Dinh dưỡng, sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật

Chia sẻ: Thanh Thảo | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:24

Thêm vào BST

Báo xấu

141
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong quá trình sống, tế bào vi sinh vật tiến hành trao đổi chất không ngừng với môi trường chung quanh. Tế bào vi sinh vật tuy rất nhỏ, nhưng vì hấp thu các chất dinh dưỡng và thải ra các sản phẩm trao đổi chất qua toàn bộ bề mặt, cho nên cường độ trao đổi chất của chúng là rất lớn

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Dinh dưỡng, sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật

78 Chương 4 Dinh dưỡng, sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật I. Dinh dưỡng Trong quá trình sống, tế bào vi sinh vật tiến hành trao đổi chất không ngừng với môi trường chung quanh. Tế bào vi sinh vật tuy rất nhỏ, nhưng vì hấp thu các chất dinh dưỡng và thải ra các sản phẩm trao đổi chất qua toàn bộ bề mặt, cho nên cường độ trao đổi chất của chúng là rất lớn. Các chất dinh dưỡng vào tế bào qua màng và được chuyển hoá để tạo thành những chất riêng biệt cần thiết cho việc xây dựng tế bào. Nhờ quá trình đồng hoá các tế bào mới có thể sinh trưởng, phát triển tăng sinh khối, đồng thời tạo ra các sản phẩm trao đổi chất. Sự biến đổi các chất dinh dưỡng bao gồm nhiều phản ứng hoá sinh khác nhau nhờ hệ enzyme theo con đường trao đổi chất, hoặc tạo ra những chất là thành phần của tế bào (quá trình đồng hoá) hoặc tạo ra năng lượng sinh học cần thiết cho hoạt động sống (quá trình dị hoá). Những chất dinh dưỡng là những hợp chất phân tử nhỏ có thể đi qua màng vào bên trong tế bào vi sinh vật và tham gia vào hai loại phản ứng sinh hoá: - Biến đổi dị hoá làm xuất hiện những sản phẩm có cấu trúc đơn giản hơn. Những biến đổi dị hoá này cung cấp cho vi sinh vật năng lượng chuyển hoá ở dạng ATP hoặc những hợp chất giàu năng lượng khác. Một số những sản phẩm dị hoá được thải đi, một số khác làm vật liệu hoặc làm tiền chất cho các phản ứng đồng hoá. - Biến đổi đồng hoá, đảm bảo sự tổng hợp của thành phần mới có cấu trúc phức tạp hơn và phân tử lượng cao hơn. Quá trình này thường được gọi là đồng hoá hoặc sinh tổng hợp. Điều kiện chủ yếu để sinh tổng hợp các thành phần tế bào vi sinh vật là cung cấp một lượng thích hợp của những hợp chất có phân tử lượng nhỏ, như các acid hữu cơ hoặc amino acid, có thể làm nguyên liệu hay tiền chất cho các phản ứng đồng hoá hay phản ứng sinh tổng hợp. Khi trong môi trường có những hợp chất - vật liệu đó thì vi sinh vật sẽ trực tiếp sử dụng. Nhưng không phải bao giờ trong môi trường cũng có sẵn những hợp chất - vật liệu cần cho quá trình sinh tổng hợp. Muốn có tế bào vi sinh vật bắt buộc phải tự sản xuất lấy bằng cách tự biến đổi những thành phần của môi trường nuôi cấy. Ở những vi sinh vật dị dưỡng sống bằng chất hữu cơ,
79 một số tiền chất được hình thành trong các phản ứng dị hoá, nó sản sinh ra ATP cùng một số lớn các hợp chất khác nhau của carbon. Các chất dinh dưỡng của vi sinh vật chủ yếu lấy ở môi trường xung quanh. Các môi trường dinh dưỡng nhân tạo cần cung cấp đầy đủ năng lượng, các vật liệu xây dựng tế bào và đảm bảo cho hiệu suất sinh tổng hợp cao. Thành phần môi trường gồm có các nguồn ăn carbon, nitơ, chất khoáng, các nguyên tố vi lượng và các chất kích thích sinh trưởng. Việc lựa chọn các nguồn dinh dưỡng và nồng độ của chúng trong môi trường phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng từng loài vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy chúng. II. Môi trường dinh dưỡng và điều kiện sinh trưởng 1. Môi trường dinh dưỡng 1.1. Nguồn thức ăn carbon Tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn carbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO2, NaHCO3 , CaCO3... ) hoặc chất hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn carbon khác nhau phụ thuộc vào thành phần hóa học, tính chất sinh lí của nguồn thức ăn và đặc điểm sinh lí của từng loại vi sinh vật. Hầu như không có hợp chất carbon nào mà không bị hoặc nhóm vi sinh vật này hoặc nhóm vi sinh vật khác phân giải. Không ít vi sinh vật có thể đồng hóa được cả các hợp chất carbon rất bền vững như cao su, chất dẻo, dầu mỏ, parafin, khí tự nhiên. Nhiều chất hữu cơ vì không tan được trong nước hoặc vì có khối lượng phân tử quá lớn cho nên trước khi được hấp thụ, vi sinh vật phải tiết ra các enzyme thủy phân (amylase, cellulase, pectinase, protease, lipase...) để chuyển hóa chúng thành các hợp chất dễ hấp thụ (đường, amino acid, acid béo...). Người ta thường sử dụng đường để làm nguồn thức ăn carbon khi nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng. Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác nhau người ta dùng các nồng độ đường không giống nhau. Với vi khuẩn, xạ khuẩn thường dùng 0,2 - 0,5% đường còn đối với nấm men, nấm sợi thường dùng 3 - 10% đường. Hầu hết vi sinh vật chỉ đồng hóa được các loại đường ở dạng đồng phân D. Nhưng phần lớn các đồng phân của đường đơn trong tự nhiên đều là thuộc loại D. Các hợp chất hữu cơ chứa cả C và N (peptone, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, nước chiết giá đậu...) có thể sử dụng vừa làm nguồn C vừa làm nguồn N đối với vi sinh
80 vật. Với vi sinh vật dị dưỡng, nguồn thức ăn carbon làm cả hai chức năng, nguồn dinh dưỡng và năng lượng. 1.2. Nguồn dinh dưỡng nitơ (N) Ý nghĩa chủ yếu của các chất dinh dưỡng chứa nitơ đối với vi sinh vật là cung cấp N để tạo thành các nhóm amin (-NH2) và nhóm imin (=NH) trong phân tử amino acid, các nucleotide, purine và pirimidine, trong nhiều vitamin... Nguồn nitơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NO3- và NH4+. Muối nitrate là nguồn thức ăn nitơ thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp đối với nhiều loại nấm men và vi khuẩn. Sau khi vi sinh vật sử dụng hết gốc NO3- các ion kim loại còn lại (K+, Na+, Mg2+..) sẽ làm kiềm hóa môi trường. Để tránh hiện tượng này người ta thường sử dụng muối NH4NO3 để làm nguồn nitơ cho nhiều loại vi sinh vật. Tuy nhiên gốc NH4+ thường được hấp thụ nhanh hơn gốc NO3-. Vi sinh vật còn có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Các thức ăn này sẽ vừa là nguồn carbon vừa là nguồn nitơ cung cấp cho vi sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử. Rất nhiều vi sinh vật có khả năng sản sinh protease thủy phân protein thành các hợp chất phân tử thấp có khả năng xâm nhập vào tế bào vi sinh vật. Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là peptone (là chế phẩm thủy phân không triệt để của một nguồn protein nào đó) chúng khác nhau về lượng chứa các loại polypeptide và lượng chứa amino acid tự do. Ngoài ra phân tử N2 tự do cũng được một nhóm nhỏ vi sinh vật sử dụng gọi là nhóm vi sinh vật cố định nitơ (nitrogen fixing microorrganisms). Chúng có hệ enzyme nitrogenase có thể bẻ gãy nối ba của nitơ phân tử ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường. 1.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng Khi sử dụng các môi trường thiên nhiên để nuôi cấy vi sinh vật thường không cần thiết bổ sung các nguyên tố khoáng. Trong nguyên liệu dùng để pha chế các môi trường này (khoai tây, nước thịt, sữa, huyết thanh, peptone, giá đậu...) thường có chứa đủ các nguyên tố khoáng cần thiết đối với vi sinh vật. Ngược lại, khi làm các môi trường tổng hợp (dùng nguyên liệu là hóa chất) bắt buộc phải bổ sung đủ các nguyên tố khoáng cần thiết. Những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi phải được cung cấp với liều lượng lớn được gọi là các nguyên tố đại lượng. Còn những
81 nguyên tố khoáng mà vi sinh vật chỉ đòi hỏi với những liều lượng rất nhỏ được gọi là các nguyên tố vi lượng. Phosphorus (P) bao giờ cũng chiếm tỉ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật (nhiều khi P chiếm đến 50% so với tổng số chất khoáng). P có mặt trong cấu tạo của nhiều thành phần quan trọng của tế bào (acid nucleic, phosphoprotein, phospholipid, ADP, ATP, UDP, UTP, CDP, CTP, NAD, NADP, flavin...; một số vitamin như thiamine, biotin...). Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng P người ta thường sử dụng các loại muối phosphate vô cơ. Việc bổ sung phosphate vào các môi trường dinh dưỡng ngoài tác dụng cung cấp P còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường. Lưu huỳnh (S) cũng là một nguyên tố khoáng quan trọng trong tế bào vi sinh vật. S có mặt trong một số amino acid (cysteine, cystine, methionine), một số vitamin (biotin, thiamine...) cysteine, cystine và một tripeptide là glutation không chỉ tham gia vào cấu trúc protein mà còn có vai trò quan trọng trong các quá trình ôxy hóa khử. Các hợp chất hữu cơ có chứa S ở dạng ôxy hóa thường có tác dụng độc đối với tế bào vi sinh vật. Trong khi đó các muối sulphate vô cơ với nguyên tử S ở trạng thái ôxy hóa lại được cơ thể vi sinh vật đồng hóa rất tốt. Một số vi sinh vật có thể dùng cả thiosulphate làm nguồn thức ăn S. Một số vi sinh vật khác lại đòi hỏi các thức ăn chứa S ở dạng khử (H2S, cystine, cysteine...). Fe là nguyên tố rất cần thiết để giúp vi sinh vật có thể tổng hợp một số enzyme loại porphiryl chứa sắt (như cytochrome, cytochrome - oxydase, peroxydase, catalase...). Một số vi sinh vật tự dưỡng quang năng còn sử dụng Fe để tổng hợp ra các sắc tố quang hợp có cấu trúc porphiryl (chlorophyll, bacteriochlorophyll). Mg là nguyên tố được vi sinh vật đòi hỏi cung cấp với lượng khá cao. Mg mang tính chất một cofactor, chúng tham gia nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến qúa trình phosphoryl hóa. Mg2+ có thể hoạt hóa các enzyme như hexokinase, ATP - ase, carboxylase, các enzyme trao đổi protein, các enzyme ôxy hóa khử của chu trình Krebs... Mg còn có vai trò quan trọng trong việc liên kết các tiểu phần ribosome với nhau. Ca mặc dầu là nguyên tố ít tham gia vào việc xây dựng nên các chất hữu cơ nhưng nó có vai trò đáng kể trong việc xây dựng các cấu trúc tinh vi của tế bào. Ca đóng vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng của tế bào sống (như giữa ADN và protein trong nhân, giữa các nucleotide với nhau, giữa ARN và protein trong ribosome). Ca rất cần thiết đối với việc hình thành các cấu trúc không gian ổn định của nhiều bào quan như ribosome, ti thể, nhân...
82 Zn cũng là một cofactor tham gia vào nhiều quá trình enzyme. Zn có tác dụng đáng kể trong việc hoạt hóa các enzyme như carbonanhydrase, enolase, pyrophosphatase, phosphatase kiềm ... Cũng có một số nguyên tố hóa học chúng ta chưa hiểu rõ về vai trò sinh lí của chúng, trong số đó phải kể đến là K. K là nguyên tố chiếm tỉ lệ khá cao trong thành phần khoáng của tế bào vi sinh vật, nhưng cho đến nay người ta chưa tìm thấy K tham gia vào bất kì thành phần nào của nguyên sinh chất, cũng chưa tìm thấy bất kì enzyme nào có chứa K. K thường tồn tại ở dạng ion K+ ở mặt ngoài của cấu trúc tế bào. Một phần đáng kể K tồn tại ở trạng thái liên kết hóa lí không bền với protein và các thành phần khác của nguyên sinh chất. K làm tăng độ ngậm nước của các hệ thống keo do đó ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi chất, nhất là các quá trình sinh tổng hợp. K còn có thể tham gia vào quá trình tổng hợp một số vitamin và có ảnh hưởng đến quá trình hô hấp của tế bào vi sinh vật. Na và Cl cũng là những nguyên tố mà nhiều vi sinh vật đòi hỏi với một lượng không nhỏ, nhưng cho tới nay người ta vẫn còn biết rất ít vai trò sinh lí của chúng. Hàm lượng Na và Cl đặc biệt cao trong tế bào vi sinh vật ưa mặn sống trong nước biển, đất, vùng ven biển hoặc trên các loại thực phẩm ướp mặn. 1.4. Yếu tố sinh trưởng Đối với vi sinh vật thì yếu tố sinh trưởng là một khái niệm rất linh động. Nó chỉ có ý nghĩa là những chất hữu cơ cần thiết đối với hoạt động sống mà một loại vi sinh vật nào đó không tự tổng hợp được từ các chất khác. Những chất được coi là yếu tố sinh trưởng của loài vi sinh vật này hoàn toàn có thể không phải là yếu tố sinh trưởng đối với một loại vi sinh vật khác. Hầu như không có chất nào là yếu tố sinh trưởng chung đối với tất cả các loài vi sinh vật. Đặc điểm của môi trường sống một mặt ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp yếu tố sinh trưởng của vi sinh vật, mặt khác ảnh hưởng đến đặc điểm trao đổi chất của chúng. Chính thông qua các ảnh hưởng này mà môi trường sống của từng loại vi sinh vật đã góp phần quyết định nhu cầu của chúng về yếu tố sinh trưởng. Khi sống lâu dài trong các môi trường thiếu yếu tố sinh trưởng, vi sinh vật sẽ dần dần tạo ra được khả năng tự tổng hợp yếu tố sinh trưởng mà chúng cần thiết. Cùng một loài vi sinh vật nhưng nếu nuôi cấy trong các điều kiện khác nhau cũng có thể có những nhu cầu khác nhau về yếu tố sinh trưởng. Chẳng hạn nấm mốc Mucor rouxii được chứng minh là chỉ cần biotin và
83 thiamine khi phát triển trong điều kiện kị khí. Khi nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí, chúng sẽ tự tổng hợp ra được yếu tố sinh trưởng này. Sự có mặt của một số chất dinh dưỡng khác có khi cũng ảnh hưởng đến nhu cầu về yếu tố sinh trưởng của vi sinh vật. Chẳng hạn việc đòi hỏi acid pantotenic của một số vi sinh vật (ví dụ vi khuẩn bạch hầu Corynebacterium diphtheriae) có thể thỏa mãn khi chỉ cần cung cấp cho chúng β - alanine, chúng có thể tự tổng hợp được acid pantoic (acid pantotenic cấu tạo từ acid pantoic và β - alanine). Thông thường các chất được coi là yếu tố sinh trưởng đối với một loài nào đó có thể thuộc về một trong các loại sau đây: các gốc kiềm purine, pirimidine và các dẫn xuất của chúng, các acid béo và thành phần của màng tế bào, các vitamin thông thường... Mặt khác, nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp vitamin. Sinh khối vi sinh vật thường chứa hầu hết các loại vitamin chủ yếu với những hàm lượng khá cao. Người ta đã sử dụng thành công một số loài vi sinh vật để sản xuất ở quy mô công nghiệp một số loại vitamin tinh khiết dùng trong y học. Đáng chú ý nhất là acid ascorbic (vitamin C), riboflavin (vitamin B2), cyanocobalamin (vitamin B12). 2. Điều kiện sinh trưởng Sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật liên quan chặt chẽ với các điều kiện của môi trường bên ngoài. Các điều kiện này bao gồm hàng loạt các yếu tố khác nhau, tác động qua lại với nhau. Đa số các yếu tố đó đều có một đặc tính tác dụng chung biểu hiện ở ba điểm hoạt động là tối thiểu, tối thích và cực đại. 2.1. Cơ chế tác dụng của các yếu tố bên ngoài lên vi sinh vật Các yếu tố của môi trường bên ngoài tác dụng lên tế bào thuộc ba loại là yếu tố vật lí (độ ẩm, nhiệt độ, áp lực, tia bức xạ...), yếu tố hóa học (pH môi trường, thế ôxy hóa khử, các chất diệt khuẩn...) và yếu tố sinh học (chất kháng sinh, kháng thể). Dù là yếu tố nào nhưng khi đã tác dụng bất lợi lên tế bào thì thường trước hết gây tổn hại đến các cấu trúc quan trọng cho sự sống của tế bào. Những tổn hại đó dẫn đến phá hủy chức phận hoạt động của các cấu trúc và làm chết tế bào. Chừng nào tế bào vi sinh vật có thể sống sót chính là do chúng đã thích ứng với yếu tố đã cho bằng những thay đổi về sinh lí hoặc di truyền. Tác dụng có hại của các yếu tố bên ngoài tế bào thể hiện chủ yếu ở những biến đổi sau đây: 1. Phá hủy thành tế bào: một số chất như enzyme lysozyme (chứa trong lá lách, bạch cầu, lòng trắng trứng, đuôi thực khuẩn thể...) có khả
84 năng phân huỷ thành tế bào vi khuẩn dẫn đến tạo thành các nguyên lạp chủ yếu ở vi khuẩn Gram dương và các cầu lạp ở vi khuẩn Gram âm. 2. Biến đổi tính thấm của màng tế bào chất: một số chất không nhất thiết phải xâm nhập tế bào, nhưng vẫn gây tác dụng kháng khuẩn. Do tác dụng lên một hoặc một chức phận sinh lí của màng tế bào, chất này sẽ làm vi khuẩn mất khả năng sinh sản. Rất có thể, trong trường hợp như vậy, hàng rào thẩm thấu tồn tại trong màng tế bào chất đã bị hư hại. Tác dụng kháng khuẩn của các chất ôxy hóa và các chất khử (H2O2, các halogen ...) là do ảnh hưởng của chúng lên các thành phần của màng tế bào chất. Cũng có thể xếp vào nhóm các hợp chất này là rượu, phenol, các chất tẩy rửa tổng hợp, các muối mật và một số kháng sinh (polymyxin, thyroxydin, nistatin). 3.Thay đổi đặc tính keo của nguyên sinh chất: các yếu tố vật lí cũng như hóa học đều có thể gây nên tác dụng này. Chẳng hạn nhiệt độ cao làm biến tính protein và làm chúng đông tụ do khả năng khử nước. 4. Kìm hãm hoạt tính: một số chất tác động vào các hệ thống sinh năng lượng của tế bào, cyanite kìm hãm cytochrome - oxydase, fluoride ngăn cản quá trình đường phân, các hợp chất hoá trị ba của acsenic bao vây chu trình Krebs, dinitrophenol kìm hãm quá trình phosphoryl hoá ôxy hóa. Các chất ôxy hóa mạnh (H2O2, halogen) phá hủy các hệ thống tế bào làm tổn hại đến chức phận trao đổi chất. Các enzyme khác có thể bị bất hoạt khi liên kết với các yếu tố kim loại như thủy ngân. 5. Hủy hoại các quá trình tổng hợp: trong sự có mặt của một số chất tương tự về mặt cấu trúc với các chất trao đổi tự nhiên, gọi là các chất kháng chất trao đổi (antimetabolism), quá trình sinh tổng hợp có thể bị ức chế. Cơ chế tác dụng của các chất kháng chất trao đổi không giống nhau. Một số gắn với trung tâm hoạt động của enzyme làm cho enzyme mất hoạt tính phân hủy cơ chất; một số khác có thể tham gia vào phản ứng enzyme và được lắp vào sản phẩm của phản ứng nhưng sau đó không được sử dụng trong trao đổi chất với cùng mức độ như trong trường hợp của cơ chất thực. 2.2. Các nhân tố ảnh hưởng * Các yếu tố vật lí - Độ ẩm: hầu hết các quá trình sống của vi sinh vật có liên quan đến nước, do đó độ ẩm là một yếu tố quan trọng của môi trường. Đa số vi khuẩn thuộc các sinh vật ưa nước nghĩa là chúng cần nước ở dạng tự do, dễ hấp thụ. Chỉ một số xạ khuẩn có thể xếp vào bọn ưa khô. Nếu làm lạnh tế bào đồng thời làm khô trong chân không ta có thể bảo quản được sức
85 sống của tế bào trong một thời gian dài. Đây là nguyên tắc của phương pháp làm đông khô vi khuẩn. Do vi khuẩn cần độ ẩm nhất định để sinh trưởng nên bằng cách phơi khô hoặc sấy khô ta có thể bảo quản được lâu dài nhiều loài sản phẩm (hoa quả khô, cá, ruốc thịt khô). - Nhiệt độ: hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật có thể coi là kết quả của các phản ứng hóa học. Vì các phản ứng này thuộc phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố nhiệt rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sống của tế bào. Như đã nói trên, hoạt động của vi sinh vật bị giới hạn trong môi trường chứa nước ở dạng có thể hấp thụ. Vùng này của nước nằm từ 2oC đến khoảng 100oC gọi là vùng sinh động học. Hầu hết tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật bị chết ở nhiệt độ cao do protein bị biến tính, một hoặc hàng loạt enzyme bị bất hoạt. Các enzyme hô hấp đặc biệt là các enzyme trong chu trình Krebs rất mẫn cảm với nhiệt độ. Sự chết của vi khuẩn ở nhiệt độ cao cũng có thể còn là hậu quả của sự bất hoạt hóa ARN và sự phá hoại màng tế bào chất (nói chung, các acid nucleic ít mẫn cảm với nhiệt độ so với các enzyme). Nhiệt độ thấp (dưới vùng sinh động học) có thể làm bất hoạt quá trình vận chuyển các chất hòa tan qua màng tế bào chất do thay đổi cấu hình không gian của một số permease chứa trong màng hoặc ảnh hưởng đến việc hình thành và tiêu thụ ATP cần cho quá trình vận chuyển chủ động các chất dinh dưỡng. - Áp lực: áp suất thẩm thấu và áp suất thủy tĩnh có thể ảnh hưởng đến cấu trúc của tế bào vi khuẩn. Màng tế bào chất của tế bào vi khuẩn là bán thấm do đó các hiện tượng thẩm thấu và việc điều chỉnh thẩm áp qua các hệ thống permease đều có liên quan đến màng này. Trong môi trường ưu trương tế bào mất khả năng rút nước và các chất dinh dưỡng hòa tan bao quanh, tế bào chịu trạng thái khô sinh lí, bị co sinh chất và có thể bị chết nếu thời gian kéo dài. Trong thực tế người ta ứng dụng tác dụng co sinh chất của các nồng độ muối cao (10 - 15%) hoặc đường cao (50- 80%) để bảo quản thực phẩm (muối dưa, cà, ướp thịt cá), hoa quả (làm mứt) vì đa số vi sinh vật rất mẫn cảm với thẩm áp cao của môi trường. Ngược lại, khi vi khuẩn vào dung dịch nhược trương nước sẽ xâm nhập tế bào, áp lực bên trong sẽ tăng lên. Tuy nhiên, do có thành tế bào cứng ở vi khuẩn không xảy ra ra hiện tượng vỡ sinh chất như ở tế bào thưc vật. Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường chứa ít hơn 2% muối, nồng độ muối cao hơn có hại cho tế bào. Nhưng cũng có một số vi khuẩn lại sinh trưởng tốt nhất trong môi trường chứa tới 30% muối, ta gọi
86 là các vi khuẩn ưa muối (halophilic). Nhiều vi khuẩn ở biển thuộc nhóm này, chúng không có khả năng phát triển ở những nồng độ đường cao. - Các tia bức xạ: ánh sáng có thể gây ra những biến đổi và do đó có thể gây tổn thương sinh học nếu được tế bào hấp thụ. Mức độ gây hại tùy thuộc vào mức năng lượng trong lượng tử ánh sáng được hấp thụ. Các tia có thể gây những biến đổi hóa học là ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại, tia X, tia gamma và tia vũ trụ. Ánh sáng mặt trời có thể gián tiếp tác động lên tế bào do làm biến đổi môi trường. Tia tử ngoại có tác dụng mạnh nhất ở bước sóng 260nm, đây là vùng hấp thụ cực đại của acid nucleic và nucleoprotein gây dimer hóa thimine, dẫn đến ức chế sự nhân đôi của ADN. Nhưng sau khi chiếu tia tử ngoại, nếu đưa vi khuẩn ra ánh sáng ban ngày thì vi khuẩn có thể phục hồi khả năng sinh trưởng và phân chia. Hiện tượng này gọi là quang tái hoạt (photoreactivation). - Âm thanh: sóng âm thanh, đặc biệt trong vùng siêu âm (trên 20 kHz) có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của vi khuẩn, các tế bào sinh dưỡng bị chết nhanh chóng. * Các yếu tố hóa học - Ảnh hưởng của pH môi trường: pH của môi trường có ý nghĩa quyết định đối với sinh trưởng của nhiều vi sinh vật. Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động lớn nhất trong tất cả các ion, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có tác động mạnh mẽ. Cho nên việc xác định pH thích hợp ban đầu và duy trì pH cần thiết trong thời gian sinh trưởng của tế bào là rất quan trọng. Các giá trị pH (cực tiểu, tối thích, cực đại) cần cho sinh trưởng và sinh sản của vi khuẩn tương ứng với các giá trị pH trung bình cần cho hoạt động của nhiều enzyme. Giới hạn pH hoạt động đối với vi sinh vật ở trong khoảng 4 - 10. Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất ở pH trung tính (7,0) như nhiều vi khuẩn gây bệnh (môi trường tự nhiên là máu và bạch huyết của cơ thể động vật có pH khoảng 7,4). Các vi khuẩn nitrate hóa, vi khuẩn nốt sần, xạ khuẩn, vi khuẩn phân giải urea lại ưa môi trường hơi kiềm. Một số vi khuẩn chịu acid (vi khuẩn lactic, Acetobacter, Sarcina ventriculi), một số khác ưa acid như Acetobacter acidophilus, Thiobacillus thiooxydans (ôxy hóa lưu huỳnh thành H2SO4) có thể sinh trưởng ở pH
87 chia vi sinh vật thành các nhóm sau: + Hiếu khí bắt buộc: thuộc nhóm này là các vi sinh vật chỉ có thể sinh trưởng được khi có mặt ôxy phân tử (O2), chúng có chuỗi hô hấp hoàn chỉnh, dùng O2 làm thể nhận hydro cuối cùng. Trong các tế bào có chứa enzyme SOD (superoxid dismutase), catalase và peroxidase có tác dụng chuyển hoá các gốc O22- và O2- để giải độc cho tế bào. Tuyệt đại đa số vi nấm và số đông vi khuẩn thuộc nhóm này. + Hiếu khí không bắt buộc: thuộc nhóm này là các vi sinh vật có thể sinh trưởng được cả trong điều kiện có ôxy lẫn không có ôxy. Trong tế bào có chứa SOD và peroxidase, khi có ôxy chúng sinh trưởng tốt hơn. Phần lớn nấm men và nhiều vi khuẩn thuộc nhóm này. Có thể kể đến các loài như Saccharomyces cerevisiae, E. coli, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris. + Vi hiếu khí: thuộc nhóm này là các vi sinh vật chỉ có thể sinh trưởng được ở điều kiện áp lực ôxy rất thấp. Chúng cũng thông qua chuỗi hô hấp và dùng ôxy làm thể nhận hydro cuối cùng. Có thể kể đến các loài như Vibrio cholerae, Hydrogenomonas spp, Zymononas spp, Bacteroides spp... + Kỵ khí: với các vi sinh vật thuộc nhóm này sự có mặt của ôxy phân tử là có hại. Chúng không sinh trưởng được trên môi trường đặc hoặc bán đặc khi để trong không khí hay trong không khí có chứa khoảng 10% CO2. Chúng chỉ sinh trưởng được ở lớp thể dịch sâu, nơi không có ôxy, có các quá trình lên men, quá trình phosphoryl hoá quang hợp, quá trình methane hoá... Trong tế bào của các vi sinh vật này không có SOD, cytochrome-oxidase, phần lớn không có hydrogenperoxidase. Có thể kể đến rất nhiều loài trong các chi Clostridium, Fusobacterium, Butyrivibrio, Desulfovibrio, Veillonella... - Các chất diệt khuẩn (sát trùng): thường sử dụng là phenol và các dẫn xuất của phenol, alkol, halogen, kim loại nặng, H2O, xà phòng, thuốc nhuộm và các chất tẩy rửa tổng hợp của các muối ammon bậc bốn. * Các yếu tố sinh học Trong các yếu tố sinh học ảnh hưởng có hại lên các quá trình sống của vi sinh vật cần kể đến kháng thể và kháng sinh. Chất kháng sinh có thể có từ nhiều nguồn gốc khác nhau như tổng hợp hoá học, chiếc xuất từ thực vật, động vật nhưng chủ yếu là được tổng hợp từ vi sinh vật. Đây là các chất đặc hiệu mà ở nồng độ thấp cũng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật một cách chọn lọc.
88 Kháng thể là những chất có sẵn trong máu hoặc được xuất hiện khi có kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, có khả năng liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên để làm mất hoạt lực của kháng nguyên (xem thêm phần kháng sinh và miễn dịch ). III. Các kiểu dinh dưỡng của vi sinh vật Căn cứ vào dạng năng lượng sử dụng người ta có thể chia làm các loại vi sinh vật: - Các cơ thể quang tự dưỡng (photoautotrophic) hay quang dưỡng vô cơ (photolithotrophic) có thể chuyển năng lượng ánh sáng thành năng lượng trao đổi chất (ATP) và chất có tính khử (NADPH2). CO2 là nguồn carbon chủ yếu, H2O hay H2S là chất cho điện tử. Có thể gặp những vi khuẩn quang hợp thải ôxy giống như cây xanh, đại diện là các loài vi khuẩn lam (Spirulina, Anabaena, Nostoc…). Các tảo đơn bào quang hợp không thải ôxy như các vi khuẩn lục thuộc họ Chlorobacteriaceae (Chlorobium, Thiosulfatophilum...), đây là những vi khuẩn quang dưỡng vô cơ kị khí với H2S hoặc S2O32- làm chất cho điện tử. Các vi khuẩn lưu huỳnh màu tía thuộc bộ Thiorhodobacteriales như Chromatium, những vi khuẩn này có khả năng phát triển trên môi trường muối vô cơ như nhiều loại cây xanh, đây là những vi khuẩn kị khí quang dưỡng vô cơ khi có mặt trong môi trường S hoặc H2S. - Các vi khuẩn quang dị dưỡng (photoheterotrophic) hay quang dưỡng hữu cơ (photoorganotrophic), sử dụng ánh sáng làm nguồn năng lượng và hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon, như các vi khuẩn màu tía không lưu huỳnh thuộc bộ Athiorhodobacteriales, họ Athiorhodaceae, các loài thuộc giống Rhodospirillum. Những vi khuẩn này thiên về vi hiếu khí, là những vi khuẩn quang dưỡng hữu cơ, không có khả năng phát triển với H2S là chất cho electron độc nhất, chất cho electron của chúng là acetate, succinate hay hydro. - Các vi khuẩn hóa dưỡng vô cơ (Chemolithotrophic) hay hóa tự dưỡng (Chemoautotrophic) sử dụng năng lượng được tạo thành từ các phản ứng hóa học và CO2 làm nguồn carbon. Năng lượng có được là nhờ ôxy hóa các hợp chất vô cơ như NH4+, NO2-, H2, H2S, S, S2O32-, Fe2+... Chúng hình thành một nhóm rất hạn chế tham gia vào các chu trình vật chất sống ở trong đất và nước như Hydrogenomonas ôxy hóa hydro, Nitrosomonas ôxy hóa NH3, Nitrobacter ôxy hóa nitrite, Thiobacillus ôxy hóa các hợp chất khử của lưu huỳnh... - Các cơ thể hóa dị dưỡng (Chemoheterotrophic) hay hóa dưỡng hữu cơ (Chemoorganotrophic) bao gồm các vi khuẩn, vi nấm, động vật nguyên
89 sinh, động vật, chúng sử dụng năng lượng hóa học và một cơ chất hữu cơ làm nguồn carbon chủ yếu. Một nhóm lớn các vi khuẩn hóa dưỡng hữu cơ là những vi sinh vật gây bệnh rất được chú ý trong Y học, các vi khuẩn tạp nhiễm vào thức ăn, các vi khuẩn được sử dụng trong công nghiệp để tổng hợp các chất kháng sinh, các loại vitamin, các amino acid... IV. Sinh lí học của sự sinh trưởng 1. Các phương pháp xác định số lượng và sinh khối vi khuẩn 1.1. Xác định sinh khối vi khuẩn Việc chọn phương pháp để xác định sinh khối vi khuẩn tùy thuộc vào mục đính nghiên cứu. Chẳng hạn, muốn đánh giá sản lượng tế bào thì cần sinh khối tươi hoặc khô sau khi đã li tâm tế bào; muốn xác định cường độ trao đổi chất hay hoạt tính enzyme, người ta lại tính hàm lượng protein hoặc nitơ. Như vậy, trong thực tế có thế sử dụng các phương pháp trực tiếp hoặc gián tiếp. Các phương pháp trực tiếp gồm có: 1. Xác định sinh khối tươi hoặc sinh khối khô (phương pháp này kém chính xác). 2. Xác định hàm lượng nitơ tổng số (phương pháp Kjelhdal) hay hàm lượng carbon tổng số (theo Vslike-Folch), các phương pháp này cho độ chính xác cao. 3. Trong thực tế người ta thường xác định hàm lượng protein của vi khuẩn. Có thế dùng phương pháp buire cải tiến hoặc phương pháp so màu khác. Các phương pháp vi lượng dựa vào việc đo số lượng các thành phần đặc trưng của protein như threonine, tryptophan (theo Lowry hoặc Folin- Ciocalteu) cũng cho kết quả tốt. Có thể nói xác định hàm lượng protein trong sinh khối là phương pháp thích hợp nhất vì một mặt protein là thành phần chủ yếu của chất khô, mặt khác đó là những thành phần hoạt động trong sinh khối (hầu hết protein của tế bào là enzyme). * Các phương pháp gián tiếp để đo sinh khối vi khuẩn: 1. Đo độ đục của dịch treo tế bào, đây là phương pháp rất thuận lợi. Trong thực tế ta thường đo mật độ quang học của dịch treo, trong một số trường hợp người ta cũng xác định sự khuếch tán ánh sáng. 2. Đo các chỉ số cường độ trao đổi chất như hấp thụ O2, tạo thành CO2 hay acid, vì các chỉ số này liên quan trực tiếp với sinh trưởng. Dĩ nhiên ta chỉ dùng các phương pháp này trong trường hợp không sử dụng được các phương pháp khác, ví dụ khi mật độ sinh khối rất nhỏ.
90 1.2. Xác định số lượng tế bào Trong trường hợp xác định số lượng tế bào sống người ta thường đếm số khuẩn lạc tạo thành bởi các vi khuẩn sống trong điều kiện sinh trưởng thuận lợi. Dịch treo vi khuẩn được pha loãng và một thể tích nhất định được đưa lên môi trường thạch trong hộp Petri. Sau khi nuôi cấy người ta đếm số khuẩn lạc mọc lên. Nếu giả dụ rằng mỗi tế bào tạo thành một khuẩn lạc thì đếm số khuẩn lạc ta sẽ đếm được số tế bào sống. Tất nhiên điều này không đúng đối với các vi khuẩn mọc thành chuỗi, thành đôi hay thành đám hoặc đối với các dịch treo vi khuẩn không đồng nhất. Số khuẩn lạc cũng rất phụ thuộc vào thành phần môi trường. Tế bào mọc thành khuẩn lạc trên môi trường này không nhất thiết cũng cho xuất hiện khuẩn lạc trên môi trường khác. Với một số loại vi khuẩn khó phát triển trên môi trường thạch người ta có thể kiểm tra số lượng bằng phương pháp pha loãng liên tiếp sau đó cấy từ mỗi độ pha loãng 1ml vào từng ống đựng môi trường chỉ thị (nếu có 1 vi khuẩn đưa vào cũng đủ cho phản ứng dương tính sau khi nuôi cấy). Phương pháp này gọi là phương pháp số lượng có khả năng nhất (MPN = Most Probable Number). Có thể cấy vào 5 ống và lấy số liệu ở 3 độ pha loãng cuối (có phản ứng dương tính) rồi tra bảng để tìm ra số lượng gần đúng mật độ vi khuẩn. Hoặc có thể lọc mẫu qua màng lọc vi khuẩn rồi đặt màng lọc lên đĩa môi trường thạch để kiểm tra số khuẩn lạc mọc và suy ra mật độ vi sinh vật trong mẫu. Nếu kích thước của tế bào khá lớn có thể đếm trực tiếp trên phòng đếm (thường hay dùng các loại phòng đếm Thomas hay Goriaev). 2. Sinh trưởng lũy thừa và thời gian thế hệ Sinh trưởng và phát triển là thuộc tính cơ sở của vi sinh vật. Sinh trưởng là sự tăng kích thước và khối lượng tế bào, còn phát triển (sinh sản) là sự tăng số lượng tế bào. Điều cần chú ý là khi nói về sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn tức là đề cập đến sinh trưởng và phát triển của một số lượng lớn tế bào của cùng một loại. Bởi vì, việc nghiên cứu một cá thể tế bào vi khuẩn quá nhỏ là rất khó. Tuy nhiên sự tăng số lượng tế bào không phải bao giờ cũng diễn ra song song với sự tăng sinh khối. Chẳng hạn, khi chất dinh dưỡng trong môi trường đã cạn, vi khuẩn tuy còn phân chia 1 - 2 lần nhưng cho 2 - 4 tế bào nhỏ hơn tế bào bình thường; trong pha mở đầu, sinh khối vi khuẩn tăng lên, nhưng số tế bào không thay đổi, ngược lại, vào cuối pha logarid kích thước tế bào giảm đi nhưng số tế bào vẫn còn tăng.
91 Giả sử trong một bình kín chứa một lượng lớn môi trường dinh dưỡng, ta cấy vào đó một tế bào vi khuẩn. Nếu thành phần môi trường hoàn toàn phù hợp với nhu cầu của tế bào vi khuẩn sẽ sinh trưởng, tăng khối lượng và thể tích, tổng hợp các thành phần của tế bào (thành tế bào, màng tế bào chất, ADN, ARN, protein...) cho đến khi kích thước lớn gấp đôi và vi khuẩn sẽphân chia cho 2 tế bào. Hai tế bào này lại tiếp tục sinh trưởng và phân chia để cho 4, 8, 16 tế bào… Nếu số tế bào ban đầu không phải là 1 mà là No thì sau n lần phân chia ta sẽ có số tế bào tổng cộng là N : N = N0 . 2n (1) Các giá trị N và N0 có thể xác định nhờ phòng đếm hoặc tính số khuẩn lạc mọc trên môi trường đặc. Còn giá trị n (số thế hệ) có thể tính nhờ logarid thập phân: logN = logN0 + n. log2 log(N − No) ⇒ n= (2) log2 Giả sử vi khuẩn phân chia n lần sau thời gian t, khoảng thời gian giữa 2 lần phân chia liên tiếp (hoặc thời gian cần cho việc phân đôi tế bào) gọi là thời gian thế hệ và được biểu thị bằng g: (t − t1 ).log 2 t g= = (3) log N − log N 0 n Ở đây t = t2 – t1 biểu thị sự sai khác giữa thời gian đầu (t1) và thời gian cuối (t2) tính bằng giờ. Giá trị đảo nghịch của thời gian thế hệ hay là số lần phân chia sau một đơn vị thời gian (tức sau 1 giờ) gọi là hằng số tốc độ phân chia C: log N − log N0 n C= = (4) (t2 − t1 ).log2 t Rõ ràng thời gian thế hệ càng ngắn, vi khuẩn sinh trưởng và sinh sản càng nhanh. Từ công thức (4) ta có: n = ct (5) Thay giá trị của n vào phương trình (1) ta có: N = N0.2ct (6) Hằng số tốc độ phân chia C phụ thuộc vào một số điều kiện: loài vi khuẩn, nhiệt độ nuôi cấy, môi trường nuôi cấy. 3. Sinh trưởng của vi khuẩn trong nuôi tĩnh
92 3.1 Quá trình sinh trưởng Nuôi cấy tĩnh là phương pháp nuôi cấy mà trong suốt thời gian đó ta không thêm vào chất dinh dưỡng cũng không loại bỏ đi các sản phẩm cuối cùng của trao đổi chất (quần thể tế bào bị giới hạn trong một khoảng không gian nhất định). Sự sinh trưởng trong một “hệ thống đóng” hay “hệ kín” như vậy tuân theo những quy luật bắt buộc không những đối với các cơ thể đơn bào mà cả đối với các cơ thể đa bào. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của logarid số lượng tế bào theo thời gian gọi là đường cong sinh trưởng (hình 4.1). Pha ổn định 12 10 Pha tử vong 8 lo g N Pha 6 logarid Pha lag 4 0 2 4 6 8 t( h ) Hình 4.1 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Quá trình sinh trưởng của tế bào vi sinh vật trong hệ kín trải qua các giai đoạn : * Pha lag (pha mở đầu = pha tiềm tàng) Pha này tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến khi vi khuẩn đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia (nghĩa là chưa có khả năng sinh sản) nhưng thể tích và khối lượng tế bào tăng lên rõ rệt do quá trình tổng hợp các chất, trước hết là các cao phân tử (protein, enzyme, acid nucleic...) diễn ra mạnh mẽ. Độ dài của pha lag phụ thuộc trước hết vào tuổi của ống giống và thành phần môi trường. Thông thường tế bào càng già thì pha lag càng dài. Rõ ràng nguyên nhân của pha lag là sự khác biệt giữa các tế bào ở pha ổn định (hoặc bào tử) với các tế bào đang sinh trưởng logarid. Trong pha lag diễn ra việc xây dựng lại các tế bào nghỉ thành các tế bào sinh trưởng logarid (hoặc sinh trưởng theo lũy thừa).
93 Khi chuyển các tế bào đang sinh trưởng logarid vào môi trường mới khác với môi trường trước đó ta vẫn thấy có sự xuất hiện pha lag. Nguyên nhân của pha lag trong trường hợp này chính là sự thích ứng của vi khuẩn với điều kiện nuôi cấy mới; sự thích ứng đó có liên quan đến việc tổng hợp các enzyme mới mà trước đây tế bào chưa cần. Các enzyme mới này được tổng hợp nhờ sự cảm ứng của các cơ chất mới. Ví dụ: Nếu chuyển các tế bào đang sinh trưởng logarid từ môi trường khoáng - glucose sang môi trường khoáng - maltose ta sẽ thấy xuất hiện pha lag, đây là thời gian cần cho việc hình thành enzyme maltase (α- glucozidase). Đặc trưng của hiện tượng sinh trưởng kép là đường cong sinh trưởng gồm hai pha lag và hai pha log. Sau khi kết thúc pha log thứ nhất tế bào lại mở đầu pha lag thứ hai và tiếp tục pha log thứ hai (hình 4.2). Hình 4.2 Đường cong sinh trưởng kép E. coli trong môi trường hỗn hợp glucose - sorbitol (bên trái) Aerobacter aerogenes trong môi trường hỗn hợp muối ammon và Hiện tượng sinh trưởng kép thường gặp khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường chứa nguồn carbon gồm một hỗn hợp của hai chất hữu cơ khác nhau. Khi sinh trưởng tế bào sẽ đồng hóa trước tiên nguồn carbon nào mà chúng “ưa thích” nhất. Đồng thời cơ chất thứ nhất này đã kìm hãm các enzyme cần cho việc đồng hóa cơ chất thứ hai. Chỉ sau khi nguồn carbon thứ nhất đã cạn thì nguồn carbon thứ hai mới có thể cảm ứng tổng hợp nên các enzyme cần trong việc chuyển hóa nó. Hiện tượng sinh trưởng kép không chỉ hạn chế ở các nguồn carbon và năng lượng mà thấy ở các nguồn nitơ và phôtpho. Chẳng hạn Aerobacter aerogenes có thể sử dụng nguồn nitơ là amino acid, muối ammon và nitrate. Nếu khi cấy chuyển vi khuẩn từ môi trường nước thịt sang môi trường chứa muối ammon hoặc nitrate thì pha lag sẽ biểu hiện.
94 Nếu từ môi trường nước thịt sang môi trường chứa hỗn hợp cả hai loại muối sẽ thấy có hiện tượng sinh trưởng kép. Các ion NH4+ được đồng hoá trước đồng thời kiềm chế việc tổng hợp cảm ứng enzyme nitrate - reductase. Chỉ sau khi hết muối ammon trong môi trường thì muối nitrate mới được sử dụng. Sinh trưởng kép là hiện tượng phổ biến và có thể giải thích bằng cơ chế kiềm chế nói chung và đặc biệt bằng hiệu ứng glucose. * Pha logarid (pha log) Trong pha này vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, nghĩa là sinh khối và số lượng tế bào tăng theo phương trình: N = No.2ct X= Xo.eut hay Kích thước của tế bào, thành phần hóa học, hoạt tính sinh lý... nói chung không thay đổi theo thời gian. Tế bào ở trạng thái động học và được coi như là “những tế bào tiêu chuẩn”. * Pha ổn định (pha cân bằng) Trong pha này quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Kết quả là số tế bào sống không tăng cũng không giảm. Tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Cho nên khi giảm nồng độ cơ chất (trước khi cơ chất bị cạn hoàn toàn) tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn cũng giảm. Do đó việc chuyển từ pha log sang pha ổn định diễn ra dần dần. Nguyên nhân tồn tại của pha ổn định rõ ràng là do sự tích lũy sản phẩm độc của trao đổi cơ chất (các loại rượu, acid hữu cơ) và việc cạn chất dinh dưỡng (thường là chất dinh dưỡng có nồng độ thấp nhất). Nguyên nhân thứ nhất rất phức tạp và khó phân tích, nguyên nhân thứ hai đã được nghiên cứu kĩ hơn. * Pha tử vong Trong pha này số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa (mặc dù số lượng tế bào tổng cộng có thể không giảm). Đôi khi các tế bào bị tự phân nhờ các enzyme của bản thân. Ở các vi khuẩn sinh bào tử quá trình phức tạp hơn do sự hình thành bào tử. Thực ra chưa có một qui luật chung cho pha tử vong. Sự chết của tế bào có thể nhanh hay chậm, có liên quan đến sự tự phân hay không tự phân. Do sức sống lớn bào tử bị chết chậm nhất (trong những điều kiện thích hợp như khô và nhiệt độ thấp bào tử có thể có khả năng sống vài trăm năm). Nguyên nhân của pha tử vong chưa thật rõ ràng, nhưng có liên
95 quan đến điều kiện bất lợi của môi trường. Trong trường hợp môi trường tích lũy các acid nguyên nhân của sự chết tế bào tương đối dễ hiểu. Nồng độ chất dinh dưỡng thấp dưới mức cần thiết cho hậu quả làm giảm hoạt tính trao đổi chất, phân hủy dần dần các chất dự trữ và cuối cùng dẫn đến sự chết của hàng loạt tế bào. Ngoài đặc tính của bản thân chủng vi khuẩn, tính chất của các sản phẩm trao đổi chất tích lũy lại cũng ảnh hưởng đến tiến trình của pha tử vong. Một số enzyme thể hiện hoạt tính xúc tác cực đại trong pha tử vong như deaminase, decarboxylase, các amylase và protease ngoại bào. Ngoài chức phận xúc tác một số quá trình tổng hợp những enzyme nói trên chủ yếu xúc tác cho quá trình phân giải. Tốc độ tử vong của tế bào có liên quan trực tiếp đến thực tiễn vi sinh vật học và kĩ thuật, đó là vấn đề bảo quản các chủng vi sinh vật quan trọng về mặt lí thuyết (các chủng và các biến chủng đặc biệt) và kĩ thuật (các chủng sinh chất kháng sinh, amino acid, vitamin... với sản lượng cao). Ngoài khả năng sống ta còn cần bảo quản cả các đặc tính di truyền của vi khuẩn với nhiều phương pháp bảo quản khác nhau, nhưng tất cả đều nhằm làm giảm trao đổi chất đến tối thiểu chủ yếu bằng cách giảm nhiệt độ và độ ẩm 4. Các thông số của đường cong sinh trưởng Sản lượng tế bào được tính bằng hiệu giữa khối lượng cực đại (Xmax) và khối lượng ban đầu (X0) khi nuôi cấy vi khuẩn (tính bằng gam): X = Xmax - X0 Tỷ số giữa sản lượng tế bào (X) với lượng cơ chất đã được dùng (S) (tính bằng đơn vị trọng lượng) gọi là hệ số kinh tế (Y). X Y= S Nếu sản lượng tính bằng gam và cơ chất đã dùng tính bằng mol thì gọi là hệ số kinh tế mol (Ym). Hệ số kinh tế mol (Ym) cho phép ta liên hệ sản lượng tế bào với số lượng ATP thu được do phân giải một lượng cơ chất nào đó. Ta có thể tính được sản lượng tế bào (tính bằng gam) cho 1 mol ATP đã tiêu thụ. Đại lượng này gọi là hệ số năng lượng (YATP). Hệ số năng lượng được tính dễ dàng nếu ta biết con đường phân giải của loại cơ chất và năng lượng ATP sinh ra do sự phân giải ấy. Hằng số tốc độ sinh trưởng của tế bào vi sinh vật trong pha log được tính theo công thức:
96 ln X t − ln X 0 lg X t − lg X 0 μ= = (t − t0 ) lg e(t − t0 ) Trong công thức: X0 và Xt là mật độ huyền phù tế bào tại các thời điểm t0 và t, và lge = 0.43429. Thời gian của pha lag (T1). Đây là một thông số quan trọng để xem xét tính chất của vi khuẩn và môi trường nuôi cấy có thích hợp hay không. Thông số này được xác định bằng hiệu giữa thời điểm tr (tại đây huyền phù tế bào có mật độ xác định nào đó xr) và ti (tại đây khối tế bào có thể đạt đến mật độ mà sau đó nếu đem nuôi cấy thì chúng bắt đầu pha log ngay). ln xr − ln x0 T1 = tr – ti = tn - μ Vì T1 chỉ thuận lợi để so sánh 2 giống với cùng tốc độ sinh trưởng log giống nhau, nên người ta thường biểu thị thời gian của pha lag không phải thời gian tuyệt đối, mà là thông qua thời gian sinh lý (thời gian của 1lứa g). Hiệu giữa sự sinh trưởng thực tế và lý thuyết là L = T1 x v. Đại lượng L chỉ cho biết giống phát triển trong thực tế chậm hơn phát triển theo lý thuyết bao nhiêu thế hệ tại thời điểm cuối pha lag và chuyển vào đầu pha log. Thông số này thường dùng để so sánh các số liệu nói về ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng khác nhau, các chất ức chế sinh trưởng và điều kiện nuôi cấy. 5. Sinh trưởng của vi khuẩn trong nuôi liên tục Trong phương pháp nuôi cấy tĩnh nói trên, các điều kiện môi trường luôn luôn thay đổi theo thời gian, mật độ vi khuẩn tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống. Vi khuẩn phải sinh trưởng và phát triển theo một số pha nhất định, sinh khối đạt được không cao. Tuy nhiên trong nhiều nghiên cứu và thực tiễn sản xuất ta cần cung cấp cho vi sinh vật những điều kiện ổn định để trong một thời gian dài chúng vẫn có thể sinh trưởng trong pha log. Dĩ nhiên trong một mức độ nào đó có thể cấy chuyền tế bào nhiều lần (qua những khoảng thời gian ngắn) vào môi trường dinh dưỡng mới. Nhưng đơn giản hơn, người ta đưa môi trường dinh dưỡng mới vào bình nuôi cấy vi khuẩn đồng thời loại khỏi bình một lượng tương ứng dịch vi khuẩn. Đây chính là cơ sở của phương pháp nuôi cấy liên tục trong chemostas và turbidostas. Cơ sở của phương pháp nuôi liên tục: giả sử ta có một bình nuôi cấy trong đó vi khuẩn đang sinh trưởng phát triển. Cho chảy liên tục vào bình môi trường mới có thành phần không đổi. Thể tích bình nuôi cấy được giữ
97 không đổi, nghĩa là bình môi trường đi vào đã được bù bởi dòng môi trường đi ra với cùng một tốc độ. Ta gọi thể tích bình là v (lít), tốc độ dòng đi vào là f (lít/giờ). Do đó tốc độ pha loãng (còn gọi là hệ số pha loãng) D = f/v (đại lượng D biểu thị sự thay đổi thể tích sau một giờ). Nếu vi khuẩn không sinh trưởng và phát triển, chúng sẽ bị rút khỏi bình nuôi cấy với thể tích: dX v- = - = D.X dt Như vậy mật độ vi khuẩn trong bình giảm, ta có công thức tính: X = X0. e-Dt Tốc độ sinh trưởng của quần thể vi khuẩn trong bình biểu thị bởi phương trình: dX v+ = = μ.X dt Như vậy mật độ vi khuẩn trong bình tăng theo phương trình: X = X0. eμt Tốc độ thay đổi cuối cùng (tăng hoặc giảm) mật độ vi khuẩn trong nuôi cấy liên tục là sự sai khác giữa độ tăng v+ và độ giảm v-: dX v = v+ - v- = = (μ - D).X dt Nếu μ > D => v > 0: mật độ vi khuẩn trong bình tăng. Nếu μ < D => v < 0: mật độ vi khuẩn trong bình giảm. Nếu μ = D => v = 0: mật độ tế bào không tăng không giảm theo thời gian, quần thể vi khuẩn ở trong trạng thái cân bằng động học. Nếu bình thí nghiệm có thiết bị duy trì μ luôn luôn bằng D ta sẽ thu được quần thể vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, thường xuyên ở một mật độ tế bào không đổi và không phụ thuộc và thời gian. Trong trường hợp như vậy không những kích thước trung bình của tế bào, trạng thái sinh lý của chúng mà cả môi trường nuôi cấy đều không đổi và không phụ thuộc vào thời gian. Điều này, một mặt tạo điều kiện cho việc nghiên cứu sinh trưởng và sinh lý của tế bào vi khuẩn, mặt khác cải thiện quá trình sản xuất vi sinh vật ở qui mô công nghiệp. Chemostas và turbidostas là hai thiết bị nuôi cấy trong đó ta có thể duy trì được điều kiện μ = D. Nuôi cấy tĩnh được xem như hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng phải trải qua các pha mở đầu, logarid, ổn định và tử vong. Mỗi pha