Kết quả thử nghiệm trên dòng tế bào thận của người HEK-293 của 20 bài thuốc dân gian thu thập tại tỉnh Sóc Trăng

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019<br /> <br /> <br /> KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TRÊN DÒNG TẾ BÀO THẬN<br /> CỦA NGƯỜI HEK-293 CỦA 20 BÀI THUỐC DÂN GIAN<br /> THU THẬP TẠI TỈNH SÓC TRĂNG<br /> Trịnh Thị Diệu Thường*, Ngô Thị Kim Oanh*, Khổng Lê Trường Giang**, Bùi Chí Bảo*<br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hệ thống Y học Cổ truyền (YHCT) đáp ứng<br /> nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu cho khoảng 80% dân số ở các nước đang phát triển. Ngay cả ở các nước phát<br /> triển, các sản phẩm thảo dược thô là những sản phẩm thay thế phổ biến cho thuốc tổng hợp, theo báo cáo từ<br /> Global Industry Analysts thì doanh số bán thuốc thảo dược thiên nhiên thô toàn cầu hàng năm đạt 107 tỷ đô la<br /> Mỹ vào năm 2017. Ở Việt Nam, truyền thống sử dụng thuốc thảo dược đã có lịch sử từ lâu đời, chủ trương trên<br /> cơ sở khoa học thừa kế, nghiên cứu những kinh nghiệm tốt của YHCT, kết hợp YHCT với y học hiện đại<br /> (YHHĐ) nhằm tăng cường khả năng phòng bệnh và chữa bệnh cho nhân dân đã được ghi trong Hiến pháp của<br /> nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam vào năm 1980 và năm 1992. Nhân dân ta sử dụng các thảo dược, bài<br /> thuốc YHCT phòng và trị bệnh trong cả nước nói chung và tỉnh Sóc Trăng nói riêng ngày càng phổ biến. Tuy<br /> nhiên, chúng ta chủ yếu thực hiện khảo sát độc tính cấp trên động vật qua đánh giá độc tính LD50, thực tế có rất<br /> ít các nghiên cứu thử nghiệm độc tính tế bào. Thử nghiệm độc tính tế bào giúp đánh giá tác dụng gây chết tế bào<br /> của thuốc. Từ đó, chúng ta có sơ sở để thử nghiệm tác dụng của thuốc trên người. Tế bào phôi người được chứng<br /> minh là có giá trị trong sàng lọc thuốc/ độc tính và các nghiên cứu cơ học bao gồm con đường phân tích bệnh tật,<br /> phân tích độc tính. Đồng thời nghiên cứu trên tế bào người sẽ có nguồn cung cấp không giới hạn cho một loạt các<br /> mô hình độc tính có thể bổ sung cho các mô hình động vật thông thường với các mô hình phù hợp với con người<br /> hơn. Trong các dòng tế bào phôi người thì dòng tế bào HEK – 293 thường được sử dụng hơn. Dòng tế bào này có<br /> nguồn gốc từ phôi thận của người, có ưu điểm là dễ dàng nuôi cấy, cấy chuyển, chứa kháng nguyên T lớn SV40<br /> có khả năng sao chép cao. Với mục tiêu nghiên cứu là thử nghiệm độc tính của dược liệu trên dòng tế bào HEK –<br /> 293 của 20 bài thuốc chọn lọc trên tỉnh Sóc Trăng.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Cao chiết của 20 bài thuốc chọn lọc từ 270 bài thuốc ở tỉnh Sóc<br /> Trăng. Phương pháp nghiên cứu theo MTS assay, dòng tế bào phôi thận của người HEK-293.<br /> Kết quả: Xác định nồng độ ức chế 50% IC50 trên các bài thuốc: 30, 70, 76, 81, 109, 180, 124 và 265:<br /> không xác định được xác định nồng độ ức chế 50% IC50 trên các bài thuốc: 19, 40, 80, 121, 141, 162, 229,<br /> 232, 248, 267, 270.<br /> Kết luận: Kết quả độc tính tế bào của 20 bài thuốc nghiên cứu được nhóm chia ra ba nhóm dựa vào số lượng<br /> tế bào sống sót ở nồng độ thuốc cao nhất: Nhóm không gây độc (8 bài thuốc): 30, 70, 76, 81, 109, 124, 180, 265.<br /> Nhóm gây độc ít (8 bài thuốc): 80, 141, 229, 232, 268, 270. Nhóm gây độc nhiều (4 bài thuốc): 19, 40, 121, 162,<br /> 248, 267. Khảo sát độc tính dựa trên đánh giá tế bào chết 50% thường kiểm tra những nhóm thuốc có tiềm năng<br /> tiêu diệt ung thư. Trong các nhóm thuốc khảo sát, thì chỉ có 2 bài có tính năng này là bài 267 và 268. Đó là hai<br /> bài sẽ được kiểm tra mở rộng trên mô hình ung thư vú và u nguyên bào thần kinh.<br /> Từ khóa: tế bào phôi thận của người HEK-293, độc tính tế bào, nồng độ gây chết 50% tế bào<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> *Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh **Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: ThS.BS. Ngô Thị Kim Oanh ĐT: 0964783153 Email: ntkoanh@ump.edu.vn<br /> <br /> <br /> <br /> 68 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> ABSTRACT<br /> EVALUATING THE TOXICITY OF 20 REMEDIES COLLECTED IN SOC TRANG PROVINCE<br /> IN HEK-293 CELLS<br /> Trinh Thi Dieu Thuong, Ngo Thi Kim Oanh, Khong Le Truong Giang, Bui Chi Bao<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 68 – 74<br /> Objectives: According to the statistics of the World Health Organization (WHO), the Traditional<br /> Medicine system provides the needs for primary health care for about 80% of the population in developing<br /> countries. Even in developed countries, raw herbal products are popularly used to substitute for synthetic<br /> medicine. According to a report from Global Industry Analysts, the annual global sales of natural herbal<br /> medicines reached 107 billion USD in 2017. In Vietnam, the tradition of using herbal medicines has a long<br /> history, we have based on the basis of science inheriting and studying good experiences of traditional<br /> medicine, have combined traditional medicine with western medicine to strengthen the ability to prevent<br /> and treat diseases for the people, which was recorded in the Constitution of the Socialist Republic of Vietnam<br /> in 1980 and 1992. Using herbs, traditional remedies to prevent and treat diseases of Vietnamese people in the<br /> whole country in general as well as particularly in Soc Trang province is more and more popular. However,<br /> the investigation of the acute toxicity of animals was mainly done through the assessment of LD50 toxicity.<br /> Only few studies concerning cytoxicity of medicine have been performed. Cytotoxicity test helps to assess the<br /> cell death effect of the medicine. Since then, we have a facility to test the effects of medicines on human.<br /> Human embryonic cells have been shown to be valuable in drug / toxicity screening and mechanical studies<br /> including pathways for disease analysis and toxicity analysis. At the same time, research on human cells will<br /> provide an unlimited application for a lot of toxic models that can supply more suitably for human. HEK-293<br /> cells are often used, this is a cell line originating from human embryos, with some advantages, such as:<br /> cultivate and transfer easily, and contain large T-antigen SV40 with high reproducibility. The aim of the<br /> research is to study the toxicity of herbal 20 remedies collected in Soc Trang province on HEK-293 cells.<br /> Materials and Methods: Aqueous extracts of 20 from 270 remedies in Soc Trang province. MTS assay,<br /> HEK-293 cell line.<br /> Results: IC50 values of the following remedies: 30, 70, 76, 81, 109, 180, 124, 265 were successfully<br /> determined while the IC50 values of the others: 19, 40, 80, 121, 141, 162, 229, 232, 248, 267, 270 could not be identified.<br /> Conclusion: The results of cytotoxicity of 20 formulas were divided into three groups, based on the number<br /> of cells surviving at the highest drug concentration: Non-toxic group (8 remedies): 30, 70, 76, 81, 109, 124, 180,<br /> 265. Low- toxic group (8 remedies): 80, 141, 229, 232, 268, 270. High-toxic group (4 remedies): 19, 40, 121, 162,<br /> 248, 267. Evaluating the toxicology based on 50% cell death assessment is often used for checking the groups of<br /> drugs with potential to kill cancer. In the remedies, only 2 remedies with this feature are 267 and 268. These<br /> remedies will be examined extensively on breast cancer model, and neuroblastoma.<br /> Key words: HEK-293 cell line, the cytotoxicity, IC50<br /> ĐẶTVẤNĐỀ phổ biến cho thuốc tổng hợp, theo báo cáo từ<br /> Global Industry Analysts thì doanh số bán thuốc<br /> Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới<br /> thảo dược thiên nhiên thô toàn cầu hàng năm<br /> (WHO), hệ thống Y học Cổ truyền (YHCT) đáp<br /> đạt 107 tỷ đô la Mỹ vào năm 2017(3). Ở Việt Nam,<br /> ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu cho<br /> truyền thống sử dụng thuốc thảo dược đã có lịch<br /> khoảng 80% dân số ở các nước đang phát<br /> sử từ thời cổ đại, phong kiến đến hiện đại, người<br /> triển(10). Ngay cả ở các nước phát triển, các sản<br /> Việt đã rất tự hào về truyền thống này qua câu<br /> phẩm thảo dược thô là những sản phẩm thay thế<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 69<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019<br /> <br /> nói của thiền sư Tuệ Tĩnh “Nam dược trị Nam Cho nước ngập mặt dược liệu.<br /> nhân”(5,6,9). Dù có nhiều thăng trầm theo chiều Sắc (chiết nóng) nước bằng nồi inox.<br /> dài lịch sử, nhưng nguồn tri thức các bài thuốc Thời gian nấu:<br /> Nam luôn được giữ gìn, truyền khẩu và liên tục<br /> + Loại thân rễ cứng: nấu 6 – 8 giờ (2 lần).<br /> bổ sung, đổi mới trong YHCT, mỗi địa phương<br /> + Lá, hoa, cành nhỏ: nấu 4 – 6 giờ (2 lần).<br /> vùng miền đều có những cây thuốc quý, nhiều<br /> bài thuốc hay và nhiều kinh nghiệm chữa bệnh + Hoa: nấu 2 – 3 giờ (2 lần).<br /> dân gian đặc sắc(4). Giai đoạn 2<br /> Việc sử dụng các thảo dược, bài thuốc YHCT Cô Cao Thuốc (Bảng 2):<br /> phòng và trị bệnh trong cả nước nói chung và Lọc dịch chiết bằng bông gòn qua phễu.<br /> tỉnh Sóc Trăng nói riêng ngày càng phổ biến. Cô cách thủy riêng từng dịch chiết.<br /> Tuy nhiên, chúng ta chủ yếu thực hiện khảo sát Bảng 1. Hiệu suất, độ ẩm và nồng độ thử nghiệm của<br /> độc tính cấp trên động vật qua đánh giá độc tính 20 bài thuốc<br /> LD50 và có rất ít các nghiên cứu thử nghiệm độc Bài Hiệu suất Nồng độ thử<br /> Độ ẩm (%) *<br /> tính trên tế bào. Tế bào phôi người được chứng thuốc chiết (%) nghiệm (µg/ml)<br /> minh là có giá trị trong sàng lọc thuốc/ độc tính 19 6 8 1 - 100<br /> và các nghiên cứu cơ học bao gồm con đường 30 8 8 1000 - 12000<br /> 40 8 12 1 - 100<br /> phân tích bệnh tật và độc tính phát triển. Đồng<br /> 70 6 8 1000 - 10000<br /> thời nghiên cứu trên tế bào người sẽ có nguồn 76 5 12 1000 - 10000<br /> cung cấp không giới hạn cho một loạt các mô 80 5 12 1 - 100<br /> hình độc tính có thể bổ sung cho các mô hình 81 5 11 1000 - 10000<br /> động vật thông thường và phù hợp với con 109 6 12 1000 - 10000<br /> người hơn. Trong đó thường sử dụng tế bào 121 6 8 1 - 100<br /> 124 5 7 1000 - 10000<br /> HEK-293, đây là dòng tế bào có nguồn gốc từ<br /> 141 6 10 1 - 150<br /> phôi thận của người (thận là nơi đào thải chính 162 5 13 1 - 100<br /> của người), có ưu điểm dễ nuôi cấy, cấy chuyển, 180 8 12 1000 - 12000<br /> và chứa kháng nguyên T lớn SV40 có khả năng 229 5 11 10 - 250<br /> sao chép cao. 232 6 10 10 - 200<br /> 248 7 14 1 - 100<br /> Mục tiêu nghiên cứu<br /> 265 5 10 1000 - 10000<br /> Thử nghiệm độc tính của dược liệu trên 267 5 15 1 - 100<br /> dòng tế bào thận của người HEK-293 của 20 bài 268 5 7 1 - 100<br /> thuốc tại tỉnh Sóc Trăng. 270 5 10 1 - 100<br /> <br /> ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Phương pháp tính IC50<br /> Đối tượng nghiên cứu Tương ứng với các dãy số nồng độ thử<br /> Cao chiết của 20 bài thuốc lọc từ 270 bài nghiệm ở bảng trên theo từng bài thuốc, nhóm<br /> thuốc ở tỉnh Sóc Trăng gồm các bước: nghiên cứu pha loãng ở 6 nồng độ khác nhau để<br /> thử nghiệm tìm IC50 cho từng bài thuốc.<br /> Giai đoạn 1<br /> Giai đoạn 3<br /> Chiết từng dược liệu bằng nước cất theo<br /> nguyên tắc như sau: Bảo quản cao đặc ở nhiệt độ 40C.<br /> Cân mỗi loại dược liệu khô theo tỷ lệ của Bài thuốc 19: (Lá dâu: Cỏ nhọ nồi) = 1:1.<br /> từng bài thuốc, tổng khối lượng mỗi bài thuốc Bài thuốc 30: (Cỏ nhọ nồi: Bồ công anh: Củ rẻ<br /> là 2 kg. quạt: Kim ngân hoa: Cam thảo dây) = 10:10:6:8:3.<br /> Xay thô dược liệu. Bài thuốc 40: (quả Sầu riêng: quả Măng<br /> <br /> <br /> 70 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> cụt)=1:2. SPSS 16.0, sử dụng phép kiểm phi tham số<br /> Bài thuốc 70: (Rau đắng: Khổ qua: Rau má: Wilcoxon signed rank sum test để so sánh các<br /> Mật gấu: Chó đẻ: Thù lù: Mướp gai: Cam thảo biến số giữa thời điểm. Sự khác biệt có ý nghĩa<br /> nam: Gừng) = 6:6:6:5:13:6:5:6:3. thống kê khi p