Đánh giá chất lượng của vật liệu nội kiểm HIV tự pha chế tại Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CỦA VẬT LIỆU NỘI KIỂM HIV TỰ PHA CHẾ<br /> TẠI BỆNH VIỆN PHẠM NGỌC THẠCH<br /> Mai Nguyệt Thu Huyền*, Đặng Thị Minh Hà* Nguyễn Thị Bích Vân*, Công Thị Mai Linh*,<br /> Nguyễn Công Thành*, Nguyễn Mạnh Hoàng*, Khuất Thị Anh Đào*, Nguyễn Hữu Lân*<br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Nội kiểm xét nghiệm là một điều kiện không thể thiếu trong việc đánh giá chất lượng xét<br /> nghiệm nói chung và chất lượng xét nghiệm khẳng định HIV nói riêng. Hiện tại vật liệu nội kiểm sinh phẩm HIV<br /> chưa có trên thị trường.<br /> Mục tiêu: Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu và tính ổn định của vật liệu nội kiểm HIV tự pha chế.<br /> Phương pháp: Thu thập các mẫu huyết thanh HIV dương tính với cả 3 sinh phẩm liên tiếp: Murex Ag/Ab,<br /> Determine HIV1/2, SD Bioline 3.0. Trộn đều các mẫu huyết thanh trên lại với nhau và phân ra thành các tube<br /> nhỏ, mỗi tube chứa 200 µl huyết thanh và lưu ở -20 độ C trong 3 tháng.<br /> Mẫu huyết tương âm tính được lấy từ các dây của các túi máu dùng truyền cho bệnh nhân. Trộn đều các<br /> mẫu huyết tương này lại với nhau sau đó chia ra thành các tube nhỏ, mỗi tube chứa 200 µl huyết tương và lưu -<br /> 20 độ C trong 3 tháng.<br /> Kết quả: Từ 1/11/2017/đến 5/11/2018, có 7 lô huyết thanh/huyết tương dùng cho nội kiểm tự pha chế, gồm<br /> 51 mẫu huyết thanh dương tính và 51 mẫu huyết tương âm tính. Tất cả các mẫu này đều có độ nhạy và độ đặc<br /> hiệu đạt 100% đối với các sinh phẩm Murex Ag/Ab, Determine HIV1/2 và SD Bioline 3.0. Theo dõi trong vòng 3<br /> tháng các optical density (OD) của chứng dương dao động từ 1,589-3,891 và các OD của chứng âm 0,049-0,088<br /> ( OD cut off: 0,196-0,229). Không có mẫu nào cho kết quả dương tính giả hay âm tính giả.<br /> Kết luận: Chúng tôi đã pha chế thành công vật liệu nội kiểm HIV với độ nhạy và độ đặc hiệu 100%, Vật liệu<br /> này vẫn ổn định trong 3 tháng ở âm 20oC và rã đông một lần.<br /> Từ khóa: HIV, nội kiểm, optical density<br /> ABSTRACT<br /> EVALUATION OF THE STABILITY OF THE IN-HOUSE INTERNAL QUALITY CONTROL MATERIAL<br /> FOR HIV TESTING AT PHẠM NGỌC THẠCH HOSPITAL<br /> Mai Nguyet Thu Huyen, Dang Thi Minh Ha, Nguyen Thi Bich Van, Cong Thi Mai Linh,<br /> Nguyen Cong Thanh, Nguyen Manh Hoang, Khuat Thi Anh Dao, Nguyen Huu Lan<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 3- 2019: 253-258<br /> Background: Internal control is an indispensable method in evaluating the quality of laboratory tests in<br /> general and of HIV-confirming tests in particular. The internal quality material control kit for HIV test is not yet<br /> available in the market.<br /> Objective: To evaluate the sensitivity, the specificity and the stability of the in-house internal quality<br /> material control kit for HIV test.<br /> Method: HIV-positive serum samples confirmed by all three sequential confirming tests including<br /> Murex Ag/Ab HIV, Determine HIV ½ and SD Bioline 3.0 were collected. They were well-mixed together<br /> <br /> *Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch<br /> Tác giả liên lạc: TS.BS Mai Nguyệt Thu Huyền ĐT: 0902944701 Email: maihuyen1967@yahoo.com<br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 253<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019<br /> <br /> and divided into 200 µl aliquots that were then frozen at -20oC for 3 months. Negative plasma samples were<br /> collected from the strings of blood transfusion bags and then divided into 200 µl aliquots that were then<br /> frozen at -20°C for 3 months.<br /> Results: From November 1, 2017 to November 5, 2018, seven batches were made, including 51 HIV-<br /> positive serum samples and 51 HIV-negative plasma samples. They all showed 100% sensitivity and 100%<br /> specificity for Murex Ag / Ab, Determine HIV1/2 and SD Bioline 3.0 tests.<br /> Follow up within 3 months, ODs of positive control samples range from 1,589-3,891 and ODs of negative control<br /> samples range from 0.049-0.088 (ODs cut off: 0.196-0.229). There are no samples that show false positive or false<br /> negative results.<br /> Conclusion: We have successfully prepared the in-house internal quality material control for HIV test with<br /> 100% sensitivity and specificity, this material is still stable within 3 months at -20oC and thawed once.<br /> Keywords: HIV, Internal Control, optical density<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ bộ kít nội kiểm gồm các mẫu huyết thanh dương<br /> tính và các mẫu huyết tương âm tính từ các<br /> Để đạt mục tiêu kết thúc đại dịch AIDS vào<br /> nguyên liệu hiện có.<br /> năm 2030, chúng ta phải đạt được mục tiêu 90-<br /> 90-90. Đó là: Mục tiêu<br /> 90% số người nhiễm HIV được biết tình Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu và tính ổn<br /> trạng nhiễm HIV của mình; 90% số người chẩn định của vật liệu nội kiểm HIV tự pha chế<br /> đoán nhiễm HIV được điều trị ARV liên tục; ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU<br /> và 90% số người được điều trị ARV kiểm soát Thiết kế nghiên cứu<br /> được tải lượng vi-rút ở mức thấp và ổn định, Thực nghiệm y học.<br /> tức là tải lượng vi-rút HIV ở mức thấp dưới<br /> Đối tượng<br /> ngưỡng phát hiện(2).<br /> Mẫu chứng dương: Gồm huyết thanh của<br /> Để đạt đươc mục tiêu 90 đầu tiên, bên cạnh<br /> bệnh nhân đã được khẳng định dương tính với<br /> việc gia tăng mở rộng hệ thống mạng lưới xét<br /> HIV bằng 3 test chẩn đoán HIV được Bộ Y tế<br /> nghiệm phát hiện nhiễm HIV tại cộng đồng<br /> công nhận(4).<br /> bằng các xét nghiệm chẩn đoán nhanh, mạng<br /> lưới các phòng xét nghiệm khẳng định HIV tại Mẫu chứng âm: Huyết thanh từ các dây<br /> tuyến huyện thực hiện bằng ba test nhanh cũng trong túi máu để truyền máu cho bệnh nhân(1).<br /> phải được phát triển. Phương pháp<br /> Các phòng xét nghiệm thực hiện xét nghiệm Quy trình pha chế huyết thanh nội kiểm dương tính<br /> khẳng định HIV cần phải bảo đảm chất lượng Thu thập các mẫu huyết thanh dương tính<br /> xét nghiệm bằng cách thực hiện nội kiểm và với HIV ở cả 3 sinh phẩm Murex Ag/Ab HIV1/2<br /> tham gia thực hiện ngoại kiểm theo Quyết định (có OD >= 1 trở lên), Determine HIV1/2 và SD<br /> 2429/QĐ-BYT của bộ y tế về đánh giá chất lượng bioline 3.0. Sau khi lưu các mẫu dương tính theo<br /> phòng xét nghiệm y học(3). quy định, dùng pipette hút toàn bộ huyết thanh<br /> Hiện tại, xét nghiệm ngoại kiểm được viện dương tính còn lại cho vào các tube lớn 10ml đã<br /> Pasteur TP. Hồ Chí Minh tổ chức thực hiện mỗi được đánh đấu "chứng dương " (ống A). Trộn<br /> 6 tháng. Tuy nhiên, xét nghiệm nôi kiểm HIV đều tất cả các mẫu dương trong ống A, sau đó<br /> chưa thực hiện được vì bộ kít nội kiểm HIV chưa hút 200 µl huyết thanh trong ống A cho vào mỗi<br /> có trên thị trường. Do đó, để bảo đảm chất lượng tube effpendorf. Lưu các tube này ở -20°C trong<br /> xét nghiệm khẳng định HIV theo Quyết định 3 tháng. Ghi ngày pha chế. Mỗi tuần lấy một<br /> 2429/QĐ-BYT, chúng tôi đã tiến hành tự pha chế tube để làm nội kiểm. Thời gian từ lúc thu thập<br /> <br /> <br /> 254 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> mẫu đến lúc trữ đông là 24 giờ. giá trị OD cut off max và min để xác định giá trị<br /> Thu thập các dây của các túi máu dùng chẩn đoán.<br /> truyền cho bệnh nhân ( túi máu dùng truyền cho Bảng 1: Độ nhạy và độ đặc hiệu được tính theo bảng<br /> bệnh nhân chắc chắn đã được xác định 2x2<br /> HIV,HbsAg, và HCV âm tính). Dùng pipette hút Sinh phẩm xét nghiệm<br /> toàn bộ máu trong dây truyền máu cho vào các Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính<br /> Dương tính A C<br /> tube effpendorf 2ml đã đánh dấu "chứng âm",<br /> Âm tính B D<br /> quay ly tâm 3000 rpm/ 5 phút để tách huyết<br /> Tổng cộng A+B C+D<br /> tương. Dùng pipette hút dung dịch nổi (huyết<br /> Độ nhạy = A/(A+B)X 100%.<br /> tương) cho vào ống 10ml (ống B - "Chứng âm").<br /> Trộn đều huyết tương trong ống B và hút 200 µl Độ đặc hiệu = D/(C+D)X 100%.<br /> cho vào mỗi tube effpendorf. Lưu các tube này ở KẾT QUẢ<br /> -20°C trong 3 tháng. Ghi ngày pha chế. Mỗi tuần Từ ngày 01/11/2017/đến ngày 05/11/2018,<br /> lấy một tube làm nội kiểm. Thời gian từ lúc thu chúng tôi đã pha chế được 7 lô mẫu nội kiểm,<br /> thập mẫu đến lúc trữ đông là 24 giờ. gồm 51 mẫu huyết thanh HIV dương tính và 51<br /> Quy trình thực hiện mẫu huyết tương HIV âm tính:<br /> Chọn ngẫu nhiên một mẫu HIV dương và Độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định<br /> một mẫu HIV âm trong cùng một lô pha chế. Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ ở âm 20<br /> Thực hiện xét nghiệm với cả 3 test HIV cho mỗi độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng Murex<br /> mẫu. Lặp lại test 5 lần cho mỗi mẫu trong 5 ngày Ag/Ab HIV<br /> để đánh giá độ lặp lại.<br /> Bảng 2: Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ ở âm<br /> Mỗi tuần, thử mẫu nội kiểm dương và nội 20 độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng Murex Ag/Ab<br /> kiểm âm của mỗi lô với ba sinh phẩm Murex HIV<br /> Ag/Ab HIV 1/2, Determine HIV1/2 và SD Bioline Murex Ag/Ab HIV<br /> 3.0. Ghi nhận kết quả âm tính/ dương tính theo Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính<br /> hướng dẫn của nhà sản xuất. Dương tính 51 0<br /> Mỗi tube sau khi rã đông chỉ dùng 1 lần. Âm tính 0 51<br /> Tổng cộng 51 51<br /> Phân tích kết quả<br /> Độ nhạy: 100%<br /> Dùng phần mềm Excel.<br /> Độ đặc hiệu: 100%.<br /> Để theo dõi độ ổn định của vật liệu nôi kiểm<br /> OD trung bình: 0,063 (Hình 1).<br /> tự pha chế, do lượng huyết thanh có hạn, nên<br /> chúng tôi pha chế 3 lô 5,6,7 mỗi lô 12 tube (từ OD min=0,049.<br /> mẫu 16-51) và lưu âm 20 độ C sử dụng trong 3 OD max= 0,088.<br /> tháng để theo dõi tính biến thiên của OD theo Giá trị OD cut off: 0,196-0,229.<br /> thời gian. Tất cả các kết quả OD của chứng OD trung bình= 3,1 (Hình 2).<br /> dương và chứng âm được nhập vào 2 cột Excel OD min=1,589.<br /> riêng theo thứ tự thời gian của các lần thực hiện.<br /> OD max= 3,891.<br /> Sau đó vẽ biểu đồ bằng excel tính giá trị OD<br /> Giá trị OD cut off: 0,196 – 0,229.<br /> trung bình, OD max và OD min và so sánh với<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 255<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019<br /> <br /> <br /> BIỂU ĐỒ MẪU HUYẾT TƯƠNG ÂM<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 0,09<br /> <br /> 0,08<br /> <br /> 0,07<br /> <br /> 0,06<br /> OD<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 0,05 OD MẪU THỬ<br /> <br /> 0,04<br /> <br /> 0,03<br /> <br /> 0,02<br /> <br /> 0,01<br /> <br /> 0<br /> 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51<br /> SỐ LẦN NỘI KIỂM<br /> <br /> <br /> Theo dõi độ ổn định OD (lần 16-51)<br /> Hình 1: Biểu đồ biến thiên của OD mẫu huyết tương HIV âm tính theo thời gian<br /> <br /> BIỂU ĐỒ MẪU HUYẾT THANH DƯƠNG<br /> <br /> <br /> 4,5<br /> <br /> <br /> 4<br /> <br /> <br /> 3,5<br /> <br /> <br /> 3<br /> <br /> <br /> 2,5<br /> OD<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> OD MẪU THỬ<br /> 2<br /> <br /> <br /> 1,5<br /> <br /> <br /> 1<br /> <br /> <br /> 0,5<br /> <br /> <br /> 0<br /> 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51<br /> SỐ LẦN NỘI KIỂM<br /> <br /> <br /> Theo dõi độ ổn định OD (lần16-51)<br /> Hình 2: Biểu đồ biến thiên của OD mẫu huyết thanh HIV dương tính theo thời gian<br /> <br /> <br /> <br /> 256 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ ở âm 20 Độ nhạy: 100%. Độ đặc hiệu: 100%.<br /> độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng Determine Mẫu huyết thanh/huyết tương lưu trữ ở âm 20<br /> HIV1/2 độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng SD Bioline 3.0<br /> Bảng 3: Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ ở âm Bảng 4: Mẫu huyết thanh/huyết tương lưu trữ ở âm<br /> 20 độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng Determine 20 độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng SD Bioline 3.0<br /> HIV1/2 SD Bioline 3.0<br /> Determine HIV1/2 Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính<br /> Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính Dương tính 51 0<br /> Dương tính 51 0 Âm tính 0 51<br /> Âm tính 0 51 Tổng cộng 51 51<br /> Tổng cộng 51 51 Độ nhạy: 100%. Độ đặc hiệu: 100%.<br /> Độ lặp lại của sinh phẩm MurexAg/Ab HIV trong cùng một lô pha chế<br /> Bảng 5: Độ lặp lại của sinh phẩm MurexAg/Ab HIV trong cùng một lô pha chế<br /> OD/CO OD/CO OD/CO OD/CO OD/CO<br /> Mẫu SD Mean CV%<br /> Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5<br /> Dương 14.441 13.500 14.029 14.354 13.315 0.5 13.92 3.6<br /> Âm 0.242 0.252 0.252 0.237 0.266 0.01 0.27 4.0<br /> BÀN LUẬN Sinh phẩm Murex hoạt động theo kỹ thuật<br /> 51 mẫu huyết tương âm tính HIV từ túi máu ELISA nên để đánh giá tính ổn định của sản<br /> và 51 mẫu huyết thanh HIV dương tính được phẩm, chúng tôi dựa vào sự thay đổi của OD.<br /> pha chế từ các mẫu huyết thanh HIV dương tính Do lượng huyết thanh/huyết tương có hạn,<br /> của bệnh nhân được lưu trữ ở -20 độ C trong chúng tôi chỉ pha chế lượng mẫu đủ dùng trong<br /> thời gian tối đa 3 tháng có kết quả độ nhạy và độ 3 tháng vì vậy chỉ đánh giá tính ổn định của sản<br /> đặc hiệu đạt 100% ở cả 3 sinh phẩm murex, phẩm trong thời gian 3 tháng, lưu trữ ở âm 20 độ<br /> Determine HIV1/2 và SD bioline 3.0. Điều này C và chỉ rã đông 1 lần.<br /> cho thấy bộ huyết thanh này rất ổn định với Đối với 3 lô 5,6,7 (lưu trữ 3 tháng) kết quả<br /> nhiệt độ và thời gian lưu trữ. cho thấy giá trị OD của các mẫu khá ổn định<br /> Cả 3 sinh phẩm Murex, Determine HIV1/2 như 4 lô đầu tiên (thời gian lưu trữ trong vòng 1<br /> và SD bioline 3.0 đều được Bộ Y Tế công nhận và tháng), tuy OD có thay đổi nhưng tính đến thời<br /> khuyến cáo dùng trong xét nghiệm khẳng định hạn 3 tháng kể từ ngày pha chế các giá trị OD<br /> HIV(4). Khoa xét nghiệm của chúng tôi đã dùng 3 vẫn đạt yêu cầu chẩn đoán (Hình 1, 2) và không<br /> sinh phẩm này tham gia ngoại kiểm HIV từ 2007 có mẫu nào cho kết quả dương tính giả hay âm<br /> cho đến nay; mỗi năm thực hiện 02 đợt ngoại tính giả.<br /> kiểm, tổng cộng 24 lần ngoại kiểm đều có kết Việc tự pha chế bộ mẫu nội kiểm mang lại<br /> quả đạt độ chính xác 100%. Điều này cho thấy rất nhiều lợi ích cho phòng xét nghiệm trong<br /> việc sử dụng 03 sinh phẩm này để pha chế vật việc bảo đảm chất lượng xét nghiệm khi mà bộ<br /> liệu nội kiểm là rất đáng tin cậy. kít nội kiểm chưa có trên thị trường. Hơn nữa,<br /> quy trình pha chế bộ mẫu nội kiểm từ các mẫu<br /> Đối với mẫu chứng âm, chúng tôi đã dùng<br /> huyết thanh sẵn có rất dễ thực hiện và có thể<br /> máu có trong dây truyền máu của túi máu để<br /> nhân rộng ở các phòng xét nghiệm khẳng định<br /> pha chế mẫu chứng âm. Đây là mẫu máu đã HIV, giúp tiết kiệm chi phí hoạt động của phòng<br /> được loại trừ nhiễm HIV bằng công nghệ NAT xét nghiệm và giảm giá thành của test. Tuy<br /> (Nucleic Acid Testing) nên kết quả HIV âm tính nhiên để vật liệu nội kiểm được ổn định cần lưu<br /> của mẫu là rất đáng tin cậy(1). ý chia thể tích huyết thanh hay huyết tương đủ<br /> <br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 257<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019<br /> <br /> cho một lần sử dụng (tránh rã đông và tái đông HIV bằng các vật liệu có sẳn với độ nhạy và độ<br /> nhiếu lần) và lưu trử âm 20 độ C đến thời gian 3 đặc hiệu đạt 100%; và vẫn ổn định trong 3 tháng.<br /> tháng vẫn còn sử dụng tốt. TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> Trong nghiên cứu này còn hạn chế do lượng 1. Bộ Y tế (2013). Hướng dẫn hoạt động truyền máu. Thông tư số<br /> mẫu ít, nên chúng tôi chỉ có thể theo dõi vật liệu 26/2013/TT-BYT.<br /> 2. Bộ Y tế (2016). Mục tiêu 90-90-90 trong phòng chống HIV-AIDS.<br /> nội kiểm tự pha chế ở âm 20 độ C trong vòng 3 3. Bộ Y tế (2017). Tiêu chí đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y<br /> tháng. Hy vọng trong tương lai với số lượng học. Quyết định số 2429/QĐ-BYT<br /> mẫu thu thập nhiều hơn có thể theo dõi tính ổn 4. Bộ Ytế (2018). Cung cấp danh mục sinh phẩm chẩn đoán HIV. Công<br /> văn 117/AIDS-GSXN.<br /> định của vật liệu nội kiểm ở nhiều nhiệt độ khác<br /> nhau và thời gian lâu hơn. Ngày nhận bài báo: 02/01/2019<br /> KẾT LUẬN Ngày phản biện nhận xét bài báo: 25/01/2019<br /> Lần đầu tiên chúng tôi đã pha chế thành Ngày bài báo được đăng: 20/04/2019<br /> công vật liệu nội kiểm xét nghiệm khẳng định<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 258 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch<br />