Khóa luận tốt nghiệp: Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus

Chia sẻ: Ha Thi Thuy | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:95

Thêm vào BST

Báo xấu

62
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu này tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu về begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây bệnh xoăn vàng lá trên ớt và cà chua.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus

HOC VIÊN NÔNG NGHIÊP VIÊT NAM ̣ ̣ ̣ ̣ KHOA NÔNG HOC ̣ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI “Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus ” Giảng viên hướng dẫn : TS.Hà Viết Cường Họ và tên : Ha Văn Dung ̀ ̃ Lớp : BVTVBK55 Chuyên ngành : Bao vê th ̉ ̣ ực vâṭ Hà Nội2014
LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình hoàn thành báo cáo này ngoài những nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được những sự giúp đỡ hết sức tận tình và quý báu từ nhiều tập thể và cá nhân. Trước hết tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới thầy TS. Hà Viết Cường – Giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Hoc viên nông nghiêp Viêt Nam, Phó khoa Nông h ̣ ̣ ̣ ̣ ọc và Ths. Trần Thị Như Hoa Phó giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành báo cáo. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cán bộ công nhân viên thuộc Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Hoc viên nông nghiêp Viêt ̣ ̣ ̣ ̣ Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực tập tại Trung tâm. Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy giáo, Cô giáo trong bộ môn bênh cây cũng nh ̣ ư các Thầy cô trong khoa Nông hoc, ̣ Trường Hoc viên ̣ ̣ ̣ ̣ nông nghiêp Viêt Nam đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại trường. Cuối cùng tôi xin được chân thành cảm ơn những người thân, gia đình, bạn bè đã hết lòng giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập cũng như hoàn thành báo cáo này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 31 tháng 7 năm 2014 Sinh viên Ha Văn Dung ̀ ̃
MUC LUC ̣ ̣ DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Từ viết tắt A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone ATP Adenosine triphosphate Bb Base pair CP Capsid protein CTAB Cetryl Ammonium Bromide ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid Dntp Deoxynucleoside triphosphate dsDNA Double strand DNA E.coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses IR Itergenic region Kb Kilo base LB Luria and Bertani ORF Open reading frame PCR Polymerase Chain Reaction
RCA Rolling circle ampliﬁcation RE Restriction enzyme Rep Replication protein RNA Ribonucleic acid Rnase Ribonuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphate SsDNA Singe strand DNA TAE Tris – acetate – EDTA Taq Thermus aquatic Vir Virulence region β ME Beta Mercaptoethanol
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH TÓM TẮT Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu về begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây bệnh xoăn vàng lá trên ớt và ca chua. ̀ Đánh giá đặc trưng sinh học bằng cách đánh giá tính gây bệnh thông qua Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation), đông th ̀ ơì chúng tôi tiến hành lây nhiễm PepYLCVNV thông qua môi giới truyền bệnh trung gian là bọ phấn.. Dựa trên mồi đặc hiệu và mồi chung, các phản ứng PCR đã được thực hiện trên một loạt các mẫu ớt thu tại miền Băc và mi ́ ền Trung Việt Nam nhằm phát hiện PepYLCV và begomovirrus khác. Lân đâu tiên phat hiên s ̀ ̀ ́ ̣ ự co măt cua ́ ̣ ̉ begomovirrus trên ớt tai miên Băc. ̣ ̀ ́ Chúng tôi đã tiến hành xây dựng thành công cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV, phân tích đặc trưng phân tử của của PepYLCVNV.
ĐẶT VẤN ĐỀ Giới thiệu Chi Begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họ Geminiviridae cả về số lượng loài và bệnh do chúng gây ra với cây trồng. Begomovirus (được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) là tên gọi chung chỉ các virus thuộc chi Begomovirus có phân virion (hạt virus) dạng hình cầu kép (hình chùy) và bộ gen DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb, lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn. Begomovirus có thể có bộ gen đơn (gồm một phân tử DNAA) hoặc có bộ gen kép (gồm hai phân tử DNAA và DNAB). Ở một số loại cây chỉ cần phân tử DNAA đã gây triệu chứng điển hình, còn ở một số loại cấy khác thì cần có cả phân tử DNAA và DNAB mới gây ra triệu chứng bệnh. Begomovirus gây bệnh trên các loại cây đều có các triệu chứng đặc trưng, điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus chỉ có thể được xác định dựa vào các phân tích phân tử Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa dạng quan trọng của begomovirus. Mặc dù vậy số lượng begomovirus xác định trên thực vật của Việt Nam vẫn còn ít chỉ gồm 19 loài được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó có nhiều cây dại. (Green, Tsai et al., 2001), (Ha, 2007). Trên cây họ cà, đã có 6 begomovirus được phát hiện gây bệnh xoăn vàng lá cà chua tại Việt Nam. Tuy nhiên hiện vẫn chưa có công bố nào cho thấy sự có mặt của begomovirus trên ớt. Năm 2012, một loạt các mẫu ớt biểu hiện triệu chứng bệnh virus trên ớt đã được TTNC Bệnh cây Nhiệt đới (Trường ĐHNN Hà Nội) thu thập khắp cả nước. Các phân tích phân tử từ một mẫu virus phân lập đầu tiên từ ớt thu thập tại Đà Nẵng (mẫu VNP93) đã xác định được một loài begomovirus mới và virus này được đặt tên là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV).
Các nghiên cứu sơ bộ tại TT NCBC NĐ cũng cho thấy virus này cũng nhiễm tự nhiên cả trên cây cà chua bị bệnh xoăn vang lá. Việc lần đầu tiên phát hiện được một begomovirus gây hại tự nhiên trên ớt ở Việt Nam có ý nghĩa quan trọng cả về mặt khoa học và thực tiễn vì cây cây ớt cũng như cây cà chua là các cây trồng quan trọng của Việt Nam. Do PepYLCVNV là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vẫn chưa được nghiên cứu. Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus” Mục tiêu và yêu cầu của đề tài Mục tiêu Xác định sự có mặt của PepLCVNV trên các mẫu ớt và cà chua thu thập tại miền Bắc và đánh giá tính gây bệnh của virus. Yêu cầu Điều tra bệnh cuốn lá ớt tại một số điểm trồng ớt chính thuộc Hà Nội, Hưng Yên. Thu thập mẫu bệnh trên ớt với triệu chứng cuốn lá điển hình Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu trên các mẫu ớt và cà chua thu thập trong nghiên cứu này và thu thập từ trước. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kỹ thuật agroinoculation trên cà chua, ớt và một số cây chỉ thị Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng vector bọ phấn.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tầm quan trọng của ớt va ca chua ̀ ̀ Cây ơt́ là môṭ loaị quả cuả cây cây thuôc̣ chi Capsicum cuả họ Cà (Solanaceae). Ớt có nguồn gốc từ châu Mỹ, ngày nay nó được trồng khắp nơi trên thế giới và được sử dụng làm gia vị, rau, và thuốc. Hiện nay, Ấn Đô là ̣ nươc san xu ́ ̉ ất ớt lớn nhất thế giới với khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, nơi chỉ riêng Chợ Guntur (lớn nhất châu Á) có 1 triệu bao ớt. Ở Viêt Nam, ̣ ơt la môt ́ ̀ ̣ ̣ ương xuyên co măt trong cac b gia vi th ̀ ́ ̣ ́ ưa ăn, ngoai ra ̃ ̀ ơt con co rât nhiêu công ́ ̀ ́ ́ ̀ ̣ dung nh ư: cai thiên hê tiêu hoa, giam cân, ch ̉ ̣ ̣ ́ ̉ ưa bênh ung th ̃ ̣ ư, ngưa tai biên ̀ ́ ̣ mach, tăng sức đê khang ̀ ́ . Cà chua (S.lycopersicum) có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nó được người Tây Ban Nha lan truyền tới Pilippine, Đông Nam Á và toàn bộ Châu Á, cuối cùng là Châu Âu. Cà chua là loài trái cây vườn phổ biến nhất ở Hoa Kỳ. Khoảng 150 triệu tấn cà chua đã được sản xuất ra trên Thế giới trong năm 2009. Trung Quốc là nước sản xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng một phần tư sản lượng toàn cầu, tiếp theo là Hoa Kỳ và Ấn Độ. Các khu vực chế biến tại California chiếm 90% lượng sản xuất ở Mỹ và 35% lượng sản xuất thế giới (Hartz, Miyao et al., 1997). Cung nh ̃ ư ơt, ́ ở nươc ta ca chua la môt gia vi ́ ̀ ̀ ̣ ̣ ̃ ữa ăn, bởi ca chua la môt th hay co trong môi b ́ ̀ ̀ ̣ ực rất giàu : Nước (chiêm 93 đ ́ ến 95 % ), giàu nguyên tố khoáng,và vitamine A, C, và E. Cà chua chín chứa nhiều sắc tố trong nhóm của caroténoïdes, như βcarotène cho một hoạt chất tiền ́ ́ ợi cho sưc khoe. vitamine A rât co l ́ ̉ Đặc điểm chung của Begomovirus Trong bốn chi của họ Geminiviradae, chi Begomovirus (được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) là chi quan trọng nhất, cả về số lượng loài (198 loài vào năm 2010, website ICTV) cũng như các bệnh mà chúng gây ra trên cây trồng. Tất cả các begomovirus (tên gọi chỉ các virus thuộc chi Begomovirus) đều không truyền qua hạt giống nhưng lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (Fauquet and Stanley, 2005).
Đặc điểm hình thái Đặc điểm hình thái chung của các Begomovirus đều có cấu trúc phân tử (virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1 tam giác đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt bằng 1, nối với nhau để tạo ra phân tử hình cầu đa diện kép (gemini). Do nối với nhau nên 2 hình cầu này không hoàn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein vỏ) được xắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein (pentameric capsomer). Kết quả là toàn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vị hình thái (Gafni and Yedidya, 2003), (Zhang, Cheng et al., 2001). Hình 2.1 Hình thái của begomovirus (Nguồn ảnh: www.ncbi.nlm.nih.gov) Cấu trúc genome của Begomovirus Begomovirus là virus thực vật có bộ gen DNA sợi vòng đơn có kích thước khoảng 2,6 2,8 kb. Chúng hoặc có bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử DNA gọi là DNAA và DNAB hoặc có bộ gen đơn (monopartite) tương đương DNAA (Ha, 2007)
Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNAA, DNAB của begomovirus (Nguồn ảnh: www.expasy.ch) Cấu trúc của phân tử DNAA Cấu trúc của một DNAA điển hình gồm 6 ORF (Open Reading Frame) được sắp xếp theo hai chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) có hai gen AV1 và AV2. Gen AV1(CP) mã hóa vỏ protein có chức năng chính là tạo vỏ phân tử virus, lan truyền Begomovirus qua vector, vận chuyển bộ gen virus vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gen giữa các tế bào. Gen AV2 mã hóa Protein có chức năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và tích lũy DNA của virus. Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng virus) gồm có 4 ORF: AC1, AC2, AC3, AC4. Trong đó, gen AC1 mã hóa protein tái sinh (Rep protein) có chức năng chính là cắt nối bộ gen virus trong quá trình tái sinh và tương tác với protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen AC2 (TrAP Transcriptional Activator Protein) mã hóa Protein hoạt hóa phiên mã có chức năng ức chế phản ứng phòng thủ của cây. Gen AC3 mã hóa protein tăng cường tái sinh (REn Replication Enhancer) có chức năng tương tác với prote ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen AC4 mã hóa protein có chức năng liên quan tới phổ ký chủ, phát triển triệu chứng, ức chế hoạt động câm gen của tế bào ký chủ (Ha, 2007).
Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNAA của Begomovirus (http://wcrc.confex.com) Cấu trúc của phân tử DNAB. DNAB của các Begomovirus kép chỉ chứa 2 ORF và cũng được sắp xếp theo 2 chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ chứa gen BV1, trên chiều ngược kim đồng hồ chứa gen BC1. BV1 là một protein con thoi: (NSP Nuclear shuttle protein) có chức năng chính là vận chuyển bộ gen virus vào, ra khỏi nhân tế bào, tuy vậy nó không liên quan đến việc nhập nhân của virus trong lúc xâm nhiễm, chức năng này được kiểm soát bởi CP. BC1 là một protein vận chuyển : (MP Movement protein) có chức năng vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào ký chủ. Hình 2.4: Cấu trúc phân tử DNAB của Begomovirus (Ha, Coombs et al., 2008). Đặc điểm của vùng IR Vùng IR (Intergenic region) là vùng liên gen không mã hóa, nằm giữa 2 vùng gen mã hóa ngược chiều nhau, có cả trên DNAA và DNAB. Vùng này có chứa nguồn gốc tái sinh (ori origin of replication) gồm các chuỗi lặp đảo (iteron) cần thiết cho sự nhận biết và gắn kết protein Rep và 1 cấu trúc thân thòng lọng (stemloop) có chứa chuỗi TAATATTAC giống nhau ở tất cả các
begomovirus. Vị trí T7 – C8 của chuỗi này là nơi protein Rep cắt và nối bộ gen Begomovirus trong quá trình tái sinh. Đối với begomovirus có bộ gen kép có chứa 1 chuỗi bảo thủ cao (khoảng 150 nucleotide) giữa 2 phân tử gọi là vùng chung CR (Common Region). Vùng CR có vai trò quan trọng trong quá trình tái sinh của DNAB bởi chuỗi ori nguồn gốc tái sinh nằm trên vùng này. Tuy nhiên, với số gen ít ỏi của mình, DNAB không thể tự tái sinh trong tế bào ký chủ mà cần có sự nhận biết và cắt nối của protein Rep được mã hóa trên DNAA (Ha, 2008) Phân loại các Begomovirus Begomovirus được chia làm hai nhóm chính là nhóm Tân thế giới (New world) bao gồm Châu Mỹ và nhóm Cựu thế giới (Old world) là khu vực Đông bán cầu bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á (Padidam, Stanley et al., 1999), (Rybicki, 1994) Các begomovirus của hai nhóm tân thế giới và cựu thế giới được phân biệt nhau bởi đặc điểm bộ gen. Tất cả các begomovirus ở cụm Tân thế giới đều có bộ gen kép, trong khi đó các begomovirus ở cụm Cựu thế giới có cả bộ gen đơn và kép, thêm vào đó tất cả các begomovirus của cụm Cựu thế giới có thêm một gen AV2 trên DNAA, gen này không tồn tại ở các virus của cụm Tân thế giới (Rybicki et al., 1994; Stanley et al., 2005). Begomovirus ở cụm Tân thế giới có chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong vỏ protein (CP) mã hóa bởi gen AV1, chuỗi này không có mặt ở begomovirus của cụm Cựu thế giới (Harrison and Robinson, 2005) Rybicki (1994) dự đoán rằng bọ phấn di chuyển từ Châu Á sang châu Mỹ có thể đã mang tổ tiên virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngày nay. Các virus này sau đó tiến hóa theo một hướng khác với các virus ở cụm Cựu thế giới.
Tái sinh của Begomovirus Begomovirus tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism). Cơ chế vòng lăn có thể được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào ký chủ (Gutierrez, RamirezParra et al., 2004), (Picó, Díez et al., 1996). Pha tổng hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gen có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vòng kép khi bộ gen virus được chuyển vào nhân tế bào. Như vậy sợi kép sẽ gồm một sợi virus và một sợi tương đồng virus. Pha này vẫn chưa được hiểu rõ. (2) Pha tái sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tại chuỗi bảo toàn TATATTAC. Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase của tế bào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus. Protein Rep lại tiếp tục cắt sợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới được tổng hơp) thành một sợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng. Protein Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gen virus sợi đơn mạch vòng hoàn chỉnh. Triệu chứng bệnh do Begomovirus Do virus phải dựa hoàn toàn vào vật chất của tế bào ký chủ để sinh sản, nên ở cây non và phần non của cây là nơi virus sinh sản rất mạnh. Ở các cây, tế bào già cỗi, quá trình này sẽ chậ m lại hay hầu như ngừng hẳn. Vì vậy điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ quá cao, quá thấp, độ pH của môi trường, ánh sáng, chế độ dinh dưỡng, chăm sóc cũng có ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện triệu chứng của bệnh do các begomovirus. Tuy nhiên, thông thường triệu chứng xuất hiện sau 24 tuần nhiễm bệnh và phát triển đầy đủ trong vòng 2 tháng (Pico et al., 1996). Một chất được nhiều nhà khoa học xác nhận có bản chất protein tan là interferon có thể đã được sản sinh ra ở tế bào ký chủ khi virus xâm nhập. Với nồng độ thấp khoảng một phần triệu gram đã có khả năng ức chế sinh sản của virus. Chính vì những lý do trên bệnh virus không gây được tác hại huỷ diệt ngay mà thường gây thoái hoá. Sự huỷ diệt chỉ xảy ra khi điều kiện môi trường và cây bệnh thuận lợi cho virus sinh sản và lây nhiễm, như trong các trận dịch của bệnh lúa vàng lụi ở nước ta những năm ̣ ̀ 1960. (Nguyên Thi Ha Uyên, 2012) ̃
Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới vào phía bên trong. Về sau, lá không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân; lá cuốn cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và nhỏ hẹp. Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân ngắn. Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bị rụng (Picó, Díez et al., 1996). Bệnh thường xuất hiện vào các vụ có thời tiết nóng như hè thu và xuân hè. Hình 2.5. Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua (httpwww.avrdc.org) Môi giơi truyên bênh va s ́ ̀ ̣ ̀ ự lan truyền Tất cả các begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (B. tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (persistant circulant). Bo phân ̣ ́ Bemisa tabaci Gennadius (1989) thuôc̣ họ râỳ phân ́ (Aleyrodidae), bộ canh ́ đêu ̀ (Homotera). ́ ơi co hai loai bo phân Cho đên nay trên thê gi ́ ́ ́ ̀ ̣ ́ được công nhân ̣ đo la: ́ ̀ Bemisia tabaci vàBemisia argentifolii, loaì Bemisia argentifolii được tim thây ̀ ́ ̀ ở Hoa ky, Nhât, Phap, Colombia, Israel, Ai Câp, Trung Quôc, … S nhiêu ̀ ̣ ́ ̣ ́ ự khać nhau giưa hai loai bo phân nay la B. ̃ ̀ ̣ ̣ ́ ̉ ơn, gây rôi loan ́ ̀ ̀ argentifolii ăn tap, măn đe h ́ ̣ ̣ ́ đôc tô cho cây trông. ̀ ̀ ̣ Theo Navot va công s ự (1991), bo phân ̣ ̣ ́ Bemisia tabaci hoan thanh môt ̀ ̀ ̀ ời khoang 20 – 30 ngay vong đ ̉ ̀ ở điêu kiên thich h ̀ ̣ ́ ợp. Trung binh co khoang 11 – ̀ ́ ̉ 15 lứa/năm. Bo phân phat triên manh trong điêu kiên khô va nong, m ̣ ́ ́ ̉ ̣ ̀ ̣ ̀ ́ ưa nhiêu ̀
̀ ̉ ̣ ̣ ̣ lam giam mât đô bo phân, chung th ́ ́ ương chich hut va bay vao buôi sang, buôi ̀ ́ ́ ̀ ̀ ̉ ́ ̉ ̉ ́ ́ ̣ ời bo phân nup vao măt d chiêu mat. Đê tranh anh sang măt tr ̀ ́ ́ ̣ ́ ́ ̀ ̣ ưới cua la, điêu nay ̉ ́ ̀ ̀ ̀ ợp vơi phân bô chu yêu phu h ́ ́ ̉ ́ ở khi hâu nhiêt đ ́ ̣ ̣ ới va cân nhiêt đ ̀ ̣ ̣ ới. Chưa có bằng chứng chứng minh begomovirus nhân lên trong cơ thể bọ phấn. Bọ phấn dùng vòi chọc vào mô mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch phloem. Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới tuyến nước bọt và cuối cùng vào ống nước bot. Chung hut dich ̣ ́ ́ ̣ ̉ ́ ̀ ̀ ̉ cây trong khoang 15 – 30 phut va tiêm ân trong c ơ thê chung la 824 gi ̉ ́ ̀ ờ (thơì ̉ ̀ ̣ ̣ ́ ̀ ́ ́ ̉ ̀ ̣ gian đê virus nâng cao nông đô trong bo phân) la chung co kha năng truyên bênh, ̉ khoang th ơi gian đê chung truyên ngăn nhât la 15 phut (EPPO/CABI, 1996). Th ̀ ̉ ́ ̀ ́ ́ ̀ ́ ơì ́ ̉ ̣ ́ ̀ ơn thơi gian truyên dich virus sang cây khoe va gian chich hut cua bo phân dai h ́ ̀ ̀ ̣ ̉ ̀ thơi gian tiêm ân la 21 gi ̀ ̀ ̉ ̀ ơ. Bo phân hut dich cây ̀ ̣ ́ ́ ̣ ở giai đoan sâu non va ngay sau ̣ ̀ ́ ưởng thanh chung co thê truyên nhiêm bênh virus theo hê thông va khi hoa tr ̀ ́ ́ ̉ ̀ ̃ ̣ ̣ ́ ̀ ̀ ̣ không truyên lai cho đời sau. Co thê phat hiên thây virus ́ ̉ ́ ̣ ́ ở bât ki giai đoan phat ́ ̀ ̣ ́ ̉ ̀ ̉ ̣ ́ ừ giai đoan tr triên naocua bo phân t ̣ ưng ( ́ Ghanim and Czosnek, 2000). Triêụ chưng xuât hiên trên cây con khi bi xâm nhiêm t ́ ́ ̣ ̣ ̃ ừ 2 – 5 tuân. Virus không truyên ̀ ̀ qua chưng bo phân. ́ ̣ ́ Hình 2.6. Bọ phấn Bemisia tabaci
Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng đã được xác định là do begomovirus gây ra như bệnh bệnh xoăn vàng lá (ngọn) cà chua, một bệnh được xem là bệnh virus nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới ( Moriones and NavasCastillo, 2000).Các bệnh nguy hiểm tương tự là bệnh khảm lá sắn, bệnh cuốn lá bông (Briddon, 2003). Trong đó gây thiệt hại lớn nhất là bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua. Bệnh xoăn vàng lá cà chua gây thiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng. Bệnh đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp Thế Giới, đặc biệt vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Picó, Díez et al., 1996). Phòng chống ́ ̃ ưa co loai thuôc hoa hoc nao phong tr Cho đên nay vân ch ́ ̀ ́ ́ ̣ ̀ ̀ ừ được trực tiêp ́ ̣ bênh do virus gây ra. Phòng tr ừ begomovirus chủ yếu dựa vào 2 chiến l ược chính là phòng chống vector và tạo cây kháng bệnh. Phòng chống vector: (KheyrPour, Bendahmane et al., 1991) cho biêt, trên thê ́ ́ giơi co khoang 500 loai cây la ky chu cua bo phân, chung co măt quanh năm trên ́ ́ ̉ ̀ ̀ ́ ̉ ̉ ̣ ́ ́ ́ ̣ ̀ ̣ ̀ ́ ̣ đông ruông. Đây la nguyên nhân khiên cho viêc phong tr ̀ ừ bo phân găp nhiêu kho ̣ ́ ̣ ̀ ́ khăn. (Murugan and Uthamasamy, 2001) nghiên cưu đăt bây dinh bo phân theo ́ ̣ ̃ ́ ̣ ́ ̣ ̣ ̣ doi măt đô bo phân trên canh đông bông ̃ ́ ́ ̀ ở Coimbatace (Ân Đô) cho thây: t ́ ̣ ́ ư ̀ thang 9 đên thang 3 năm sau l ́ ́ ́ ượng mưa thâp, nhiêt đô cao, c ́ ̣ ̣ ường đô anh sang ̣ ́ ́ lơn v ́ ơi âm đô trung binh tao điêu kiên cho bo phân sinh sôi nay n ́ ̉ ̣ ̀ ̣ ̀ ̣ ̣ ́ ̉ ở nhanh chong ́ ̣ ̣ ̣ nên mât đô bo phân cao, t ́ ừ thang 5 đên thang 8 m ́ ́ ́ ưa nhiêu nên mât đô bo phân ̀ ̣ ̣ ̣ ́ ́ ̉ ̉ ̣ ̣ ̣ ̉ thâp, đinh cao cua mât đô bo phân khoang thang 11 đên thang 1 năm sau. T ́ ́ ́ ́ ừ đăc̣ ̉ ́ ều kỹ thuật phòng trừ bọ phấn được áp dụng tùy điều kiện: điêm đo, nhi + Dùng giống kháng bọ phấn. + Dùng thuốc hóa học. + Trồng cây trong nhà lưới, nhà kính.
+ Dùng bẫy hấp dẫn màu vàng hoặc bề mặt phản xạ (chỉ áp dụng có hiệu quả trong điều kiện nhà lưới) . Tạo giống kháng virus: Tính kháng begomovirus có thể được tạo ra nhờ 2 cơ chế: Tính kháng từ cây và tính kháng từ tác nhân gây bệnh (PRD). Nhưng năm gân đây, cung v ̃ ̀ ̀ ơi tiên bô khoa hoc ki thuât cac nha khoa hoc ́ ́ ̣ ̣ ̃ ̣ ́ ̀ ̣ ̃ ̣ ́ ơt co kha năng chông lai s đa tao ra cac giông ́ ́ ́ ̉ ́ ̣ ự xâm nhiêm, tai tô h ̃ ́ ̉ ợp cuả virus trong tê bao cây. Trung tâm nghiên c ́ ̀ ưu va phat triên rau châu A ́ ̀ ́ ̉ ́ ̃ ̣ (AVRDC) đa lai tao ra nh ưng dong ̃ ̀ ơt co tinh khang rât cao v ́ ́ ́ ́ ́ ới bo phân ̣ ́ Bemisia tabaci cung nh ̃ ư khang bênh do begomovirus gây ra. ́ ̣ Ở nươc ta ́ ́ ự an thi nghiêm nghiên c đang co d ́ ́ ̣ ứu tinh khang bênh virus (begomovirus) ́ ́ ̣ ̉ ́ ớt co nguôn gôc t cu 34 giông ́ ̀ ́ ừ AVRDC (trung tâm rau mau thê gi ̀ ́ ới) taị ̀ ́ ươc đâu đa cho nh Đông Thap b ́ ̀ ̃ ưng kêt qua rât kha quan, đây đêu là các ̃ ́ ̉ ́ ̉ ̀ giống kháng chuyển gen dùng gen kháng từ cây. Một số begomovirus hại cà chua ̣ ́ ơi h Hiên nay co t ́ ơn 50 begomovirus phân lâp t ̣ ừ ca chua (co t ̀ ́ ừ tomato ở ̃ ược công bô trên thê gi đâu tên virus) đa đ ̀ ́ ́ ới (Fauquet, Briddon et al., 2008). Trên ̀ ́ ̣ ̣ cây ca chua, cac begomovirus tao triêu chứng giông nhau, điêm hinh la cuôn la ́ ̉ ̀ ̀ ́ ́ ̣ ̀ ́ ́ ̣ ̣ ở la non) biên vang; la nho hep; cây nhiêm (cong lai hinh thia); mep la (đăc biêt ̀ ́ ́ ̀ ́ ̉ ̣ ̉ sơm coi coc v ́ ̀ ̣ ơi ty lê đâu qua rât thâp. Danh tinh virus gây bênh chi co thê biêt ́ ̉ ̣ ̣ ̉ ́ ́ ́ ̣ ̉ ́ ̉ ́ được dựa vao cac phân tich phân t ̀ ́ ́ ử (Moriones & NavasCastillo, 2000). ̣ ̣ ̣ ́ ược xem la bênh virus quan trong nhât Tai Viêt Nam, bênh xoăn vang la đ ̀ ̀ ̣ ̣ ́ trên ca chua v ̀ ơi ti lê nhiêm bênh trên cac ruông trông ca chua th ́ ̉ ̣ ̃ ̣ ́ ̣ ̀ ̀ ương rât cao, co ̀ ́ ́ khi tơi 100%. Bênh đa đ ́ ̣ ̃ ược phat hiên thây trên ca chua t ́ ̣ ́ ̀ ừ nhưng năm 80. Môt ̃ ̣ sô nghiên c ́ ưu vê tao huyêt thanh chuân đoan, lây nhiêm nhân tao đa đ ́ ̀ ̣ ́ ̉ ́ ̃ ̣ ̃ ược thực ̣ hiên trong th ơi gian nay nh ̀ ̀ ưng ban chât th ̉ ́ ực sự cua virus vân ch ̉ ̃ ưa ro. Gân đây ̃ ̀ dựa vao cac phân tich phân t ̀ ́ ́ ử, co it nhât 3 loai begomovirus đ ́́ ́ ̀ ược phat hiên gây ́ ̣ ̣ ra bênh xoăn vang la ca chua ̀ ́ ̀ ở Viêt Nam. Loai th ̣ ̀ ứ nhât la Tomato leaf curl Viêt ́ ̀ ̣ Nam virus (ToLCVNV) được phân phâp t ̣ ừ cây ca chua bi bênh xoăn vang ngon ̀ ̣ ̣ ̀ ̣ ở miên Băc vao năm 2001 (Green et al., 2001), Loai th ̀ ́ ̀ ̀ ứ hai la Tomato yellow ̀
leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCKaV), được phân lâp ̣ đâù tiên ở tinh ̉ ̀ ược phat hiên Kanchanaburi (Thai Lan) vao năm 2002 (Green et al., 2002) va đ ́ ̀ ́ ̣ trên cây ca chua ̀ ở Viêt Nam vao năm 2005 (ma sô Genbank cua mâu Viêt Nam ̣ ̀ ̃ ́ ̉ ̃ ̣ la DQ169054, 55). Năm 2007, t ̀ ừ môt mâu ca chua bi bênh xoăn vang ngon thu ̣ ̃ ̀ ̣ ̀ ̣ ̣ ̣ ̀ ̣ ̀ ơi ToLCVV, môt loai begomovirus th thâp tai Ha Nôi, cung v ́ ̣ ̀ ứ ba cung đa đ ̃ ̃ ược ̣ Loaì nay phân lâp. ̀ được đăṭ tên la Tomato yellow leaf ̀ ̣ curl Viêt Nam virus (ToYLCKaV) (Ha et al., 2008). Trong sô 3 virus trên co 2 virus đ ̀ ́ ́ ược phân lâp ̣ ̣ xoăn vang trên mâũ cà chua gây bênh ̀ lá ở miên ̀ Băć là ToLCVNV và TYLCVNV. Một số begomovirus hai ̣ ớt ́ ̉ ̀ ́ ̣ Theo (Green and Kim, 1991) co khoang 35 loai virus khac nhau gây hai trên ơt ́ ở cac vung trông trên thê gi ́ ̀ ̀ ́ ới đa đ ̃ ược phat hiên thi co 12 loai gây hai ́ ̣ ̀ ́ ̀ ̣ trên ơt ́ ở Châu A Thai Binh D ́ ́ ̀ ương. Cho đên năm 2001 thi co đên 65 loai virus ́ ̀ ́ ́ ̀ ̃ ược phat hiên trong đo co nh khac nhau đa đ ́ ́ ̣ ́ ́ ững loai thuôc chi ̀ ̣ Begomovirus (AVRDC, 2001). ̉ Theo kêt qua nghiên c ́ ưu cua ( ́ ̉ Green and Kim, 1991), triêu ch ̣ ưng cuôn la ́ ́ ́ ớt trông ̀ ở Banthra lan truyên qua bo phân ̀ ̣ ́ Bemissia tabaci la do ̀ Chilli Leaf Curl Virus (ChiLCV) gây ra. ́ ượng cac loai virus m Sô l ́ ̀ ơi gây hai trên ́ ̣ ớt ngot va ̣ ̀ơt cay ngay cang đ ́ ̀ ̀ ược ́ ̣ . Đa co h phat hiên ̃ ́ ơn 9 loai virus thuôc chi ̀ ̣ ̣ begomovirus gây hai trên cac cây ́ ̀ ́ ở Trung Quôc va Đai Loan trông khac ́ ̀ ̀ Ở nươc ta, ́ tại miền Bắc, Nguyễn Thị Thu Ngọc (2009) đã phát hiện được sự có mặt của begomovirus cụ thể là 2 virus Tomato yellow leaf curl virus (TYLCVNV) và Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) trên ớt. Tuy nhiên hiện tại ở Việt Nam lại chưa có nhiều nghiên cứu về xác định thành phần bệnh virus hại ớt nói chung và Begomovirus hại ớt nói riêng. Trên ớt triệu chứng do begomovirus gây ra gồm có: biến vàng, cuốn lá, khảm lá,...Triệu chứng của Pepper leaf curl virus gây ra: gây hại là non, lá biến dạng, bị cuốn mép.
Kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR Giới thiệu: PCR là một trong các phát minh quan trọng nhất của thế kỷ 20 trong sinh học phân tử. PCR là kỹ thuật đơn giản nhưng được sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu CNSH (Hà Viết Cường, 2010), đặc biệt là trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh virus. Ngoài các kỹ thuật chẩn đoán thông thường bằng mắt, chỉ thị, kháng nguyên kháng thể thì PCR là kỹ thuật chẩn đoán cho kết quả chính xác và hiệu quả nhất. Trên thực tế những loài tác nhân gây bệnh trong cùng 1 chi hay 1 họ sẽ gây ra những triệu chứng tương tự nhau, khó phân biệt. PCR giúp phân biệt chính xác đến loài nhờ vào mồi đặc hiệu, được thiết kế trên vùng bảo thủ của gen. Nguyên lý: PCR là phản ứng sinh tổng hợp DNA, gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Biến tính: Hỗn hợp phản ứng được dặt ở nhiệt độ cao (92940C) trong khoảng thời gian ngắn (2060 giây). Ở nhiệt độ này, khuôn DNA dạng sợi kép tách thành sợi đơn. Gắn mồi: Hỗn hợp phản ứng được đặt ở nhiệt độ gắn mồi trong thời gian ngắn (35 giây). Nhiệt độ gắn mồi được tính toán tùy thuộc đặc điểm mồi, thường trong khoảng 40600C, ở nhiệt độ này mồi được gắn vào sợi khuôn ở vị trí đặc hiệu. Tổng hợp sản phẩm PCR: hỗn hợp phản ứng được tăng tới nhiệt độ tối ưu cho phản ứng tổng hợp chuỗi, tùy thuộc DNA polymerase chịu nhiệt. Kỹ thuật RCA (Rolling circle amplication) Gần đây, một phương pháp nhân bản DNA mới dùng kỹ thuật RCA (Rolling Circle Amplification) đã được sử dụng để nhân các bộ gen DNA dạng mạch vòng. Kỹ thuật RCA dùng enzyme DNA polymerase của thực khuẩn thể Φ29, một enzyme có hoạt tính chuyển mạch (stranddisplacement) rất cao, và mồi hexamer để nhân các phân tử DNA mạch vòng thành các multimer mạch thẳng (gồm nhiều bộ gen virus liên tiếp) (Hình 2.10) Sản phẩm RCA sẽ được