Đánh giá chất lượng và cơ chế tác dụng của globulin miễn dịch đặc hiệu nguồn gốc từ trứng gà kháng độc tố tả (cholera toxin)

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br /> <br /> ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG VÀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA<br /> GLOBULIN MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU NGUỒN GỐC TỪ<br /> TRỨNG GÀ KHÁNG ĐỘC TỐ TẢ (CHOLERA TOXIN)<br /> Hoàng Trung Kiên*; Nguyễn Đặng Dũng*<br /> TÓM TẮT<br /> Theo một số nghiên cứu gần đây trên động vật thực nghiệm, kháng thể kháng độc tố tả (ĐTT)<br /> (cholera toxin) hoặc kháng tiểu phần B của ĐTT (CT-B subunit) có thể được sử dụng như là một<br /> biện pháp tạo miễn dịch thụ động đặc hiệu nhằm điều trị và/hoặc dự phòng trường hợp nhiễm vi<br /> khuẩn (VK) tả đường tiêu hóa. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát chất lượng và có chế tác<br /> dụng của kháng thể IgY kháng ĐTT được phân lập từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch với kháng<br /> nguyên ĐTT. Kết quả cho thấy kháng thể IgY kháng độc tố VK tả phân lập từ lòng đỏ trứng gà gây<br /> miễn dịch thể hiện hoạt tính đặc hiệu với độc tố VK tả trên in vitro, ngăn không cho độc tố gắn vào<br /> thụ thể GM1.<br /> * Từ khóa: Độc tố tả; Kháng thể IgY.<br /> <br /> Study on quality and mechanism of action of yolk<br /> immunoglobulin (IgY) specific to cholera toxin<br /> Summary<br /> Recently, several papers revealed that antibodies against cholera toxin (CT) or CT-B subunit<br /> showed protective effect when used as preventive or therapeutic method on animal models orally<br /> infected with V.cholerae. In the present study, we investigated the purity and tested the reactivity<br /> of IgY isolated from eggs laid of previously immunized hens. The results showed that the IgY<br /> preparation isolated from eggs laid of immunized hens was relatively pure and could inhibit binding of<br /> CTB with GM1 in vitro.<br /> * Key words: Cholera toxin; Immunoglobulin Y (IgY).<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Bệnh tiêu chảy là một trong những nguyên<br /> nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn cầu,<br /> chủ yếu ở trẻ em, đặc biệt các quốc gia đang<br /> phát triển. Một trong những tác nhân gây tiêu<br /> chảy cấp là nhiễm K tả (Vibrio cholerae)<br /> <br /> theo đường tiêu hóa. Theo thống kê của Tổ<br /> chức Y tế Thế giới (WHO) công bố năm<br /> 2013, trong năm 2012 đã ghi nhận 245.393<br /> trường hợp mắc bệnh tả tại tất cả các châu<br /> lục trên toàn thế giới, với 3.034 trường hợp<br /> tử vong [7]. Cơ chế bệnh sinh của bệnh có<br /> sự tham gia của ĐTT (cholera toxin - CT),<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Đặng Dũng (dzungmd@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 30/11/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/12/2013<br /> Ngày bài báo được đăng: 16/12/2013<br /> <br /> 7<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br /> do VK tả tiết ra sau khi nhiễm vào ruột bệnh<br /> <br /> nguyên là 0,1 mg/ml, sau đó gây miễn dịch<br /> <br /> nhân; ĐTT gây tổn thương tế bào niêm mạc<br /> <br /> cho gà mái, thu hoạch trứng và tách chiết<br /> <br /> ruột, làm tăng tiết dịch tại ruột, dẫn đến ỉa<br /> <br /> kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng theo các<br /> <br /> chảy cấp. Một số nghiên cứu gần đây cho<br /> <br /> quy trình đã được mô tả trong nghiên cứu<br /> <br /> thấy, bên cạnh các biện pháp dự phòng và<br /> <br /> trước của chúng tôi [1].<br /> <br /> điều trị kinh điển khi nhiễm VK tả (như sử<br /> dụng vắcxin, bổ sung nước, điện giải; sử<br /> dụng kháng sinh), việc sử dụng kháng thể<br /> đặc hiệu với VK tả hoặc với ĐTT có thể là<br /> một biện pháp dự phòng và/hoặc điều trị<br /> đặc hiệu có tác dụng bảo vệ rõ rệt trên mô<br /> hình động vật thực nghiệm nhiễm VK tả<br /> đường tiêu hóa [4, 6].<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo<br /> <br /> * Kiểm tra khả năng gắn kết của CT-B<br /> với GM1 in vitro:<br /> - Gắn GM1 lên phiến ELISA: ủ 50 µl GM1<br /> (100 pmol/ml) trong mỗi giếng của phiến<br /> ELISA, thời gian 2 giờ ở nhiệt độ phòng.<br /> - Tiến hành phản ứng: bổ sung vào mỗi<br /> giếng 50 µl cộng hợp HRP-CTB ở những<br /> nồng độ khác nhau, sao cho lượng CTB<br /> trong mỗi giếng lần lượt là 1,25; 2,5 và 5<br /> <br /> sát độ tinh sạch, đồng thời đánh giá hoạt<br /> <br /> ng; rửa giếng bằng PBS-T, sau đó bổ sung<br /> <br /> tính kháng thể IgY phân lập từ trứng gà<br /> <br /> vào mỗi giếng 50 µl OPD (0,5 mg/ml, mỗi<br /> <br /> được gây miễn dịch với ĐTT trên in vitro.<br /> <br /> 50 ml OPD bổ sung thêm 20 µl H2O2 ngay<br /> trước khi sử dụng); ủ phiến ELISA ở nhiệt<br /> <br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> <br /> độ phòng 15 phút trong bóng tối; ngừng<br /> <br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> phản ứng bằng cách bổ sung 50 ul HCl 2N.<br /> <br /> 1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu.<br /> - Độc tố VK tả (cholera toxin- CT) (Sigma,<br /> Hoa Kỳ).<br /> - Hoá chất, sinh phẩm chủ yếu: hóa chất<br /> <br /> - Đo mật độ quang (OD) của các giếng<br /> tại bước sóng 492 nm.<br /> * Ph¶n øng ELISA đánh giá hoạt tính của<br /> kháng thể IgY kháng CT-B:<br /> <br /> chạy điện di SDS-PAGE; GM1, cộng hợp CTB<br /> <br /> - Ủ 50 µl GM1 (100 pmol/ml) trong mỗi giếng<br /> <br /> (cholera toxin-B subunit)- HRP (horse radish<br /> <br /> của phiến ELISA trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.<br /> <br /> peroxidase) (Bio-Rad, Hoa Kỳ; Sanofi, Pháp).<br /> <br /> - Bổ sung cộng hợp HRP-CTB cùng với<br /> <br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> <br /> kháng thể IgY phân lập từ lòng đỏ trứng gà<br /> <br /> * Gây miễn dịch cho gà mái với kháng<br /> <br /> gây miễn dịch với kháng nguyên CT. Giếng đối<br /> <br /> nguyên ĐTT và phân lập IgY:<br /> - Tạo kháng nguyên ĐTT: trộn huyền<br /> dịch ĐTT với tá chất freund hoàn chỉnh<br /> <br /> chứng âm, sử dụng BSA thay cho IgY. Bên<br /> cạnh đó, I Ig (intravenous immunoglobulin) được<br /> sử dụng như đối chứng dương trong thí nghiệm.<br /> <br /> hoặc không hoàn chỉnh (tỷ lệ 1:1 về thể<br /> <br /> - Rửa phiến ELISA bằng PBS-T. Bổ sung<br /> <br /> tích); nồng độ ĐTT trong huyền dịch kháng<br /> <br /> vào mỗi giếng 50 µl OPD (0,5 mg/ml, mỗi 50 ml<br /> <br /> 8<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br /> OPD bổ sung thêm 20 µl H2O2). Ủ phiến<br /> ELISA trong bóng tối 15 phút ở nhiệt độ<br /> phòng; ngừng phản ứng bằng cách bổ sung<br /> 50 ul HCl 2N. Đo OD của các giếng tại bước<br /> sóng 492 nm.<br /> <br /> khoảng 70 kDa và 35 kDa, tương ứng với<br /> chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L) của IgY.<br /> 2. Khả năng gắn kết của CTB với GM1<br /> in vitro.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Độ tinh sạch của chế phẩm IgY sau<br /> phân lập.<br /> Đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm IgY<br /> sau thẩm tích loại muối bằng kỹ thuật điện<br /> di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính protein.<br /> <br /> CT-B concentration (ng/well<br /> <br /> Hình 2: Khả năng gắn kết của CTB với<br /> GM1 in vitro.<br /> Kết quả thí nghiệm cho thấy ở các nồng<br /> độ khác nhau, CTB đều thể hiện khả năng<br /> gắn kết đặc hiệu với GM1 in vitro.<br /> 3. Tác dụng của IgY ức chế gắn kết<br /> của CTB với GM1.<br /> <br /> Hình 1: Kết quả điện di SDS-PAGE trong<br /> điều kiện biến tính IgY.<br /> <br /> Hình 3: Tác dụng của IgY ức chế gắn kết<br /> CTB- GM1 in vitro.<br /> (GM1: 5 pmol/giếng; CTB: 5 ng/giếng).<br /> <br /> Kết quả cho thấy, sản phẩm IgY thu<br /> được sau thẩm tích loại bỏ muối amoni<br /> sulfate có độ tinh sạch cao, với 2 băng trên<br /> điện di SDS-PAGE có trọng lượng lần lượt<br /> <br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br /> <br /> Hình 4: Tác dụng của IgY ức chế gắn kết<br /> CTB- GM1 in vitro.<br /> (GM1: 5 pmol/giếng; CTB: 1 ng/giếng)<br /> <br /> Hình 5: Tác dụng của IgY ức chế gắn kết<br /> CTB- GM1 in vitro.<br /> (GM1: 5 pmol/giếng; CTB: 0,2 ng/giếng)<br /> Kết quả phản ứng ELISA cho thấy: kháng<br /> thể IgY thu được từ lòng đỏ trứng gà gây<br /> miễn dịch bằng độc tố VK tả phản ứng đặc<br /> hiệu với CTB, đồng thời thể hiện tác dụng<br /> ức chế sự gắn kết của CTB với GM1, trong<br /> khi BSA (đối chứng âm) không thể hiện tác<br /> dụng này. I Ig chỉ thể hiện tác dụng ức chế<br /> gắn kết của CTB với GM1 khi nồng độ CTB<br /> là 1,0 và 0,2 ng/giếng (hình 4, 5), không thể<br /> hiện tác dụng này ở nồng độ CTB 5 ng/giếng<br /> (hình 3). Việc sử dụng I Ig như đối chứng<br /> dương trong thí nghiệm này dựa vào kết<br /> quả nghiên cứu của Yuki N. và CS (1996)<br /> công bố, trong đó, nhóm nghiên cứu nhận<br /> thấy I Ig có tác dụng ngăn cản sự gắn kết<br /> của ĐTT với GM1 in vitro [5]. Kết quả nghiên<br /> cứu cho thấy chế phẩm IgY do chúng tôi<br /> <br /> 10<br /> <br /> tạo ra thể hiện hoạt tính ức chế gắn kết của<br /> CTB với GM1 mạnh hơn rõ rệt so với hoạt<br /> tính của IVIg: ở tất cả các nồng độ CTB<br /> được khảo sát, IgY đều thể hiện tác dụng<br /> ức chế. Lý do có được kết quả này là do<br /> IgY sử dụng trong thí nghiệm là sản phẩm<br /> thu được sau gây miễn dịch đặc hiệu với<br /> CT. Do đó, IgY có khả năng gắn kết đặc<br /> hiệu với CTB, dẫn đến ức chế gắn kết của<br /> CTB với GM1. Hoạt tính này của IgY kháng<br /> ĐTT có thể là một cơ chế tác dụng của IgY<br /> đặc hiệu với CT tạo ra hiệu quả bảo vệ: IgY<br /> ức chế gắn của CTB với thụ thể GM1 trên<br /> tế bào niêm mạc ruột, do đó ngăn chặn<br /> ĐTT bám lên màng tế bào niêm mạc ruột,<br /> cuối cùng, giảm tác động gây tổn thương tế<br /> bào niêm mạc ruột của ĐTT.<br /> Bằng phương pháp gây miễn dịch trên<br /> gà mái và thu thập kháng thể IgY từ lòng đỏ<br /> trứng của gà gây miễn dịch, Hoàng Trung<br /> Kiên và CS đã thu được IgY từ lòng đỏ<br /> trứng gà kháng K E. ictaluri (gây bệnh mủ<br /> gan cá tra) [1], hoặc kháng thể đặc hiệu với<br /> VK tả [2]. Tim Sunnary và CS với phương<br /> pháp tương tự đã thu được kháng thể IgY<br /> kháng trực khuẩn mủ xanh, có tác dụng ức<br /> chế trực khuẩn mủ xanh trên mô hình vết<br /> thương bỏng thực nghiệm gây nhiễm trực<br /> khuẩn mủ xanh [3].<br /> Trong nghiên cứu này, gây miễn dịch<br /> cho gà mái với kháng nguyên là ĐTT tự<br /> nhiên (CT), cho phép phân lập được kháng<br /> thể IgY từ trứng của gà được gây miễn<br /> dịch, có phản ứng đặc hiệu với CTB. Theo<br /> một số nghiên cứu gần đây, kháng thể IgY<br /> đặc hiệu với kháng nguyên CT-B, thể hiện<br /> tác dụng bảo vệ trên mô hình động vật thí<br /> nghiệm nhiễm VK tả theo đường tiêu hóa<br /> [4]. Kết quả thu được trong nghiên cứu này<br /> gợi ý: IgY đặc hiệu với kháng nguyên ĐTT<br /> (CT) và/hoặc CTB thể hiện tác dụng bảo vệ<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br /> trên mô hình động vật nhiễm VK tả đường<br /> tiêu hóa thông qua cơ chế ức chế gắn kết<br /> của CTB với GM1.<br /> KẾT LUẬN<br /> Chế phẩm kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng<br /> gà được gây miễn dịch với kháng nguyên<br /> CT tương đối tinh khiết, có tác dụng ức chế<br /> sự gắn kết của CTB với GM1 in vitro.<br /> KẾT LUẬN<br /> 1. Hoàng Trung Kiên, Đỗ Khắc Đại, Nguyễn<br /> Ngọc Tuấn. Nghiên cứu chế tạo kháng thể<br /> kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan ở<br /> cá tra bằng công nghệ tạo kháng thể IgY gà.<br /> Tạp chí Thông tin y dược. 2010, số 3, tr.71-76<br /> 2. Hoàng Trung Kiên, Lê Thu Hồng, Lê Thu<br /> Hà, Nguyễn Đặng Dũng. Nghiên cứu quy trình<br /> gây miễn dịch tạo kháng thể IgY kháng K tả<br /> (Vibrio cholerae) trên gà mái. Tạp chí Y - Dược<br /> học quân sự. 2013, tập 38, số 1,tr. 46-51.<br /> <br /> thể IgY kháng trực khuẩn mủ xanh trên vết<br /> thương bỏng thực nghiệm nhiễm trực khuẩn mủ<br /> xanh. Tạp chí Y - Dược học quân sự. 2011, tập<br /> 36, số 8, tr.44-49.<br /> 4. Hirai K, Arimitsu H, Umeda K. Passive oral<br /> immunization by egg yolk immunoglobulin (IgY)<br /> to Vibrio cholerae effectively prevents cholera.<br /> ActaMedica Okayama. 2010, 64 (3), pp.163-170.<br /> 5. Nobuhiro Yuki, Fuminori Myiagi. Possible<br /> mechanism of intravenous immunoglobulin treatment<br /> on anti-GM1 antibody-mediated neuropathies.<br /> Journal of the Neurological Sciences. 1996, Vol.<br /> 139, Issue 1, pp.160-162.<br /> 6. Osek J, Jonson G, Svennerholm AM,<br /> Holmgren J. Role of antibodies against biotypespecific Vibrio cholerae pili in protection against<br /> experimental classical and El Tor cholera. Infect<br /> Immun. 1994, 62 (7), pp.2901-2907.<br /> 7. World Health Organization. Cholera, 2012.<br /> Weekly Epidemiological Record. 2013, Vol 88,<br /> No 31, pp.321-336.<br /> <br /> 3. Tim Sunnary, Đỗ Minh Trung, Lê Thu<br /> Hồng, Lê Văn Đông. Tác dụng in vivo của kháng<br /> <br /> 11<br /> <br />