Định danh tế bào đầu dòng tiết dopamin trên phôi chuột cống trắng marker vimentin và thyroxin hydroxylase

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> ĐỊNH DANH TẾ BÀO ĐẦU DÒNG TIẾT DOPAMIN TRÊN PHÔI<br /> CHUỘT CỐNG TRẮNG MARKER VIMENTIN VÀ<br /> THYROXIN HYDROXYLASE<br /> Nguyễn Thị Bình*; Nguyễn Phúc Hoàn*<br /> Nguyễn Thanh Hoa*; Nguyễn Mạnh Hà*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: định danh quần thể tế bào đầu dòng tiết dopamin ở não giữa phôi chuột cống trắng.<br /> Phương pháp: ống thần kinh não giữa phôi chuột cống trắng giai đoạn 12,5 - 13,5 ngày tuổi<br /> (E.12,5 - E.13,5) trích thủ từ phôi chuột một phần được nhuộm hóa mô miễn dịch với 2 marker<br /> là vimentin và thyroxin hydroxylase (TH); một phần được phân lập, nuôi cấy trong môi trường<br /> cơ bản (DMEM/F12; 1:1) có bổ sung b-FGF2, EGF và một số yếu tố tăng trưởng khác. Tiếp tục<br /> nhuộm các tế bào thu được sau nuôi cấy với 2 marker trên. Kết quả: biểu hiện vimentin có ở<br /> hầu hết các tế bào ống thần kinh phôi chuột, giai đoạn E.13,5 dương tính mạnh hơn E.12,5.<br /> Biểu hiện TH bắt đầu thấy ở E.13,5. Sau nuôi cấy, các tế bào tăng sinh mạnh, hầu hết tế bào<br /> dương tính với vimentin, một số tế bào dương tính với TH.<br /> * Từ khoá: Tế bào đầu dòng tiết dopamin; Vimentin; Thyroxin hydroxylase.<br /> <br /> Identify Dopaminergic Precursor Cells in Rat’s Embryo by Vimentine<br /> and Thyroxin Hydroxylase<br /> Summary<br /> Objectives: To identify dopaminergic precursor cells in rat mesencephalon tube by vimentine<br /> and thyroxin hydroxylase (TH). Methods: Rat mesencephalic cells from embryonic days 12.5 13.5 (E.12.5 - E.13.5) days were dissected, a half of pieces were immunostained with vimentine<br /> and TH’s markers; the others were isolated and cultured in the medium composed of DMEM/F12<br /> (1:1), supplemented with b-FGF2, EGF and growth factors. Harvest cells were immunostained with<br /> these makers. Results: While vimentine was positive in almost all cells of the mesencephalon<br /> tube, TH was not positive until E.13.5. Ventral mesencephalon cells were proliferated and<br /> differentiated after 6 - 8 days culture. A large number of harvest cells were positive with vimentin<br /> and some of them were positive with TH.<br /> * Keywords: Dopaminergic precursor cells; Vimentine; Thyroxine hydroxylase.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Trước đây, hệ thần kinh được coi là hệ<br /> cơ quan “thầm lặng” nhất trong cơ thể do<br /> các tế bào không tiếp tục được tạo mới<br /> <br /> sau khi trẻ ra đời. Tuy nhiên, Joshep Alman<br /> và CS tại Viện Nghiên cứu Massachusette<br /> (Hoa Kỳ) đ làm thay đổi quan điểm này khi<br /> công bố có tồn tại H3-thymidin, chất đánh<br /> dấu phân chia tế bào ở não chuột cống trắng<br /> <br /> * Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Phúc Hoàn (phuchoan85@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/08/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 01/09/2017<br /> <br /> 179<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> trưởng thành (1962) [1]. Sau đó, nhiều<br /> nghiên cứu khác đ chỉ ra sự tồn tại của<br /> tế bào gốc thần kinh trong não [2]. Tế bào<br /> gốc có khả năng phân chia và phát triển<br /> thành tế bào chuyên biệt các cơ quan<br /> trong cơ thể. Nếu như ở phôi là tế bào<br /> gốc vạn năng - chịu trách nhiệm hình<br /> thành nên những cơ quan, hệ cơ quan thì<br /> ở cơ thể trưởng thành là những tế bào<br /> gốc đơn tiềm năng hoặc đa tiềm năng đóng vai trò trong việc thay thế tế bào<br /> thoái hóa, góp phần sửa chữa những cơ<br /> quan, vùng cơ quan bị tổn thương. Như<br /> vậy, tế bào gốc nói chung và tế bào gốc<br /> thần kinh nói riêng có thể được phân lập<br /> từ nhiều nguồn tế bào khác nhau: có thể<br /> rất sớm ngay từ lúc phôi của phôi nang<br /> hoặc từ phôi ở các giai đoạn phát triển<br /> <br /> khác nhau hoặc ở người trưởng thành.<br /> Chính vì thế, việc định danh tế bào phân<br /> lập được để nhận biết chính xác nguồn<br /> tế bào đang sử dụng là một thách thức<br /> lớn với các nhà khoa học. Với tế bào<br /> gốc thần kinh, rất nhiều marker có thể<br /> sử dụng như: nestin, vimentin, musashi 1,<br /> SOX1, PAX6… [3]. Tuy nhiên, chưa có<br /> marker nào thực sự đặc hiệu, do đó việc<br /> sử dụng phối hợp nhiều marker sẽ giúp<br /> tăng giá trị chẩn đoán dương tính của xét<br /> nghiệm. Nằm trong đề tài nghiên cứu ứng<br /> dụng quy trình phân lập tế bào gốc não<br /> giữa thần kinh phôi chuột để điều trị bệnh<br /> Parkinson thực nghiệm, chúng tôi sử dụng<br /> hai marker là vimentin và TH để nhận biết<br /> tế bào đầu dòng tiết dopamin các tế bào<br /> được lấy từ não giữa phôi chuột cống trắng.<br /> <br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> Phôi chuột cống giai đoạn 12,5 - 13,5 ngày tuổi (E.12,5 - E.13,5).<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Mô hình nghiên cứu:<br /> <br /> Tạo phôi chuột<br /> <br /> Não giữa phôi chuột<br /> E.12,5 - E.13,5<br /> Nhuộm hóa mô miễn<br /> dịch với vimentin và TH<br /> Phân lập và nuôi cấy<br /> tăng sinh<br /> <br /> * Tạo phôi chuột:<br /> - Chuột cống đực và cái trưởng thành được nhốt qua đêm (từ 19 giờ ngày hôm trước<br /> tới 8 giờ sáng ngày hôm sau).<br /> - Kiểm tra phiến đồ âm đạo chuột vào buổi sáng hôm sau. Nếu có tinh trùng trong<br /> âm đạo, chuột cái được coi là có thai ngày 0,5. Nếu không, coi như không có thai.<br /> - Phẫu tích lấy phôi chuột vào thời điểm E.12,5 - E.13,5.<br /> 180<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> * Trích thủ mô não giữa phôi chuột<br /> E.12,5 - E.13,5:<br /> - Cắt rời phần đầu phôi cho vào môi<br /> trường HBSS.<br /> - Đặt não phôi theo mặt ngang, cắt<br /> thẳng đứng từ trên xuống, giới hạn phía<br /> trước có rãnh giữa não giữa và n o trước,<br /> giới hạn phía sau có rãnh giữa não giữa<br /> vào não sau.<br /> - Loại bỏ ngoại bì da và màng não phía<br /> ngoài dưới kính hiển vi soi nổi.<br /> * Phân lập và nuôi cấy tăng sinh mảnh<br /> mô sàn não giữa phôi chuột:<br /> - Phẫu tích cắt bỏ vùng trần não giữa,<br /> giữ lại mảnh mô sàn não.<br /> - Dùng enzym dispase và trypsin EDTA để ly giải mô sàn não giữa thành<br /> dịch treo.<br /> - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:<br /> DMEM/F12 (1:1) có bổ sung thêm transferin<br /> (100 mg/ml), insulin (25 ng/ml), progesteron<br /> (20 nM), putrescin (62 mM) và muối selinit<br /> (30 nM), 20 ng/ml EGF và FGF-2 (sigma),<br /> penicillin (100 UI/ml), streptomycin (100 µg/ml),<br /> amphotericin B (0,25 µg/ml).<br /> - Nuôi cấy dịch treo tế bào phân lập<br /> được với mật độ 1,5 x 104/cm2 trong slide<br /> chambre.<br /> - Khi các tế bào mọc kín đáy slide chambre,<br /> tiến hành nhuộm hóa mô miễn dịch.<br /> * Kỹ thuật nhuộm hoá mô miễn dịch<br /> với marker vimentin và TH não giữa phôi<br /> chuột:<br /> Mảnh mô não giữa phôi chuột sau khi<br /> loại bỏ ngoại bì da và màng n o được cố<br /> định bằng PFA 4% trong 2 giờ ở nhiệt độ<br /> phòng, tiếp tục ngâm sucrose 20% qua<br /> đêm ở 40C, sau đó đúc khuôn OCT và để<br /> lạnh ở nhiệt độ -200C đến -800C. Dùng máy<br /> <br /> cắt lạnh cắt từng lát mỏng 5 - 10 µm rồi<br /> tiến hành hoạt hóa kháng nguyên bằng<br /> dung dịch đệm natri citrat 0,1 M, pH 6,0 ở<br /> 96°C, đưa lại nhiệt độ thường và rửa nước.<br /> Tiếp theo, tiến hành block kháng nguyên<br /> không đặc hiệu bằng dung dịch 5% NGS,<br /> 0,1% triton X-100 trong PBS 0,1 M.<br /> Nhuộm kháng thể vimentin (abcam, ab92745<br /> pha loãng 1/300) hoặc TH (abcam, ab112<br /> pha loãng 1/750) qua đêm ở 4°C. Rửa PBS<br /> 0,1 M 3 lần, sau đó tiếp tục nhuộm kháng<br /> thể huỳnh quang (alexa flour 546 pha<br /> loãng 1/200 trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng;<br /> cuối cùng là nhuộm nhân tế bào bằng sytox<br /> green (pha loãng 1/10.000) trong 1 phút.<br /> Rửa PBS 0,1 M, dán lamelle và soi trên<br /> kính hiển vi huỳnh quang.<br /> * Kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch<br /> với marker vimentin và TH tế bào não giữa<br /> phôi chuột sau nuôi cấy:<br /> Các mẫu tế bào sau khi hút bỏ môi<br /> trường nuôi cấy, cố định ngay trong dung<br /> dịch PFA 4% 20 phút. Rửa sạch PFA<br /> bằng PBS 0,1 M. Sau đó ủ với marker<br /> vimentin (abcam, ab92745 pha loãng 1/300)<br /> hoặc TH (abcam, ab112 pha loãng 1/750),<br /> ở nhiệt độ 40C qua đêm. Tiếp tục phủ<br /> kháng thể 2 gắn huỳnh quang (alexa flour<br /> 546 pha loãng 1/200) trong 1 giờ ở nhiệt<br /> độ phòng. Nhuộm nhân tế bào bằng sytox<br /> green (pha loãng 1/10.000) trong 30 giây.<br /> Rửa 3 lần bằng PBS 0,1 M. Mẫu tế bào<br /> được chụp ảnh trên kính hiển vi huỳnh quang.<br /> * Chỉ tiêu nghiên cứu:<br /> - Hình ảnh não giữa phôi chuột cống<br /> trắng E.12,5 nhuộm vimentin, TH.<br /> - Hình ảnh não giữa phôi chuột cống<br /> trắng E.13,5 nhuộm vimentin, TH.<br /> - Hình ảnh tế bào não giữa phôi chuột<br /> sau nuôi cấy nhuộm vimentin, TH.<br /> 181<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> * Thời gian và địa điểm nghiên cứu:<br /> Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10 - 2014 đến 10 - 2016 tại Bộ môn Mô phôi,<br /> Trường Đại học Y Hà nội.<br /> * Đạo đức nghiên cứu:<br /> Nghiên cứu thực nghiệm trên chuột cống trắng đ được Hội đồng Đạo đức Trường<br /> Đại học Y Hà Nội phê duyệt.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Biểu hiện marker vimentin ở não giữa phôi chuột E.12,5 - E.13,5.<br /> <br /> Hình 1: Nhuộm hóa mô miễn dịch marker vimentin thành<br /> não giữa phôi chuột E.12,5 - E.13,5.<br /> (A, B: biểu hiện marker vimentin (màu đỏ); C,D: nhuộm nhân với sytox (xanh))<br /> Bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch mảnh mô não giữa phôi chuột cống<br /> trắng giai đoạn E.12,5 - E.13,5, chúng tôi quan sát thấy tại thời điểm E.12,5 (hình 1A)<br /> các tế bào dương tính với vimentin (màu đỏ), một số tế bào có xu hướng tạo nhánh,<br /> chạy xuyên suốt thành não giữa, nhân tế bào bắt màu xanh (hình 1B).<br /> 182<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Não giữa phôi chuột E.13,5, các tế bào ở ống thần kinh não giữa tăng mạnh về số<br /> lượng, thành ống dày đặc nhân tế bào. Bào tương tế bào bắt màu mạnh với marker<br /> vimentin (màu đỏ, hình 1C), các nhánh bào tương chạy vuông góc với thành não giữa,<br /> nhân tế bào bắt màu xanh (hình 1D).<br /> 2. Biểu hiện marker TH ở não giữa phôi chuột E.12,5 - E.13,5.<br /> <br /> Hình 2: Nhuộm hóa mô miễn dịch marker TH thành<br /> não giữa phôi chuột E.12,5 - E.13,5.<br /> (A, B: ở giai đoạn E.12,5, không thấy biểu hiện của marker TH (màu đỏ - A);<br /> B: nhuộm nhân màu xanh với sytox; C, D: ở giai đoạn E.12,5, bắt đầu xuất hiện một số<br /> tế bào TH (+) (màu đỏ). Hai hình ảnh A, B chụp 2 kênh màu của cùng một cấu trúc)<br /> Khi nhuộm hóa mô miễn dịch ống thần kinh não giữa phôi chuột với marker TH,<br /> chúng tôi không quan sát thấy tế bào nào có biểu hiện của marker này ở giai đoạn<br /> E.12,5 (hình 2A, B). Tuy nhiên, ở giai đoạn E.13,5, chúng tôi bắt đầu quan sát được<br /> một số tế bào dương tính với TH ở vùng sàn não giữa (hình 2C, D).<br /> 183<br /> <br />