Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, nội soi, mô bệnh học, nhiễm các týp Helicobacter pylori trong viêm teo niêm mạc dạ dày

Chia sẻ: Lê Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:73

Thêm vào BST

Báo xấu

210
lượt xem 41
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nhằm hai mục tiêu sau: Phân tích đặc điểm lâm sàng, nội soi, mô bệnh học của viêm teo niêm mạc dạ dày; tìm hiểu đặc điểm nhiễm các týp Helicobacter pylori trong viêm teo niêm mạc dạ dày.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, nội soi, mô bệnh học, nhiễm các týp Helicobacter pylori trong viêm teo niêm mạc dạ dày

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lý dạ dày tá tràng (DDTT) là một bệnh phổ biến hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam, trong đó viêm dạ dày (VDD) là bệnh thường gặp nhất. Ở Việt nam viêm dạ dày chiếm tỷ lệ từ 50% – 60%, trong đó viêm dạ dày mạn (VDDM) chiếm khoảng 35% - 45% các bệnh lý dạ dày tá tràng [4],[5]. Tương tự trên thế giới như: Ở Phần lan, viêm dạ dày mạn chiếm khoảng 28% dân số; ở Nhật Bản có tới 79% người trên 50 tuổi bị viêm dạ dày mạn; ở Châu Âu có 30% - 50% người trên 60 tuổi bị viêm dạ dày mạn [13]. Chẩn đoán mô bệnh học viêm dạ dày mạn [16], [20], [21] được đặc trưng bởi sự thâm nhiễm ưu thế của bạch cầu đơn nhân vào niêm mạc dạ dày. Bệnh viêm dạ dày mạn tiến triển tiềm tàng cùng lứa tuổi của bệnh nhân từ viêm dạ dày mạn nông trở thành viêm teo niêm mạc dạ dày. Theo Tạ Long, nguy cơ xuất hiện viêm teo niêm mạc dạ dày từ viêm dạ dày mạn không teo ở Việt Nam là khoảng 3% một năm; viêm teo niêm mạc dạ dày là một bệnh nặng song ít được chú ý vì nó tiềm tiến và nguy cơ loét dạ dày (LDD), dị sản ruột (DSR), loạn sản (LS), ung thư dạ dày (UTDD) sẽ xảy ra khi viêm teo nặng [8], [17], [21]. Trước đây, có nhiều học thuyết giải thích về nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh của viêm dạ dày mạn, tuy nhiên chưa có một thuyết nào giải thích một cách đầy đủ thuyết phục. Chỉ tới năm 1983, khi B.Marshall và R. Warren [69] phát hiện và nuôi cấy thành công vi khuẩn Helicobacter pylori (HP) người ta mới khẳng định vai trò số một của vi khuẩn này trong bệnh lý dạ dày tá tràng nói chung và viêm dạ dày mạn nói riêng. Nhiễm HP mạn sẽ gây viêm dạ dày mạn, dẫn tới viêm teo niêm mạc, dị sản ruột, loạn sản, là những tổn thương tiền ung thư [19], [21]. viêm dạ dày mạn có liên quan đên trào ngược dịch mật và trào ngược tá tràng – dạ dày. Theo tác giả Phạm Quang Cử (1999) thì tỷ lệ viêm teo niêm mạc dạ dày cao nhất ở những bệnh nhân có cả nhiễm HP và dịch mật trào ngược với 53%, những bệnh nhân chỉ nhiễm HP 1
2 thì tỷ lệ viêm teo dạ dày là 40%, còn những bệnh nhân chỉ trào ngược dịch mật không nhiễm HP thì tỷ lệ viêm teo niêm mạc dạ dày là 20,05% [9]. Theo tác giả Hoàng Thanh Tuyền và Phạm Quang Cử trong “Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm HP, tình trạng viêm dạ dày mạn tính ở bệnh nhân có trào ngược tá tràng - dạ dày” trên tạp chí Y học Việt Nam số 4/2004 thì tỷ lệ viêm teo dạ dày ở những bệnh nhân nhiễm HP và trào ngược tá tràng- dạ dày là 90,9% cao hơn có ý nghĩa so với tỷ lệ viêm teo dạ dày ở những bệnh nhân chỉ có trào ngược tá tràng- dạ dày (58,6%) với p < 0,05 [28]. Khi nghiên cứu về mặt sinh học phân tử của HP, nhiều tác giả đã phát hiện rằng những chủng HP mang gen CagA(+) gây độc tế bào thường chiếm tỷ lệ rất cao trong các thể bệnh nặng như loét dạ dày tá tràng, ung thư dạ dày (70 - 100%). Nếu các chủng HP có cả gen CagA(+) và gen VacA(+), gen này gây rỗng tế bào, thì khả năng gây bệnh còn cao hơn. Các công trình ở Việt Nam nghiên cứu định týp HP theo kiểu này đã cho biết: tỷ lệ týp I (CagA(+) VacA(+)) trong loét dạ dày, ung thư dạ dày rất cao 73,3% và 75% [14]. Nguy cơ UTDD ở những người viêm teo nặng hang vị cao gấp 18 lần so với dạ dày bình thường và nếu viêm teo nặng cả hang vị và thân vị thì tỷ lệ UTDD cao gấp 90 lần dạ dày bình thường [17], [40]. Vậy các tổn thương viêm teo niêm mạc dạ dày này có thể có mối liên quan tới sự nhiễm các týp HP hay không hiện nay chưa có nghiên cứu nào trong nước đề cập đến. Đó là lý do chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, nội soi, mô bệnh học, nhiễm các týp Helicobacter pylori trong viêm teo niêm mạc dạ dày”. Đề tài nhằm hai mục tiêu sau: 1- Phân tích đặc điểm lâm sàng, nội soi, mô bệnh học của viêm teo niêm mạc dạ dày. 2- Tìm hiểu đặc điểm nhiễm các týp Helicobacter pylori trong viêm teo niêm mạc dạ dày. 2
3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM MÔ HỌC DẠ DÀY 1.1.1 Thành dạ dày Được cấu tạo gồm 4 lớp: niêm mạc, dưới niêm mạc, lớp cơ, lớp thanh mạc. - Lớp niêm mạc: là lớp trong cùng của thành dạ dày, bề mặt niêm mạc dược bao phủ bởi các tế bào biểu mô tạo thành nhiều hố lõm là nơi đổ ra của các tuyến dạ dày. - Lớp dưới niêm mạc: là tổ chức liên kết lỏng lẻo chứa nhiều mạch máu và mạch bạch huyết. - Lớp cơ: gồm 3 lớp cơ trơn: + Lớp trong: các cơ hướng vòng. + Lớp giữa: các cơ chéo. + Lớp ngoài: các cơ dọc. - Lớp thanh mạc: là lớp bao ngoài cùng của dạ dày, rất mỏng có chứa các tế bào mỡ và mạch máu. 1.1.2. Các tuyến niêm mạc - Tuyến thân vị là những tuyến hình ống thẳng, đứng sát nhau, ít chia nhánh. Thành tuyến gồm hai loại tế bào: té bào chính và tế bào viền. + Tế bào chính: hình trụ, ưa kiềm, chế tiết pepsinogen I và II, sẽ được hoạt hoá thành pepsin. + Tế bào viền: hình đa diện, chế tiết acid HCl, Kaliclorua và yếu tố nội. Tế bào viền bị kích thích bởi histamine, gastrin và thần kinh X. - Tuyến hang vị: là tuyến ống chia nhánh nhiều, chế tiết nhày, pepsinogen và một số yếu tố nội như: gastrin, histamine… 3
4 1.2. VIÊM DẠ DÀY MẠN TÍNH 1.2.1. Triệu chứng lâm sàng Triệu chứng lâm sàng của viêm dạ dày mạn tính thường nghèo nàn và đa phần là không có triệu chứng. Triệu chứng hay gặp nhất là đau âm ỉ vùng thượng vị không có tính chất chu kỳ chiếm 51% và không đặc hiệu [28]. Ngoài đau âm ỉ vùng thượng vị người bệnh còn có một số triệu chứng khác như: Đầy bụng, cảm giác ăn không tiêu, ợ hơi ợ chua, buồn nôn… Trên thực tế khám lâm sàng ít có giá trị chẩn đoán viêm dạ dày mạn. 1.2.2. Chẩn đoán - Nội soi: Chẩn đoán viêm VDD mạn tính chủ yếu dựa vào nội soi và được nhận định theo phân loại của hệ thống Sydney (2000). - Mô bệnh học: Đây là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định viêm dạ dày mạn tính. Các thương tổn viêm dạ dày theo mô bệnh học được phân loại theo Whitehead. - Xét nghiệm dịch vị: Trong viêm dạ dày mạn tính nhất là thể teo lượng acid tối đa giảm không quá 3- 5 mEq/l. Trong khi dó ở người bình thường đậm độ acid dịch vị là 22- 25 mEq/l. Phương pháp này hiện nay ở nước ta ít dùng trong chẩn đoán viêm dạ dày mạn tính. - Chụp dạ dày có uống thuốc cản quang: Ngày nay ít dùng và ít có giá trị chẩn đoán viêm dạ dày mạn tính. - Xét nghiệm huyết thanh: Chẩn đoán huyết thanh trong viên dạ dày mạn tính được làm bằng cách xác định nồng độ pepsinogen và gastrin huyết thanh. Mức pepsinogen I huyết thanh thấp dưới 20 microgam/l và tỷ lệ pepsinogen I / pepsinogen II thấp dưới 1,0 với mức Gastrin huyết thanh cao (trên 100 pmol/l) cho thấy bệnh nhân đó bị viêm teo dạ dày vùng thân nặng với độ nhạy trên 90% và độ đặc hiệu 100%. Pepsinogen I huyết thanh thấp kèm theo mức gastrin huyết thanh thấp hoặc bình thường cho thấy bệnh nhân bị viêm teo dạ dày toàn bộ nặng. Những cá nhân đó có nguy cơ cao phát triển 4
5 thành ung thư dạ dày. Phương pháp này chưa phổ biến và hiện chưa áp dụng ở nước ta. 1.2.3. Nguyên nhân Cho đến nay, người ta vẫn chưa xác định được chính xác nguyên nhân gây viêm dạ dày mạn tính. Tuy nhiên có nhiều yếu tố được coi là có tác động gây bệnh và các yếu tố này thường phối hợp với nhau trên cùng một bệnh nhân để gây ra viêm dạ dày mạn tính. Một số yếu tố được nhiều tác giả công nhận đó là: - Rượu: Uống rượu quá mức trong một thời gian dài có thể ra viêm dạ dày mạn. Tuy nhiên vấn đề này hiện vẫn chưa được làm sáng tỏ. - Thuốc lá: Đã có nhiều nghiên cứu khẳng định vai trò của thuốc lá trong viêm, loét dạ dày. Tuy nhiên cơ chế bệnh sinh vẫn chưa rõ ràng. - Nhiễm khuẩn: + Các nhiễm khuẩn đường hô hấp trên như: viêm xoang, viêm amidan… có thể thể dẫn đến viêm dạ dày mạn tính. + Helicobacter Pylori: Việc phát hiện H. Pylori như một tác nhân gây nhiễm khuẩn khu trú trong niêm mạc dạ dày đã cho thấy vi khuẩn này có khả năng gây ra phản ứng tế bào viêm điển hình của dạ dày. H. Pylori đã được khẳng định là yếu tố nguyên nhân chính gây viêm dạ dày mạn vì nó xuất hiện ở gần 80% các trường hợp có phản ứng viêm mạn của niêm mạc dạ dày [28]. - Tuổi: Tỷ lệ VDD mạn tăng theo tuổi. - Di truyền: Trong bệnh thiếu máu Biermer. - Nội tiết: Phối hợp thiếu máu ác tính với viêm tuyến giáp Hashimoto, thiểu giáp, đái đường, bệnh Addison. Viêm teo dạ dày thường gặp trong các bệnh nội tiết dù không có thiếu máu ác tính. - Bệnh hệ thống: Hay gặp VDD mạn trong viêm đa khớp dạng thấp, luput ban đỏ, xơ cứng bì, hội chứng Sjogren, viêm da dạng herpes. - Trào ngược tá tràng - dạ dày, nhất là sau cắt đoạn dạ dày. 5
6 - Các yếu tố miễn dịch - tế bào - Các yếu tố ngoại lai: Nghiện rượu, thuốc lá, ăn cay, nóng, dùng NSAID, các thuốc hại dạ dày. 1.2.4. Cơ chế bệnh sinh Đã có nhiều công trình nghiên cứu để giải thích cơ chế bệnh sinh của viêm dạ dày nói chung và viêm dạ dày mạn tính nói riêng. Bình thường, hàng rào niêm mạc dạ dày có khả năng hạn chế sự khuếch tán ngược của các ion H+ từ lòng dạ dày tới niêm mạc dạ dày và của các ion Na+ từ niêm mạc tới lòng dạ dày. Một số thuốc như: NSAID, Corticoit, acid mật, muối mật… có khả năng phá vỡ hàng rào niêm mạc dạ dày làm tăng khuếch tán ngược của ion H+ vào niêm mạc dạ dày gây nên một loạt các phản ứng dây chuyền đưa đến hậu quả cuối cùng là tổn thương hoại tử hoặc chảy máu của niêm mạc. Tổn thương như vậy kéo dài sẽ đưa đến viêm dạy dày mạn tính. 1.2.5. Phân loại viêm dạ dày mạn 1.2.5.1. Phân loại viêm dạ dày mạn theo mô bệnh học - Viêm dạ dày mạn nông. - Viêm dạ dày mạn teo, trong đó chia theo mức độ: teo nhẹ, vừa, nặng. - Viêm dạ dày hoạt động, chia theo mức độ: hoạt động nhẹ, vừa, nặng. Trong VDD mạn thường kèm theo polip, DSR. 1.2.5.2. Phân loại viêm dạ dày mạn theo nội soi Nội soi có thể thấy VDD khu trú hoặc lan tỏa, phân ra: - Viêm dạ dày typ A: Tổn thương chỉ ở thân vị, không có ở hang vị, tiết axit giảm ít gặp. - Viêm dạ dày typ B: Tổn thương ở hang vị, lan toả, tỷ lệ nhiều hơn typ A hơn 4 lần, hay gặp trong nhiễm HP - và chiếm đa số trong VDD các thể. - Viêm dạ dày typ AB: Cả thân vị và hang vị đều có viêm. - Các tổn thương có thể phối hợp với VDDM là UTDD, LDD, U tuyến lành tính, DSR. 6
7 1.2.5.3. Phân loại viêm dạ dày mạn theo hệ thống Sydney Từ việc công nhận và chứng minh được vai trò quan trọng của HP trong cơ chế bệnh sinh của bệnh lý DDTT, người ta nhận thấy các phân loại VDD trước đây chưa thực sự đầy đủ, chưa tính đến những yếu tố quan trọng như mức độ nhiễm HP, và sự có mặt cuả bạch cầu đa nhân biểu hiện mức độ hoạt động của VDD mạn tính. Năm 1990 tại hội nghị tiêu hoá Sydney, phân loại VDD mạn tính mới đã được đưa ra dựa trên mô bệnh học, vị trí và hình ảnh nội soi. Những tiến bộ của phân loại mới này được thể hiện trong việc sử dụng các thang cho từng tiêu chuẩn mô bệnh học (MBH) và hình ảnh nội soi. Do đó phân loại viêm dạ dày mạn theo hệ thống Sydney đã được nhiều nước áp dụng [66]: - Viêm dạ dày xung huyết: Niêm mạc dạ dày mất tính bóng, hơi lần sần, có từng mảng xung huyết, dễ chảy máu khi chạm máy soi. - Viêm dạ dày dạng trợt phẳng: niêm mạc có nhiều trợt nông, trên có giả mạc bám hoặc có những trợt nông chạy dài trên các nếp niêm mạc. - Viêm dạ dày dạng trợt lồi: khi có nhiều trợt lồii (trợt dạng đậu mùa) các nốt nổi gồ trên bề mặt niêm mạc dạ dày, ở đỉnh lõm xuống (nặng, nhẹ tính theo số lượng trợt lồi). - Viêm dạ dày dạng teo: nhìn thấy các mạch máu và các nếp niêm mạc mỏng khi không bơm căng lên. Có thể nhìn thấy hình ảnh DSR dưới dạng những mảng trắng. - Viêm dạ dày xuất huyết: có những đốm xuất huyết, hoặc những đám bầm tím do chảy máu trong cơ, hoặc có thể chảy máu vào lòng dạ dày. - Viêm dạ dày dạng phì đại: khi niêm mạc mất tính chất nhẵn bóng, và các nếp niêm mạc nổi to, không xẹp khi bơm hơi (>5 mm), trên có các đám giả mạc bám. - Viêm dạ dày do trào ngược dạ dày tá tràng: niêm mạc phù nề, xung huyết, các nếp niêm mạc phì đại và có dịch mật trong dạ dày. 7
8 1.2.5.4. Phân loại theo Whitehead và cộng sự (1985) Đây là phân loại hình thái học được sử dụng phổ biến nhiều nhất bao gồm hai loại chính [64]. - Viêm mạn nông: Trong viêm mạn nông thâm nhiễm nhiều các bào tương đơn nhân và bạch cầu mono, chủ yếu ở phần ba trên vùng khe của niêm mạc dạ dày, các tuyến dạ dày phía dưới bình thường. - Viêm mạn teo: Là thương tổn có sự phối hợp biểu mô tuyến và các tuyến . Tế bào viêm xâm nhập toàn bộ chiều dày niêm mạc làm giảm thể tích và số lượng các tuyến. dựa vào mức độ giảm của các tuyến mà chia thành: Viêm teo nhẹ, vừa, nặng. + Viêm teo nhẹ: Số lượng các tuyến giảm ít. Không có dị sản ruột hoặc dị sản ruột nhẹ. Xâm nhập tế bào viêm loại lympho. + Viêm teo vừa: Số lượng và thể tích các tuyến giảm nhiều nhưng chưa mất hoàn toàn. Mô liên kết tăng sinh làm các tuyến cách xa nhau, xâm nhập nhiều tế bào lympho, tương bào, dị sản ruột. + Viêm teo nặng: số lượng và thể tích các tuyến giảm nhiều hoặc mất hoàn toàn. Mô liên kết tăng sinh xơ, các tuyến còn lại phân bbố thành từng nhóm, chiều cao niêm mạc giảm rõ rệt. Xâm nhập ít rõ ràng hơn, dị sản ruột nặng. + Dị sản ruột: Viêm dạ dày mạn teo thường đi kèm với dị sản. Các tế bào dị sản là các tế bào chưa trưởng thành, và có một số hình ảnh giống với niêm mạc bào thai. Trong quá trình tiến triển của viêm teo các tế bào dạ dày bình thường biến mất và được thay thế bằng các tế bào dị sản. Có hai loại dị sản thường thấy ở viêm niêm mạc dạ dày teo. * Dị sản ruột: Là sự thay thế niêm mạc dạ dày bằng niêm mạc ruột. Các tế bào ở tuyến ruột dị sản có những thành phần bắt màu giống như các tế bào niêm mạc ruột bình thường. Các tuyến ruột dị sản có thể xuất hiện ở niêm mạc viêm teo vùng hang vị hoặc thân dạ dày. Trong giai đoạn sớm của viêm teo dạ dày mạn chỉ có một đám nhỏ các tuyến kiểu ruột đựoc tìm thấy 8
9 giữa các niêm mạc dạ dày bình thường. Trong viêm teo dạ dày nặng hơn hoặc giai đoạn muộn toàn bộ niêm mạc dạ dày có thể bị “ruột hóa” hoàn toàn., bề mặt niêm mạc dạ dày bị thay thế hoàn toàn bởi bề mặt niêm mạc kiểu ruột với các tế bào ly có chân (goblet). * Dị sản giả môn vị: Là sự thay thế các tuyến ở thândạ dày bằng các tế bào sáng là đặc trưng của tuyến niêm mạc môn vị. Những tế bào sáng trong vùng dị sản giả môn vị không chỉ giống các tế bào vùng hang vị bình thường về mặ cấu trúc mà còn giống cả về chức năng. Chúng sản xuất các chất nhày là đặc trưng của tuyến hang vị bình thường và sản xuất cả pepsinogen II. 1.2.5.5. Dị sản ruột Dị sản ruột là hình ảnh thường thấy trong viêm dạ dày mạn tính đặc biệt là viêm teo niêm mạc dạ dày. Đây là tình trạng tổn thương mà niêm mạc dạ dày được thay thế bằng những tế bào biểu mô kiểu ruột (các tế bào có chân chứa nhày, các tuyến hốc kiêu ruột, có tế bào Paneth), đôi khi thấy các nhung mao giống như ở ruột. Bình thường các tế bào nằm ở màng đáy của các tuyến dạ dày, nay tập trung lại đáy của các hốc tuyến như ở ruột non. Dị sản ruột được chia thành ba loại như sau. + Týp I (dị sản ruột hoàn toàn): Bao gồm các tế bào ruột non với bờ bàn chải và các tế bào hình chén tiết sialomucin. Các khe tuyến thẳng, cấu trúc đều đặn. + Týp II (dị sản ruột không hoàn toàn): Các tế bào hấp thu không có hoặc có rất ít. Có mặt các tế bào hình trụ “trung gian” ở các giai đoạn biệt hóa, tiết chất nhày trung tính và siamulocin acid. Các tế bào hình ly có chân tiết siamulocin hoặc đôi khi sulfomucin. Cấu trúc tuyến không còn thẳng, đều. + týp III (dị sản ruột không hoàn toàn): Các tế bào không biệt hóa nhiều hơn týp II, các tế bào “trung gian” chủ yếu tiết sulfomucin, các tế bào hình ly có chân tiết siamulocin hoặc đôi khi sulfomucin. Không gặp các tế bào hập thu, cấu trúc tuyến bị thay đổi nhiều. 9
10 1.2.5.6. Loạn sản Loạn sản là hình ảnh quá sản tế bào, thay đổi cấu trúc, hình dạng nhân, chất nguyên sinh, thay đổi tỷ lệ nhân trên chất nguyên sinh. Theo tổ chức y tế thế giới lọa sản được chia làm ba mức độ: + Loạn sản nhẹ: trên mô học thấy thây đổi ít, tế bào biểu mô phủ và tuyến hình trụ tăng ưa kiềm nhưng nhân tế bào còn tương đối đồng dạng, thon dài và sắp xếp ở phía màng đáy. Tỷ lệ nhân trên chất nguyên sinh tăng nhẹ. + Loạn sản vừa: Biểu hiện bằng tính mất biệt hóa hoàn toàn của tế bào biểu mô. nhân tế bào lớn trở lên tròn hơn, tỷ lệ nhân trên chất nguyên sinh tăng rõ, tăng chỉ số nhân chia. Cấu trúc của tuyến không còn bình thường. + Loạn sản nặng: Có những biến đổi không điển hình về tế bào và cấu trúc của tuyến. đa hình thái tế bào và nhân, tế bào sắp xếp giả hàng hoặc nhiều hàng ở các tuyến không bình thường. xuất hiện nhiều nhân chia và co nhân chia không điển hình. 1.3. HELICOBACTER PYLORI Năm 1982, Warren JR và Marshall BJ đã phân lập được chủng vi khuẩn mới từ mẫu sinh thiết dạ dày của một bệnh nhân loét hành tá tràng và đặt tên là Campylobacter pyloridis [62]. Năm 1983, các ông đã nuôi cấy thành công chủng vi khuẩn này và công trình nghiên cứu này được đăng trên tạp chí Lancet [63]. Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy Campylobacter pyloridis khác hẳn với những Campylobacter về đặc điểm sinh hóa học, do đó Goodwin và CS đề nghị xếp vào giống Helicobacter. Tháng 6 năm 1989 Thompson phát hiện ra thành phần 16s RNA nhiễm sắc thể đặc trưng cho Campylobacter pylori, mà không có ở Campylobacter. Từ đó Campylobacter pylori có tên là Helicobacter pylori. Theo Jean Louis Fauchere thì có ít nhất 9 loại Helicobacter được phát hiện, tuy nhiên chỉ có 3 10
11 loại H. pylori, H. cinaedi, H. heilmanni có ở trong dạ dày người, trong đó chủ yếu là H. pylori, còn H.heilmanni chỉ chiếm khoảng 1-8%. Việc phát hiện vi khuẩn HP đã làm thay đổi cơ bản những hiểu biết về bệnh sinh của loét và viêm teo mạn tính niêm mạc dạ dày. Tại hội thảo quốc tế ở Dublin, Irland (7/ 1992 ) đã kết luận: HP có vai trò chủ yếu trong nguyên nhân sinh bệnh VDD, loét DDTT và còn được xếp vào nhóm I trong các tác nhân gây UTDD. 1.3.1. Dịch tễ học Helicobacter pylori Helicobacter pylori có lẽ là vi khuẩn có tỷ lệ lây nhiễm phổ biến nhất trên thế giới. Ở các nước công nghiệp phát triển, trung bình có khoảng 20- 30% dân số bị nhiễm khuẩn này và tăng nhanh tới trên 50% ở tuổi 60. Tỷ lệ nhiễm cao và kéo dài dẫn đến VDD mạn tính trong đó có những người bị chuyển thành loét DDTT, một số chuyển thành UTDD [20]. Tỷ lệ nhiễm HP của trẻ em ở miền Tây Virginia (Mỹ) được coi là rất cao với 35% trước 15 tuổi; ở Mexico là 1 tuổi là 20% và 10 tuổi là 50% và trong cùng một thành phố tỷ lệ nhiễm ở người có độ tuổi về hưu (80-85 tuổi) chiếm 34,8%. Tỷ lệ nhiễm HP trong nhân dân Mỹ khoảng 45% [37]. Ở các nước Đông Nam Á (bao gồm Việt Nam), tỷ lệ nhiễm trong quần thể khoảng 55-60%. Mitchell và Bohane thấy rằng tỷ lệ nhiễm HP tăng cao trong những gia đình đã có người bị nhiễm HP trước đó. Graham và CS [42] đã xét nghiệm HP cho 485 người tình nguyện ở Mỹ bằng xét nghiệm huyết thanh và test thở, thấy rằng tỷ lệ nhiệm HP trong nhóm người da đen rất cao 70% so với 34% ở nhóm người da trắng. Nhiễm HP ở trẻ em da đen cũng cao gần gấp đôi so với trẻ em da trắng, tỷ lệ tương ứng là 80% và 43%. Các nghiên cứu về dịch tễ học cũng cho thấy tình hình nhiễm HP ở trẻ em như sau: Bardhan khảo sát ở 14 nước đang phát triển thấy tỷ lệ nhiễm HP ở tuổi 15 là 80%. Ở Bangladesh tỷ lệ HP(+) là 61% ở trẻ 1-3 tháng, 33% ở trẻ 11
12 1 tuổi, > 80% ở trẻ > 5 tuổi. Ở Nicaragua, 63% ở trẻ > 2 tuổi có HP(+). Nghiên cứu ở Châu Âu như Đức chỉ có 40/647 trẻ ở lứa tuổi 5 - 8 tuổi có HP(+) chiếm tỷ lệ 6,1%; 27.6% trẻ em ở các nước khác có HP(+). Ở Việt Nam (2001), Vương Tuyết Mai và cộng sự [16] sử dụng kỹ thuật ELISA phát hiện tỷ lệ nhiễm HP ở 528 người khỏe mạnh cho thấy: Tỷ lệ nhiễm HP trong quần thể nghiên cứu là 75,2%. Tỷ lệ nhiễm giữa nam và nữ là như nhau. Trẻ nhỏ nhiễm HP thấp hơn người lớn, xuất hiện ở cả 1- 2 tuổi. Tỷ lệ nhiễm HP ở các địa phương cũng khác nhau. Tỷ lệ nhiễm tăng theo tuổi qua nghiên cứu xét nghiệm huyết thanh của những nhóm người cùng hoàn cảnh kinh tế - xã hội ở các nước phát triển cũng giống như ở các nước đang phát triển. Trong một nghiên cứu gồm 3000 người không có triệu chứng thuộc 17 quần thể, tỷ lệ nhiễm chung ở những người từ 55- 64 tuổi là 62%, ở những người độ tuổi 25- 34 là 35%. Ở những nước đang phát triển hơn một nửa số trẻ em 10 tuổi bị nhiễm HP. Những người có điều kiện kinh tế - xã hội thấp thường có tỷ lệ nhiễm cao [19]. Nhiễm khuẩn HP chủ yếu bị mắc từ tuổi nhỏ, và sự khác nhau về tỷ lệ hiện nhiễm quan sát qua các thế hệ nối tiếp đã phản ánh những điều kiện kinh tế - xã hội và môi trường họ sống trong suốt thế kỷ 20. Phần lớn các nghiên cứu về tỷ lệ hiện nhiễm theo phương pháp cắt ngang. Chưa có nhiều nghiên cứu về tỷ lệ mới nhiễm và theo dõi lâu dài. Banatvala và CS (1993) trong một số nghiên cứu quần thể cho biết: ở miền tây châu Úc và Canada, trẻ em thường sớm bị nhiễm HP. Những trẻ đẻ sớm hơn có tỷ lệ nhiễm cao hơn những trẻ đẻ muộn hơn. Một nghiên cứu quần thể đáng chú ý của Malaty và CS (1999) về diễn biến tự nhiên của nhiễm HP ở trẻ nhỏ tại một cộng đồng có 2 chủng tộc theo dõi 12 năm. Kết quả cho biết: ở tuổi 7- 9, có 19% số trẻ bị nhiễm HP (40% trẻ da đen so với 11% trẻ da trắng với p = 0,001). 12 năm sau, 33% số trẻ có test huyết thanh dương tính (64% trẻ da đen so với 20% trẻ da trắng). Sự tăng tỷ lệ lên 9% 12
13 ở trẻ da trắng và 24% ở trẻ da đen không phải chỉ do nhiễm khuẩn mới. Phân tích từng trường hợp cho thấy thực ra ở trẻ da trắng có 22 trẻ (16% số không bị nhiễm lúc đầu) đã bị nhiễm trong quá trình theo dõi nhưng có 8 trẻ (50% số nhiễm lúc đầu) đã trở nên âm tính. Ở trẻ da đen, có 16 trẻ (43% số trẻ chưa bị nhiễm HP lúc đầu) mới bị nhiễm khuẩn trong quá trình theo dõi, song chỉ có 1 trở nên âm tính (4% số đã bị nhiễm). Sự chuyển đổi huyết thanh ở 38 trẻ đã xảy ra trước lúc 10- 12 tuổi; 22 ca (58%), vào giữa độ tuổi 10 - 12 và 15 - 17: 8 ca (21%) và vào độ tuổi 15- 17 đến 19- 21 : 8 ca (21%). Nghiên cứu này cho thấy tính chất diễn biến của nhiễm khuẩn ở trẻ cùng lứa tuổi, và có khác nhau giữa các chủng tộc, tuy cùng những điều kiện kinh tế xã hội giống nhau, song tập quán xã hội ở những người da đen có thể giải thích sự truyền bệnh trong gia đình họ. Như vậy sự tăng theo tuổi có lẽ phản ánh tác động của quần thể hơn là xu hướng bị nhiễm trong quá trình sống suốt cuộc đời. 1.3.2. Đặc tính sinh học của Helicobacter pylori Helicobacter pylori là một vi khuẩn gram âm vi ái khí, dạng dấu phẩy, chữ S hoặc C [22], [32], [43]. Dưới kính hiển vi điện tử, HP dài 1,5- 5 m, có đường kính 0,3 - 1 m, có 1 - 6 lông mảnh ở một đầu [32],[43]. Trong điều kiện không thuận lợi hoặc sau điều trị bằng một số kháng sinh, HP có thể chuyển thành dạng hình cầu [54]. HP thường nằm dưới lớp chất nhầy phủ bề mặt niêm mạc dạ dày, bám trên mặt ngọn hoặc chui sâu vào khe giữa các tế bào biểu mô dạ dày, có khi thấy HP trong lòng các khe tuyến nông trên gần bề mặt niêm mạc [22]. Các lông của HP ở một đầu, tận cùng bởi các đĩa, cấu trúc này không gặp ở bất kỳ loại Campylobacter nào khác. Nhờ vào các lông này mà HP có thể di chuyển nhanh chóng trong lớp chất nhầy đặc bằng những động tác quẫy và quay đặc biệt. Phần còn lại của bề mặt HP nhẵn. 13
14 Trong môi trường nuôi cấy, HP có thể có dạng hình cầu với nhiều kích thước khác nhau. Các tác giả cho đó là thể thoái hóa, một số lại cho rằng đó là thể đề kháng, nhất là sau khi điều trị bằng một số kháng sinh [22]. Với thể hình cầu HP có thể tồn tại lâu hơn trong các môi trường không thuận lợi. Goodwin gọi đây là thể ngủ của HP [41]. Giacosa và cộng sự thấy rằng nếu các mảnh sinh thiết niêm mạc dạ dày để lâu mà không được bảo quản tốt trong các môi trường phù hợp, HP rất dễ chuyển thành dạng cầu và khó mọc khi nuôi cấy. Có nhiều phương pháp nhuộm khác nhau để phát hiện HP. Helicobacter pylori bắt mầu gram (-) trên tiêu bản nhuộm Gram, màu tím đỏ khi nhuộm Hematoxylin-Eosin (HE), màu đen đậm trên tiêu bản nhuộm Warthin-Starry, màu xanh sẫm khi nhuộm Giemsa hoặc Diff- Quik, màu da cam ánh vàng khi nhuộm huỳnh quang [22], [43], [67]. Helicobacter pylori là loại vi khuẩn khó nuôi cấy, phát triển yếu trên các môi trường thông thường và trong khí trường bình thường, khó cấy chuyển và lưu giữ [66]. Môi trường nuôi cấy tối ưu cho sự phát triển của HP là điều kiện vi ái khí (với O2 5%, CO2 7%, H2 8%, N2 70%, 10% khí khác) và ở nhiệt độ 370C [43]. Thời gian để HP mọc thành khuẩn lạc điển hình là sau 48 giờ. Theo Sauerbaun [57], trong khi hầu hết những vi sinh vật khác bị chết trong môi trường toan thì HP lại phát triển tốt nhờ hệ men Urease cực mạnh. Men này là một trong những protein có tính kháng nguyên cao nhất của HP đối với người bệnh. Urease có trọng lượng phân tử 500- 600 Kda. Urease có ở rất nhiều loại vi khuẩn, nhất là vi khuẩn đường ruột, nhưng ở HP có một lượng Urease lớn gấp hàng trăm lần các vi khuẩn khác [52]. Men Urease xúc tác thủy phân Urea thành amoniac và cacbamate. Sau đó cacbamate lại được thủy phân tiếp thành amoniac và acid cacbonic (H2CO3). Chính amoniac làm kiềm hóa môi trường và làm chuyển màu chất chỉ thị pH từ đỏ phenol sang 14
15 màu hồng. Đó chính là cơ sở để Marshall đề xuất phương pháp phát hiện HP bằng xét nghiệm urease từ các mảnh sinh thiết niêm mạc dạ dày (CLO-test). Màng ngoài của HP hoạt động như lớp ngụy trang, giúp vi khuẩn tránh những tế bào miễn dịch và cho phép kéo dài hiện tượng nhiễm trùng dai dẳng. Những bí mật về "sự ngụy trang" nằm trong việc bắt chước kháng nguyên tế bào người [57]. HP dạng hình cầu HP dạng hình cong Ảnh 1.1: Hình ảnh siêu cấu trúc của HP (theo Trịnh Tuấn Dũng 2000) [11] Đến nay người ta đã xác định được rằng có ít nhất 9 gen trong cụm gen đảm nhiệm việc tổng hợp urease của HP. Đó là các gen ure A, B, C, D, E, F, G, H và I. Trong đó các gen A, B là gen cấu trúc, còn các gen ure F, G, H là gen điều hoà [52]. - Cấu trúc gen của Helicobacter pylori. Ngoài cụm gen tổng hợp urease, trong số 1590 gen đã biết của HP có một số gen quan trọng khác có liên quan nhiều tới các bệnh VDD, loét DDTT và UTDD đó là CagA và VagA. + CagA (Cytotoxin Associated Gene): CagA là một protein có trọng lượng phân tử 120- 140 Kda là biểu hiện của gen CagA. Gen này được định vị trong các chuỗi AND của hệ gen HP, vị trí của nó ở vùng tiểu đảo sinh bệnh 15
16 (PAI, pathogenicity island). Ở vi khuẩn HP, tiểu đảo PAI mã hoá cho một bộ máy tiết có thể chuyển vận protein CagA vào trong tế bào, khi vi khuẩn tiếp xúc với tế bào biểu mô hoặc thực bào. Sự tương tác giữa một chủng HP (có tiểu đảo Cag hoàn toàn hoạt động) với tế bào dạ dày người sẽ dẫn đến: - Kích thích tiết IL- 8, IL- 10, IL- 12 do hoạt hoá yếu tố NFkB (nuclear factor kappa B) - Tiết và chuyển vận protein CagA vào trong tế bào, rồi protein này được phosphoryl hoá. - Sắp xếp lại khung các tế bào tiếp xúc, kết hợp tạo thành cấu trúc hình đế và với phenotyp kiểu colibri (hình các tế bào kéo dài). - Tín hiệu hoá tế bào và tạo ra các yếu tố sao chép như AP- 1 (Proteine activatrice 1) - Sau cùng tạo ra các sản phẩm tiền ung thư c-fos, c-jun. Các chủng có PAI có đặc tính gây các yếu tố tiền viêm cao và khởi động đáp ứng viêm. Sự hiện diện của các protein này sẽ hoạt hoá các yếu tố sao chép MAP- kinase và AP- 1 trong các tế bào biểu mô dẫn đến sản sinh ra IL- 8 tạo nên sự thoát mạch các bạch cầu đa nhân trung tính và các tế bào lympho trong lớp đệm. Trong các nghiên cứu lâm sàng ở châu âu, sự hiện diện của CagA thường kết hợp với các thể bệnh lý nặng như loét DDTT, UTDD. Một số nghiên cứu thấy ở bệnh nhân VDD có từ 40- 60% các chủng HP phân lập được có CagA (+), với loét tá tràng tỷ lệ này là 80- 100%. Hơn nữa, nhiễm các chủng CagA (+) thường có nguy cơ tăng DSR, viêm mạn teo và UTDD. Bommelaer và CS [65], trong một nghiên cứu đa trung tâm ở Pháp trên 652 bệnh nhân được nội soi, sinh thiết và làm PCR, cho biết những người có HP với CagA (+) thường có những tổn thương mô bệnh học rất nặng như VDD hoạt động rõ, mức độ viêm teo niêm mạc dạ dày cao hơn ở hang vị, 16
17 thân vị và DSR ở hang vị kết hợp với viêm teo nhiều hơn so với những người có HP CagA (-). Theo Anthory P (1998) xấp xỉ 60% các chủng HP phân lập được có gen CagA . Người ta thấy kháng thể CagA có ở 100% bệnh nhân loét DDTT và 76.5% ở bệnh nhân có biểu hiện bệnh lý dạ dày tá tràng nhưng không có loét. Theo Colm O'Morain (1996), ở các nước phát triển, bệnh lý về DDTT có liên quan với chủng HP có CagA (+) hơn các chủng CagA (-). Một nghiên cứu của Hidekazu Suzuki và cộng sự cho thấy [44] ở Nhật Bản qua 30 bệnh nhân LDD cho thấy 22/30 (73%) có CagA (+) và 8/30 (27%) Cag A(-) [19]. + VacA (Vacuolating Cytotoxin): là độc tố gây rỗng tế bào do gene VacA của HP sản xuất ra. Đó là một protein có trọng lượng phân tử 87 KDa. Chất độc này được sản xuất bởi khoảng 60% các chủng HP và gần 100% các chủng HP ở bệnh nhân loét tá tràng. Người ta thấy rằng mặc dù các chủng đều có gene vacA, nhưng chỉ có khoảng 40% sản xuất độc tố tế bào làm tổn thương tế bào biểu mô. Kháng thể VacA tìm thấy ở 69.2% bệnh nhân loét và ở 64,75% bệnh nhân không có loét. Người ta thấy rằng những chủng HP sản xuất VacA có quan hệ với rất nhiều bệnh ở Mỹ và Châu Âu, trong đó có bệnh loét. Theo Atherton J. (1996) [31], khoảng 70% các chủng có gen A kết hợp với độc tố tế bào được gọi là CagA. Việc tìm kiếm những đầu mối để khám phá những bí mật về độc lực sẽ giúp thầy thuốc xác định bệnh nhân nào đang bị đe dọa loét hoặc ung thư biểu mô [30]. Rudi J.K thấy rằng HP tăng tính độc lên rất nhiều khi có cả CagA (+) và VacA (+). Gần đây nhiều tác giả đã quan tâm đến độc tính của VacA và các phân typ của nó trong các thể bệnh loét DDTT. Trong gen VacA có vùng tín hiệu s (signal) và vùng giữa m (middle). Trong VacA s lại chia ra 2 typ s1 và s2. Các phân typ của VacA s1 là s1a, s1b, s1c. Vùng m cũng có các phân typ là m1 và m2. Các phân typ của m1 là m1a, m1b. Gen iceA (gây ra khi tiếp xúc với niêm mạc) có 2 phân typ là iceA1 và 17
18 iceA2. Sự khác nhau giữa các khu vực địa lý trên thế giới cũng được nói đến khi phân tích các typ HP. Theo một số tác giả, những chủng HP với allen s1a thường có trong VDD, loét tá tràng hơn là allen s1b và s2. Người ta cũng nhận thấy rằng phân typ allen m1 có liên quan với mức độ cao của độc tố hoạt động và nhiều loại tổn thương biểu mô hơn allen m2. Như vậy, qua phân tích dấu ấn về kiểu gen có thể giúp tiên đoán được độc tính của HP [2]. 1.3.3. Các phương pháp phát hiện Helicobacter pylori 1.3.3.1. Các phương pháp xâm phạm Qua nội soi dạ dày và lấy các mảnh sinh thiết để xét nghiệm. Phương pháp này cho phép kiểm tra được hình thái tế bào, xác định được typ HP nuôi cấy và làm được kháng sinh đồ. - Nội soi dạ dày: Qua nội soi phun lên bề mặt niêm mạc dạ dày một hỗn hợp urea và đỏ phenol (chất chỉ thị pH), sau khoảng 5 phút, nếu thấy vùng niêm mạc chuyển màu đỏ là có nhiễm HP. Ngoài ra, có một số dấu hiệu gợi ý là có nhiễm HP gián tiếp qua các tổn thương của niêm mạc dạ dày như: các vết trợt, những nốt nhỏ nổi lên trên niêm mạc hoặc có những ban đỏ không đồng nhất xen kẽ những vùng xám nhạt ở niêm mạc hang vị [67]. Theo Giacosa A. và CS. 1995 [67], phương pháp nội soi cho tỷ lệ dự báo âm tính cao (96,8%) nếu bệnh nhân không có bất kỳ một dấu hiệu nào đã nêu trên. Tuy nhiên, do giá trị dự báo dương tính thấp nên sức thuyết phục không cao. - Phết bệnh phẩm lên lam kính: Nhuộm màu bằng giemsa hoặc gram. Thường hay nhuộm bằng gram vì đơn giản, nhanh chóng, độ nhạy 41- 100%. Kết quả: Quan sát trên kính hiển vi thấy HP có hình xoắn, không bắt màu gram. - Mẫu thử urease: Dựa trên cơ sở HP tiết ra nhiều men urease đã phân huỷ urea thành amoniac và làm cho môi trường trở nên kiềm tính, từ đó làm dung dịch Ure-Indol màu vàng chuyển sang màu hồng tím trong môi trường kiềm. Nhưng hạn chế của phưong pháp này là độ nhạy thấp, cần phải có ít 18
19 nhất 105 vi khuẩn trong mảnh sinh thiết mới đủ để làm dung dịch đổi màu, ngoài ra cuối đợt điều trị, không thể dùng test này để chẩn đoán vì có thể vi khuẩn vẫn còn, nhưng số lượng còn ít, không đủ để làm dung dịch đổi màu. Đọc kết quả sau 24 giờ đặt ra một vấn đề: Lúc này độ nhạy có thể cao, nhưng không còn có giá trị của một xét nghiệm nhanh, ngoài ra độ đặc hiệu giảm do một số vi khuẩn urease- positives có ở miệng như S. staphylococus có thể là nguyên nhân của kết quả dương tính giả. Một loại vi khuẩn không nuôi cấy được rất hiếm gặp, có thể là nguyên nhân của viêm dạ dày. Gastrospirillum Hominis, cũng có thể gây ra phản ứng dương tính. - Phương pháp xét nghiệm mô học: Bệnh phẩm được cố định bằng Formol 10% hoặc dung dịch Bouin, được xử lý theo phương pháp thông thường, cắt mảnh 4- 6 àm. Nhuộm màu bằng nhiều phương pháp như: Hematixyline-Eosine(H.E), Warthin-Starry, Giemsa, nhuộm Acridine- Orange và nhuộm hoá mô miễn dịch với kháng thể không đánh dấu, nhuộm Peroxydase- Antiperoxydase [67]. Các phương pháp này cho thấy được số lượng, hình thể HP, nhưng muốn chính xác phải lấy 3- 4 mẫu ở nhiều nơi khác nhau do vậy nhược điểm của nó là phụ thuộc vào kết quả xử lý bệnh phẩm. Trong các phương pháp trên, nhuộm Giemsa thường được áp dụng hơn cả vì đơn giản, rẻ tiền, cho kết quả nhanh. Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại lớn thấy HP thường nằm trong các khe và trên bề mặt của niêm mạc. Ưu điểm của phương pháp này là có thể áp dụng được ở hầu hết các cơ sở y tế. - Phương pháp nuôi cấy: Mảnh sinh thiết được nghiền trong 0,5 ml nước cấy trong vài giây, sau đó được cấy vào môi trường cấy . HP là một loài vi khuẩn yếu và khó nuôi cấy. Nhiệt độ môi trường phải luôn ở 37 0C. Quan sát hàng ngày sẽ thấy các khuẩn lạc tròn, sáng sau 3 ngày. Nuôi cấy từ dịch dạ dày cho kết quả thấp (độ nhạy 30-50%). Phương pháp này có độ đặc hiệu và 19
20 độ nhạy cao và đặc biệt cần thiết trong các trường hợp cần phải thử độ nhạy của kháng sinh trong điều trị HP [30]. - Kỹ thuật khuếch đại gen PCR (Polymerase Chain Reaction): Kỹ thuật này thực hiện dựa trên cơ sở đã biết các đoạn gen đặc hiệu của HP, người ta sử dụng các chuỗi mồi (primer) tương ứng để nhận dạng các gen HP và suy ra sự có mặt của HP ở mảnh sinh thiết. PCR còn xác định được chính xác các typ của HP, thông qua các gen CagA, VacA, iceA và các chủng HP kháng thuốc thông qua việc xác định những đột biến trong ADN của HP. Phương pháp PCR có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, không cần điều kiện vận chuyển đặc biệt. Nếu sử dụng hai bộ primer thì cho độ đặc hiệu tối đa [52], cho kết quả nhanh. Phương pháp PCR không nhất thiết phải có HP còn sống, người ta có thể giữ mảnh sinh thiết ở nhiệt độ thấp (-70 đến -90oC) trong thời gian dài cho đến khi sử dụng để xét nghiệm. - Phương pháp siêu cấu trúc: Đây là phương pháp có tính chính xác cao, cho phép nghiên cứu cấu trúc chi tiết của vi khuẩn, vị trí khu trú cũng như các tổn thương ở mức dưới tế bào của niêm mạc dạ dày. Phương pháp được thực hiện ở những trung tâm có trang bị kính hiển vị điện tử, máy siêu cắt, sử dụng nhiều hoá chất đắt tiền, đội ngũ chuyên viên kỹ thuật chuyên sâu. Phương pháp có độ nhạy thấp do lát cắt siêu mỏng (60- 100Ao) [22],[32]. 1.3.3.2. Các phương pháp không xâm phạm - Phương pháp thở urease bằng sử dụng phóng xạ 13C hoặc 14C: là phương pháp tương đối chíng xác. Dựa trên khả năng của HP phân huỷ ure thành amoniac và CO2. Cho bệnh nhân uống một dung dịch ure phóng xạ 13C hoặc 14C, khi có mặt Helicobacter Pylori thì ure phóng xạ này sẽ bị phân huỷ và giải phóng ra CO2 phóng xạ, chất này được hấp thụ vào máu và được thải ra qua phổi trong khí thở ra, sau đó người ta đo CO2 phóng xạ trong vòng 1 giờ . Các mẫu khí thở ra được phân tích tìm phóng xạ bằng một máy đếm nhấp nháy. Phương pháp này nhạy và đặc hiệu nhưng đắt tiền, hay dùng cho 20