Giáo trình CƠ SƠ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ - Chương 8

Chia sẻ: Doc Tai | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:17

Thêm vào BST

Báo xấu

223
lượt xem 73
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chương 8 TẾ BÀO CHỦ VÀ VECTOR Tóm tắt: Trong chương này, chúng ta sẽ bàn đến khía cạnh sinh học của việc tách dòng gene bao gồm việc sử dụng các phân tử vector và hệ thống sống thích hợp, tức vật chủ mà ở đó vector có thể được nhân lên. Các loại tế bào chủ sẽ được mô tả đầu tiên, tiếp theo lả các hệ thống vector và các phương pháp dùng để đưa ADN vào các tế bào. Tế bào chủ và vector là hai đối tượng cực kì quan trọng trong kĩ thuật tách dòng....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình CƠ SƠ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ - Chương 8

Chương 8 TẾ BÀO CHỦ VÀ VECTOR Tóm tắt: Trong chương này, chúng ta sẽ bàn đến khía cạnh sinh học của việc tách dòng gene bao gồm việc sử dụng các phân tử vector và hệ thống sống thích hợp, tức vật chủ mà ở đó vector có thể được nhân lên. Các loại tế bào chủ sẽ được mô tả đầu tiên, tiếp theo lả các hệ thống vector và các phương pháp dùng để đưa ADN vào các tế bào. Tế bào chủ và vector là hai đối tượng cực kì quan trọng trong kĩ thuật tách dòng. Có hai loại tế bào chủ, đó là: Tế bào chủ nhân sơ, Tế bào chủ nhân chuẩn và E. coli là vật chủ được sử dụng nhiều nhất trong kĩ thuật tách dòng. Vector tách dòng được phân biệt với vector chuyển gene ở một số đặc điểm cơ bản. Có nhiều loại vector được sử dụng trong kĩ thuật di truyền, nhưng được sử dụng rộng rãi nhất là plasmid. Nội dung của chương gồm 3 vấn đề chính là: (1) Tế bào chủ; (2). Vector, (3). Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bảo chủ. §1. TẾ BÀO CHỦ Loại tế bào chủ sử dụng trong một ứng dụng cụ thể chủ yếu phụ thuộc vào mục đích của thí nghiệm tách dòng. Nếu mục đích đó là tách ra một gene để phân tích cấu trúc thì yêu cầu ở dây chỉ là một hệ thống đơn giản, dễ sử dụng. Nếu mục đích là biểu hiện thông tin di truyền ở một sinh vật nhân chuẩn bậc cao, chẳng hạn ở thực vật, thì đòi hỏi phải có một hệ thống đặc thù hơn. Thường thì một vật chủ ban đầu đơn giản được sử dụng để tách một đoạn trình tự mà đoạn này sau đó được đưa vào một hệ thống phức tạp hơn để biểu hiện. Các loại tế bào chủ yếu được nêu trên bảng 8.1. 1.1. Các vật chủ nhân sơ Một tế bào chủ lí tưởng là một tế bào dễ nuôi cấy và dễ nhân giống, dễ thu nhận được nhiều loại vector. Vi khuẩn E. coli đáp ứng các yêu cầu này và được sử dụng trong rất nhiều kĩ thuật tách dòng. E. coli được nghiên cứu rất tỉ mỉ, rất nhiều loài khác nhau đã được các nhà di truyền học vi sinh vật phân lập khi nghiên cứu các cơ chế di truyền của sinh vật nhân sơ này. Các nghiên cứu đó đã cung cấp những thông tin khoa học giá trị làm cơ sở cho kĩ thuật di truyền. 109
Bảng 8.1. Các loại tế bào chủ dùng trong kĩ thuật di truyền Vi khuẩn Nhân sơ Gram âm Escherichia coli Gram dương Bacillus subtilis Streptomyces spp. Nấm Nhân chuẩn Vi sinh vật saccharomces cerevisiae Aspergillus nidulans Có khuẩn li Thực vật Nhân chuẩn Tế bào trần Các loại khác nhau Tế bào nguyên Các loại khác nhau Cả cơ thể Các loại khác nhau Động vật Nhân chuẩn Tế bào sâu bọ Drosophiia melanogaster Tế bào động vật Các loại khác nhau Tế bào trứng Các loại khác nhau Cả cơ thể Các loại khác nhau E. coli là vi khuẩn gram âm có một nhiễm sắc thể riêng lẻ nằm trong một cấu trúc gọi là vùng nhân (nucleoit). Kích thước của hệ gene vào khoảng 4 x 106 bp. Các quá trình biểu hiện gene (phiên mã và dịch mã) đi đôi với nhau, sinh ra sợi mARN được tổng hợp mới và được sử dụng ngay cho quá trình dịch mã. Vì vậy, E. coli có thể được coi là một trong những tế bào vật chủ đơn giản nhất, cho nên các thí nghiệm tách dòng gene đều sử dụng E. coli làm vật chủ với nhiều nòi khác nhau về mặt di truyền và cho những ứng dụng đặc biệt. Ngoài E. coli, các vi khuẩn khác cũng được dùng làm vật chủ cho các thí nghiệm tách dòng gene, chẳng hạn: Bacillus, Pseudomonas và Streptomyces. Các loại vi khuẩn này có những hạn chế nhất định đối với các vật chủ, đó là có rất ít vector thích hợp để sử dụng trong các tế bào đó và đưa ADN tái tổ hợp vào các tế bào đó có thể gặp khó khăn, đặc biệt khó khăn khi dối mặt với các thí nghiệm tách dòng ban đầu. 1.2. Các vật chủ nhân chuẩn Một trong những nhược điểm sử dụng E. coli làm vật chủ để tách dòng là là sinh vật nhân sơ không có màng nhân như ở các tế bào nhân chuẩn. Các tế bào nhân chuẩn có phổ tồn tại rất rộng từ các vi sinh vật như nấm men và tảo cho đến các tế bào của các sinh vật đa bào phức tạp, như con người chẳng hạn. Các tế bào vi sinh vật nhân chuẩn có nhiều đặc tính của vi khuẩn như dễ nhân giống, dễ tạo ra các đột biến. Trong khi các sinh vật nhân chuẩn bậc cao gây ra hàng loạt khó khăn đòi hỏi phải có những cách giải quyết đặc hiệu. 110
Nấm men Saccharomyces cerevisiae là một vi sinh vật nhân chuẩn được ưa thích để nghiên cứu kĩ thuật di truyền. Nó đã được sử dụng nhiều thế kỉ trong sản xuất bánh mì và bia, và được nghiên cứu rất tích cực. Sinh vật này có thể sử dụng dễ dàng để phân tích di truyền học kinh điển, chúng có nhiều loại tế bào đột biến. Hệ gene của S. cerevisaae có khoản 1,35 x 107; bazơ nitơ, nhiều hơn E.coli khoảng 3,5 lần. Các nấm khác cũng được dùng trong các thí nghiệm tách dòng gene là Aspergillus nidulans và Neurospora crassa. Các tế bào thực vật và động vật cũng có thể được sử dụng như các vật chủ trong các thí nghiệm thao tác gene. Các tế bào thực vật và động vật khác thường được nuôi cấy trong các môi trường thích hợp và ở điều kiện này, để sử dụng trong các thí nghiệm thao tác gene so với các tế bào trong cơ thể. §2. VECTOR 2.1. Khái niệm Để thu nhận gene dưới dạng tinh sạch với hàm lượng lớn người ta phải tách dòng (clone) gene đó. Việc tách dòng cơ bản là tiến hành gắn trình tự ADN vào vector. Vector cũng là một ADN dạng vòng, có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và mượn tế bào vi khuẩn để tạo ra những bản sao khác giống hệt vector ban đầu. Hình 8.1. Sơ đồ plasmid Vector có các ứng dụng chủ yếu sau: - Tạo dòng nhằm khuếch đại số lượng bản sao một trình tự ADN xác định. - Tạo sinh vật chuyển gene (chuyển các gene vào tế bào hay cơ thể). - Sản xuất ARN với số lượng lớn từ ADN được tạo dòng. - Sản xuất protein với số lượng lớn từ ADN được tạo dòng. Đặc tính cần có của một vector: 111
- Vector có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào vật chủ. Độc lập với sự sao chép của bộ gene vật chủ. - Vector có kích thước càng nhỏ càng tốt. - Vector phải được phát hiện rõ ràng trong vật chủ. - Phải tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ. - Vector chỉ tồn tại một vị trí nhận biết cho mỗi enzyme. Vector được sử dụng trong kĩ thuật tách dòng phân tử ADN đối với tế bào E. coli: (1) Plasmids; (2) Bacteriophage l, (3) Cosmids; (4) Bactenophage M13; (5) Phagemids và một số loại vector đặc biệt khác như: (i) Ti plasmid; (ii) YACS; (iii) BACS; (iv) Retrovirus; (iiv) Baculovirus. (iiiv) Yeast 2 micron plasmid. Việc lựa chọn sử dụng một loại vector dựa vào kích thước của đoạn ADN cần tạo dòng và mục đích tạo dòng. Vector được sử dụng với mục đích tách dòng gene (vector tách dòng) và chuyển gene (vector chuyển gene). Hình 8.2. Plasmid pBR322 (a) và plasmid pUC18 (b) (theo Nông Văn Hảí, 2002) 2.2. Các vector plasmid dùng cho E. coli Có một số đặc điểm quan trọng mà các vectơ cần phải có, chúng phải những phân tử ADN nhỏ giúp cho việc phân tách và bảo quản chúng dễ dàng. Phải có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication), để cho ADN nó được nhân lên và do vậy được duy trì trong quần thể tế bào khi sinh vật chủ sinh trưởng và phân chia. Cần có một loại dấu chuẩn, chọn lọc (selectable marker) tạo điều kiện cho vector được dễ dàng phát hiện và cũng cần phải có ít nhất một điểm cắt bởi enzyme giới hạn để tạo điều kiện cho ADN xen vào trong quá trình tạo ra các thể tái tổ hợp. Các plamid có các đặc điểm phù hợp với yêu cầu trên và chúng được sử dụng thường xuyên như các vector trong các thí nghiệm tách dòng. 2.2.1. Plasmid 112
Nhiều loại plasmid được tìm thấy trong tự nhiên ở các vi khuẩn và trong một số nấm men. Chúng là những phân tử AND mạch vòng tương đối nhỏ so với nhiễm sắc thể của tế bào vật chủ. Các plasmid tồn tại chủ yếu ở trạng thái ngoài nhiễm sắc thể. Plasmid cos khả năng truyền các tính trạng cho vật chủ (chẳng hạn: tính bền vững với kháng sinh), do vậy giúp cho việc lựa chọn dễ dàng trong những điều kiện xác định. Các gene bền vững với kháng sinh do AND plasmid mã hóa thường được sử dụng trong việc thiết kế các vector dùng cho kĩ thuật di truyền vì chúng cung cấp một phương tiện thuận lợi để lựa chọn các tế bào có mang plasmid. Các plasmid có thể phân chia thành 2 nhóm: tiếp hợp và không tiếp hợp. Các plasmid tiếp hợp có thể tự truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác thông qua quá trình tiếp hợp. Quá trình này đòi hỏi các chức năng của các đoạn đặc thù tra (transfer) và mob (mobilising) nằm trên plasmid. Các plasmid không tiếp hợp thì không tự truyền đi được. Một cách phân loại khác dựa trên số lượng các bản sao của plasmid có trong tế bào chủ. Các plasmid có số bản sao thấp có khuynh hướng kiểm soát chặt chẽ việc sao chép ADN, thường ADN plasmid loại này phải sao chép bắt buộc cùng với sự sao chép ADN nhiễm sắc thể của vật chủ. Các plasmid có số bản sao cao gọi lào các plasmid thoải mái, việc sao chép ADN của chúng không phụ thuộc vào sự sao chép ADN nhiễm sắc thể của tế bào chủ. Nói chung, các plasmid tiếp hợp thường lớn, có cơ chế kiểm soát chặt chẽ việc sao chép ADN và tồn tại trong tế bào với số lượng bản sao thấp. Trong khi đó, các plasmid không tiếp hợp thường nhỏ, sao chép ADN một cách thoải mái và tồn tại trong tế bào với số bản sao cao. 2.2.2. Các plasmid cơ bản dùng để tách dòng Trong kĩ thuật di truyền, các plasmid gặp trong tự nhiên thường được sửa đổi nhiều để tạo ra các vector có đặc điểm mong muốn. Để đặt tên plasmid, chữ p được dùng để chỉ plasmid và tiếp theo đó thường là tên của những người đã phân lập hoặc thiết kế plasmid. Các con số cũng có thể được sử dụng để phân loại các chủng cụ thể. Một trong những plasmid được sử dụng rộng rãi là pBR322, nó được hoàn thiện bởi Francisco Bolivar và đồng nghiệp. Việc thiết kế pBR322 bao gồm một loạt những thao tác để có được những đoạn ADN cần thiết cùng nối với nhau với kết quả cuối cùng là một ADN có 3 nguồn gốc. Plasmid này có tất cả các đặc tính của một vector tốt, chẳng hạn như: trọng lượng phân tử thấp, có các gene kháng kháng sinh, có điểm khởi đầu sao chép, và có một số điểm cắt riêng biệt bởi các enzyme giới hạn. Có một số plasmid trong nhóm pBR mang các đặc điểm khác nhau chút ít. Tuy nhiên, plasmid bắt nguồn từ pBR322 được sử dụng rộng rãi, vì chúng có 113
một số đặc điểm ưu việt so với plasmid ban đầu. Ví dụ: plasmid pAT153, là một dẫn xuất mất đoạn của pBR322. Plasmid này được tạo ra bằng các loại bỏ 2 đoạn ADN từ pBR322 sau khi dùng enzym giới hạn Hael. Lượng ADN bị loại bỏ rất nhỏ (705 cặp bazơ), nhưng hiệu quả đã làm tăng số bản sao lên 3 lần và đã loại bỏ các đoạn trình tự cần thiết cho quá trình huy động (mobilisation). Như vậy, pAT153 về một số phương diện là vector "tốt hơn" pBR322, vì nó có nhiều bản sao hơn trong tế bào và nó có mức độ bền vững sinh học cao hơn do mất khả năng huy động. Hình 8.3. Vector pBluescript (theo Nông Văn Hải, 2002) Sự có mặt của 2 gene kháng kháng sinh (Apr và Tcr) cho phép lựa chọn các tế bào có mang plasmid, vì các tế bào đó sẽ kháng với cả ampicilin và tetracylin. Một ưu việt nữa là các điểm cắt giới hạn duy nhất nằm trong các gene kháng sinh cho phép lựa chọn được các ADN tách dòng, và do vậy được gọi là bất hoạt do xen đoạn (insertional inactivation), khi mà đoạn ADN xen vào làm gián đoạn đoạn mã hoá của gene kháng và vì vậy làm thay đổi kiểu hình của tế bào mang ADN tái tổ hợp. 2.2.3. Các vectorplasmid khác Mặc dù các plasmid pBR322 và pAT153 được sử dụng rộng rãi trong nhiều ứng dụng của tách dòng gene, còn có các vector plasmid khác cũng được sử dụng. Nói chung, chúng dược thiết kế sao cho có được những đặc tính cụ thể, không thấy có trong các vector đơn giản. Chúng có thể mang những khởi điểm đặc hiệu để biểu hiện các gene xen vào hoặc chúng có thể có những ưu việt khác như tạo ra khả năng chọn lọc trực tiếp các thể tái tổ hợp. Một nhóm các vector plasmid cũng rất phổ biến là các plasmid thuộc họ PUC. Các plasmid này có 114
một đoạn ngắn chứa một số các điểm riêng lẻ bị cắt bởi enzyme giới hạn. Đoạn này gọi là đoạn đa liên kết (polilinker) hoặc điểm đa tách dòng (multiple cloning site), chúng rất hữu hiệu bởi vì có thể lựa chọn điểm cắt mong muốn để xen đoạn ADN trong quá trình tạo ra ADN tái tổ hợp. Bản đồ của một trong các vector pUC có các điểm cắt giới hạn nằm trong vùng polilinker, các plasmid pUC còn có vùng mang gene β - blaceosidaza, gene này mã hoá α - peptit. Đoạn trình tự này có chứa vùng polilinker, và việc một đoạn ADN vào một trong những điểm tách dòng sẽ dẫn đến một α - peptit không hoạt động chức năng. Việc đó đặt cơ sở cho một phương pháp sàng lọc trực tiếp các thể tái tổ hợp rất hữu hiệu sử dụng cơ chất tạo màu X-gal. Mặc dù các vector plasmid có nhiều tính chất hữu hiệu và chúng rất quan trọng cho việc thao tác gene, nhưng chúng vẫn mang hàng loạt nhược điểm. Hình 8.4. Tạo vector tái tổ hợp (theo Nông Văn Hải, 2002) 2.3. Các vector phage dùng cho E. coli Mặc dù các vector dựa trên cơ sở phage về nhiều phương diện đặc hiệu hơn các vector plasmid, nhưng về thực chất chúng thực hiện cùng một chức năng, có nghĩa là chúng hoạt động như các phân tử mang các đoạn ADN. Có 2 loại phage( λ và M13) được hoàn thiện tích cực cho các mục đích tách dòng. 2.3.1. Phage Trong những năm 40, Max Delbruck và "nhóm phage" do ông thành lập 115
đã đặt nền móng cho sinh học phân tử hiện đại bằng cách nghiên cứu các phage Đó là những "thể ăn khuẩn", và là các virut chỉ nhân lên được bên trong vi khuẩn. Vì chúng có kích thước rất nhỏ nên người ta còn gọi chúng là hạt (particle). Về mặt cấu trúc, các phage chia thành 3 nhóm chính: (1) không đuôi;(2) có đầu và đuôi, và (3) có lông. Vật chất di truyền có thể là ADN mạch đơn, mạch kép, hoặc ARN. Thường thấy là các ADN mạch kép (DdsDN) (double- stranded ADN). Ở các phage không đuôi và có đuôi, hệ gene được bao bọc trong vỏ protein gọi là capsid (đôi khi được biết đến như vỏ hoặc đầu của phage. Trong các phage, dsADN điển hình hệ gene là những hệ gene bao gồm khoảng 50% toàn bộ khối lượng của hạt phage. Như vậy, phage là những hệ thống tương đối đơn giản nếu so sánh với vi khuẩn, vì nguyên nhân này chúng được sử dụng rất rộng rãi như các mô hình để nghiên cứu sự biểu hiện của gene. Hình 8.5. Hình ảnh phage λ Các phage có thể phân thành phage độc (virulent) và phage ôn hoà (temperate), tuỳ thuộc vào chu trình sống của chúng. Khi một phage chui vào trong một tế bào vi khuẩn, nó có thể sinh ra nhiều phage và giết chết tế bào đó, đó là chu trình sinh tan (litic) hoặc nó có thể nhập vào nhiễm sắc thể và ở lại đó mà không giết chết tế bào, đó là chu trình tiềm tan (lisogeneic). Phage độc là phage chỉ có chu trình sinh tan. Phage ôn hoà là phage có chu trình tiềm tan, nhưng cũng có thể có phản ứng sinh tan trong những điều kiện thích hợp. Hệ gene của phage λ có chiều dài 48,5kb, mã hoá cho 46 gene. Toàn bộ hệ gene đã được giải trình tự, và tất cả các điểm điều hoà đều đã được biết. Ở hai đầu của hệ gene mạch dài có các đoạn ngắn (12bp) sợi đơn, chúng bổ trợ cho nhau. Các đoạn này là những "đầu dính", chúng tạo điều kiện cho hệ gene trở thành mạch vòng sau khi nhiễm vào vi khuẩn. Đoạn của hệ gene được sinh ra bằng cách gắn các đầu dính gọi là điểm cos (cos site). 116
Hình 8.6. Hệ gene của Phage λ Quá trình xâm nhiễm của phage vào vi khuẩn bắt đầu bằng việc phage bám vào dinh dưỡng điểm nhận trên bề mặt vi khuẩn. Khi phage bị hấp thụ thì ADN được tiêm vào bên trong tế bào và chu trình sống có thể bắt đầu. Hệ gene trở thành mạch vòng và phage bắt đầu chu trình sinh tan hoặc tiềm tan tuỳ thuộc vào một loại yếu tố như dinh dưỡng và trạng thái trao đổi chất của tế bào chủ và phụ thuộc vào tính đa nhiễm (số lượng phage xâm nhập vi khuẩn trong quá trình hấp thụ). Nếu chu trình tiềm tan bắt đầu thì hệ gene của phagenhập vào nhiễm sắc thể vật chủ và chúng được duy trì ở dạng prophage. Sau đó, nó sao chép cùng với ADN nhiễm sắc thể và được chuyển tới các tế bào thế hệ con trong một dạng ổn định. Nếu chu trình sinh tan bắt đầu thì một loạt các sự kiện phiên mã sẽ diễn ra, phage hoàn toàn làm chủ tế bào vật chủ và sinh ra nhiều bản sao của hệ gene phage cũng như các protein cấu trúc. Sau đó các thành phần này được lắp ráp lại hay còn gọi là bọc gói để tạo thành các phage trưởng thành, sau đó chúng thoát ra khỏi tế bào chủ khi tế bào này bị tan. Để xác định số lượng các phage có trong dịch tan, người ta pha loãng nhiều lần dịch phage và trộn lẫn với một số lượng dư thừa vi khuẩn chỉ thị rồi cấy lên mặt thạch. Sau khi ủ, vi khuẩn sẽ mọc và tạo thành cái gọi là thảm vi khuẩn. Phage mọc trên thảm này sẽ làm cho các tế bào bị phage xâm nhiễm tiêu tan, tạo nên các vết tan (plaque) trên thảm. Sau đó, người ta đếm số lượng các vết tan và xác định được số lượng phage trong dịch huyền phù ban đầu. Vết tan có thể được lấy ra cho mọc và phân tích tiếp. Phage có thể nhân lên trong dịch lỏng bằng cách cho nhiễm giống đang mọc của tế bào chủ và ủ cho đến khi các tế bào bị tan hoàn toàn, số lượng các hạt phage sinh ra phụ thuộc vào độ đa nhiễm và vào trạng thái của chu trình sinh sản vi khuẩn mà chúng nhiễm vào. Khi ADN chui vào tế bào thì nó chuyển sang phân tử mạch đôi gọi là dạng sao chép (RF) (replicative from), nó sao chép cho đến khi có khoảng 1000 bản sao trong tế bào. Tại thời điểm này, việc sao chép ADN trở nên bất đối xứng (asymmetric) và các bản sao mạch đơn của hệ gene được sinh ra và thoát khỏi tế bào như các hạt M13. Vi khuẩn không bị tan và vẫn còn sống trong suốt quá trình này, mặc dù quá trình sinh sản và phân chia có chậm hơn so với các tế bào không bị xâm nhiễm. 117
2.3.2. Các vector dựa trên cơs ở phage λ Việc sử dụng phage λ làm vector tách dòng phụ thuộc vào một thực tế là không phải tất cả hệ gene của λ đều cần thiết cho phage hoạt động chức năng. Do vậy, có một phạm vi để đưa ADN ngoại lai vào, mặc dù một số đòi hỏi nhất định cần phải có trong quá trình hoàn thiện các vector tách dòng dựa trên cơ sở phage λ . Một là sự sắp xếp các gene trên hệ gene λ sẽ quyết định phần nào cần phải loại bỏ đi hoặc cần phải được thay thế để đưa ADN ngoại lai vào. Vùng trung tâm của hệ gene λ nằm giữa các vị trí 20 và 35 trên bản đồ, là một đoạn lớn có thể bỏ qua mà không cần có sự sắp xếp lại invitro một cách phức tạp đối với hệ gene. Vùng trung tâm này chủ yếu kiểm soát các tính chất tiềm tan của phage, và phần lớn vùng đó có thể cắt bỏ mà không làm suy yếu các chức năng cần thiết cho chu trình sinh tan. Hai là, phage λ kiểu dại nói chung có nhiều điểm nhận biết của các enzyme giới hạn thường được sử dụng trong kĩ thuật tách dòng. Điều đó có thể là một khó khăn lớn, vì nó giới hạn sự lựa chọn các điểm để xen ADN vào. Trong thực tế sẽ tương đối dễ dàng lựa chọn đối với phage có số lượng giới hạn các điểm bị cắt bởi các enzyme giới hạn cụ thể, và kĩ thuật gây đột biến in vitro có thể được sử dụng để sửa đổi các điểm còn lại - tức các điểm không cần thiết. Như vậy, có thể nhận được phage mang tổ hợp mong muốn các điểm nhận biết bởi enzyme giới hạn. Hình 8.7. Vector Phage λ 118
Một trong các nhược điểm lớn của các vector λ là capsid chỉ có thể bọc gói một số lượng ADN nhất định trong quá trình lắp ráp phage, do vậy, nó giới hạn kích thước của các đoạn ADN ngoại lai cần tách dòng. Trong quá trình bọc gói, các hạt phage có khả năng sống có thể sinh ra với chiều dài ADN nằm trong khoảng 38kb đến 52kb. 2.3.3. Các vector dựa trên cơ sở phage M13 Có hai điểm trong việc gây nhiễm M13 có giá trị đối với kĩ thuật di truyền. Một là, dạng sao chép RF rất giống với plasmid, vì vậy có thể tách chiết và thao tác bằng cùng những kĩ thuật như nhau. Ưu điểm thứ hai là ADN sợi đơn sinh ra trong quá trình nhiễm rất hữu ích trong các thí nghiệm như xác định trình tự theo phương pháp dùng dideoxynucleotit. Chỉ riêng về mặt này đã khiến cho M13 trở thành một vector có tiềm năng hết sức hấp dẫn. Khác với phage λ M13 không mang các gene không quan trọng. Hệ gene 6407 cặp bazơ nằm ở vùng giữa các gene. Vùng này đã được dùng để thiết kế một loạt các vector M13mp bằng cách xen một đoạn polinker/lac Z α - peptit vào đó. Việc này đã tạo điều kiện cho việc sử dụng hệ thống sàng lọc X-gal để phát hiện các thể tái tổ hợp, chẳng hạn như trường hợp với các plasmid pUC. Khi M13 mọc trên thảm vi khuẩn thì các vết tan xuất hiện do làm giảm sự sinh trưởng của các tế bào (chúng không bị tan), và có thể lấy ra phân tích tiếp. Hình 8.8. Tách dòng gene bởi vector Phage hai sợi M13 (1). AND của Vector M13RF bị cắt bởi HindIII (2). Đoạn AND được cắt bởi Hind III (3). Ligase 119
(4). Biến nạp (5). AND Tái bản Ưu việt thứ hai của các vector M13 là chúng không hoạt động chức năng một cách đầy đủ khi các đoạn ADN dài được xen vào vector. Mặc dù về mặt lí thuyết không có một giới hạn nào đối với kích thước của các đoạn có thể tách dòng, vì cấu trúc capsid được xác định bởi kích thước hiệu quả tách dòng đối với các đoạn lớn hơn 1,5kb. Trên thực tế, đó không phải là vấn đề chính vì các vector M13 được sử dụng chủ yếu khi tách dòng các đoạn ADN nhỏ để xác định trình tự. Trong ứng dụng này, việc sản sinh ra ADN sợi đơn cùng với sự dễ dàng trong việc tinh sạch ADN từ mô tế bào đã làm lu mờ những hạn chế về kích thước. 2.4. Các vector khác Cho đến nay, chúng ta mới tập trung vào các plasmid và phage để dùng trong các vật chủ E. coli, vi khuẩn này cho đến nay vẫn là đại diện chủ yếu được sử dụng trong phần lớn các công nghệ thao tác gene. Tuy nhiên, còn tồn tại các hệ thống vật chủ / vector khác cũng rất quan trọng, mặc dù chúng chuyên dụng hơn. Trong phần này, chúng tôi sẽ giới thiệu những đặc điểm của các vector vi khuẩn bổ sung và một số vector được sử dụng trong các sinh vật khác. 2.4 1. Các vector plasmid / phage Một đặc tính của các vector phagelà ở chỗ kĩ thuật bọc gói invitro độc lập về mặt trình tự, không đòi hỏi phải có các điểm cos nằm tách biệt bởi ADN với kích thước có thể bọc gói được (38-51kb). Điều đó đã được sử dụng để thiết kế các vector hình thành từ các đoạn trình tự plasmid kết nối với các điểm cos của phage λ . Các vector như thế gọi là các cosmid. Chúng có kích thước nhỏ (4- 6kb) và vì vậy, có thể chứa các đoạn ADN tách đòng dài tới 47kb. Vì chúng không có các gene của phage nên chúng hoạt động như các plasmid khi đưa vào E. coli bằng cơ chế bọc gói/ nhiễm của λ . Bởi vậy, các vector cosmid cung cấp một hệ thống hết sức lí tưởng - một phương pháp đặc biệt và có hiệu quả cao để đưa ADN tái tổ hợp vào trong tế bào chủ, và khả năng tách dòng này lớn hơn khoảng 2 lần so với các vector λ tốt nhất. Tuy nhiên, chúng cũng có những nhược điểm và thường thì việc sử dụng cosmid thay cho các vector phage làm mất đi sự dễ dàng trong sử dụng và xử lí các trình tự tách dòng này. 120
Hình 8.9. Vector Cosmid Các vector lai plasmid/ phage được hoàn thiện để khắc phục những hạn chế về kích thước của hệ thống tách dòng M13, và đến nay chúng được sử dụng rộng rãi cho các ứng dụng như giải trình tự ADN và sản xuất các mẫu dò để sử dụng trong các nghiên cứu về lai axit nucleic. Các vector này là những plasmid quan trọng, chúng chứa điểm khởi đầu sao chép fl của phage M13. Khi các tế bào có chứa plasmid này bị siêu nhiễm bởi phagethì chúng sản sinh ra các bản sao sợi đơn của ADN plasmid và tiết chúng ra môi trường ở dạng các hạt giống M13. Các vector, chẳng hạn như pEMBL9 hoặc pBluescript có thể tiếp nhận các đoạn ADN dài tới 10kb. 2.4.2. Các vector dùng trong các tế bào nhân chuẩn Khi xem xét các tế bào chủ nhân chuẩn thì các yêu cầu về vector trở nên rất phức tạp. Trong khi các vi khuẩn tương đối đơn giản về mặt di truyền thì các tế bào nhân chuẩn lại có nhiều nhiễm sắc thể nằm trong nhân có vỏ bao bọc. Vì các sinh vật nhân chuẩn hết sức đa dạng, nên lẽ tự nhiên là các vector có xu hướng đặc hiệu cao và cần thiết kế riêng biệt cho các mục đích cụ thể. Nhiều vector đã được hoàn thiện để sử dụng trong các tế bào nấm men và tuỳ thuộc vào từng ứng dụng cụ thể mà lựa chọn vector. Các plasmid episom của nấm men (Yeps) được hoàn thiện trên cơ sở plasmid nấm men thường gặp trong tự nhiên, chúng có thể tự sao chép hoặc hoà nhập vào nhiễm sắc thể. Các plasmid hoà nhập của nấm men (Yips) được thiết kế để gắn vào nhiễm sắc thể bằng cách tương tự như các plasmid YEp, còn các plasmid tự sao chép của nấm men (Yrps) vẫn ở trạng thái độc lập, không hoà nhập vào nhiễm sắc thể. Các plasmid có chứa các đoạn trình tự trong vùng tâm động đúng như các nhiễm sắc thể mini. Cuối cùng, các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (YACs) là các vector nấm men phức tạp nhất. Chúng có những vùng của tâm động và điểm mút, và có thể được sử dụng để tách dòng các đoạn ADN có kích thước rất lớn, bởi vì thế tái tổ hợp được duy trì chủ yếu như một nhiễm sắc thể nấm men. Trên thực tế, độ bền vững của các 121
YAC dường như tăng lên khi kích thước của đoạn tách dòng tăng lên, điều này không giống với nhiều hệ thống vector khác. Bảng 8.2. Một số vector có thể dùng cho các tế bào động vật và thực vật Loại tế Loại Loại hệ Thí dụ bào vector gene Plasmid ADN Plasmid Ti của Agrobacterium tumefaciens Thực vật Virut ADN Virut khảm cải hoa, Geminivirut ARN Virut khảm thuốc lá Plasmid ADN Các loại vector plasmid khác nhau. Nhiều loại là vector lại có chứa một phần hệ gene của SV40 Động vật Virut ADN Baculovirut Virut Papilloma Virut Simian 40 (SV40) Virut ARN Retrovirut Gene nhảy ADN Các phần từ P trong Drosophilla melanogaster Khi làm thí nghiệm với các sinh vật nhân chuẩn bậc cao đa bào, như thực vật và động vật, các vấn đề đưa ADN tái tổ hợp vào trong cơ thể có khác biệt chút ít so với trường hợp các sinh vật nhân chuẩn đơn bào như nấm men. Mục tiêu của kĩ thuật di truyền ở các sinh vật nhân chuẩn bậc cao bao gồm: (1) Đưa ADN tái tổ hợp vào các tế bào động vật và thực vật trong mô nuôi cấy nhằm nghiên cứu cơ bản về sự biểu hiện của gene hoặc nhằm sản xuất các protein hữu ích. (2). Biến đổi cấu trúc di truyền của sinh vật và tạo ra một vận chuyển gene. Các vector dùng cho các tế bào thực vật và động vật có thể được đưa vào các tế bào trực tiếp bằng các kĩ thuật hoặc chúng có thể có cơ chế xâm nhập sinh học nếu dựa trên các virut hoặc các tác nhân xâm nhiễm khác như Agrobacteria. §3. PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN VECTOR TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ Việc thao tác vector và xen ADN để tạo ra các vector tái tổ hợp được thực 122
hiện trong ống nghiệm, và sau đó là đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ để nhân lên. Hiệu quả của bước này thường là yếu tố quyết định sự thành công của kĩ thuật tách dòng. Các phương pháp hiện có phụ thuộc vào kiểu loại của hệ thống vật chủ/ vector và bao gồm các kĩ thuật đơn giản đến những kĩ thuật rất phức tạp và đặc thù. 3.1. Biến nạp và lây nhiễm Các kĩ thuật biến nạp và lây nhiễm là những phương pháp đơn giản nhất để đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ. Trong trường hợp các tế bào E. coli thì biến nạp có nghĩa là đưa ADN plasmid vào trong tế bào, còn lây nhiễm là đưa ADN phage vào trong các tế bào. Biến nạp còn được sử dụng với nghĩa rộng hơn, cụ thể là: đưa bất kì ADN nào vào bất kì tế bào nào. Để cho biến nạp ở E. coli có hiệu quả các tế bào cần trở nên khả biến (competent). Để đạt được điều này, người ta ngâm các tế bào trong dung dịch calcium chlorid lạnh đóng đá, khi đó, các tế bào trở nên khả biến theo một cách mà cho đến nay chưa biết rõ nguyên nhân. Việc biến nạp các tế bào khả biến được thực hiện bằng cách trộn ADN plasmid với các tế bào, rồi ủ trong đá 20 đến 30 phút, sau đó tạo một sốc nhiệt ngắn (2 phút ở 420C), làm như vậy ADN sẽ chui vào tế bào. Các tế bào biến nạp thường được ủ trong nước thịt dinh dưỡng ở 370C trong vòng 60 đến 90 phút để làm cho các plasmid ổn định và biểu hiện các tính trạng của chúng ra kiểu hình. Sau đó, các tế bào được đưa lên môi trường chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmid. Trong quá trình biến nạp, chỉ có một phần rất nhỏ tế bào khả biến được biến nạp. Mặc dù có nhược điểm rất lớn, biến nạp vẫn là một kĩ thuật quan trọng, nó có thể tạo ra tới 109 các tế bào biến nạp (tức các thể biến nạp) khi đưa 1gr ADN vào thí nghiệm. Thường trên thực tế với 1 μ g ADN người ta tạo ra được 106 đến 107 tế bào biến nạp. Lây nhiễm là một quá trình tương tự với biến nạp, chỉ khác ở chỗ ADN plasmid được thay thế bằng ADN phage. Quá trình này cũng không diễn ra với 100% các tế bào, và vì vậy chúng thường được thay thể bằng các bọc gói invitro trong các thí nghiệm đòi hỏi phải đưa ADN của phage vào bên trong các tế bào E. coli. 3.2. Bọc gói ADN của phage invitro Trong quá trình sinh tan của phage λ , ADN của phage được sao chép để tạo thành cái gọi là chuỗi khảm (concatemere). Đó là một phân tử ADN rất dài bao gồm nhiều bản sao của hệ gene λ được nối liền với nhau. Khi các hạt phage được lắp ráp thì ADN được bọc gói thành các capsid, quá trình này bao gồm việc cắt ADN tại các điểm cos bằng enzyme endonucleaza do phage mã hoá. 123
Các hạt phage trưởng thành sau đó dược sinh ra, và thoát ra ngoài khi các tế bào tan, sau đó chúng lại có khả năng nhiễm vào các tế bào khác. Quá trình này thường diễn ra invitro dưới sự điều khiển của các gene phage. Tuy nhiên, cũng có thể thực hiện trong ống nghiệm. Để bọc gói invitro thì các thành phần của capsid λ , và endonucleaza phải có trong ống nghiệm. Trên thực tế, hai nòi vi khuẩn được sử dụng để tạo ra dịch tan gọi là dịch chiết bọc gói (packaging extract). Mỗi nòi mang đột biến về một chức năng trong quá trình phát sinh hình thái của phage). Như vậy, các dịch chiết bọc gói sẽ không hoạt động riêng rẻ. Khi trộn hai cái với nhau với ADN tái tổ hợp không hoạt động khảm (concatemer) trong những điều kiện thích hợp và với đầy đủ các thành phần thì các hạt phage sẽ được sinh ra. Các hạt này sau đó có thể dược sử dụng để gây nhiễm các tế bào E. coli và tạo ra các vết tan. 3.3. Các phương pháp truyền ADN khác Các phương pháp dùng để đưa ADN vào các tế bào vi khuẩn không dễ áp dụng cho các loại tế bào khác. Hệ thống bọc gói đặc thù cho phage không dùng được cho các hệ thống khác, và việc hiến nạp bằng các phương pháp thông thường có thể không thực hiện được hoặc hiệu quả rất thấp. Tuy nhiên, có những phương pháp khác dùng để đưa AND vào các tế bào. Thông thường, các phương pháp này có những đòi hỏi về kĩ thuật và kém hiệu quả so với các phương pháp dùng cho vi khuẩn. Tuy nhiên, người ta đã đạt được kết quả trong một số trường hợp. Vấn đề khó khăn nhất trong việc đưa ADN vào các tế bào không phải là vi khuẩn thường xảy ra với các tế bào thực vật. Các tế bào động vật lại được biến nạp tương đối dễ dàng. Còn việc biến nạp các tế bào thực vật gặp khó khăn vì vỏ tế bào của chúng rất cứng, ngăn chặn không cho ADN chui vào. Có thể khắc phục việc này bằng cách tạo ra các tế bào trần (protoplasts) là những tế bào mà thành của chúng đã được loại bỏ bằng enzym. Sau đó, các tế bào trần có thể được biến nạp bằng các kĩ thuật như mở lỗ bằng điện, khi một cung được sử dụng để tạo ra các lỗ trên màng tế bào mà qua đó ADN có thể xâm nhập. Sau đó các tế bào trần có thể được tái sinh (tạo vỏ mới). Ngoài ứng dụng này, các tế bào trần còn có vai trò quan trọng trong việc tạo ra các tế bào lai thực vật khi dung hợp với nhau. Mọi loại phương pháp biến nạp khác có thể đưa ADN vào bên trong tế bào là các phương pháp vật lí. Một cách để làm việc đó là sử dụng một cái kim rất mảnh để tiêm ADN trực tiếp vào trong nhân. Kĩ thuật này gọi là vi tiêm và đã được sử dụng thành công cả đối với các tế bào động vật và thực vật. Tế bào được giữ trên đầu một ống thuỷ tinh đầu tầy, còn chiếc kim nhọn được dùng để đâm xuyên qua màng tế bào. Kĩ thuật này đòi hỏi phải có một máy vi 124
thao tác cơ học, một kính hiển vi và đặc biệt phải có kĩ năng thực hành tinh vi. Gần đây người ta đã hoàn thiện một phương pháp tỏ ra rất hữu hiệu để biến nạp tế bào thực vật, gọi là kĩ thuật bắn ADN vào tế bào. ADN được dùng để bao bọc các hạt vonfram cực nhỏ gọi là vi đạn. Khi bắn, chúng được tăng tốc trên viên đạn lớn là bộ phận được bắn đi do ngòi thuốc nổ cháy. Tại một đầu của "súng" có một lỗ nhỏ chặn viên đạn lớn lại nhưng vẫn cho vi đạn chui qua. Khi nhằm bắn vào tế bào, các vi đạn sẽ đưa ADN vào trong tế bào và trong một số trường hợp biến nạp sẽ thực hiện thành công. THẢO LUẬN 1. Nêu các loại tế bào chủ và ưu, nhược điểm trong kĩ thuật tách dòng gene. 2. Plasmid là gì? các loại plasmid. Trình bày về các vector plasmid dùng cho E. coli. 3. Trình bày về vector phage. 4. Các vector dùng trong các tế bào nhân chuẩn. 5. Trình bày đặc điểm cơ bản của một số phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. 6. E. coli và sử dụng E. coli trong kĩ thuật di truyền. 7. Vector tách dòng và vector biểu hiện gene. 8. Vấn đề tách dòng gene. 9. Vấn đề chuyển gene và sinh vật chuyển gene. 125