
<br />
86<br />
<br />
DBY<br />
<br />
UPSP9Y<br />
<br />
121<br />
<br />
124<br />
<br />
127<br />
<br />
128<br />
<br />
130<br />
<br />
133<br />
<br />
134<br />
<br />
143<br />
<br />
152<br />
<br />
153<br />
<br />
254<br />
<br />
255<br />
<br />
157<br />
<br />
Tổng<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
3<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
2<br />
<br />
0<br />
<br />
2<br />
<br />
0<br />
<br />
2<br />
<br />
1<br />
<br />
1<br />
<br />
0<br />
<br />
15<br />
<br />
14<br />
<br />
14<br />
<br />
14<br />
<br />
14<br />
<br />
(n = 83)<br />
<br />
Thống kê theo từng STS nghiên cứu ở<br />
từng vùng AZF thấy: các mất đoạn ở sY152,<br />
sY153, sY254, sY255, sY157 chiếm tỷ lệ<br />
cao nhất, 71/83 BN mất đoạn các loại, tiếp<br />
đến là mất đoạn ở sY84, sY127, sY121,<br />
sY130, sY133, s134, còn lại không phát<br />
hiện thấy mất đoạn ở các sY khác.<br />
<br />
4<br />
<br />
A Zhou-Cun [2] nghiên cứu trên 358<br />
trường hợp, trong đó, 256 BN không TT và<br />
102 BN ít TT phát hiện 319 BN không có<br />
bất thường nhiễm sắc, 220 BN không TT và<br />
99 BN ít TT, sử dụng 12 cặp mồi sàng lọc<br />
mất đoạn nhỏ NST Y, 46 BN (14,4%) có mất<br />
đoạn. 33/220 BN không TT (15%) mất đoạn.<br />
Trong đó, tỷ lệ mất đoạn cao nhất liên quan<br />
<br />
TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br />
<br />
đến các sY: 152/254/255 (20/33 BN). Tiếp<br />
theo, sY84 (127/134 BN), sY86 chỉ gặp 1 BN.<br />
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ<br />
mất đoạn AZFc liên quan đến các sY:<br />
152/153/254/255/157 là cao nhất. Canan<br />
Figen Sargın và CS (2004) [3], nghiên cứu<br />
trên 60 BN, 48 BN không TT, 13 BN ít TT,<br />
phát hiện thấy 3 BN (3,3%) có mất đoạn.<br />
Trong đó, 1 BN mất đoạn liên quan sY127/254<br />
và 1 sY84/134 và 1 sY86. Nhiều nghiên cứu<br />
cũng thấy mất đoạn hoàn toàn vùng AZFa<br />
chắc chắn sẽ dẫn tới hội chứng SCOS<br />
[1, 4, 6, 8]. Ở những BN này, việc chọc hút<br />
hay sinh thiết mào tinh để lấy TT hoàn toàn<br />
vô ích. Do vậy, nên khuyên những BN này<br />
nhận con nuôi thay vì theo đuổi các phương<br />
pháp điều trị. Đối với trường hợp chỉ mất<br />
đoạn vùng AZFb sẽ gây hiện tượng kìm<br />
hãm quá trình sinh tinh, trường hợp BN mất<br />
đoạn AZFb+c dẫn tới hội chứng SCOS<br />
hoặc hiện tượng kìm hãm sinh tinh [4].<br />
Trong nghiên cứu của chúng tôi, 1 trường<br />
hợp mất cả hai STS sY127, sY134 của<br />
vùng AZFb. Đối với BN bị mất AZFb hoặc<br />
AZFb/c không thấy TT khi áp dụng kỹ thuật<br />
TESE. Hopp và CS [4] đã chứng minh, đối<br />
với những mất đoạn trên AZFa, AZFb,<br />
AZFb+c, không có khả năng tách TT khi sử<br />
dụng kỹ thuật TESE, trong khi đó, đối với<br />
mất đoạn trên AZFc, khả năng tách TT từ<br />
tinh hoàn thành công lên đến 75%. Tương<br />
đồng với những kết quả nghiên cứu trên,<br />
Krausz [5] đã phát hiện 50% xuất hiện TT ở<br />
trường hợp mất đoạn thuộc vùng AZFc và<br />
những mất đoạn thuộc vùng AZFa, AZFb<br />
hiếm khi tách được TT từ tinh hoàn. Vì vậy,<br />
phát hiện các mất đoạn AZF khác nhau liên<br />
<br />
quan đến tiên lượng và chỉ định điều trị.<br />
Giữa tỷ lệ mất đoạn nhỏ được phát hiện và<br />
STS được sử dụng trong nghiên cứu có<br />
mối quan hệ chặt chẽ với nhau. Vì vậy,<br />
nghiên cứu thêm để đưa ra bộ STS phù<br />
hợp nhằm có được kết quả cao là điều cần<br />
thiết [9].<br />
Dưới đây là một số kết quả điện di trong<br />
nghiên cứu:<br />
<br />
Hình 1: Ảnh điện di của BN phát hiện<br />
mất đoạn ở sY84, sY86.<br />
<br />
5<br />
<br />