intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Đặc điểm và phân bố mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng và ít tinh trùng

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

89
lượt xem
2
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm phân tích đặc điểm và phân bố mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng và ít tinh trùng. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Đặc điểm và phân bố mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng và ít tinh trùng

TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> ĐẶC ĐIỂM VÀ PHÂN BỐ MẤT ĐOẠN NHỎ NHIỄM SẮC THỂ Y Ở<br /> BỆNH NHÂN VÔ SINH NAM KHÔNG CÓ TINH TRÙNG VÀ<br /> ÍT TINH TRÙNG<br /> TrÇn Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang*; Quản Hoàng Lâm*<br /> Ngô Trường Giang*; Nguyễn Thị Việt Hà*<br /> TÓM TẮT<br /> Phân tích mất đoạn gen của vùng yếu tố vô tinh trùng (TT) của nhiễm sắc thể (NST) Y bằng<br /> phương pháp PCR là một công cụ sàng lọc quan trọng trong điều trị vô sinh nam. Nghiên cứu sử<br /> dụng phương pháp multiplex PCR để phân tích mất đoạn nhỏ NST Y sử dụng 19 trình tự mồi phát<br /> hiện (STSs) thuộc ba gen của vùng yếu tố vô TT hoÆc Ýt TT. 323 bệnh nhân (BN) đối tượng nam<br /> không có TT có NST bình thường được phân tích. Kết quả: phát hiện 17/323 nam giới vô sinh<br /> (5,26%) bị mất đoạn nhỏ NST Y. Trong đó, 3 BN mất đoạn AZFa, 1 BN mất đoạn AZFb, 11 BN mất<br /> đoạn AZFc+d, 1 BN mất đoạn AZFa+b+c và 1 BN mất đoạn AZFa+b+c+d. Hai tổ hợp multiplex PCR<br /> được thiết kế sử dụng 8 trình tự mồi (STSs) có thể phát hiện một cách hiệu quả các mất đoạn phổ<br /> biến trên NST Y ở đối tượng vô sinh nam.<br /> * Từ khoá: Vô sinh nam; Vô tinh trùng; Mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y.<br /> <br /> CHARACTERISTICS AND DISTRIBUTION OF MICRODELETIONS<br /> ON Y CHROMOSOME in infertile azoospermia men<br /> Summary<br /> Analysis of the microdelection in azoospermia factor (AZF) region of Y chromosome by PCR is<br /> an important screening tool in treatment of infertile males. In the present study, the Y chromosome<br /> microdeletions were analyzed by PCR, using primers corresponding to 19 sequence tagged sites<br /> (STSs) on three genes of the AZF region. A total of 323 azoospermic male showing normal karyotype<br /> were included in the study. Results: Y chromosome microdeletions were observed in 17 out of 323<br /> (5.26%) infertile males. Of the seventeen subjects, 3 had deletions in AZFa, 1 in AZFb, 11 in AZFc+d, 1 in<br /> AZFa+b+c regions and 1 in AZFa+b+c+d. Two multiplex PCRs were designed using 8 STSs markers,<br /> which could detect efficiently almost Y chromosome microdeletions in infertile males.<br /> * Key words: Male infertile; Azoospermia; Micro-deletions in the Y-chromosome.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tỷ lệ vô sinh chiếm khoảng 5 - 10% các<br /> cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản. Khoảng<br /> 40% do nam giới, 40% do nữ và 20% còn<br /> lại do cả hai [3]. Trong số các trường hợp vô<br /> sinh nam, tỷ lệ không có TT chiếm khoảng<br /> <br /> 10 - 15%. Khoảng 10% trường hợp vô sinh<br /> không có TT không rõ nguyên nhân. Phân<br /> tích di truyền cho thấy 3 vùng không chồng<br /> nhau trên NST Y gọi là vùng yếu tố vô TT<br /> AZFa, AZFb và AZFc [10]. Mất đoạn nhỏ một<br /> trong số các gen này có thể liên quan đến<br /> suy giảm sinh tinh và vô sinh nam [1, 4, 6, 8].<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Hoàng Văn Lương<br /> GS. TS. Nguyễn Đình Tảo<br /> <br /> 1<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> Những nghiên cứu tần số mất đoạn nhỏ<br /> NST Y ở các chủng tộc trên thế giới cho<br /> thấy kết quả mất đoạn nhỏ NST Y ở nam<br /> giới không TT và ít TT không rõ nguyên<br /> nhân dao động từ 1 - 55%. Tuy nhiên, chưa<br /> có nhiều nghiên cứu về mất đoạn nhỏ NST<br /> Y trên BN vô sinh nam ở Việt Nam. Nghiên<br /> cứu này được thực hiện nhằm: Phân tích<br /> đặc điểm và phân bố mất đoạn nhỏ NST Y<br /> ở BN nam không có TT.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 323 nam giới vô sinh, không TT hoÆc Ýt<br /> TT, có vợ bình thường, đến khám tại Trung<br /> tâm Công nghệ Phôi, Học viện Quân y, Bộ<br /> môn Y sinh học - Di truyền, Đại học Y Hà<br /> Nội và Viện Nam học và Hiếm muộn Hà Nội<br /> trong thời gian 2010 - 2011. Sau khám xét<br /> lâm sàng, xét nghiệm hormon và kiểm tra<br /> hệ thống sinh dục, lựa chọn nam vô sinh<br /> không có TT làm đối tượng nghiên cứu. Lấy<br /> tinh dịch xét nghiệm sau khi kiêng sinh hoạt<br /> tình dục trong vòng 7 ngày. Phân tích các<br /> mẫu tinh dịch theo tiêu chí của Tổ chức Y tế<br /> Thế giới.<br /> * Tiêu chí loại trừ: vô sinh thứ phát, có bất<br /> thường cơ quan sinh dục, bất thường NST.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Mô tả cắt ngang.<br /> <br /> * Tách AND:<br /> Sử dụng kit ADN Blood Minikit (Qiagen)<br /> để tách ADN theo quy trình hướng dẫn của<br /> nhà sản suất. Kiểm tra nồng độ, độ tinh<br /> sạch mẫu ADN thu được bằng hệ thống<br /> Nano-Drop 1000, USA. Kiểm tra các mẫu<br /> đạt nồng độ, độ tinh sạch sẽ được dùng<br /> cho phản ứng PCR.<br /> * Lựa chọn các cặp mồi nhân đoạn gen<br /> AZF:<br /> - Tiêu chí lựa chọn: mồi nhân trình tự<br /> đặc hiệu trên vùng AZF thuộc nhánh dài<br /> NST Y. Mỗi vùng AZF a, b, c có ít nhất hai<br /> trình tự mồi, đặc biệt các vị trí hay xảy ra<br /> đứt gãy, mất đoạn gen. Các mồi có nhiệt độ<br /> gắn mồi tương đương nhau. Chúng tôi lựa<br /> chọn được 19 cặp mồi nhân vùng gen AZZF<br /> và 1 cặp mồi SRY nhân đoạn gen trên nhánh<br /> ngắn NST Y làm nội chứng dương.<br /> * Multiplex PCR:<br /> Dựa vào kích thước sản phẩm PCR,<br /> chúng tôi tổ hợp các mồi trên vào 5 ống<br /> phản ứng để chạy multiplex PCR. Mỗi phản<br /> ứng bao gồm 9 μl mastermix, 2 - 3 μl ADN<br /> khuôn, 0,25 - 0,5 μl mỗi mồi, nước cất vừa<br /> đủ đến 15 μl. Phản ứng thực hiện qua 35<br /> chu kỳ. Chu trình nhiệt cho mỗi chu kỳ như<br /> sau: 940C trong 45 giây, 570C trong 45 giây<br /> và 720C trong 1 phút. Chương trình được đặt<br /> biến tính lần đầu trước ở 940C trong 11 phút<br /> và cuối cùng nối dài 720C trong 6 phút.<br /> <br /> SRY (472 bp)<br /> <br /> SRY (472 bp)<br /> <br /> SRY (472 bp)<br /> <br /> DBY (689 bp)<br /> <br /> SRY (472 bp)<br /> <br /> sY254 (350 bp)<br /> <br /> sY84 (326 bp)<br /> <br /> sY143 (311 bp)<br /> <br /> SRY (472 bp)<br /> <br /> USP9Y (249 bp)<br /> <br /> sY86 (320 bp)<br /> <br /> sY134 (301 bp)<br /> <br /> sY128 (228 bp)<br /> <br /> sY157 (285 bp)<br /> <br /> sY81 (209 bp)<br /> <br /> sY127 (274 bp)<br /> <br /> sY153 (139 bp)<br /> <br /> sY130 (173 bp)<br /> <br /> AZFa (220 bp)<br /> <br /> sY133 (177 bp)<br /> <br /> sY124 (109 bp)<br /> <br /> sY121 (190 bp)<br /> <br /> sY255 (126 bp)<br /> <br /> sY152 (125 bp)<br /> <br /> * Điện di:<br /> <br /> 2<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, trong 1 giờ với hiệu điện thế 100 V và<br /> cường độ dòng điện 100 mA, nhuộm ethidium bromide, soi UV, chụp hình và phân tích.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> Sử dụng phản ứng multiplex PCR khảo sát mất đoạn nhỏ NST Y vùng AZF trên 329 BN<br /> vô sinh nam không có TT, kết quả như sau:<br /> 1. Tỷ lệ mất đoạn vùng AZF ở BN vô sinh nam.<br /> Với 323 BN vô sinh nam được kiểm tra không có bất thường về kiểu nhân, tiến hành<br /> phân tích ADN, chạy multiplex PCR với 19 cặp mồi nêu trên. Kết quả cho thấy: trong tổng<br /> số 323 BN được xét nghiệm ADN, 17 BN (5,26%) bị mất đoạn trên vùng AZF.<br /> Đối chiếu với kết quả của một số tác giả khác trong khu vực và trên thế giới chúng tôi thấy:<br /> Bảng 1: Tỷ lệ mất đoạn của nghiên cứu này so với một số nghiên cứu khác.<br /> TÁC GIẢ<br /> Martinez M.C, 2000 (Tây Ban Nha) [6]<br /> Canan F, 2004 (Thổ Nhĩ Kỳ) [3]<br /> A Zhou Can, 2006 (Trung Quốc) [2]<br /> Anurag Mitra, 2008 (Ấn Độ) [1]<br /> Nghiên cứu này<br /> <br /> n<br /> <br /> SỐ STSs<br /> <br /> TỶ LỆ (%)<br /> <br /> 57<br /> <br /> 10<br /> <br /> 14<br /> <br /> 47<br /> <br /> 6<br /> <br /> 4,26<br /> <br /> 220<br /> <br /> 6<br /> <br /> 15<br /> <br /> 170<br /> <br /> 6<br /> <br /> 5,29<br /> <br /> 323<br /> <br /> 20<br /> <br /> 5,26<br /> <br /> Tỷ lệ mất đoạn NST dao động trong các nghiên cứu khác nhau. Tuy nhiên, tỷ lệ này<br /> trong nghiên cứu của chúng tôi nằm ở giá trị trung bình so với các nghiên cứu khác của<br /> các nước trong cùng khu vực cũng như châu Âu, cho thấy việc lựa chọn cặp mồi để phát<br /> hiện mất đoạn nhỏ phù hợp với đối tượng nam vô sinh không TT ở người Việt Nam.<br /> 2. Phân bố mất đoạn theo từng vùng AZFa, AZFb, AZFc.<br /> Bảng 2: Phân bố tỷ lệ mất đoạn trên từng vùng AZF của nghiên cứu này và một số<br /> nghiên cứu khác.<br /> NGHIÊN<br /> CỨU NÀY<br /> <br /> MATINEZ<br /> (TÂY BAN<br /> NHA) [6]<br /> <br /> CANAN F.<br /> THỔ NHĨ<br /> KỲ [3]<br /> <br /> A ZHOU CAN<br /> (TRUNG<br /> QUỐC) [2]<br /> <br /> ANURAG<br /> (ẤN ĐỘ) [1]<br /> <br /> Mất đoạn vùng AZFa<br /> <br /> 3 (17,65%)<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 5<br /> <br /> 2<br /> <br /> Mất đoạn vùng AZFb<br /> <br /> 1 (5,88%)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1<br /> <br /> 8<br /> <br /> 1<br /> <br /> Mất đoạn vùng AZFc<br /> <br /> 0<br /> <br /> 3<br /> <br /> 0<br /> <br /> 19<br /> <br /> 3<br /> <br /> Mất đoạn vùng AZFd<br /> <br /> 0<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 0<br /> <br /> -<br /> <br /> (2)<br /> <br /> (3)<br /> <br /> (4)<br /> <br /> 5)<br /> <br /> (6)<br /> <br /> PHÂN BỐ<br /> <br /> (1)<br /> <br /> 3<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> Mất đoạn vùng AZFa+b<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> Mất đoạn vùng AZFb+c<br /> <br /> 0<br /> <br /> 4<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 3<br /> <br /> Mất đoạn vùng AZFc+d<br /> <br /> 11 (64,71%)<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 1<br /> <br /> -<br /> <br /> Mất đoạn vùng AZFa+b+c<br /> <br /> 1 (5,88%)<br /> <br /> 0<br /> <br /> -<br /> <br /> 0<br /> <br /> -<br /> <br /> Mất đoạn vùng AZFa+b+c+d<br /> <br /> 1 (5,88%)<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 0<br /> <br /> -<br /> <br /> Tổng số<br /> <br /> 17/323<br /> <br /> 8/57<br /> <br /> 2/47<br /> <br /> 33/220<br /> <br /> 9/170<br /> <br /> Mất đoạn AZFc+d thường đi cùng nhau<br /> và chiếm tỷ lệ cao nhất. Điều này có thể lý<br /> giải vì vùng AZFd là vùng chồng lấn AZFb<br /> và c, do đó, một số tác giả gộp vùng AZFb<br /> với c thành một vùng AZFc. Chỉ 2 BN mất<br /> đoạn trên cả 3 vùng AZFa+b+c hoặc 4 vïng<br /> AZFa+b+c+d.<br /> Mir Davood Omrami và CS [7] nghiên<br /> cứu, trên 99 BN không có TT và ít TT sử<br /> dụng 20 cặp mồi khác nhau bằng kỹ thuật<br /> multiplex PCR đã phát hiện 17 BN mất đoạn<br /> gen. Trong đó, 15 BN có một mất đoạn,<br /> <br /> 6 BN có hai mất đoạn và 3 BN mất ba đoạn.<br /> Những mất đoạn chủ yếu ở vùng AZFc<br /> (21/17 BN). Nghiên cứu của chúng tôi: điểm<br /> tương đồng về tỷ lệ mất đoạn AZFc+d là chủ<br /> yếu [1, 2, 3]. Tuy nhiên, tỷ lệ mất đoạn AZFa<br /> trong nghiên cứu này cao hơn các nghiên<br /> cứu khác là do đối tượng tham gia nghiên<br /> cứu chưa đại diện tiêu biểu cho cộng đồng<br /> dân cư trên toàn quốc, thông thường, các<br /> trường hợp đến khám và điều trị tại các trung<br /> tâm đã từng khám và điều trị ở nhiều nơi<br /> khác nhưng không đạt kết quả mong muốn.<br /> <br /> 3. Phân bố mất đoạn theo từng STS.<br /> Bảng 3: Phân bố tỷ lệ BN vô sinh nam theo từng STS nghiên cứu.<br /> a<br /> <br /> b<br /> <br /> d<br /> <br /> c<br /> <br /> sY<br /> <br /> AZFa<br /> <br /> 81<br /> <br /> 84<br /> <br /> 86<br /> <br /> DBY<br /> <br /> UPSP9Y<br /> <br /> 121<br /> <br /> 124<br /> <br /> 127<br /> <br /> 128<br /> <br /> 130<br /> <br /> 133<br /> <br /> 134<br /> <br /> 143<br /> <br /> 152<br /> <br /> 153<br /> <br /> 254<br /> <br /> 255<br /> <br /> 157<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 3<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 2<br /> <br /> 0<br /> <br /> 2<br /> <br /> 0<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 15<br /> <br /> 14<br /> <br /> 14<br /> <br /> 14<br /> <br /> 14<br /> <br /> (n = 83)<br /> <br /> Thống kê theo từng STS nghiên cứu ở<br /> từng vùng AZF thấy: các mất đoạn ở sY152,<br /> sY153, sY254, sY255, sY157 chiếm tỷ lệ<br /> cao nhất, 71/83 BN mất đoạn các loại, tiếp<br /> đến là mất đoạn ở sY84, sY127, sY121,<br /> sY130, sY133, s134, còn lại không phát<br /> hiện thấy mất đoạn ở các sY khác.<br /> <br /> 4<br /> <br /> A Zhou-Cun [2] nghiên cứu trên 358<br /> trường hợp, trong đó, 256 BN không TT và<br /> 102 BN ít TT phát hiện 319 BN không có<br /> bất thường nhiễm sắc, 220 BN không TT và<br /> 99 BN ít TT, sử dụng 12 cặp mồi sàng lọc<br /> mất đoạn nhỏ NST Y, 46 BN (14,4%) có mất<br /> đoạn. 33/220 BN không TT (15%) mất đoạn.<br /> Trong đó, tỷ lệ mất đoạn cao nhất liên quan<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> đến các sY: 152/254/255 (20/33 BN). Tiếp<br /> theo, sY84 (127/134 BN), sY86 chỉ gặp 1 BN.<br /> Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ<br /> mất đoạn AZFc liên quan đến các sY:<br /> 152/153/254/255/157 là cao nhất. Canan<br /> Figen Sargın và CS (2004) [3], nghiên cứu<br /> trên 60 BN, 48 BN không TT, 13 BN ít TT,<br /> phát hiện thấy 3 BN (3,3%) có mất đoạn.<br /> Trong đó, 1 BN mất đoạn liên quan sY127/254<br /> và 1 sY84/134 và 1 sY86. Nhiều nghiên cứu<br /> cũng thấy mất đoạn hoàn toàn vùng AZFa<br /> chắc chắn sẽ dẫn tới hội chứng SCOS<br /> [1, 4, 6, 8]. Ở những BN này, việc chọc hút<br /> hay sinh thiết mào tinh để lấy TT hoàn toàn<br /> vô ích. Do vậy, nên khuyên những BN này<br /> nhận con nuôi thay vì theo đuổi các phương<br /> pháp điều trị. Đối với trường hợp chỉ mất<br /> đoạn vùng AZFb sẽ gây hiện tượng kìm<br /> hãm quá trình sinh tinh, trường hợp BN mất<br /> đoạn AZFb+c dẫn tới hội chứng SCOS<br /> hoặc hiện tượng kìm hãm sinh tinh [4].<br /> Trong nghiên cứu của chúng tôi, 1 trường<br /> hợp mất cả hai STS sY127, sY134 của<br /> vùng AZFb. Đối với BN bị mất AZFb hoặc<br /> AZFb/c không thấy TT khi áp dụng kỹ thuật<br /> TESE. Hopp và CS [4] đã chứng minh, đối<br /> với những mất đoạn trên AZFa, AZFb,<br /> AZFb+c, không có khả năng tách TT khi sử<br /> dụng kỹ thuật TESE, trong khi đó, đối với<br /> mất đoạn trên AZFc, khả năng tách TT từ<br /> tinh hoàn thành công lên đến 75%. Tương<br /> đồng với những kết quả nghiên cứu trên,<br /> Krausz [5] đã phát hiện 50% xuất hiện TT ở<br /> trường hợp mất đoạn thuộc vùng AZFc và<br /> những mất đoạn thuộc vùng AZFa, AZFb<br /> hiếm khi tách được TT từ tinh hoàn. Vì vậy,<br /> phát hiện các mất đoạn AZF khác nhau liên<br /> <br /> quan đến tiên lượng và chỉ định điều trị.<br /> Giữa tỷ lệ mất đoạn nhỏ được phát hiện và<br /> STS được sử dụng trong nghiên cứu có<br /> mối quan hệ chặt chẽ với nhau. Vì vậy,<br /> nghiên cứu thêm để đưa ra bộ STS phù<br /> hợp nhằm có được kết quả cao là điều cần<br /> thiết [9].<br /> Dưới đây là một số kết quả điện di trong<br /> nghiên cứu:<br /> <br /> Hình 1: Ảnh điện di của BN phát hiện<br /> mất đoạn ở sY84, sY86.<br /> <br /> 5<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2