zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Nông - Lâm - Ngư

» Nông nghiệp

Giáo trình công nghệ sinh học: Kỹ thuật nhân giống in vitro

Chia sẻ: Nguyen Phuong Anh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:50

Báo xấu

866
lượt xem 169
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bao gồm: + Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành + Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình công nghệ sinh học: Kỹ thuật nhân giống in vitro

 Giáo trình công nghệ sinh học Kỹ thuật nhân giống in vitro
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp Chuyên đề 3. Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro ---------- o 0 o ---------- Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bao gồm: + Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành + Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh. + Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành + Nuôi cấy mô sẹo (callus) + Nuôi cấy tế bào đơn + Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm (in vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm (in vivo). Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm. Đây là hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp. *Cơ sở khoa học Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô tính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hoá và phản phân hoá. - Tính toàn năng của tế bào: Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào đã chuyên hoá đều chứa một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền của một cơ thể trưởng thành. Vì vậy, trong điều kiện nhất định một tế bào bất kỳ đều 1
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh. Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào. Qua đó người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô) thành một cơ thể hoàn chỉnh khi được nuôi cấy trong một môi trường thích hợp có đầy đủ các điều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các quá trình phân hoá, phản phân hoá. - Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào + Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chực năng khác nhau. Trong cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào môi sinh đã trải qua giai đoạn phân hoá tế bào để hình thành các mô riêng biệt. + Tính phản phân hoá của tế bào: dó là các tế bào khi đã được phân hoá thành các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định chúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào. Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân…thì giai đoạn tạo mô sẹo chính là khi tế bào quay trở về trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân… trước đó. Sự phân hoá và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào đã chuyên hoá được biểu diễn theo sơ đồ sau: Phân hoá tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá và một số gen khác bị ức chế. Điều này được xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các gen để hình thành một các thể mới. Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. *Các ứng dụng Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro là việc sử dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ. Ở kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn. Mô nuôi cáy dễ phân hoá và sau đó dễ tái sinh hơn. Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không có được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối 2
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền. Ứng dụng: - Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống. - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp cây giống của các loại cây trống khác nhau. + Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt + Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa các loại cây trồng khác. + Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus + Bảo quản các tạp đoàn gen, đặc biệt với loại cây dễ bị nhiếm bệnh trong điều kiện tự nhiên, hoặccác cây dễ bị giao phấn. Với phương pháp này nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền, cúc…), cây lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà phê…), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây…), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, dứa sợi…) đã được phổ biến nhanh vào trong sản xuất. *Các bước trong nhân giống in vitro Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trược khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro. Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá. Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro Măng tây: chồi ngọn (Kohter, 1975) Khoai tây: mầm (Morel, 1952) Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976) Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975) Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978) Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được 3
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl 0.1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br… Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến: Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962) Chất hữu cơ: đường sarcaroza Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin (GA3) Bước 3: nhân nhanh Mục đích cảu giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi. Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân hoá chồi (Weiss và Jaffe, 1969). Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối… Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn nhưng chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ. Vì vậy, cần chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin. Mỗi chồi khi ra rễ là thành một cây hoàn chỉnh. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng. Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp thì phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: - Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây…) - Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để thích nghi với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây ngoài điều kiênj tự nhiên, mở nắp bình nuôi… 4
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp - Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoat nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sánh của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng thích hợp. * Các phương pháp nhân giống in vitro Tất cả các phương pháp nhân giống in vitro đều có các ưu, nhược điểm sau: * Ưu điểm - Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng cây giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0.1-10mm. Trong khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5-20cm. - Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đựoc sẽ không bị nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài - Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng cây giống sạch virus - Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng… theo ý muốn - Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng cây giống trong một thời gian ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 36-1012/năm, như vậy không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn. - Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối của điều kiện ngoại cảnh của thời vụ. 5
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp - Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong thời gian dài ở điều kiện in vitro * Nhược điểm - Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra cí kích thước nhỏ và đôi khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn - Cây giống in vitro được cung cấp nguồn hydrat cacbon nhân tạo nên khả năng tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ của cây kém. Đồng thời cây giống in vitro được nuôi dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên đọ ẩm không khí thường bão hoà. Do đó khi trồng ra điều kiện tự nhiên cây thường bi mất cân bằng nước, gây hiện tượng cây bị héo và chết. Vì vậy trước khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện in vivo cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để cây quen dần với điều kiện bên ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh. - Cần trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao. - Những vấn đề tồn tại trong vi nhân giống + Tính bất định về mặt di truyền + Sự nhiễm mẫu + Việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy + Hiện tượng thuỷ tinh hoá 6
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp Chuyên đề 4: Vì sao có thể nuôi cấy mô phân sinh (meristem) để tạo ra cây sạch virus? Các bước và điều kiện cần thiết của một hệ thống sản xuất giống sạch bệnh? ------------- o 0 o ------------- * Tác hại của virus: Trong thế giới các loài sinh vật thì thế giới của các loài vi sinh vật vô cùng đa dạng và phức tạp mà đến nay vẫn còn rất nhiều loài mà con người vẫn chưa biết đến. Người ta thường phân vi sinh vật thành 2 loại là vi sinh vật có tác dụng tốt cho con người và vi sinh vật có hại cho con người. Trong thế giới vi sinh vật ấy thì virus là một loại rất nguy hiểm. Đối với cả con người và các loài động thực vật khác khi đã nhiễm bệnh virus thì không có một loại thuốc nào có thể chữa được, mà chỉ phụ thuộc vào khả năng đề kháng của cơ thể. Vì vậy, để đề phòng và chống lại tác hại của virus người ta đã tạo ra các loại vacxin và thuốc kháng sinh nhằm tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. Phổ tác động của virus là rất lớn. Nó không những tác động đến con người, động thực vật, thậm chí cả những loài vi sinh vật khác. Trong nông học, chúng ta quan tâm chủ yếu đến thực vật vì đây là đối tượng chủ yếu trong sản xuất nông nghiệp. Theo thống kê, có khoảng 600 loài virus trên thực vật mà con người đã biết đến, trong đó có ít nhất 80 loại có thể truyền qua hạt giống. Bệnh virus hại thực vật là một loại bệnh nguy hiểm, dễ lan truyền qua nhân giống vô tính (do tồn tại trong các mô sống), qua mô giới truyền bệnh (các loại côn trùng như rệp, bọ phấn, nhện, v.v.), qua tiếp xúc cơ giới (vết cắt, xây xát, v.v.). Tác hại của virus là vô cùng lớn. Nó ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất và phẩm chất của nông sản. Côn trùng Biểu hiện một số bệnh virus truyền bệnh 7
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp * Cơ sở lý luận của phương pháp: Virus tồn tại ở mọi cơ thể sống. Theo White (1934), Limasset & Cornuet (1950), Morel & Martin (1952): nồng độ virus ở mô phân sinh đỉnh rễ, đỉnh chồi và lá bao thứ nhất là bằng không sau đó tăng dần ở các lá xa với mô phân sinh ở phía dưới. Như vậy, có thể sử dụng mô phân sinh đỉnh để tạo ra cây sạch virus hoàn toàn từ cây đã nhiễm bệnh. Gần đây, vào năm 1987 bằng những nghiên cứu của mình, ông Meyer cho thấy phương pháp nuôi cấy meristem để loại virus là hoàn toàn đúng đắn. Sự loại virus phụ thuộc rất nhiều sự có mặt của một hay nhiều loại virus xâm nhiễm. Ví dụ có thể sử dụng đỉnh sinh trưởng với kích thước 1-2mm để loại virus chủ yếu hại khoai tây (trừ virus X đòi hỏi kích thước 0,2mm). Theo nghiên cứu của Mathews (1970) & Wang et Hu (1980) thì hoàn toàn có cơ sở khẳng định mô phân sinh đỉnh không có virus. Theo các ông có thể do các lý do sau: - Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ mô dẫn, hệ thống này không có trong mô phân sinh đỉnh. - Trong sự phân chia, các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các thông tin di truyền của virus. - Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng mô phân sinh đỉnh mạnh hơn các vùng khác trong cây. - Nồng độ auxin cao ở mô phân sinh đỉnh có thể ngăn cản quá trình sao chép virus. * Kỹ thuật làm sạch virus in vitro: - Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh: tách chính xác mô phân sinh đỉnh có kích thước
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 1,0mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với phương pháp tách ở kích thước 0,1-0,2mm. Có thể xử lý nhiệt độ cao 35-370C một thời gian dài cho cây mẹ trước khi tách mô phân sinh đỉnh (5-10 tuần). Hoặc có thể xử lý các mẫu sau khi đưa vào nuôi cấy in vitro ở nhiệt độ 39-400C trong 1-2 tuần. Ở nhiệt độ này, thường các mARN của virus sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ có độ sạch virus cao. - Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý hóa chất: Khi nuôi cấy mô phân sinh đỉnh có kích thước 0,5-1,0mm có thể kết hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kháng virus để tạo cây sạch bệnh. Các chất kháng virus như 2-thiouracil, ribavirin, vidarabin làm tăng kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản của virus. - Vi ghép: Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên gốc cây sạch và kháng bệnh trong điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch virus. Kỹ thuật này thường sử dụng với cây thân gỗ, đặc biệt họ cam chanh. Một số ứng dụng kỹ thuật làm sạch virus:  Kỹ thuật tạo củ khoai tây bằng phương pháp in vitro: Một hiện trạng sản xuất khoai tây là rất dễ bị nhiễm virus do quá trình nhân giống vô tính. Vì vậy cần tạo ra các giống khoai tây sạch bệnh virus. Đó là lý do mà ngày nay khoai tây được nhân giống bằng phương pháp in vitro khá phổ biến. Để nhân giống in vitro khoai tây cần thực hiện các bước sau đây: + Bước 1: Chọn cây giống đủ tiêu chuẩn. Cây đủ tiêu chuẩn lấy mẫu cso chiều cao 7-10cm, có từ 8-10 lá, cây phải sinh trưởng khỏe, thân mập. Thông thường nuôi cấy 8-10 cây trong bình 250ml. + Bước 2: Rót môi trường tạo củ vào các bình 250ml đã chọn. Môi trường tạo củ gồm MS và 12% saccarose. Lượng môi trường cho mỗi bình là 50-70ml. + Bước 3: Tiến hành nuôi cây giống trong điếu kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ 20-220C. + Bước 4: Sau 2 tháng cây đã hình thành củ. Lúc này tiến hành thu hoạch củ in vitrro. Như vậy, đã tạo được củ sạch bệnh virus. 9
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp Cây sau khi nuôi cấy Cây khi hình thành củ  Nhân giống in vitro hoa đồng tiền: Các bước thực hiện như sau: + Bước 1: Khử trùng mẫu. Mẫu lấy là các nụ hoa bình thường. Nụ hoa được lấy về sau đó khử trùng bằng HgCl 2 nồng độ 0,1% trong 7 phút. + Bước 2: Cắt nụ hoa thành các lát mỏng. Dùng các lát mỏng này để tạo thể tiền chồi bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo (MS, 1ppmBA, 0,2ppm Ki, 0,2pp IAA). + Bước 3: Nhân nhanh chồi mầm. Tách thể tiền chồi và nuôi cấy trong môi trường nhân tạo (MS, 1ppm Ki). + Bước 4: Tạo cây hoàn chỉnh. Sau nhân nhanh tách cây và nuôi trong môi trường nhân tạo (MS, 0,1ppm α-NAA). + Bước 5: Sau tạo cây hoàn chỉnh thì đưa cây con ra vườn thích nghi. Cây con được trồng trong giá thể (1 trấu hun + 1 mùn) và đảm bảo những điều kiện tốt nhất cho cây con phát triển. Sau đó cây con được đưa ra vườn sản xuất. Tiến hành chăm sóc bình thường. 10
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp Nụ hoa Tạo thể tiền chồi Nhân nhanh Vườn ươm Cây giống Vườn sản xuất * Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus: Sau khi đã nuôi cấy thành công cây sạch bệnh thì việc nhân nhanh và duy trì nguồn giống sạch bệnh là vô cùng quan trọng. Chính vì vậy, ở giai đoạn này việc chuẩn đoán bệnh virus tái nhiễm là không việc không thể thiếu, để từ đó phát hiện ra các cá thể nhiễm bệnh và loại ra khỏi nguồn giống. Có một số phương pháp chuẩn đoán bệnh virus như sau: - Phương pháp chuẩn đoán bằng mắt (thông qua triệu chứng bệnh): Đây là phương pháp đơn giản nhất cho phép có thể xác định bệnh virus thông qua biểu hiện của cây trồng. Phương pháp này đòi hỏi phải có kinh nghiệm quan sát và so sánh do có thể nhầm lẫn với một số loại bệnh không phải virus gây ra. Phương pháp này cũng không thể cho phép xác định chính xác loại bệnh virus đang nhiễm. 11
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp - Phương pháp chuẩn đoán bằng cây chỉ thị: Vào những năm 1940, phương pháp này được coi là phương pháp nhạy và chính xác nhất để xác định bệnh virus. Nhờ phương pháp này đã xác định được 2 virus phổ biến là X và A (Leviel 1986). Phương pháp này dựa trên những biểu hiện đặc trưng của cây chỉ thị khi nhiễm bệnh. Người ta đã tìm ra khoảng 200 cây chỉ thị chủ yếu thuộc họ cà (Solanaceae), họ rau dền (Amaranthaceae), họ rau muối (Chenopodaceae), họ đậu (Fabaceae), họ cúc (Asteraceae), trong đó họ cà chiếm ưu thế. Tuy nhiên phương pháp này vẫn bộc lộ một số nhược điểm như: + Thời gian chuẩn đoán kéo dài do phải qua một quá trình ủ bệnh mới xuất hiện triệu chứng. + Việc xuất hiện các triệu chứng đặc trưng còn phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, v.v. + Phương pháp lây nhiễm cho cây chỉ thị khá phức tạp, có loại phải truyền qua côn trùng truyền bệnh (các vecto truyền bệnh) rất phức tạp. + Tốn khá nhiều công để trồng trọt, chăm sóc cây chỉ thị, nuôi dưỡng côn trùng truyền bệnh. Cần có nhà nuôi cấy cách ly. Kinh phí đầu tư lớn. + Việc chuẩn đoán bệnh cuốn lá bằng phương pháp này khó tiến hành. + Phương pháp này chỉ sử dụng khi số lượng cá thể ít. Ví dụ như bệnh hoa lá dưa leo (Cucumic Mosaic Virus) sử dụng cây chỉ thị là cây Chenopodium quinoa. - Phương pháp huyết thanh: Phương pháp này được đánh giá là nhanh và hiệu quả. Có thể cho kết quả sau 48 giờ. Do đó chi phí cho xét nghiệm là ít. Muốn xem phản ứng huyết thanh người ta trộng lẫn huyết thanh đặc hiệu cho mỗi loại virus với dịch cây cần chuẩn đoán bệnh. Kết quả thu được kết tủa ở dạng bông hay dạng mây mờ (phản ứng kháng nguyên + kháng thể). Phương pháp này đã có nhiều cải tiến như làm sạch protein virus trước khi tiêm vào thỏ; tạo ra kháng thể đơn dòng có tính đặc hiệu rất cao đã nâng cao chất lượng của huyết thanh. - Phương pháp chuẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử: Kính hiển vi điện tử có độ phóng đại từ một đến hàng chục vạn lần, có thẻ quan sát được các sợi, thể hạt của virus. Tuy nhiên phương pháp này còn hạn chế do: + Chi phí cho thiết bị khá lớn. + Số lượng mẫu hạn chế, phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu khá phức tạp. + Không phát hiện được virus cầu do chúng khá giống cơ quan tử của tế bào. - Phương pháp chuẩn đoán bằng test ELISA (enzym linked immunosorbent assay): Test ELISA là một tiến bộ trong lĩnh vực chuẩn đoán bệnh virus hại cây trồng. Phương pháp có độ đặc hiệu cao. Chính xác, nhậy, nhanh, dễ tiến hành nên nhanh chóng trở thành phương pháp thông dụng. Test ELISA được Enguall và Permann (1971;1972) đề cập đầu tiên trong lĩnh vực nhân y. Từ năm 1986 nó được sử dụng như một test có độ nhạy rất cao để chuẩn đoán virus ở thực vật (Clark, Adams và Barbara 1976). Với khả năng phát hiện 12
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp nhạy, mọi virus nhất là virus cuốn lá hại khoai tây (nồng độ thấp), phương pháp này là tốt nhất, dễ sử dụng (Casper 1977). Nguyên lý của phương pháp vẫn dựa vào phản ứng kháng nguyên và kháng thể, nhưng kháng thể được liên kết với một enzym (enzym linked). Phức enzym – kháng thể- kháng nguyên sẽ dễ nhận biết do một phản ứng màu nhờ hính sự có mặt của emzym xúc tác. Phản ứng màu thường là sử dụng các phản ứng phân giải 4- nitrophenolphosphat bởi photphataza. Khi tách phosphat, α-nitrophenol sẽ có màu vàng. Mỗi enzym có thể xúc tác cho hàng ngàn phân tử cơ chất nên tín hiệu màu được khuếch đại rất rõ. Phản ứng test được tiến hành khi gắn trên các mặt bản thử plastic, nên có tên gọi là immunosorbent. Như vậy, trên bản thử lỗ nào có màu vàng, nơi ấy có mặt phức kháng nguyên – kháng thể - enzym, tức là có virus. Cho đến nay có thể nói test ELISA là công cụ chính trong việc chuẩn đoán bệnh virus. Bằng phương pháp ELISA có thể chuẩn đoán chính xác cả mặt định tính và định lượng. - Chuẩn đoán bằng kỹ thuật phân tích ADN: Phương pháp này cho kết quả nhanh và chính xác. Phương pháp thông dụng gọi là phương pháp PCR. Nguyên lý chung của phương pháp là xác định trực tiếp sự có mặt của phần lõi axit nucleic của virus. Phần lõi này có trình tự rất đặc hiệu tùy theo mỗi loại virus. Từ đó mà có thể là phát hiện trực tiếp qua bảng phản ứng PCR. Sử dụng các cặp mồi là các đoạn nucleotid (dài từ 10-30 nu) có trình tự bổ sung với hai đầu (phía 3’) của hai sợi đoạn ADN cần nhân. Sau thời gian cho phản ứng trên máy PCR khoảng 3 giờ có thể lấy mẫu và đánh giá kết quả. Nếu mẫu sạch virus tức là không có khuôn ADN của virus thì cặp mồi không bắt cặp, quá trình nhân ADN không xảy ra. Còn ở mẫu bệnh, sự nhân ADN diễn ra mạnh mẽ (sau 30 chu kỳ có thể nhân hàng trăn triệu đoạn ADN). Có thể nhận biết ADN qua phương pháp điện di. Từ đây cso thể kết luận mẫu có nhiễm bệnh hay không. Tuy nhiên, một số virus có cấu tạo phần axit nucleic là ARN, trong trường hợp này cần phải chuyển ARN virus sang dạng ADN (cADN) sau đó phát hiện ADN này bằng phương pháp PCR. Phương pháp này được coi là vũ khí vô cùng lợi hại của con người. Phương pháp này có thể phát hiện virus ở nồng độ rất thấp với độ chính xác rất cao. Chính vì vậy, phương pháp này đã được ứng dụng rất nhiều trong công nghệ sản xuất các giống sạch bệnh virrus hiện nay. 13
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp Chuyên đề 5: Trình bày kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro và ứng dụng của chúng trong công tác giống cây trồng? ------------- o 0 o ------------- * Khái niệm về cây đơn bội: Các cây trồng khác nhau thường có mức bội thể khác nhau. Có thể là đơn bội (n), lưỡng bội (2n), tứ bội (4n), v.v. Tuy nhiên phổ biến trong tự nhiên là lưỡng bội (2n) và tứ bội (4n). Như vậy, với các loại cây trồng này kiểu hình thể hiện ra ngoài là sự tác động tổng hợp của nhiều kiểu gen, phụ thuộc và tính trạng là lặn hay trội. Trong công tác chọn giống người chú ý nhiều tới thể đơn bội (n), bởi lẽ cây trồng ở dạng đơn bội thường rất khó tồn tại trong tự nhiên. Nó chỉ sống được trong điều kiện nhân tạo của con người. Cây đơn bội mang bộ NST (n), vì vậy để cho nó sống được người ta phải tiến hành đồng hợp tử tuyệt đối, tức là tạo ra alen hoàn toàn giống nhau. Những biểu hiện của cây đơn bội (kiểu hình) thể hiện chính xác kiểu gen mà nó đang có, kể cả các gen lặn. Đây sẽ là nguồn vật liệu di truyền vô cùng quý giá trong công tác chọn giống. * Các đường hướng tạo cây đơn bội: Cơ thể thực vật trong tự nhiên chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào đơn bội. Nếu như chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n). Tuy nhiên trong tự nhiên rất hiếm gặp các cây đơn bội, vì vậy các nhà khoa học đã tiến hành nghien cứu bằng các con đường khác nhau nhằm tạo ra cây đơn bội làm nguồn vật liệu cho công tác chọn giống. Vào năm 1924, Blakeslee và cộng sự đã chứng minh được rằng có thể thu được các dòng nhị bội thuần đồng hợp bằng cách nhị bội hóa các thể đơn bội. Đến năm 1964, hai ông Guka & Maheshwari (Ấn Độ) đã lần đầu tiên tạo thành công cây đơn bội bằng nuôi cây bao phấn cà độc dược. Tiếp sau đó với các đóng góp của Nitsch và Noieel (1973-1976) đã càng khẳng định việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy là hoàn toàn có thể thành công. Cho đến nay, đã có khoảng 170 loài cây trồng được tạo ra bằng con đường đơn bội. Việc tạo cây đơn bội có thể có nhiều hướng khác nhau: - Tạo cây đơn bội (dòng thuần) bằng con đường tự phối. Đây là một hướng có thể coi là thủ công và rất mất thời gian. Thường phải mất đến 5-7 thế hệ mới tạo được dạng đồng hợp tử. Đây cũng là một phương pháp khó thực hiện và tốn kém. - Tạo cây đơn bội bằng in vitro. Đây là phương pháp chiếm ưu thế bởi sự tiện dụng và nhanh chóng của phương pháp này. Chỉ mất 1 thế hệ để tạo ra cây đơn bội. Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua việc kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây khi nuôi cấy bao phấn, hạt phấn và gần đây, người ta còn nuôi cây kích thích các tế bào trứng (noãn chưa thụ tinh) phát triển thành cây đơn bội. Đặc biệt với cây ngô đã nhanh chóng tạo hàng loạt cây đơn bội ứng dụng trong công tác giống cây trồng. 14
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp * Khả năng ứng dụng trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống cây trồng: Cây đơn bội có thể ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau: - Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen. - Tạo đột biến ở mức đơn bội. - Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ công tác giống cây trồng. Sơ đồ các hướng ứng dụng cây đơn bội: Dòng thuần ổn định (F1, F2) Chọn giống ưu thế lai dòng đồng hợp tử tuyệt đối Nhị bội hóa số lượng NST (Tự phát, xử lý, colchicine) Cá thể đơn bội Lai với các thể đơn bội khác bằng dung hợp tế bào trần Nuôi cây tế bào trần (lai Soma) của các thể đơn bội Gây đột biến, chọn lọc in vitro Tái sinh cây Nguyên liệu khởi đầu cho chọn giống * Kỹ thuật tạo cây đơn bội: - Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn: + Nguyên lý: Nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích các hạt phấn này phát triển thành cây đơn bội. 15
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp Sự phát sinh cây đơn bội từ hạt phấn được gọi là sự sinh sản đơn tính đực (androgensis). Khi nuôi cấy hạt phấn đơn nhân in vitro có thể có 3 phương thức sinh sản đơn tính đực như sau:  Sinh sản đơn tính đực trực tiếp như ở thuốc lá, cà độc dược. Khi đó hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tạo phôi 1n, phôi này sẽ phát triển thành cơ thể 1n (cây 1n).  Sinh sản đơn tính đực gián tiếp như ở lúa, ngô. Khi đó hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tạo mô sẹo 1n, nhân nhanh thành chồi 1n, phát triển thành cây 1n.  Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp: Qua trình này diễn ra tương tự như sinh sản đơn tính đực gián tiếp, nhưng sự thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết như ở cây cà chua. + Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn: Bước 1: Chọn bao phấn. Giai đoạn phát triển của hạt phấn có vai trò quyết định trong việc tạo cây đơn bội, tốt nhất là hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào giảm nhiễm lần một. Bao phấn của những hoa đầu tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn. Bước 2: Xử lý nụ hoa. Xử lý nhiệt độ thấp cho nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để cấy sẽ kích thích sự phân chia của tiểu bào tử để tạo cây đơn bội. Chế độ xử lý lạnh phụ thuộc vào loại cây. Ví dụ: lúa Japonica xử lý ở 100C trong 2-3 tuần; lúa Indica xử lý ở 70C trong 1 tuần; thuốc lá xử ý ở 2-3 ngày. Bước 3: Chọn môi trường thích hợp. Môi trường nuôi cấy thích hợp là điều vô cùng quan trọng. Với mỗi loại cây trồng khác nhau thì lại có môi trường thích hợp khác nhau. Chẳng hạn, với họ hòa thảo cần nhiều auxin, đặc biệt 2,4 D ở nồng độ cao để khởi động sự phân chia đầu tiên (lúc mì 10-5mol 2,4 D trong 12 ngày); Cây họ cà cần ít hơn, khoảng 10-6mol. Về hàm lượng đường cũng khác nhau, ở ngô là 60- 120g saccarose/l, lúa 50-60 g saccarose/l, cây họ cà 20-40g saccarose/l, v.v. Ngoài ra một số hỗn hợp tự nhiên như dịch chiết khoai tây, nước dừa tỏ ra có tác dụng tốt trong nuôi cấy bao phấn. Còn các nguyên tố đa lượng và vi lượng ít ảnh hưởng trong nuôi cấy bao phấn. Bước 4: Chọn lọc cây đơn bội. Không phải tất cả các cây tái sinh khi nuôi cấy bao phấn đều là cây đơn bội, vì vậy để xác định cây đơn bội có thể sử dụng một số phương pháp như đếm số lượng NST, đo gián tiếp hàm lượng ADN của tế bào, trồng cây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước, khả năng sinh trưởng. + Kỹ thuật nuôi cây cấy hạt phấn: Các bước nuôi cấy hạt phấn tương tự như nuôi cấy bao phấn, tuy nhiên hạt phấn được rời khỏi bao phấn trước khi nuôi. Các hạt phấn này thước được nuôi cấy trong môi trường lỏng kèm theo chế độ lắc hay nuôi cấy trong môi trường bán lỏng. 16
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp Sơ đồ tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn: Cây đơn bội Phôi hóa Tạo callus Cây đơn bội Nuôi cây bao phấn môi trường dinh dưỡng đặc hiệu - Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh: Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay trinh nữ sinh (gynogensis). Đã có nhiều thành công trong việc nuôi cây bao phấn và hạt phấn để tạo cây đơn bội. Tuy nhiên, khi đi sâu vào nghiên cứu và thực hiện người ta thấy rằng, nuôi cấy bằng bao phấn và hạt phấn đã bộc lộ nhiều nhược điểm như tỷ lệ bạch tạng là rất cao. Đặc biệt với các loại cây như hành, củ cải đường, hướng dương, v.v. đã không cho kết quả như mong muốn. Trên cơ sở đó, vòa những năm 70 các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu giải quyết cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh và đã thu được nhiều thành tựu. Tỷ lệ tạo cây đơn bội bằng trinh nữ sinh biến động ở các loại cây khác nhau. Đối với hành, củ cải đường tỷ lệ này là 5-20%; ở lúa là 1,5-12%; ở dâu tằm là 3-6%, … Tuy nhiên kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn và phức tạp do việc tách tế bào trứng rất khó và dễ gây thương tổn. Nhằm tăng hiệu quả của quá trình này, người ta tập trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy, … 17
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp Trong các cây ngũ cốc, ở cây ngô việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tương đối đơn giản và thu được nhiều thành công hơn cả. 18
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp Chuyên đề 6. Kỹ thuật tách, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần (protoplast) ---------- o 0 ---------- a. Khái niệm tế bào trần Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào chỉ còn phần nguyên sinh chất, nhân, các cơ quan tử khác và màng sinh chất là ranh giới phân biệt bên trong và bên ngoài tế bào trần. b. Phương pháp tách tế bào trần * Nguyên tắc: - Sử dụng hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza để phân giải thành tế bào và giải phóng các tế bào trần. - Một nguyên tắc cơ bản là sau khi thành tế bào được tách ra, tế bào trần phải được phóng thích vào môi trường có áp suất thẩm thấu cao để tránh nước xâm nhập vào không bào, gây vỡ tế bào chất bằng việc bổ sung các chất gây áp suất thẩm thấu như saccarose, manitol, sorbitol, Ca2+… - Nồng độ chất áp suất thẩm thấu và thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho phù hợp với từng loại cây trồng. Đây là phương pháp dùng phổ biến và có hiệu quả cao: Có thể thu được từ 1g lá tươi có thể thu được 6÷12 triệu tế bào trần. * Các bước tiến hành - Chọn nguyên liệu: ex ivtro: mô lá non (cần phải khử trùng), in vitro: lá, mô sẹo, tế bào huyền phù. - Xử lý gây co nguyên sinh chất (CaCl2, đường monitol …0,5÷0,7M) - Xử lý hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza - Tách và làm sạch protoplast: lọc, ly tâm. - Kiểm tra khả năng sống (fluorescein diacetate) và tạo huyền phù protoplast có mật độ phù hợp (104 ÷107/ml) Ví dụ về kỹ thuật tách tế bào trần + Ở cây t h u ố c l á Nguyên liệu thực vật: lá thứ 3 từ trên xuống. Hỗn hợp enzym: cellulolaza 1% macerozyme 0,02% driselaza0,05% Thời gian ủ: 16h (ngâm qua đêm) + Ở câ y n g ô Nguyên liệu thực vật: tế bào hạt phấn. Hỗn hợp enzym: cellulolaza 2% macerozyme 0,1% pectolyaza 0,05% 19

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.