Đồ án: Thao tác kỹ thuật trên Saccharomyces Cerevisiae ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu

Chia sẻ: Vũ Thanh Phong | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:69

Thêm vào BST

Báo xấu

381
lượt xem 99
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án: Thao tác kỹ thuật trên Saccharomyces Cerevisiae ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu gồm 4 chương với nội dung: khái quát công nghệ sản xuất rượu và tác động của các yếu tố truyền thống đến quá trình lên men rượu, tác động của thao tác kỹ thuật trên gen HSP26 và YHR087W lên quá trình lên men rượu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án: Thao tác kỹ thuật trên Saccharomyces Cerevisiae ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒCHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI H ỌC BÁCH K HOA TP. HCM KHO A KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH THAO TÁC KỸ THUẬT TRÊN SACCHAROMYCES CEREVISIAE ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU GVHD: Th.S HOÀNG MỸ DUNG SVTH: TRẦN TRƯỜNG LUÂN MSSV: 60601418 LỚP: HC06BSH TP. HCM, 07/2010
LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự chân thành, tôi xin gởi lời cảm ơn đến:  Thạc sĩ Hoàng Mỹ Dung - Bộ môn Công Nghệ Sinh Học-Khoa Kỹ Thuật Hóa Học - Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã tận tình hướng dẫn và chia sẽ kinh nghiệm qúy báu, luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án chuyên ngành.  Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt những kiến thức bổ ích giúp tôi có những bước đi rõ ràng để hoàn thành đề tài.  Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã cùng chia sẽ, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc. ii
MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................... 1 1.1.Đặt vấn đề chọn đề tài........................................................................................ 1 1.2.Mục đích nghiên cứu. ......................................................................................... 1 1.3.Nhiệm vụ của đề tài. ........................................................................................... 2 1.4.Ý nghĩa thực tiễn. ............................................................................................... 2 CHƯƠNG 2: TÁC ĐỘNG CỦA CÁC YẾU TỐ TRUYỀN THỐNG .......................... 4 KHÁI QUÁT CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU VÀ TÁC ĐỘNG CỦA CÁC YẾU TỐ TRUYỀN THỐNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU................................... 4 2.1.Khái quát chung về công nghệ sản xuất rượu vang. ............................................ 4 2.1.1.Lịch sử sản xuất rượu vang ........................................................................... 4 2.1.2.Sơ đồ quy trình công nghệ sản suất rượu vang trắng và vang đỏ: .................. 5 2.1.3. Một số công đoạn quan trọng trong quá trình sản xuất rượu vang. ............... 6 2.1.4. Nguyên liệu sản xuất rượu vang. ................................................................. 8 2.2.Tổng quan nấm men. .......................................................................................... 8 2.2.1. Tăng trưởng ,dinh dưỡng. ............................................................................ 9 2.2.2. Sinh thái. ................................................................................................... 10 2.2.3. Sinh sản: .................................................................................................... 10 2.2.4. Ứng dụng: ................................................................................................. 10 2.3. Nấm men Saccharomyces Cerevisiae............................................................... 11 2.3.1 Đặc điểm sinh thái, thành phần cấu tạo, sinh trưởng và phát triển ở Saccharomyces cerevisiae. .................................................................................. 11 2.3.2. Một số chủng Saccharomyces: ................................................................... 18 2.4.Cơ sở khoa học của quá trình lên men rượu. ..................................................... 20 2.5.Các yếu tố ảnh hưởng đến nấm men Saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men rượu. ......................................................................................................... 24 2.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ :........................................................................... 24 2.5.2. Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men và tác động của các acid lên sự thay đổi pH. ........................................................................................................ 27 2.5.3. Ảnh hưởng của SO2: .................................................................................. 31 2.5.4. Ảnh hưởng nguồn Carbon ......................................................................... 33 iii
2.5.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ: ....................................................................... 34 2.5.6. Ảnh hưởng của nồng độ đường ( ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu). ......... 35 2.5.7 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol lên quá trình lên men của Saccharomyces cerevisiae. ........................................................................................................... 36 2.5.8 Ảnh hưởng của một số hóa chất và chất sát trùng. ...................................... 38 2.5.9. Ảnh hưởng của sục khí. ............................................................................. 38 CHƯƠNG 3: TÁC ĐỘNG CỦA THAO TÁC KỸ THUẬT....................................... 40 TÁC ĐỘNG CỦA THAO TÁC KỸ THUẬT TRÊN GEN HSP26 VÀ YHR087W LÊN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU ...................................................................... 40 3.1. Tổng quan về HSP26 và YHR087W và giá trị thực tiễn đối với quá trình lên men rượu. ............................................................................................................... 40 3.1.1. Tổng quan và chức năng HSP26,ý nghĩa đối với quá trình lên men rượu. .. 40 3.1.2. Tổng quan và chức năng YHR087W,ý nghĩa đối với quá trình lên men rượu. ............................................................................................................................ 43 3.1.3. Cơ chế biểu hiện của HSP26 và phương pháp nghiên cứu trên HSP26 và YHR087W. ......................................................................................................... 44 3.1.4. Phương pháp nghiên cứu trên gen HSP26 và YHR087W........................... 45 3.2. Kết quả của thao tác gen tác động lên mức độ biểu hiện của gen HSP26 và YHR087W ............................................................................................................. 47 3.2.1.Minh chứng sự biểu hiện của HSP26 dưới các điều kiện tác động nhiệt...... 47 3.2.2 Ảnh hưởng của việc đưa gen HSP26 và YHR087W thành một plasmid multicopy dưới sự kiểm soát của promoter của chúng. ........................................ 49 3.2.3 Hiệu quả của việc đưa gen HSP26 và YHR087W vào một centromeric plasmid dưới sự kiểm soát của promoter nó......................................................... 50 3.2.4 Ảnh hưởng của sự thay thế promoter HSP26 hoặc YHR087W bằng promoter của gen SPI1. ...................................................................................................... 52 3.2.5 Ảnh hưởng của thay thế các promoter YHR087W bởi promoter của gen PGK1 bởi một trong những bản sao di truyền của nó .......................................... 53 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN............................................ 54 4.1.Bàn luận ........................................................................................................... 54 4.2 Hướng phát triển............................................................................................... 55 4.2.1 Phát triển dựa trên các phương pháp kiểm soát tối ưu điều kiện lên men. ... 55 iv
4.2.2 Phát triển dựa trên việc cải tiến hệ gen của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae. ........................................................................................................... 56 Tài liệu tham khảo: .................................................................................................... 57 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 60 v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ TCA: TriCarboxylic Acid cycle (chu trình acid citric). EMP: Embden-Meyerhof Pathway (chu trình chuyển hóa Glucose thành pyruvate). Chaperone: khả năng gấp cuộn của protein trước điều kiện tác động nhiệt. sHSPs: small Heat Shock Proteins : Nhóm gen chịu điều kiện shock nhiệt. Marker: gen hoặc 1 đoạn DNA với 1 điểm nhận biết trên Nhiễm sắc thể dùng để định danh các tế bào. Episomal plasmid: Chứa điểm khởi đầu sao chép, cần thiết cho quá trình phiên mã của gen nằm trong plasmid. Centromeric plasmid: Chứa centromere đóng vai trò trong quá trình nhân đôi, phân chia của gen trong plasmid. vi
DANH MỤC HÌNH Hình 2.1.1: Sơ đồ quy trình sản xuất rượu vang trắng và vang đỏ[8]. ........................... 5 Hình 2.2.1: Một số loại nấm men: A: Lactobacillus-johnsonii, B: Candida, C: LactobacillusAcidophilus, D: Saccharomyces cerevisiae [31]...................................... 9 Hình 2.3.1: Tế bào nấm men S. cerevisiae trong giai đoạn sinh sản bằng phương pháp tạo chồi [31]............................................................................................................... 11 Hình 2.3.2: Tế bào nấm men S. cerevisiae cố định dưới kính hiển vi điện tử)[26]...... 11 Hình 2.3.3: Chu kỳ sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [8]. ....... 15 Hình 2.3.4: Quá trình sinh trưởng của tế bào chồi con nấm men[8]. ........................... 16 Hình 2.3.5: Sinh sản bằng cách nẩy chồi ở nấm men (Sharma,1998)......................... 17 Hình 2.3.6: Giai đoạn sinh sản hữu tính ở nấm men Saccharomyces cerevisiae (Sharma, 1998) .......................................................................................................... 18 Hình 2.4.1: Quá trình chuyển hóa glucose trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [1]. ............................................................................................................ 21 Hình 2.4.2: Quá trình chuyển hóa glucose thành ethanol [31]. .................................. 22 Hình 2.5.1: Tác động của nhiệt độ lên mật độ tế bào[28]. .......................................... 24 Hình 2.5.2: Sự sinh trưởng của nấm men S. cerevisiea S228C trong môi trường YPD [19]. ........................................................................................................................... 27 Hình 2.5.3: Những sự thay đổi trong mức độ lên men tối đa [10]. .............................. 28 Hình 2.5.4: Những minh chứng của cho sự thay đổi pH trong quá trình lên men[10]. 30 Hình 2.5.5: Một số acid có mặt trong nội bào trong suốt quá trình lên men của hèm nho ở 25oC [10]. ........................................................................................................ 30 Hình 2.5.6: Sự thay đổi pH tại các nồng độ acid hữu cơ khác nhau [10]..................... 31 Hình 2.5.7: Ảnh hưởng của SO2 lên ethanol và acetaldehyde [9]. .............................. 32 Hình 2.5.8: Ảnh hưởng của SO2 lên acid malic và acid lactic [9]. .............................. 33 vii
Hình 2.5.9: Sự giảm glucose, ethanol, và nồng độ glycerol cũng như là sự phát triển của nấm men dưới những điều kiện khác nhau về nồng độ glucose [12]. ................... 37 Hình 3.1.1: Cấu trúc của HSP26 [23]. ........................................................................ 41 Hình 3.1.3: Mô hình cấu trúc không gian của gen HSP26 [24]. .................................. 42 Hình 3.1.4: Vị trí, kích thước của YHR087W trên Nhiễm sắc thể VIII của nấm men S.cerevisiae[30,31]. ................................................................................................... 43 Hình 3.1.5: Cấu trúc không gian của YHR087W [30]. ............................................... 44 Hình 3.1.6: Mẫu thể hiện cơ chế của chaperone dưới sự kiểm soát nhiệt độ của sHsp. [25]. ........................................................................................................................... 45 Hình 3.1.7: Cơ chế nhân số lượng bản sao của gen HSP26 [22]. ................................ 46 Hình 3.1.8: Sơ đồ sự hình thành các chủng ICV16 (ICV27)-PPGK1-YHR087W. [22]. .................................................................................................................................. 47 Hình.3.2.1: Hsp26 biểu hiện trong các chủng khác nhau trước và sau khi sốc nhiệt [17]. ........................................................................................................................... 48 Hình 3.2.2: Ảnh hưởng của việc gắn gen HSP26 và YHR087W vào plasmid YEp352 trên gen biểu hiện và kháng stress. [22]. .................................................................... 49 Hình 3.2.3 : Tác động của việc gắn HSP26 và YHR087W vào centromeric plasmid pRS316 lên chung ICV27 biểu hiện gen, stress thẩm thấu và khả năng lên men [22]. 51 Hình 3.2.4: Sự thay thế thích hợp promoter của gen HSP26 và YHR087W trên chủng ICV16 và ICV27 bằng promoter SPI1 [22]. ............................................................... 52 Hình 3.2.5: Sự thay thế thích hợp promoter của HSP26 và YHR087W bằng PGK1 trên cả hai chủng ICV16 và ICV27 [22]............................................................................ 53 viii
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong cấu trúc của nấm men được lạnh đông khô[8]. .................................................................................................................................. 12 Bảng 2.2: Các thành phần hóa học trong nấm men đông khô[8]................................. 12 Bảng 2.3: Một số chủng nấm men saccharomyces cerevisiae[1]. ............................... 19 Bảng 2.4: Tác động điều kiện nhiệt độ lên các sản phẩm của quá trình lên men [28].. 25 Bảng 2.5 : Sự tác động của yếu tố nhiệt độ lên quá trình lên men rượu trên chủng Saccharomyces cerevisiae.......................................................................................... 26 Bảng 2.6: Thông số động lực học và pH kết thúc quá trình lên men với những pH ban đầu khác nhau trong môi trường có sự thiếu hụt hoặc hiện diện của acid tartaric........ 29 Bảng 2.7: Ảnh hưởng của một số acid lên sự sự sinh trưởng của nấm men. ............... 30 Bảng 2.8: Các thông số đánh giá trong quá trình lên men với thành phần môi trường lên men chứa 20% glucose và các nguồn Nito ban đầu khác nhau[20]. ...................... 35 Bảng 2.9: Tác động của glucose lên một số yếu tố trong quá trình lên men[12]. ........ 36 Bảng 3.1: Vị trí , thành phần nucleotide và acid amin cấu tạo của HSP26 [29] .......... 41 Bảng 3.2: Vị trí, thành phần nucleotide, acid amin cấu tạo YHR087W [30]. .............. 43 ix
Chương 1: Mở đầu CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề chọn đề tài. Các cuộc cách mạng sinh học phân tử đã mang lại những ý nghĩa mới lạ, tiến bộ với các ứng dụng vào lên men và lưu trữ rượu. Những nghiên cứu trên một số chủng nấm men đã cung cấp những thông tin về môi trường nuôi cấy và mật độ vi sinh vật có trong rượu. Đồng thời cho thấy môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào phương pháp sinh học phân tử điều này trở thành những thông tin có giá trị trong công nghệ sản xuất rượu. Những đoạn gen có giá trị cung cấp những cơ hội hiểu biết và khai thác ứng dụng vi sinh trong sản xuất rượu cũng như là tìm ra chìa khóa của các nhân tố gen đây là cơ sở phát triển giá trị thương phẩm hoặc hạ giá thành của rượu[8]. Những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học phân tử đã thay đổi quan điểm của các nhà khoa học về việc đánh giá hệ vi sinh có trong rượu.Tạo nên cái nhìn mới về tính phức tạp trong các phản ứng chuyển đổi từ các loại trái cây đến rượu vang mang đậm mùi vị đặc trưng [8]. Công nghệ sản xuất rượu đã và đang là một công nghệ chuyên nghiệp lâu đời ở nhiều nước trên thế giới. Phương pháp truyền thống là dựa vào kinh nghiệm và kỹ thuật thủ công. Nhưng ngày nay, những thiết bị tự động hoá đang dần thay thế và đồng thời kiểm soát được chất lượng cũng như cải thiện được vấn đề vệ sinh trong quá trình sản xuất. Rượu đại diện cho lịch sử ,nền văn hóa của một dân tộc. Ngày này người dùng không chỉ quan tâm đến sự đa dạng của các loại rượu mà còn về chất lượng của sản phẩm.Do đó việc cải thiện những kỹ thuật lên men trong quá trình sản xuất là yếu tố quan mà nhà sản xuất hướng đến [1]. Việc cải thiện chất lượng,khả năng sinh tổng hợp lượng,loại bỏ chất độc hại,bổ sung tăng hàm lượng chất dinh dưỡng trong rượu là những yêu cầu cấp thiết đối với công nghệ sản xuất rượu hiện nay[1]. 1.2.Mục đích nghiên cứu. Việc tối ưu quá trình lên men tạo ra hàm lượng ethanol cao trở thành một yếu tố quan trọng trong kỹ thuật hiện đại. Đã có rất nhiều nghiên cứu về những thay đổi kỹ thuật trong quá trình lên men như pH, nhiệt độ, nồng độ đường…Hiện nay với những kỹ thuật tiên tiến về sinh học phân tử các nhà nghiên cứu đã không chỉ thay đổi những yếu tố kỹ thuật truyền thống như trên mà còn tác động đến bộ gen của chủng vi sinh sử dụng lên men rượu thông qua những kỹ thuật di truyền. 1
Chương 1: Mở đầu Nghiên cứu này chỉ ra hướng đi quan trong trong công nghiệp sản xuất rượu hiện nay. Đầu tiên là sự tối ưu hóa các điều kiện ảnh hưởng lên quá trình lên men của Saccharomyces cerevisiae đã giúp chất lượng rượu ngày càng trở nên hoàn hảo, không những về chất lượng rượu mà còn tận dụng tối đa được nguồn nguyên liệu, tăng khả năng đáp ứng của nấm men dưới các điều kiện stress nhằm tạo ra lượng ethanol là lớn nhất trong quá trình lên men rượu. Bên cạnh đó, nghiên cứu này mở ra một hướng đi mới trong công nghệ sản xuất rượu.Thay đổi xu hướng tác động kỹ thuật truyền thống lên quá trình lên men, thay vào đó là tác động lên hệ gen của chủng vi sinh. Những tác động kỹ thuật ảnh hưởng tới giá trị cảm quan, chất lượng của rượu vang thành phẩm và thao tác kỹ thuật gen trên 2 gen HSP26 và YHR087W nằm trong hệ gen của Saccharomyces cerevisiae đã tăng lượng ethanol lên đến 10% so với thông thường. Điều này đã chứng minh tầm quan trọng của những thao tác kỹ thuật gen lên quá trình tối ưu lượng ethanol sinh ra cũng như là chất lượng rượu thành phẩm. 1.3.Nhiệm vụ của đề tài. Tổng quan về chủng nấm men: Saccharomyces cerevisiae giống nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men rượu hiện nay. Làm rõ những đặc điểm sinh lý,di truyền,hệ gen các yếu tố tác động Nghiên cứu các ảnh hưởng kỹ thuật truyền thống lên quá trình lên men rượu bao gồm:pH ,nhiệt độ, hàm lượng đường,độ thẩm thấu, lượng ethanol sinh ra…Từ đó có thể ứng dụng sản xuất để có chất lượng rượu phù hợp. Nghiên cứu kỹ thuật gen thao tác trên gen HSP26 và YHR087W của Saccharomyces cerevisiae. Cơ chế hoạt động sinh tổng hợp trong quá trình lên men. Thao tác kỹ thuật nâng cao hàm lượng ethanol. Đánh giá kết quả mang lại qua các nghiên cứu trên thế giới. 1.4.Ý nghĩa thực tiễn. Những tác động kỹ thuật trong quá trình lên men rượu đã nâng cao chất lượng rượu thành phẩm. Đồng thời, giảm thiểu chi phí cho quá trình sản xuất, mang lại hiệu quả kinh tế và giá trị lợi nhuận cho nhà sản xuất. Ngoài những thay đổi về tác động kỹ thuật truyền thống thường dùng có thể dùng những thao tác trên kỹ thuật di truyền để tạo ra những giống nấm men có khả năng tạo ra lượng ethanol lớn hơn so với chủng thông thường. Thông qua những tác động lên chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae nhằm giúp tạo nên một cơ sở dữ liệu về những điều kiện tác động kỹ thuật, về hệ gen và khả năng thích ứng các yêu cầu trong công nghiệp sản xuất rượu của nấm men. Cũng như, tìm cách giải quyết những khó khăn trong việc loại bỏ các độc tố, hợp chất hữu cơ, 2
Chương 1: Mở đầu acid hữu cơ có thể gây hại hoặc ảnh hưởng đến chất lượng rượu trong quá trình sản xuất. 3
Chương 2: Tác động của các yếu tố truyền thống CHƯƠNG 2: TÁC ĐỘNG CỦA CÁC YẾU TỐ TRUYỀN THỐNG KHÁI QUÁT CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU VÀ TÁC ĐỘNG CỦA CÁC YẾU TỐ TRUYỀN THỐNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU 2.1.Khái quát chung về công nghệ sản xuất rượu vang. 2.1.1.Lịch sử sản xuất rượu vang Lịch sự ra đời của rượu vang đã đồng hành cùng lịch sử nhân loại.Các nhà khảo cổ cho rằng,rượu vang có xuất xứ từ khu vực Capcazo và Trung Đông khoảng 8000 năm về trước. Các di khảo cổ tại Ai Cập cho thấy rằng rượu vang đã có mặt ở đây từ 5000 trước công nguyên.Khoảng 2000 năm trước công nguyên sản xuất rượu vang du nhập tới Hy Lạp và sau đó được truyền đi khắp Địa Trung Hải. Vào thế kỷ XVI ,các nhà thám hiểm Châu Âu đã mang tới Châu Mỹ .Năm 1530 Người Tây Ban Nha xâm chiếm Trung và Nam Mỹ bắt đầu trồng nho ở Mexico,Argentina… Đến năm 1813 nghề trồng nho đã lớn mạnh ở tất cả những nơi mà thực dân Châu Âu đặt chân tới.Tại Bắc Mỹ ,khoảng giữa thế kỷ XIX nghề trồng nho và làm rượu thức sự mới phát triển[1,7]. Ngày nay trồng nho và sản xuất rượu vang đã trở thành một phần không thể thiếu trong văn hóa và kinh tế nhân loại.Hằng năm có 26 tỷ lít rượu vang được sản xuất ra[1]. Rượu vang được làm từ các loại nho nguyên chất và được lên men một cách tự nhiên. Vì nho vốn có hai đặc tính tự nhiên là đường và men nên nước nho được ép ra, trải qua một quy chình chế biến sẽ trở thành rượu vang.Rượu vang là một sản phẩm của quy trình tinh xảo mà khởi đầu bằng việc quyết định thởi điểm thích hợp nhất để hái nho.Tất cả các quy trình để làm rượu vang cơ bản đều giống nhau từ lúc hái cho đến khi đóng chai. Nguyên lý làm rượu vang cũng rất đơn giản ,tuy nhiên việc xủ lý nho, lên men rượu van để tạo hương vị mong muốn là cả một nghệ thuật.Trong quá trình sản xuất các nhà nấu rượu cần đối các yếu tố giữa những mùi hương dễ chịu với những mùi khó chịu. Nồng độ rượu và acid cũng cần được điều tiết ,nếu cid vượt quá rượu sẽ có vị chua,nếu nhiều cồn quá rượu sẽ sốc. Tác nhân quan trọng nhất trong sản xuất rượu vạng là chủng vi sinh và chất lượng nho. Nguyên liệu chính sẽ quyết định hương vị , nồng độ cồn, độ chưa, màu sắc của thành phẩm. Vang trắng, nho được nghiền dịch quả và tách khỏi lớp vỏ trước khi lên men. Vang đỏ lên men cùng vỏ. Chất màu đỏ (anthocyanin)và một số chất khác từ vỏ quả được chiết tách trong quá trình lên men và tạo thành màu đỏ cùng hương vị đặc trưng của vang đỏ. Vang hồng 4
Chương 2: Tác động của các yếu tố truyền thống có màu sắc hồng nhạt được làm từ nho đỏ theo công thức của lên men vang trắng(không lên men cùng vỏ). Lượng chất màu được chiết ra trong quá trình ép quả tạo màu cho rượu[1,7]. 2.1.2.Sơ đồ quy trình công nghệ sản suất rượu vang trắng và vang đỏ: Hình 2.1.1: Sơ đồ quy trình sản xuất rượu vang trắng và vang đỏ[8]. 5
Chương 2: Tác động của các yếu tố truyền thống 2.1.3. Một số công đoạn quan trọng trong quá trình sản xuất rượu vang. 2.1.3.1.Thời điểm gặt hái nho: Khi nho chín thì độ acid sẽ giảm xuống và lượng đường sẽ tăng lên. Thời điểm thích hợp để gặt hái nho là vào tháng 8 đối với Vang nổ (Sparkling Wines) vào tháng 10 đối với rượu đỏ. Các nghệ nhân sẽ quyết định thời điểm gặt hái nho, nhằm đạt lượng acid và lượng đường như mong muốn để chế biến theo khẩu vị riêng của mình. Thời điểm các trang trại gặt hái nho cũng được thể hiện rõ trên nhãn của các loại rượu vang. Để làm rượu vang nổ thì nho sẽ được hái khi độ acid đạt khoảng 1% và 19 o Brix (Brix là đơn vị đo lượng đường còn lại trên nho, nhân đơn vị Brix với 0,55 thì sẽ được nồng độ cồn). Để làm rượu vang đỏ, nho sẽ đựơc hái khi đạt gần được khoảng 0,8% độ acid và 22 o Brix (e có biết tại sao o, vị của 2 loại rượu này khác nhau ntn?). Phần lớn các loại nho dùng để làm rượu vang trắng và đỏ khi được gặt hái thì sẽ đạt khoảng 0,65% độ acid và 23o Brix. Điều kiện trên là tiêu chuẩn cơ bản để quyết định thời điểm thích hợp nhất khi gặt hái nho. Phần lớn các nghệ nhân làm rượu vang quyết định thời điểm gặt hái nho bằng thông qua việc đánh giá màu sắc nho và nếm quả nho [1]. 2.1.3.2.Quy trình chiết dịch nho: Bước đầu tiên là lấy nước từ những quả nho. Quy trình này được thực hiện qua hệ thống Vắt và Tước cuống. Hệ thống này sẽ tước các cuống từ những chùm nho và vắt nước ra khỏi vỏ nho. Nước này được gọi là nước chất lượng 1. Để làm ra vang trắng thì nước chất lượng 1 này sẽ được đưa qua hệ thống ép và sau đó được đưa vào bồn lên men. Để làm ra rượu đỏ thì nước chất lượng 1 sẽ được đưa trực tiếp đến bồn lên men rồi sau đó đưa qua hệ thống ép. 2.1.3.3.Quy trình lên men: Phần lớn hệ thống lên men rượu trên thế giới đều sử dụng phương pháp truyền thống. Phương pháp lên men truyền thống này đã chứng minh được hiệu quả cao và ổn định vì vậy rất ít nghệ nhân ứng dụng những phương pháp khác.Trong quy trình lên men, có một yếu tố rất quan trọng mà các nghệ nhân chú tâm đạt tới đó là nhiệt độ. Khi lên men với nhiệt độ (7oC đến 12 o C) thì hương thơm của nho được bảo quản tuyệt đối. Với nhiệt độ (25o đến 35 o C) sẽ đạt được hương vị của hoa nhiều hơn là hương vị của quả. Trong quá trình lên men để làm rượu vang trắng và vang nổ thì nhiệt độ lý tưởng nhất là 10 o C và cho vang đỏ là 30oC.Thời gian lên men keos dài từ 8-10 ngày[1,8,3]. 2.1.3.4.Quy trình ép: Hơn một nửa lượng nước ép ra từ quả nho một cách dễ dàng không cần đến áp lực cao. Phần còn lại sẽ được ép ra từ hệ thống ép. Để làm rượu vang trắng nho sẽ được ép trước sau đó đưa lên hệ thống lên men. Còn rượu vang đỏ thì 6
Chương 2: Tác động của các yếu tố truyền thống ngược lại, được đưa lên hệ thống lên men trước khi đưa vào hệ thống ép.Phần bã sẽ được đêm ép để tận thu các chất chiết còn sót lại trong quá trình lên men[1,3]. 2.1.3.5.Quy trình ủ: Để rượu đạt được sự hài hòa và ổn định của mùi vị và chất lượng thì rượu phải được ủ nhằm làm cho khí ôxi tác động thật chậm.Rượu vang ủ lạnh sẽ phải ủ lâu hơn rượu vang ủ ấm.Rượu vang ủ trong bồn thép lớn sẽ phải ủ lâu hơn rượu vang để trong các bồn hoặc trong các thùng bằng gỗ. Thời gian là yếu tố quan trọng trong quy trình ủ. Thông thường rượu vang được ủ trong khoảng 3 đến 6 tháng hoặc 2 đến 3 năm. Nhiệt độ ủ rượu thường từ 8-18oC. Trong giai đoạn này rượu được tách bỏ cặn và châm thêm rượu vang định kỳ vào thiết bị ủ để giảm khoảng không gian ở bề mặt lên men[3] 2.1.3.6.Quy trình lọc và làm mịn: Để đạt được mầu tinh khiết cho rượu ở giai đoạn cuối cần đưa hệ thống lọc và làm mịn vào dây chuyền sản xuất.Hệ thống lọc sẽ làm cho nước nho trong hơn. Rượu sau khi được lọc sẽ được chuyển qua bồn chứa sạch khác và quy trình lọc sẽ được thực hiện vài ba lần trong 6 tháng cho đến 3 năm trong quy trình làm rượu vang. Hệ thống làm mịn sẽ lọc được các phần tử nhỏ nhất để rượu đạt được mầu trong suốt. 2.1.3.7.Phương pháp pha trộn: Pha trộn là một nghệ thuật tâm đắc nhất của công nghệ sản xuất rượu. Pha trộn có thể mang đến những sản phẩm có đặc thù riêng và chất lượng rất ổn định. Các nghệ nhân có thể pha trộn theo các phương thức sau đây: - Hai hoặc nhiều giống nho chính trong cùng một nông trại nho. - Cùng một giống nho chính từ nhiều nông trại nho khác nhau. - Hai hoặc nhiều giống nho chính từ hai hoặc nhiều nông trại nho khác nhau - Nho từ các năm gặt hái khác nhau. -Và những phương pháp khác pha trộn khác.Việc pha trộn được thực hiện vào thời điểm giữa hai quy trình lên men và vô chai. 2.1.3.8.Quy trình vô chai: Quy trình vô chai không phức tạp nhưng đòi hỏi sự thận trọng để tránh sự ôxy hoá. Vệ sinh là yếu tố tất yếu để tránh nhiễm vi khuẩn chua và mọi vi khuẩn khác có hại đến con người. 7
Chương 2: Tác động của các yếu tố truyền thống 2.1.4. Nguyên liệu sản xuất rượu vang. Nguyên liệu trong công nghiệp sản xuất rượu vang thường có khá nhiều chủng loại khác nhau như: nho, dâu tằm, các loại trái cây…Nhưng loại phổ biến và được sử dụng phổ biến nhất hiện nay là nho. Các loại nguyên liệu trong sản xuất cần đạt độ chín về sinh lý nhằm thu được dịch quả có hàm lượng acid thấp,hàm lượng đường cao.Ngoài ra còn có một số chỉ tiêu về hình dáng,đặc điểm,các chỉ tiêu về an toàn chất lượng thực phẩm nhằm mang lại vang thương phẩm có giá trị. Thành phần hóa học của nguyên liệu: Nước: chiếm tỷ lệ rất cao trung bình 80-90% ,nước chủ yếu tồn tại ở dạng tự do ,trong dịch tế bào ,chất nguyên sinh và gian bào.Ở màng tế bào nước liên kết với hemicellulase và cellulase.Lượng nước phân bố không đồng đều giữa các mô. Đường :tồn tại chủ yếu ở dạng D-glucose ,D-fructose và saccharose .Glucose còn ở dạng liên kết trong phân tử của saccharose ,tinh bột ,cellulase... Ngoài hai thành phần trên, trong nho còn chứa các thành phần khác như: các acid hữu cơ(bao gồm có malic, tartaric, citric,cetonic…), hợp chất màu( anthocyanes và flavones), phenol, tanin, polyphenol ngưng tụ, hợp chất chứa nito… 2.2.Tổng quan nấm men. Nấm men thường có hình dạng khác nhau. Thường chúng có hình cầu, hình ellip, hình bầu dục và cả hình dài. Một số loài nấm men có tế bào hình dài nối với nhau thành những sợi gọi là khuẩn ty (mycelium) hay khuẩn ty giả (pserdomycelium). Hình dạng của nấm men hầu như không ổn định. Nó phụ thuộc vào tuổi của nấm men và phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy[2]. Kích thước tế bào nấm men: Tế bào nấm men thường có kích thước lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước trung bình của tế bào nấm men như sau: chiều dài 9-10µ, chiều rộng 2-7µ. Kích thước của tế bào nấm men thay đổi theo điều kiện nuôi cấy, theo tuổi sinh lý[2]. 8
Chương 2: Tác động của các yếu tố truyền thống Hình 2.2.1: Một số loại nấm men: A: Lactobacillus-johnsonii, B: Candida, C: LactobacillusAcidophilus, D: Saccharomyces cerevisiae [31] Nấm men là sinh vật nhân chuẩn, có khoảng 1500 loài khác nhau đã được phát hiện trên thế giới. Hầu hết chúng sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi. Mặc dù có một vài loài sinh sản bằng cách phân đôi. Nấm men là sinh vật đơn bào, một số loài có thể tạo cơ thể đa bào,kích thước khác nhau tùy thuộc loài thông thường chúng có kích thước từ 3-4µm.Có những loài có kích thước đến 40µm. Saccharomyces cerevisiae là loại nấm men được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bánh mì và thức uống có cồn. Saccharomyces cerevisiae được dùng trong phòng thí nghiệm và giữ vai trò quan trọng trong trong nghiên cứu vi sinh tế bào, tìm hiểu những thông tin về tế bào để phục vụ cho những nghiên cứu của con người. Các loài nấm men, như Candida albicans là tác nhân gây bệnh và có thể gây nhiễm trùng ở người. Gần đây một số loài nấm men đã được sử dụng trong các phản ứng sinh học tao ra nguồn nhiên liệu sinh học, sản xuất ethanol cho các ngành công nghiệp. 2.2.1. Tăng trưởng ,dinh dưỡng. Nấm men là sinh vật tự dưỡng chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ như là nguồn năng lượng chính và không cần có ánh sáng mặt trời. Nguồn carbon chính được nhận chủ yếu từ các từ hexose như glucose và frutose hoặc từ disaccharide như sucrose và maltose. Một vài loài có thể chuyển hóa đường pentose, cồn và các acid hữu cơ. Nấm men phát triển tốt nhất trên môi trường pH trung tính hoặc hơi 9
Chương 2: Tác động của các yếu tố truyền thống chua. Nhiệt độ phát triển của nấm men cũng hoàn toàn khác nhau. Leucosporidium frigidum phát triển ở -2đến 20°C(28-68°F). Saccharomyces telluris phát triển từ 5- 35°C(41-95°F) và Candida slooffi ở 28-45 °C(82-113°F). Các tế bào có thể sống trong điều kiện đóng băng trong ở điều kiện nhất định, với khả năng sống sót giảm theo thời gian đóng băng. 2.2.2. Sinh thái. Nấm men là rất phổ biến trong môi trường. Ví dụ như nấm men xuất hiện trong tự nhiên trên vỏ của trái cây và quả (như nho, táo hay đào), và dịch tiết từ thực vật. Một số nấm men được tìm thấy ở trong đất và côn trùng. Các chức năng sinh thái và đa dạng sinh học của nấm men là tương đối không rõ. So với các vi sinh vật khác. Nấm men bao gồm Candida albicans, Rubra rhodotorula, Torulopsis và Cutaneum trichosporon được tìm thấy ở môi trường quanh con người hoặc trên vỏ thực vật. Nấm men cũng có mặt trong các thực vật đường ruột của động vật có vú và một số loài côn trùng. 2.2.3. Sinh sản: Nấm men sinh sản vô tính hoặc hữu tính. Hình thức thường gặp là sinh sản vô tính bằng phương pháp nảy chồi. Chúng gồm những chồi nhỏ,hoặc tế bào con được hình thành từ các tế bào mẹ. Tế bào mẹ tạo các nhân và truyền vật chất di truyền qua cho các tế bào con. Các chồi con tiếp tục phát triển cho đến khi tách khỏi tế bào mẹ, hình thành tế bào mới.Một số nấm men sinh sản theo cách tách đôi thay vì tạo chồi. 2.2.4. Ứng dụng: Nấm men được ứng dụng rộng rãi trong khá nhiều lĩnh vực. Trong đó, quá trình lên mên bằng phương pháp công nghệ sinh học tạo ra các sản phẩm đặc trưng,chi phí thấp được quan tâm nhiều nhất. Các loại nấm men được ứng dụng vào công nghiệp sản xuất đồ uống có cồn như bia ,rượu…Công nghệ sản xuất thực phẩm:bánh mì với khá nhiều sản phẩm đa dạng phong phú. Công nghệ sản xuất nguồn nhiên liệu (bioethanol)…Ngày nay còn hướng đến lĩnh vực đồ uống không cồn, probiotic, thực phẩm chức năng đem lại nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao. 10
Chương 2: Tác động của các yếu tố truyền thống 2.3. Nấm men Saccharomyces Cerevisiae. 2.3.1 Đặc điểm sinh thái, thành phần cấu tạo, sinh trưởng và phát triển ở Saccharomyces cerevisiae. Hình 2.3.1: Tế bào nấm men S. cerevisiae trong giai đoạn sinh sản bằng phương pháp tạo chồi [31]. Hình 2.3.2: Tế bào nấm men S. cerevisiae cố định dưới kính hiển vi điện tử ( độ phóng đại: A:500X, B:1000X, C: 2000X)[26]. Saccharomyces cerevisiae thuộc:  Bộ: Endomycetales.  Họ: Saccharomycetaceae. Saccharomyces có khoảng 40 loài (Van Der Walt, 1970) và các loài trong giống này được biết nhiều do chúng được ứng dụng trong làm nổi bánh, bia, rượu....Chúng hiện diện nhiều trong sản phẩm có đường, đất, trái cây chín, phấn hoa.... Nấm men có hình bầu dục, gần tròn, kích thước khoảng 6 - 8 µm x 5 - 6 µm, vỏ tế bào cấu tạo bởi carbohydrat, lipid, protein dầy khoảng 0,5 µm, màng tế bào chất, tế bào chất và nhân đã được trình bày chung ở phần “Tế bào vi sinh vật chân hạch”. 11