Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tạo dòng và tối ưu điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:112

Thêm vào BST

Báo xấu

19
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu tạo dòng và tối ưu điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp" được hoàn thành với mục tiêu nhằm phân lập, tạo dòng gen mã hóa nattokinase từ các chủng Bacillus subtilis tự nhiên và biểu hiện thành công nattokinase tái tổ hợp trong chủng B. subtilis BD170. Nattokinase tái tổ hợp được biểu hiện mạnh và có khả năng phân hủy cục máu đông.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tạo dòng và tối ưu điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp

ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ ANH THƢ NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TRONG Bacillus subtilis BD170 TÁI TỔ HỢP LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HUẾ, 2024
ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ ANH THƢ NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TRONG Bacillus subtilis BD170 TÁI TỔ HỢP LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 9 42 02 01 Ngƣời hƣớng dẫn Khoa học: GS.TS. NGUYỄN HOÀNG LỘC HUẾ, 2024 i
Lời Cảm Ơn Trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án, em đã nhận được rçt nhiều sự quan tåm, giúp đỡ của quý ban lãnh đäo, quý thæy cô giáo, quý đồng nghiệp và các anh chị học viên và sinh viên. Em xin chân thành câm ơn sự giúp đỡ quý giá đó. Đặc biệt, em xin bày tô lòng biết ơn chån thành và lời câm ơn såu sắc đến Thæy giáo GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc đã tận tình chỉ bâo và nhẫn näi với em trong suốt quá trình làm luận án, đã giúp đỡ em hoàn thành luận án này. Nếu không có sự giúp đỡ của thæy, thật sự em không thể có được như ngày hôm nay. Em xin câm ơn các thæy cô giáo täi bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đäi học Khoa học, Đäi học Huế đã nhiệt tình giúp đỡ em thực hiện đề tài, đã động viên em chån thành và đæy cởi mở ngay từ những ngày đæu tiên. Em xin cám ơn phòng Đào täo Sau đäi học trường Đäi học Khoa học, Đäi học Huế đã có nhiều giúp đỡ quý báu, täo mọi điều kiện tốt nhçt để em hoàn thành luận án này. Em muốn gửi lời câm ơn đến Thæy giáo TS. Nguyễn Minh Trí, Thæy đã giúp đỡ em rçt nhiều trong việc hoàn thành các thủ tục hồ sơ giçy tờ để em có thể bâo vệ thành công luận án. Em xin gửi lời câm ơn đến Ban Giám đốc, Ban Đào täo và Công tác Sinh viên Đäi học Huế; Ban Giám hiệu, Phòng Tổ chức Hành chính và Thanh tra Pháp chế, quý đồng nghiệp Khoa Cơ bân, Trường Đäi học Y - Dược, Đäi học Huế đã luôn täo những điều kiện tốt nhçt để em có điều kiện hoàn thành luận án này. Tôi xin chån thành cám ơn các bän học viên, sinh viên ngành Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ rçt nhiều trong quá trình thực hiện các thí nghiệm của luận án, đã đồng hành cùng tôi suốt thời gian làm luận án. Con xin gửi đến ba mẹ yêu quý của con những lời biết ơn chån thành nhçt. Cám ơn ba mẹ luôn ở bên cänh con để chia sẻ, động viên con trong những ngày con làm luận án. Cuối cùng xin gửi lời câm ơn đến người chồng yêu quý và hai con đã luôn bên cänh động viên, khuyến khích. Thật sự đåy là những động lực to lớn để tôi có thể đi đến thành công này. Một læn nữa xin câm ơn tçt câ với lòng biết ơn và chån thành nhçt! Thừa Thiên Huế, tháng 2 năm 2024 Nguyễn Thị Anh Thư ii
LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Ngƣời cam đoan Nguyễn Thị Anh Thƣ iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AchE Acetylcholinesterase ADAM10 A Disintegrin and Metalloproteinase Protein 10 ADAM9 A Disintegrin and Metalloproteinase Protein 9 ATP Adenosine triphosphate ATPS Aqueous two-phase system Hệ hai pha nƣớc BDNF Brain-derived neurotrophic factor Yếu tố thần kinh nguồn gốc từ não BSA Bovine serum albumin cAMP Cyclic adenosine monophosphate CDS Coding Sequence cs Cộng sự ĐC Đối chứng DEAE Diethylaminoethyl DFP Diisopropyl fluorophosphate EDTA Ethylene diamine triacetic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Kỹ thuật sinh hóa đƣợc dùng trong miễn dịch học GenBank Ngân hàng Gen GFP Green fluorescent protein HĐC Hoạt độ chung HĐR Hoạt độ riêng IGF-1 Insulin-like growth factor-1 Yếu tố tăng trƣởng giống Insulin-1 IPTG Isopropyl β-D-1- iv
thiogalactopyranoside JAK1 Janus kinase 1 KLPT Khối lƣợng phân tử LB Luria Bertani ORF Open reading frame PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1 PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi Polymerase PEG polyethylene glycol pI Điểm đẳng điện PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride PP Potassium phosphate RBS Ribosome binding site SBTI Self-Directed Biological Transformation Initiative SDS- Sodium dodecyl-sulfate PAGE polyacrylamide gel electrophoresis Sec SRP Signal recognition particle STAT1 Signal transducer and activator of transcription 1 TCA Trichloroacetic acid TGF-β Transforming growth factor beta uPA Urokinase-type plasminogen activator WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới YPD Yeast peptone dextrose Zymogram Điện di cơ chất v
MỤC LỤC Lời cảm ơn ................................................................................................................ ii LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. iv MỤC LỤC ................................................................................................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... ix DANH MỤC CÁC HÌNH .........................................................................................x MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................4 1.1. GIỚI THIỆU VỀ NATTOKINASE ............................................................................ 4 1.1.1. Đặc điểm của nattokinase .......................................................................4 1.1.2. Nguồn sản xuất nattokinase .......................................................................6 1.1.2.1. Vi khuẩn Bacillus ................................................................................6 1.1.2.2. Các nguồn sinh vật khác ...................................................................11 1.1.3. Ứng dụng của nattokinase .......................................................................14 1.1.3.1. Ứng dụng trong chống đông máu .....................................................14 1.1.3.2. Các ứng dụng khác ............................................................................16 1.2. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN Bacillus subtilis ............................................................... 18 1.2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................................18 1.2.2. Hệ thống vector biểu hiện ở Bacillus ......................................................19 1.2.3. Hệ thống tiết ở Bacillus ...........................................................................20 1.3. ỨNG DỤNG Bacillus subtilis TRONG SẢN XUẤT ENZYME TÁI TỔ HỢP .. 23 1.3.1. Nattokinase ..............................................................................................23 1.3.2. Các enzyme khác .....................................................................................25 1.4. TINH SẠCH ENZYME BẰNG HỆ 2 PHA NƢỚC ............................................... 27 1.4.1. Cấu tạo và đặc tính của hệ hai pha nƣớc .................................................28 1.4.2. Ứng dụng hệ hai pha trong tinh sạch enzyme .........................................31 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................37 vi
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................................... 37 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................. 37 2.2.1. Phân lập gen mã hóa nattokinase từ các chủng B. subtilis C10 và N05 ..37 2.2.2. Tạo dòng gen mã hóa nattokinase trong tế bào E. coli TOP10 ...............38 2.2.3. Biến nạp vector pHT43/nat05 và pHT43/natC10 vào Bacillus subtilis BD170 ................................................................................................................40 2.2.4. Biểu hiện nattokinase bằng hệ thống vector pHT43................................41 2.2.5. Xác định hoạt tính nattokinase ................................................................43 2.2.6. Ảnh hƣởng của một số yếu tố lên hoạt tính phân giải fibrin ...................44 2.2.7. Thử nghiệm khả năng phân giải fibrin trong máu thỏ bằng nattokinase tái tổ hợp .................................................................................................................45 2.2.8. Tinh sạch nattokinase tái tổ hợp bằng hệ hai pha nƣớc ...........................45 2.3. XỬ LÝ THỐNG KÊ ......................................................................................47 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................48 3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TỪ CÁC CHỦNG Bacillus subtilis……………………………………………………………………………………….48 3.1.1. Khuếch đại gen mã hóa nattokinase từ các chủng B. subtilis ..................48 3.1.2. Tạo dòng gen nattokinase giả định trong vector pCR®2.1 ......................49 3.1.3. Xác định trình tự gen nattokinase giả định từ các chủng B. subtilis .......51 3.2. TẠO DÒNG GEN nat05 VÀ natC10 TRONG Bacillus subtilis BD170............... 54 3.2.1. Tạo dòng gen nat05 và natC10 vào vector pHT43 .................................54 3.2.2. Biến nạp vector pHT43 tái tổ hợp vào B. subtilis BD170 .......................56 3.3. BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP TRONG Bacillus subtilis BD170 . 57 3.3.1. Xác định dòng B. subtilis BD170 biểu hiện nattokinase mạnh ...............57 3.3.2. Đặc điểm của nattokinase tái tổ hợp ở dòng R4 ......................................59 3.4. TINH SẠCH NATTOKINASE BẰNG HỆ HAI PHA NƢỚC ............................. 63 3.4.1. Ảnh hƣởng của khối lƣợng phân tử PEG ................................................63 3.4.2. Ảnh hƣởng của nồng độ potassium phosphate ........................................65 3.4.3. Thu hồi enzyme .......................................................................................66 vii
3.4.4. Xác định khối lƣợng phân tử của nattokinase tái tổ hợp .........................67 Chƣơng 4. THẢO LUẬN ........................................................................................69 4.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TỪ CÁC CHỦNG Bacillus subtilis .................................................................................................................................. 69 4.2. TẠO DÒNG GEN nat05 VÀ natC10 TRONG VECTOR BIỂU HIỆN pHT43 70 4.3. BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP Ở Bacilus subtilis ........................... 71 4.3.1. Biểu hiện gen mã hóa nattokinase ...........................................................71 4.3.2. Ảnh hƣởng của một số yếu tố lên hoạt tính phân giải fibrin ...................74 4.3.3. Thử nghiệm khả năng phân giải cơ chất của nattokinase ........................77 4.4. TINH SẠCH NATTOKINASE BẰNG HỆ HAI PHA NƢỚC ............................. 79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................81 1. KẾT LUẬN..................................................................................................................... 81 2. KIẾN NGHỊ .................................................................................................................... 81 DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .............................82 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................83 viii
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số chủng vi khuẩn Bacillus sản xuất đƣợc phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống ...............................................................................6 Bảng 1.2. Nguồn sinh vật sản xuất enzyme thủy phân fibrin. ...............................11 Bảng 2.1. Trình tự các primer dùng để khuếch đại PCR gen nattokinase từ B. subtilis C10 và N05 ...............................................................................38 Bảng 3.1. Hoạt độ protease của các dòng B. subtilis BD170 tái tổ hợp ................58 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính nattokinase của Nat05...............60 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính nattokinase của Nat05 .......................61 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của các ion kim loại và chất hoạt động bề mặt lên hoạt tính nattokinase của Nat05............................................................................62 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của PEG 2000 và PP 20% đến sự phân tách nattokinase. ..64 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của PEG 6000 và PP 20% đến sự phân tách nattokinase. ..64 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của PEG 10000 và PP 20% đến sự phân tách nattokinase .65 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của PP 15% đến sự phân tách nattokinase .........................65 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của PP 25% đến sự phân tách nattokinase .........................66 Bảng 3.10. Độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi enzyme khi sử dụng hệ hai pha nƣớc của B. subtilis BD170 tái tổ hợp ............................................................67 ix
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian 3 chiều của nattokiase ............................................5 Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của nattokinase trong chống đông máu. ...................14 Hình 1.3. Hình ảnh kính hiển vi điện tự quét tế bào B. subtilis 168. ....................19 Hình 1.4. Sơ đồ biểu diễn hệ thống mạng lƣới các con đƣờng tiết protein của B. subtilis....................................................................................................21 Hình 1.5. Sơ đồ mô tả hệ thống tiết protein theo con đƣờng Sec và các thành phần tham gia ở B. subtilis.. ...........................................................................23 Hình 1.6. Sơ đồ phân tách quá trình chuyển hóa sinh học bằng hệ hai pha ..........28 Hình 1.7. Các giai đoạn phân tách và tinh sạch enzyme bằng hệ hai pha PEG/muối. .............................................................................................30 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tách nattokinase bằng hệ 2 pha. ..............47 Hình 3.1. Khuếch đại PCR với cặp mồi NatF và NatR từ DNA tổng số.. ............48 Hình 3.2. Tinh sạch sản phẩm PCR.. ...................................................................49 Hình 3.3. Kiểm tra khuẩn lạc mang sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu. ..........50 Hình 3.4. Sơ đồ vector pCR®2.1 mang gen mã hóa nattokinase. ..........................50 Hình 3.5. So sánh trình tự của các gen nat05 và natC10 phân lập đƣợc với trình tự gen aprN từ chủng B. subtilis MTCC 7164...........................................53 Hình 3.6. So sánh trình tự amino acid suy diễn của các gen phân lập đƣợc với trình tự nattokinase từ chủng B. subtilis MTCC 7164 . ........................54 Hình 3.7. Kiểm tra sự hiện diện gen mã hóa nattokinase trong vector pHT43 ở chủng vi khuẩn E. coli TOP10 bằng phản ứng PCR. ............................55 Hình 3.8. Sơ đồ vector pHT43 mang gen mã hóa nattokinase.. ............................55 Hình 3.9. Kiểm tra sự hiện diện của vector pHT43 tái tổ hợp trong B. subtilis BD170 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.. ..............................56 Hình 3.10. Vòng phân giải sữa tách béo của các dòng B. subtilis BD170 tái tổ hợp khi cảm ứng IPTG ở nồng độ 1 mM. ....................................................57 x
Hình 3.11. Vòng phân giải fibrinogen của dòng R4 khi đƣợc cảm ứng với IPTG ở các nồng độ khác nhau (1-5 mM). .................................................................58 Hình 3.12. Điện di SDS-PAGE (A) và điện di cơ chất (B) của dịch enzyme ngoại bào.. .......................................................................................................59 Hình 3.13. Thử nghiệm khả năng phân giải cục máu đông thỏ bằng enzyme tái tổ hợp. ........................................................................................................62 Hình 3.14. Điện di sản phẩm tinh sạch trên polyacrylamide gel 12%. ...................68 Hình 3.15. Điện di sản phẩm tinh sạch trên polyacrylamide gel có bổ sung cơ chất. ...68 xi
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nhồi máu cơ tim và các bệnh tim mạch là những bệnh rất nghiêm trọng, ảnh hƣởng lớn đến sức khỏe con ngƣời và là nguyên nhân chính gây đột tử ở ngƣời. Theo thống kê của WHO, khoảng 17,7 triệu ngƣời chết mỗi năm trên thế giới liên quan đến bệnh tim mạch, trong đó chủ yếu bệnh thiếu máu cục bộ, cao huyết áp và các bệnh mạch máu não. Nhồi máu cơ tim, đột quỵ do thiếu máu, tắc nghẽn phổi, cục máu đông tĩnh mạch là các chứng bệnh do rối loạn đông máu gây ra. Ở ngƣời bình thƣờng, sự tích tụ fibrin và phân hủy fibrin trong máu đƣợc duy trì cân bằng, tuy nhiên khi fibrin không bị phân hủy gây nên sự mất cân bằng, dẫn đến nhồi máu cơ tim và các rối loạn đông máu khác. Khi đó, máu đông sẽ hình thành trong thành mạch [119]. Phân giải fibrin đóng vai trò quan trọng trong liệu pháp điều trị các bệnh tắc nghẽn mạch máu. Do bản chất fibrin là các protein nên chúng sẽ bị phân hủy bằng protease. Các protease thƣờng đƣợc sử dụng trong điều trị gồm có nattokinase, urokinase, streptokinase và plasmin. Urokinase và plasmin luôn hiện diện trong cơ thể ngƣời nhƣng sự tích lũy plasmin có thể gây ra hiện tƣợng xuất huyết trong. Streptokinase có nguồn gốc từ vi sinh vật, có giá thành sản xuất rẻ, tuy nhiên gây ra đáp ứng miễn dịch khi đƣa vào cơ thể, tạo ra hiệu ứng không mong muốn nhƣ xuất huyết trong và dị ứng. Hiện nay, nattokinase là liệu pháp chính đƣợc sử dụng để chống lại các bệnh máu đông [91, 99]. Natto là một sản phẩm lên men từ đậu nành đƣợc ngƣời Nhật sử dụng trên 2000 năm nhƣ thuốc tự nhiên phòng và trị các bệnh tim mạch. Thành phần chính của Natto là nattokinase, đây là một serine protease [102]. Nattokinase phân hủy máu đông trực tiếp thông qua thủy phân sợi fibrin và cơ chất plasmin, chuyển đổi prourokinase nội sinh đến urokinase, phân hủy tác nhân ức chế lên plasminogen và tăng mức độ hoạt hóa plasminogen ở mô qua đó tăng cƣờng hoạt tính thủy phân fibrin [119, 126]. Ngoài ƣu điểm ít tác dụng phụ lên mạch máu, nattokinase dễ dàng đƣợc hấp thụ qua đƣờng ruột và có hoạt tính rất mạnh sau khi hấp thụ trong tá tràng. 1
Những ƣu điểm này giúp nattokinase dễ sử dụng và hoạt tính thủy phân fibrin có thể áp dụng chống lại bệnh máu đông [35, 45]. Ngoài ra, nattokinae còn đƣợc sử dụng trong điều trị huyết áp [28] hay đƣợc sử dụng trong nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer [31]. Công nghệ DNA tái tổ hợp đã góp phần tạo ra một lƣợng lớn enzyme công nghiệp nhƣ protease, amylase, và lipase từ vi khuẩn Gram dƣơng và nấm. Bacillus là một trong những nhóm vi sinh vật đƣợc ứng dụng nhiều nhất để sản xuất enzyme, phụ gia thực phẩm, vitamin, kháng sinh và thuốc diệt côn trùng. Bên cạnh ƣu điểm sản xuất protein ngoại bào mạnh, vi khuẩn thuộc chi Bacillus còn sử dụng sản xuất các protein tái tổ hợp không glycosyl hóa do đặc tính di truyền của chúng đƣợc nghiên cứu rất kỹ và dễ dàng kiểm soát quá trình sinh tổng hợp thông qua các kỹ thuật di truyền [29]. Bên cạnh đó, trình tự tín hiệu peptide của chúng có thể đƣợc sử dụng trong sản xuất các protein dung hợp. Đặc biệt, các trình tự tín hiệu peptide dễ dàng đƣợc tối ƣu cho từng loại protein đích, vì vậy tăng cƣờng đáng kể hiệu quả sản xuất ngoại bào các protein tái tổ hợp [15]. Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng và tối ƣu điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp” nhằm mục đích cung cấp nguồn dƣợc chất tự nhiên cho các ứng dụng trong lĩnh vực y dƣợc học. 2. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập, tạo dòng gen mã hóa nattokinase từ các chủng Bacillus subtilis tự nhiên và biểu hiện thành công nattokinase tái tổ hợp trong chủng B. subtilis BD170. Nattokinase tái tổ hợp đƣợc biểu hiện mạnh và có khả năng phân hủy cục máu đông. 3. Nội dung và phạm vi nghiên cứu Nội dung nghiên cứu - Phân lập gen mã hóa nattokinase từ các chủng B. subtilis tự nhiên - Tạo dòng gen mã hóa nattokinase trong B. subtilis BD170 - Biểu hiện nattokinase tái tổ hợp trong B. subtilis BD170 - Tinh sạch nattokinase bằng hệ hai pha nƣớc 2
Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế. 4. Đóng góp mới của luận án Luận án đã phân lập và tạo dòng các gen mã hóa nattokinase từ các chủng Bacillus subtilis tự nhiên N05 và C10, biểu hiện thành công trong chủng B. subtilis BD170. Nattokinase tái tổ hợp đã đƣợc thu hồi, tinh sạch bằng hệ 2 pha nƣớc, phân tích đặc điểm và bƣớc đầu thử nghiệm phân hủy cục máu đông mạnh với enzyme đƣợc kết tủa bằng acetone 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của Luận án Nattokinase là enzyme có vai trò quan trọng trong y học, đặc biệt trong việc bảo vệ sức khỏe tim mạch. Nattokinase thƣờng đƣợc sản xuất dƣới dạng thực phẩm chức năng và đƣợc sử dụng phổ biến ở những ngƣời mắc các bệnh lý tim mạch nhƣ bệnh tim, tăng huyết áp, mỡ máu, đột quỵ, đau thắt ngực, huyết khối tĩnh mạch sâu, xơ vữa động mạch, … Vì vậy, nghiên cứu sản xuất nattokinase bằng công nghệ DNA tái tổ hợp nhằm tăng khả năng sản xuất enzyme này là việc làm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, góp phần vào việc phát triển các sản phẩm bảo vệ sức khỏe cho con ngƣời. 3
Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ NATTOKINASE 1.1.1. Đặc điểm của nattokinase Nattokinase đƣợc mã hóa bởi gen aprN và đƣợc sinh tổng hợp ở dạng tiền chất với tín hiệu peptide và trình tự propeptide nằm ở đầu tận cùng NH2 trong cấu trúc enzyme [83]. Phần lớn các nghiên cứu cho thấy nattokinase từ Bacilus subtilis là một serine protease có khối lƣợng phân tử khoảng 27-29 kDa và pI khoảng 8,6 [52, 83, 84, 115]. Gần đây, nhiều nattokinase khác đã đƣợc phân lập và công bố, chẳng hạn, Pinontoan và cs (2021) đã phân lập đƣợc 6 nattokinase từ chủng B. subtilis G8, các enzyme này có khối lƣợng phân tử từ 13,7 đến 42 kDa, trong đó enzyme có khối lƣợng phân tử 20 kDa thể hiện hoạt tính mạnh nhất [96]. Minh và cs (2022) nhận thấy sau khi tinh sạch nattokinase từ B. subtilis TH9, có 3 băng với khối lƣợng phân tử khoảng 21, 27 và 37 kDa thể hiện hoạt tính thủy phân fibrin [76]. Phân tích cấu trúc 3 chiều cho thấy, nattokinase từ chủng B. subtilis natto là một chuỗi polypeptide đơn không chứa liên kết disulfide. Enzyme chứa 9 chuỗi xoắn α, 9 vị trí gấp cuộn β (Gln2, Asp41, Leu75, Asn77, Ile79, Val81, Ala169, Tyr171, Thr174) và 2 vị trí gắn Ca2+. Trung tâm hoạt động của enzyme là Asp32- His64-Ser221, trong khi vị trí gắn cơ chất chứa các amino acid là Ser125, Leu126, Gly127 (Hình 1.1). Tƣơng tự các serine protease khác, 7 vị trí gấp cuộn β của nattokinase nằm gần trung tâm hoạt động của phân tử enzyme, 2 vị trí gấp cuộn khác nằm gần đầu tận cùng NH2. 9 gấp cuộn β nằm ngƣợc với 9 cấu trúc xoắn α, trong đó có 7 xoắn α có bề mặt tƣơng tự nhau [127]. Cơ chế xúc tác của nattokinase hiện nay chƣa đƣợc công bố. Từ mô hình cấu trúc 3 chiều cũng nhƣ so sánh với các protease khác cho thấy cơ chế phân tử của nattokinase cũng tƣơng tự nhƣ các alkaline serine protease khác [127]. Cấu trúc nattokinase tƣơng đồng cao với subtilisin E trong họ serine protease của Bacillus [91]. Nattokinase là một protease không có cysteine, vì vậy không có liên kết 4
disulfide giữa các amino acid. Khi có sự hiện diện của PMSF, nattokinase mất hầu hết hoạt tính enzyme tƣơng tự nhƣ các enzyme khác trong họ serine protease. Mặc dù đƣợc xếp vào nhóm sublitisin trong họ protease nhƣng nattokinase khác với subtilisin ở đặc tính tác dụng mạnh trên cơ chất fibrin [91, 124]. Hình 1.1. Cấu trúc không gian 3 chiều của nattokiase [127]. A. Vị trí liên kết calcium (màu vàng), B. Cấu trúc không gian 3 chiều, C. ba vị trí xúc tác của nattokinase (His-64, Asp-32 và Seb-221). Nghiên cứu đột biến điểm định hƣớng và động học phân tử của các mô hình cấu trúc 3D cho thấy liên kết hydrogen giữa các amino acid Ser33, Asp60, Ser62 và Thr220 giúp ổn định phản ứng, các amino acid Ser125, Leu126 và Gly127 đóng vai trò liên kết với cơ chất. Trong khi đó, các amino acid Ser3, Gly100, Ser101 và Leu126 chịu trách nhiệm hoạt tính thủy phân fibrin [121]. Nghiên cứu đánh giá độc tính nattokinase lên mô hình động vật thí nghiệm cũng nhƣ ngƣời cho thấy nattokinase an toàn, không gây đột biến di truyền ở điều kiện thí nghiệm in vitro. Bên cạnh đó, nattokinase không gây ra sự khác biệt nào sau 28 ngày thí nghiệm trên chuột ở mức bổ sung 157 mg/kg/ngày và 90 ngày với mức 1000 mg/kg/ngày. Các phân tích ở mức độ tế bào cũng không cho thấy có tổn thƣơng nào. Kiểm tra trên ngƣời với mức bổ sung 10 mg/kg/ngày liên tục trong 4 tuần cho thấy nattokinase không gây ra bất kỳ sự thay đổi nào. Nghiên cứu đã cho thấy nattokinase không có hoặc có độc tính ở mức độ rất thấp khi sử dụng với liều lƣợng 10 mg/kg/ngày [58]. 5
1.1.2. Nguồn sản xuất nattokinase 1.1.2.1. Vi khuẩn Bacillus Nattokinase đƣợc sản xuất từ các nguồn vi sinh vật khác nhau, chủ yếu từ thực phẩm lên men nhƣ Natto của Nhật Bản, Chungkook-jang và Meju của Hàn Quốc, Gembus của Indonesia, Douchi của Trung Quốc. Natto là một sản phẩm đậu nành lên men đƣợc xem là nguồn nguyên liệu tốt nhất để sản xuất nattokinase. Chungkook-Jang cũng là sản phẩm lên men từ đậu nành và cũng là nguồn nguyên liệu phổ biến cho sản xuất nattokinase (Bảng 1.1) [91, 92, 99]. Bảng 1.1. Một số chủng vi khuẩn Bacillus sản xuất đƣợc phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống [91] Chủng vi khuẩn Nguồn phân lập Tên enzyme B. natto Natto, Nhật Bản Nattokinase, NK B. amyloliquefaciens DC-4 Douchi, Trung Quốc Subtilisin DFE Bacillus sp. CK Chungkook-jang, Hàn Quốc CK Bacillus sp. DJ-4 Doen-jang, Hàn Quốc Subtilisin DJ-4 Bacillus sp. DJ-2 Doen-jang, Hàn Quốc bpDJ-2 Bacillus sp. KA38 Jeot-gal, Hàn Quốc Jeot-gal enzyme B. subtilis QK02 Đậu nành lên men, Hàn Quốc QK-1 và QK-2 Bacillus firmus NA-1 Natto, Nhật Bản - B. subtilis IMR-NK1 Natto, Đài Loan - Bacillus sp. KDO-13 Bơ đậu, Hàn Quốc - Fujita và cs (1993) đã tinh sạch enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin từ thực phẩm lên men Natto gọi là nattokinase. Nattokinase đƣợc tách chiết từ Natto bằng dung dịch muối sinh lý, sau đó đƣợc tinh sạch theo trình tự sắc ký kỵ nƣớc, sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel. Nhóm nghiên cứu đã giải trình tự enzyme cho thấy có 275 amino acid với khối lƣợng phân tử khoảng 27,78 kDa. Trình tự enzyme này tƣơng đồng cao với nhóm enzyme subtilisin. Nattokinase tinh sạch ngoài đặc tính thủy phân sợi fibrin còn có khả năng thủy phân nhiều cơ chất peptide tổng hợp khác nhau. Trong số các peptide tổng hợp đƣợc khảo sát thì trình tự peptide Suc-Ala-Ala- Pro-Phe-pNA cho hiệu quả thủy phân cao nhất. Enzyme bị ức chế mạnh bởi PMSF 6
ở cả 2 đặc tính thủy phân fibrin và thủy phân peptide cho thấy nattokinase thuộc họ serine protease [34]. Wei và cs (2012) đã phân lập chủng vi khuẩn sinh nattokinase từ sản phẩm đậu nành lên men để sản xuất nattokinase làm thực phẩm chức năng. Kết hợp phƣơng pháp hóa sinh xác định hoạt tính enzyme và giải trình tự gen 16S rDNA, nhóm tác giả đã định danh đƣợc một chủng thuộc B. subtilis và đặt tên là LSSE-22. Hoạt độ nattokinase đạt giá trị 356,25 FU/g cơ chất. Nattokinase sau đó đƣợc tách chiết với ethanol 50% và kết tủa với ethanol 70%, hỗn hợp sau kết tủa có hoạt tính nattokinase 4000 FU/g [118]. Chủng vi khuẩn B. subtilis ICTF-1 phân lập từ nƣớc biển và đƣợc xác định có sản xuất nattokinase nhờ phƣơng pháp thử hoạt tính với fibrin. Enzyme sau đó đƣợc tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion để khảo sát đặc tính. Băng protein của enzyme tinh sạch có khối lƣợng phân tử khoảng 28 kDa trên hình ảnh điện di SDS-PAGE. pH tối ƣu cho hoạt tính enzyme từ 7-11 với giá trị tối ƣu là pH 9. Nhiệt độ tối ƣu của enzyme từ 50-60oC. Hoạt tính enzyme giảm mạnh khi có mặt PMSF, Zn2+, Fe3+ và Hg2+ [71]. Chủng vi khuẩn B. subtilis RJA19 đƣợc phân lập từ đậu nành lên men và định danh phân tử bằng trình tự gen 16S rDNA. Chủng RJA19 sản xuất nattokinase cao nhất sau 72 giờ nuôi cấy ở 50oC và pH 9. Cơ chất lactose và peptone giúp tăng khả năng sản xuất enzyme. Nattokinase sau khi thu nhận từ dịch nuôi cấy đƣợc phân tích SDS-PAGE cũng nhƣ khảo sát các đặc tính của nó. Kết quả cho thấy enzyme có khối lƣợng phân tử khoảng 35 kDa, hoạt động ổn định trong khoảng pH 9,5-11 (tối ƣu là 9,5). Nhiệt độ tối ƣu cho hoạt tính enzyme là 65oC và độ bền nhiệt lên đến 85oC [56]. Các chủng vi khuẩn có hoạt tính nattokinase cũng đƣợc phân lập từ đậu nành lên men truyền thống của Trung Quốc bằng phƣơng pháp sàng lọc đĩa fibrin. Từ những nghiên cứu đó, chủng vi khuẩn B. subtilis MX-6 đã đƣợc tuyển chọn có hoạt tính nattokinase rất mạnh. Gen aprN mã hóa nattokinase cũng đƣợc khuếch đại, tạo dòng, giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu của GenBank. Nattokinase từ dịch nuôi cấy đƣợc kết tủa bằng ammonium sulfate sau đó đƣợc tinh sạch bằng phƣơng 7
pháp sắc ký. Enzyme tinh khiết đƣợc phân tích SDS-PAGE cho một băng protein có khối lƣợng phân tử khoảng 28 kDa. Chủng MX-6 cho hiệu quả sản xuất nattokinase cao nhất sau 72 giờ nuôi cấy với vòng phân hủy fibrin đạt 21,6 mm [72]. Bên cạnh việc thu nhận nattokinase, các nghiên cứu tối ƣu hóa sản xuất enzyme này từ B. subtilis cũng đã đƣợc quan tâm trong những năm qua. Mahajan và cs (2012) đã nghiên cứu tối ƣu hóa thành phần môi trƣờng cho chủng B. subtilis ICTF-1 phân lập từ đất ven biển. Các tác giả khảo sát ảnh hƣởng của 8 yếu tố lên hoạt tính thủy phân fibrin bao gồm: pH môi trƣờng, nồng độ maltose, peptone đậu nành, dịch chiết nấm men, K2HPO4, MgSO4, CaCl2 và NaCl trong 18 thí nghiệm khác nhau. Kết quả cho thấy nồng độ MgSO4 và CaCl2 có ảnh hƣởng lớn nhất đến lƣợng enzyme thu đƣợc trong khi pH có ảnh hƣởng không đáng kể. Tăng nồng độ maltose kết hợp với K2HPO4 và MgSO4 cũng cải thiện hiệu suất enzyme. Bên cạnh đó, peptone đậu nành, dịch chiết nấm men, CaCl2 và NaCl khi sử dụng ở nồng độ thấp cho hoạt tính enzyme cao nhất. Dựa trên các kết quả thu đƣợc, môi trƣờng tối ƣu cho chủng B. subtilis ICTF-1 sản xuất nattokinase đƣợc đề xuất gồm có 30 g/L maltose, 5 g/L peptone đậu nành, 15 g/L dịch chiết nấm men, 1,5 g/L K2HPO4, 1,25 g/L MgSO4, 0,25 g/L CaCl2 và 10 g/L NaCl (pH 8) cho hoạt độ enzyme lên tới 8.814 U/mL [71]. Unrean và cs (2012) đã tối ƣu hóa quá trình sản xuất nattokinase từ vi khuẩn B. subtilis K-C3 trong hệ lên men mẻ có bổ sung dinh dƣỡng. Sau khi khảo sát và tối ƣu các nguồn cơ chất ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme kết quả cho thấy glycerol là nguồn cơ chất tốt nhất để sản xuất nattokinase đồng thời hạn chế sự hình thành các sản phẩm phụ. Quá trình tối ƣu hóa ở hệ lên men sử dụng mô hình động học với tốc độ sinh trƣởng đặc trƣng (specific growth rate) đƣợc cố định thông qua kiểm soát lƣợng glycerol bổ sung. Kết quả thu đƣợc sinh khối cực đại đạt 73,47 g/L và hoạt tính nattokinase là 9198,5 U/mL sau 28 giờ nuôi cấy. Lƣợng enzyme trung bình thu nhận đƣợc là 61,36 U/g. Hiệu suất nattokinase thu đƣợc trong hệ lên men đạt 545,95 U/giờ, cao hơn 20 lần so với lên men mẻ [112]. Chủng B. subtilis RJAS19 phân lập từ thực phẩm lên men Natto cũng đã đƣợc sử dụng để sản xuất nattokinase và khảo sát đặc tính của enzyme sau tinh sạch. 8