KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)

Chia sẻ: Nguyen Uyen | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:30

Thêm vào BST

Báo xấu

236
lượt xem 77
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kỹ thuật PCR (viết tắt từ chữ Polymerase Chain Reaction), hay còn gọi là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase hoặc phản ứng chuỗi tổng hợp ADN, do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Kỹ thuật PCR đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền phân tử, khuếch đại in vitro có chọn lọc bằng tạo dòng in vitro mà không cần sự hiện diện của tế bào, khắc phục được nhược điểm thao tác phức tạp và cần thời gian dài của kỹ thuật tạo dòng in vivo. Nhờ phản ứng PCR,...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)

KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)
KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) I. MỞ ĐẦU:  Kỹ thuật PCR (viết tắt từ chữ Polymerase Chain Reaction), hay còn gọi là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase hoặc phản ứng chuỗi tổng hợp ADN, do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Kỹ th uật PCR đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền phân tử, khuếch đại in vitro có chọn lọc bằng tạo dòng in vitro mà không cần sự hiện diện của tế b ào, khắc phục được nhược điểm thao tác phức tạp và cần thời gian dài của kỹ thuật tạo dòng in vivo. Nhờ phản ứng PCR, một đoạn ADN ở một vùng bất kỳ trong bộ gien đ ược khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn đó đ ã biết. II. NGUYÊN TẮC CƠ BẢN:  Kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép ADN. ADN polymerase dùng các đoạn ADN mạch đ ơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với sợi n ày. Các sợi ADN khuôn mạch đơn có thể tạo ra theo cách đơn giản là đun nóng dung d ịch ADN mạch kép đến gần nhiệt độ sôi.  ADN polymerase cũng đòi hỏi phải có một đoạn ngắn ADN mạch đơn (đoạn mồi) để khởi đầu quá trình tổng hợp. Do đó, để khởi đầu quá trình tổng hợp cần cung
cấp đoạn mồi oligonucleotid (có độ dài từ 6 đến 30 nucleotid), đoạn này gắn bổ sung vào ADN khuôn tại điểm khởi đầu sao chép.  Cả hai sợi ADN đều được dùng đ ể làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi oligonucleotid được cung cấp cho cả hai sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn để chặn hai đầu của đoạn ADN cần nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới đ ược bắt đầu từ mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia (Hình 1c). Như vậy, sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi ADN mới được tổng hợp.
5' 3' a) Vật liệu khởi đầu là phân tử ADN m ạch kép 3' 5' Các đoạn mồi b) Các sợi tách nhau ra khi gia nhiệt 94oC, sau đó h ạ xuống 30-65oC, 5' 3' trong 30 giây để các đoạn mồi gắn vào hai vị trí tương hợp trên ADN 3' 5' c) Taq polymerase tổng hợp các sợi 5' 3' ADN mới tương hợp với sợi khuôn, bắt đầu từ đoạn mồi kéo dài về phía đoạn mồi nằm b ên sợi kia. 3' 5' d) Hỗn hợp phản ứng lại được gia nhiệt. Sợi ban đầu và sợi mới tổng hợp tách nhau ra. Trên hai 3' 5' sợi mới tổng hợp xuất hiện 2 điểm bám cho các đoạn mồi gắn vào. 5' 3' e) Taq polymerase tổng hợp các sợi ADN tương hợp mới, nhưng các chuỗi mới lần này ch ỉ tiến đến đúng vị trí đã được xác định bởi các cặp đoạn mồi đã lựa chọn. f) Quá trình được lặp lại, các đoạn mồi tiếp tục gắn vào các sợi mới tổng hợp. 5' 3' g) Taq polymerase tổng hợp các đoạn tương hợp sinh ra hai đoạn ADN mạch kép giống hệt đoạn 5' 3' cần tổng hợp. Quá trình cứ thế tiếp tục. 3' ác C đoạn mong muốn 5' 5' 3' H ình 1. Sơ đồ nguyên lý phản ứng chuỗi 3' 5' … và cứ thế tiếp tục trùng hợp PCR. (Để đơn giản hóa sơ đồ, từ phần (d) không vẽ hai sợi ADN khuôn ban đầu)
 Hỗn hợp phản ứng lại được đun nóng lên để tách sợi ban đầu khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đó lại đ ược dùng tiếp cho chu trình tiếp theo, bao gồm các bư ớc gắn đoạn mồi, tổng hợp ADN và tách rời các đoạn. Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết ta sẽ có 2n-2 bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đo ạn mồi (Bảng1). Bảng 1. Hiệu quả nhân ADN của kỹ thuật PCR Số chu kỳ Số phân tử ADN Số chu kỳ Số phân tử ADN (n) mạch kép sinh ra (n) mạch kép sinh ra 1 0 17 32.768 2 0 18 65.536 3 2 19 131.072 4 4 20 262.144 5 8 21 524.288 6 16 22 1.048.567 7 32 23 2.097.152 8 64 24 4.194.304 9 128 25 8.388.608 10 256 26 16.777.216 11 512 27 33.544.432 12 1 .024 28 67.108.864 13 2 .048 29 134.217.728
14 4 .096 30 268.435.456 15 8 .192 31 536.870.912 16 19.384 32 1.073.741.824 III. CÁCH TIẾN H ÀNH MỘT PH ẢN ỨNG DÂY CHUYỀN TỔNG HỢP ADN:  PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm tương đối dễ làm, rất đa năng và phổ ứng dụng hết sức rộng rãi.  Vật liệu gồm trước hết là ADN có chứa đoạn cần nhân lên. Không cần thiết phải tách riêng đo ạn cần nhân lên vì việc đó đã được các đoạn mồi dùng trong phản ứng xác định. Hàm lượng ADN cần cho phản ứng rất nhỏ. Trong các thí nghiệm b ình thường ở phòng thí nghiệm chỉ cần một microgram ADN hệ gien (chromosome) là đủ. Trong nhiều trường hợp, phản ứng PCR có thể nhân các đoạn ADN chỉ từ một phân tử riêng lẻ. Hai đoạn mồi để xác định điểm bắt đầu tổng hợp ADN, ADN polymerase, và hỗn hợp của tất cả bốn tiền chất deoxynucleotid (ở dạng dNTP) và dung d ịch đệm có ion Mg2+ cần được đưa vào ống nghiệm có chứa ADN khuôn. Dung tích tổng số thường là 50 ml hoặc 20 ml. Hỗn hợp phản ứng được cho vào ống nhựa nhỏ chịu nhiệt, có nắp đậy. Bước 1: làm nóng hỗn hợp phản ứng đến khoảng 94oC. Tại nhiệt độ này,  các phân tử ADN mạch kép tách nhau ra ho àn toàn, tạo nên các sợi đơn để dùng làm khuôn cho các đoạn mồi và ADN polymerase. Bước 2 : nhiệt độ được hạ xuống 30 – 65 oC để các đoạn mồi (số lượng rất  lớn) gắn với các trình tự bổ sung trên các phân tử ADN khuôn (do số lượng mồi
lớn nên liên kết giữa mồi và ADN khuôn xảy ra chủ yếu so với liên kết phục hồi giữa hai sợi đơn). Nhiệt độ gắn kết này góp phần quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Nhiệt độ và khoảng thời gian dùng ở đây thay đổi tùy thuộc vào chiều dài của đoạn ADN cần nhân lên (từ 30 – 70 oC). Các điều kiện này sẽ tạo ra khuôn được mồi để cho ADN polymerase hoạt động. Bước 3: nhiệt độ đ ược nâng lên 72oC trong kho ảng 5 phút để ADN được  tổng hợp. Hỗn hợp ADN và m ồi đư ợc ủ với enzyme Taq polymerase và bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Vào cuối giai đoạn này, nhiệt độ một lần nữa được nâng lên 94oC, nhưng lần này ch ỉ trong vòng 30 giây để cho các mẩu ngắn của ADN mạch kép (cả sợi ban đầu và sợi mới đ ược tổng hợp) tách nhau ra. Các sợi đơn này trở thành khuôn cho một chu kỳ tổng hợp ADN khác. Tóm lại, một chu kỳ gồm: đun nóng để tách các sợi ADN kép thành sợi đ ơn đ ể làm khuôn, gắn kết các đoạn mồi vào sợi khuôn, và tổng hợp ADN bằng ADN polymerase, được lặp lại từ 30 đến 60 lần (Hình 1). IV. CÁC THÀNH PHẦN PHẢN ỨNG: Một phản ứng PCR có thể gồm các thành ph ần hay các vật liệu ban đầu: mạch khuôn cho sự khuếch đại, các đoạn mồi oligonucleotide, dNTP, và ADN polymerase chịu nhiệt với dung dịch đệm phản ứng thích hợp và MgCl2. Nồng độ của mỗi thành phần này tùy yêu cầu. Trừ ADN khuôn và các đoạn mồi, các thành phần cho PCR đều có sẵn từ các nh à cung cấp.
1. Các polymerase chịu nhiệt:  Enzyme ADN polymerase được sử dụng đầu tiên trong PCR là đoạn Klenow của ADN polymerase I. Đặc tính của đoạn n ày là xúc tác sự tổng hợp ADN theo chiều 5’- 3’ và có ho ạt tính exonuclease (thủy giải dần liên kết giữa các nucleotide từ đầu phân tử ADN) theo chiều 3’-5’. Tuy nhiên enzyme này không chịu đ ược nhiệt n ên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải th êm enzyme mới vào ph ản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân hủy, nhiệt độ lai thấp khiến sự khuếch đại không đặc hiệu vv…).  Hiện nay th ường dùng ADN polymerase là Taq polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ một loài vi khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus. Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng.  Taq polymerase có sẵn trên thị trường từ các công ty hàng đầu về công nghệ sinh học. Các polymerase chịu nhiệt khác có trên thị trường bao gồm Vent polymerase được phân lập từ Thermococcus litoralis, nó sẽ cho nhiều bản sao chính xác từ mạch khuôn hơn là Taq polymerase. Ngoài ra còn có Tth polymerase được phân lập từ Thermus thermophilus. Các polymerase chịu nhiệt là thành ph ần đắt nhất của PCR và thường được sử dụng ở nồng độ là 1 đơn vị cho một phản ứng. Nồng độ này đủ để xúc tác cho sự khuếch đại khoảng 40 chu kỳ bằng máy PCR.  Trước đây, việc lựa chọn polymerase chịu nhiệt cho một thử nghiệm thì không mấy khó khăn vì chỉ có một loại ADN polymerase chịu nhiệt (Taq). Hiện nay có nhiều loại polymerase có nguồn gốc khác nhau, nhiều bản sao của các polymerase này được
biến đổi di truyền và chúng có thể ưu việt hơn polymerase gốc trong phạm vi một vài ứng dụng (Bảng 2). Sự chọn lựa một polymerase chịu nhiệt cho một thử nghiệm PCR phụ thuộc vào yêu cầu của từng thử nghiệm.
Cation cần3 ’5’ Enzyme Nguồn gốc Mức ổn Hoạt Nơi ở thiết Exonuclease định ở động 95oC tối ưu (t1/2) Suối Thermus 40 phút 50 -75 MgCl2 - Tag nước aquaticus nóng AmpliTaq Tag tái tổ hợp 40 phút 50 -75 MgCl2 - AmpliTaq Am pliTag minus 80 phút 75 -80 MgCl2 - 289 Stoffel N-terminal aa Suối Tái tổ hợp Thermus 20 phút 55 -75 MnCl2 - nước thermophilus (RT), nóng MgCl2 (PCR) Biển Thermotoga + Ultima maritima sâu gió nóng Biển Thermococcus >95% 80 MgSO4 + Vent sâu gió hoạt động litoralis nóng sau 1 h Vent tái tổ hợp MgSO4 - Vent (Exo-) sp. Biển Deep Vent Pyrococcus >95% 72 -80 MgSO4 + sâu gió hoạt động Strain GB-D nóng sau 1 h Biển P yrococcus >95% 75 MgCl2 + Pfu
Bảng 2: Các loại ADN polymerase thông thường 2. ADN khuôn mẫu:  Phản ứng PCR cực nhạy, có thể chỉ cần dùng một phân tử ADN làm khuôn cũng thu được sản phẩm. Tuy nhiên, mức độ nhạy cảm cao là nguyên nhân chính gây ra sự dương tính giả do các ADN ngoại nhiễm.  Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên ADN th ật tinh khi ết nhưng nhiều kỹ thu ật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với ADN thu nhận trực tiếp từ dịch chiết mẫu thử (vết máu, vật liệu lưu trữ, ADN cũ và ngay cả vi khuẩn đã tiệt trùng). Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp khác, các quá trình chu ẩn bị mẫu phải được thực hiện để đảm bảo cho việc khuếch đại, vì các ch ất ức chế như heparin, EDTA, hay các acid có thể hiện diện trong mẫu.  Mạch ADN khuôn mẫu cũng có thể ảnh hưởng đến phản ứng chuỗi. Nếu ADN này có ch ứa nhiều GC thì sẽ khó khăn cho việc tách rời các chuỗi ADN ở nhiệt độ cao. Trong các trường hợp này, việc thêm formamide hay dimethyl sulfoxide (DMSO) vào hỗn hợp phản ứng có thể giải quyết được vấn đề.  Nồng độ của ADN khuôn mẫu trong PCR sẽ ảnh hưởng đến mức độ khuếch đại. Với việc sử dụng các polymerse cho hiệu quả cao, lượng ADN mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1 microgram còn 100 nanogram). Mặc dù, các khuôn m ẫu đ ơn được khuếch đại nhưng không phải mọi thí nghiệm đều đạt được sự nhạy cảm này. Do đó, nên thiết lập P CR với lượng ADN khuôn mẫu thích hợp. Lượng khuôn mẫu ADN dư thừa có thể ảnh hư ởng xấu đến quá trình khu ếch đại. Nếu lượng ADN khuôn mẫu quá cao thì sẽ có khuynh hướng tạo ra lượng lớn các sản phẩm được kéo d ài từ đoạn
mồi. Sự giới hạn đoạn mồi, sự có mặt của các chất ức chế và quá trình ủ lặp lại không thích h ợp cũng có thể làm giảm sự khuếch đại.  ADN khuôn có thể là bộ gien tách ra từ tế bào, ADN từ các ngân hàng genome hoặc cADN (chỉ cần nồng độ dư ới ng), các ADN bất kỳ, ARN tổng số hoặc ARNm. 3. Các đoạn mồi: Các đo ạn mồi là thành phần quyết định sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao của PCR. Việc chọn đoạn mồi phải tuân thủ một số nguyên tắc:  Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa các mồi tạo cấu trúc bậc hai hay dimer giữa các nucleotide ngay trong một mồi của các đoạn mồi làm cho phản ứng giảm hiệu quả và ngăn cản sự tạo thành đoạn mong muốn.  Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gien.  Kích thước một đoạn mồi tối ưu từ 18-25 nucleotide. Đoạn mồi với kích thư ớc này đ ảm bảo cho việc gắn chuyên biệt ở nhiệt độ tối ưu và giá thành cho một đoạn mồi được giảm thiểu.  Khoảng cách giữa hai mồi không dài quá 3 kb. Phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb.  Tỷ lệ GC ở các mồi thường chiếm khoảng 40-75%. Trong thành phần các đoạn mồi tránh có quá nhiều cặp GC hay là m ột loạt các nucleotid G và C. Vì liên kết G:C mạnh hơn liên kết A:T (G nối với C bằng 3 liên kết hydro còn A với C chỉ có 2). Do vậy, việc bẻ gãy liên kết giữa G:C cần nhiều năng lượng hơn liên kết A:T. Người ta
tính nhiệt độ tối ưu sẽ hữu ích cho việc ủ các đoạn mồi trong PCR. Nhiệt độ n ày gọi là Tm –5 oC là nhiệt độ “chảy” của đoạn mồi trừ đi 5. Kết quả này có từ phép tính đ ơn giản : Tm = 2 oC x(A+T) + 4 oC x(G+C) Nhiệt độ ủ = Tm –5oC  Các đoạn mồi được tổng hợp hóa học trên một chất tải rắn trong máy tổng hợp oligonucleotide. Các máy này được tự động hoá cao, dễ dàng tổng hợp ra các đoạn mồi. Có nhiều qui tắc để thiết kế đoạn mồi và đ ã có một số phần mềm cho sự chọn lựa một cặp đoạn mồi tối ưu cho sự khuếch đại của một ADN khuôn mẫu có trình tự đã biết. Nồng độ mồi khoảng 0,1 mM đến 1 mM. Nồng độ thư ờng được xác định dựa vào giá trị OD (optical density) đo ở 260 nm. 4. Nồng độ Magnesium chloride:  Nồng độ MgCl2 ảnh hưởng đến sự thành công của phản ứng, nếu không có mặt Mg++ thì sự khuếch đại sẽ không xảy ra. MgCl2 cần cho hoạt động của ADN polymerase khi ủ ADN với các đoạn mồi và nó có một mối tương quan với nucleotid triphosphat. Nồng độ MgCl2 tối ưu cho PCR phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thực nghiệm. Có thể dùng phương pháp định phân bằng cách thiết lập một phản ứng với các nồng độ MgCl2 khác nhau từ 1 mM đến 5 mM và xác định nồng độ MgCl2 tối ưu cho m ẫu mong muốn.
5. Nồng độ nucleotid triphosphat (dNTPs)  Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20-200 mM/ mỗi loại nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong thành ph ần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. V. CHU KỲ NHIỆT PCR:  Sự khuếch đại PCR đạt được bằng các chu kỳ đư ợc lặp đi lặp lại. Mỗi chu kỳ gồm sự biến tính bằng cách nâng nhiệt độ, ủ bằng cách hạ nhiệt độ và sự kéo d ài. Một chu kỳ điển hình cho việc khuếch đại đoạn ADN gồm 500 cặp base sẽ là biến tính ở 95oC trong 60 giây, ủ ở 50oC trong 60 giây và 72 oC trong 60 giây. Mỗi PCR được thiết kế và được tối ưu hóa khác nhau và tùy thuộc một số các yếu tố :  Kích thước của đoạn được khuếch đại. Các sản phẩm khuếch đại lớn h ơn có th ể cần giai đoạn biến tính và kéo dài lâu hơn. Các đo ạn ngắn h ơn cần ít thời gian hơn ở giai đo ạn kéo d ài.  Trình tự của các đoạn mồi và các điều kiện về ion sẽ quyết định nhiệt độ ủ tốt nhất cho một chu kỳ. Vì vậy, dựa vào các phản ứng đã được thực hiện, nhiệt độ ủ có thể thay đổi từ 37oC đến 65oC. VI. ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR: Việc ứng dụng rộng rãi kỹ thuật PCR có nhiều lý do:  Rất nhanh chóng. Chỉ tốn khoảng 3 giờ là có th ể khuếch đại một trình tự mong muốn đã biết so với các kỹ thuật công nghệ di truyền “cổ điển” phải mất một tuần hay hơn nữa.
 Đơn giản: PCR có thể đ ược thực hiện trong một ống nhỏ với các th ành ph ần tối thiểu và chỉ việc trộn chúng lại với nhau. Các phương pháp tạo dòng gien điển hình khác cần có các vật liệu mắc tiền như các màng và các nucleotide triphosphate được đánh d ấu phóng xạ và các k ỹ thuật đặc biệt. PCR có thể được thực hiện trên các mẫu có ch ứa ADN tương đối thô, ví dụ vết máu chưa được xử lý cho việc phân tích pháp y. Điều n ày ngư ợc với các phương pháp về thao tác gien là cần phải có ADN cả khuôn mẫu lẫn vector tương đối tinh khiết. Các yếu tố trên cho th ấy rằng PCR là một sự thay đổi đáng kể so với các phương pháp cổ điển cho việc khuếch đại các trình tự đặc biệt.  Nh ạy: Phản ứng PCR cực nhạy vì có thể chỉ cần dùng một phân tử ADN làm khuôn cũng thu được sản phẩm. Tuy nhiên, cần phải nhấn mạnh rằng các ứng dụng rộng rãi của kỹ thuật PCR đòi hỏi phải biết rõ trình tự ADN khuôn mẫu. Đây là một điểm giới hạn của kỹ thuật này, nghĩa là nó vẫn phải dựa vào nền tảng của các kỹ thuật công nghệ di truyền chứ không hẳn là thay thế các kỹ thuật n ày. Do vậy người ta không sử dụng kỹ thuật này trong các kỹ thuật tạo dòng gien thiết kế. Trong một vài trường hợp phương pháp PCR không áp dụng được với các đoạn ADN kích thước lớn h ơn 3 kb (thư ờng
PCR ngược (Reverse-PCR), RAPD-PCR vv… nhưng tất cả đều dựa trên nguyên tắc của phản ứng PCR. 1. PCR “tổ”:  Để đạt được mức độ nhạy cảm cao trong PCR, người ta có thể thực hiện 2 PCR liên tiếp. Trên một điện di đồ, các đoạn đạt được sau PCR thứ nhất, người ta quan sát được một vệt chính, nhưng cũng kèm theo các vệt nhỏ khác. Điều n ày là do các mồi có thể bắt cặp với vùng khác của ADN đích bởi sự lai hóa không đặc hiệu .  PCR thứ 2 được thực hiện với các mồi giống nhau, khuếch đại các sản phẩm tạo thành của PCR thứ nhất. PCR “tổ” có độ đặc hiệu cao: trong kỹ thuật này, sử dụng 2 cặp mồi khác nhau.  Cặp mồi ngoại: Cặp mồi này tạo ra các đoạn ADN được khuếch đại giống với PCR cổ điển. Chúng đặc hiệu cho 2 trình tự mút của ADN cần khuếch đại. Các đoạn ADN thu được (ví dụ đoạn thu được có khoảng 258 cặp base) làm khuôn mẫu cho PCR thứ 2.  Cặp mồi nội: Cặp mồi này bổ sung với vùng nằm bên trong chuỗi nucleotide thu được với cặp mồi thứ nhất (theo ví dụ trên, sẽ cho các đoạn khoảng 211 cặp bases). Thu ật ngữ “PCR tổ” là vì các đo ạn mồi được tổ, đóng hộp trong lần PCR đầu.  Kỹ thuật này có độ nhạy và độ chuyên biệt cao. Người ta dùng kỹ thuật n ày để phát hiện virus gây bệnh viêm gan C, một loại virus có vật liệu di truyền là ARN. ARN virus không thể được phát hiện bằng sự lai hóa trực tiếp, một sự khuếch đại phải được thực hiện. Cần phải chuyển tất cả ARN virus thành cADN, đây chính là bư ớc sao
mã ngư ợc nhờ sự khuếch đại của cADN bằng k ỹ thuật PCR “tổ”. Trong PCR thứ 2, một mồi được biotin hóa, một mồi được gắn với iod 125. Các đoạn thu đư ợc sẽ được gắn trên một giá mang avidin (avidin là một chất có ái lực mạnh đối với biotin), và cuối cùng người ta đo hoạt tính phóng xạ để kết luận mẫu là dương tính hay âm tính (hình 2).  PCR “tổ” có độ nhạy cao hơn PCR tiêu chuẩn là do lặp lại sự khuếch đại sản phẩm từ một PCR thứ 1 với một PCR thứ 2. Tuy nhiên vấn đề ngoại nhiễm cũng là vấn đề hạn chế của nó. 2 ADN “nhánh”:  Nguyên tắc: ADN đích được khuếch đại bằng PCR, sau đó cho lai với đoạn dò (là một phần đặc hiệu của ADN này), tín hiệu được lai hóa đặc hiệu với đoạn dò theo cùng cách thức của ADN đích có gắn (chất huỳnh quang, chất dạ quang hay chất màu), tín hiệu sẽ được tạo ra nhờ chất đánh dấu hiện diện sau cùng ở m áy khuếch đại. Máy khuếch đại chính là một ADN tổng hợp cài lược. Sự tổng hợp của ADN cài lược được thực hiện bằng kỹ thuật với phosphoramide, sử dụng phosphoramide gắn cytosin đặc biệt gồm có nhánh carbon gắn trên –NH2, tận cùng nhánh này có ch ức rượu alcol bậc 1. PCR “nhánh” có độ đặc hiệu cao.  Kỹ thuật ADN “nhánh” được dùng để phát hiện ADN của virus gây bệnh viêm gan B. Trong k ỹ thuật này sử dụng 5 đoạn dò. Một đoạn dò thành phần là một trình tự cho phép sự lai hóa cùng một lúc trên 2 đoạn đích khác nhau (Hình 3).
d Khueáh ñaï c i C B A ADN ñích a H ình 3 Kỹ thuật ADN “nhánh” sử dụng 5 đoạn dò 3. Kỹ thuật PCR đa thành phần:  Trong kỹ thuật này, 2 hay nhiều ADN đích được khuếch đại đồng thời. PCR đa thành phần có thể được sử dụng thường xuyên trong các xét nghiệm chẩn đoán, sử dụng 2 bộ mồi khác nhau: bộ thứ nhất để xác định sự đồng nhất của PCR và bộ thứ hai nhắm vào các trình tự ADN dư thừa. PCR đa th ành ph ần cũng có thể được sử dụng trong phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng với cùng đoạn dò cho một mẫu xét nghiệm cho vài sinh vật khác nhau trong một ống PCR.  Khi tiến hành PCR đa thành phần cần phải xem xét một số yếu tố trong thiết kế đoạn mồi. Các mồi phải có nhiệt độ lai tương tự nhau. Sự khác biệt 10oC trong nhiệt độ lai giữa các bộ mồi có thể làm cho các sản phẩm khuếch đại rất khác nhau hay tạo sự khuếch đại không thể phát hiện được của sản phẩm này hay sản phẩm khác. Các đoạn mồi được sử dụng cũng đư ợc thiết kế sao cho các sản phẩm khác nhau đủ về kích thước để mỗi sản phẩm có th ể đ ược xác định nhưng không quá khác nhau đ ể cho sự khuếch đại của một ADN đích đư ợc ưu tiên hơn so với sự khuếch đại của ADN đích
khác. PCR đa thành phần có các ADN đích khác nhau nhiều về kích thước thư ờng ưu tiên khu ếch đại các ADN đích ngắn trước các ADN đích dài, kết quả là có sự khác nhau về số lư ợng các sản phẩm được khuếch đại. Tuy nhiên, sự thay đổi đáng kể về nhiệt độ lai hay chiều dài ADN đích là không thể tránh khỏi. Người ta có thể điều ch ỉnh qui trình thực hiện để làm cân bằng phản ứng và đạt được số lượng sản phẩm tương đương nhau hoặc điều chỉnh nồng độ mồi cân bằng với một phản ứng đa thành phần. 4. PCR của ARN:  Khi ARN của retrovirus được ly trích và được chuyển đổi th ành cADN bởi enzyme sao mã ngược reverse transcriptase, người ta đ ã thành công trong việc tiến hành PCR để phát hiện ARN đích. cADN mới được dùng làm khuôn mẫu cho PCR. Tuy nhiên, các phản ứng nhờ men reverse transcriptase khó thực hiện và việc sử dụng các enzyme không chịu được nhiệt trên 42oC là m ột bất lợi vì xảy ra sự lai không nghiêm ngặt. Vì vậy, sự phiên mã ngư ợc kém hiệu quả là một trở ngại làm cho sự phát hiện các ARN đích kém nhạy và kém đ ặc hiệu.  Một loại reverse transcriptase chịu nhiệt sẽ làm giảm nhiều bất lợi đi khi tổng hợp cADN, làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng. Người ta đ ã tìm ra ADN polymerase ch ịu nhiệt có hoạt tính reverse transcriptase đó là ADN polymerase tái tổ hợp đư ợc trích từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus thermophilus (Tth pol). ADN polymerase chịu nhiệt n ày ho ạt động hữu hiệu khi có sự hiện diện của ion Mn2+. Hỗn hợp phản ứng của PCR của ARN bao gồm : Tth pol, 2 loại mồi oligonucleotide (một đ ược sử dụng cho sự tổng hợp cADN, và cả 2 được sử dụng cho PCR ), ion mangan ở dạng MnCl2, và tất cả các thành phần khác cần cho sự phiên mã ngược và PCR. Máy chu kỳ nhiệt được