Luận án Tiến sĩ Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:206

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của Luận án nhằm ứng dụng thành công kỹ thuật tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần, xác định con lai soma, chọn lọc con lai backcross (BC1) để tạo nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY có đặc tính nông sinh học mong muốn. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đinh Thị Thu Lê NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN ĐỂ CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG VIRUS PVY Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đinh Thị Thu Lê NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN ĐỂ CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG VIRUS PVY Ở VIỆT NAM Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS. TS. HOÀNG ĐÌNH HÒA 2. GS. TS. NGUYỄN QUANG THẠCH Hà Nội - 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TS. Hoàng Đình Hòa và GS.TS. Nguyễn Quang Thạch. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được tác giả công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày ………. tháng …… năm 2020 Tác giả luận án Đinh Thị Thu Lê i
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận án tiến sĩ, em đã nhận được sự giúp đỡ và động viên của các thày, cô và tập thể. Lời đầu tiên, cho phép em được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS. Hoàng Đình Hòa – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, GS.TS. Nguyễn Quang Thạch – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, là những người thày đã trực tiếp hưỡng dẫn, định hướng và tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận án. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thày, cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã dạy dỗ, động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian là nghiên cứu sinh của bộ môn. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thày, cô, anh chị và bạn Đỗ Thị Thu Hà, Vũ Thị Hằng – Phòng Công nghệ phân tử & Công nghệ Vi sinh, Viện Sinh học Nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã luôn nhiệt tình giúp đỡ và sát cánh bên em trong quá trình thực hiện luận án tại đơn vị. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cơ quan chủ quản – Trường Đại học Mở Hà Nội, khoa Công nghệ Sinh học đã bố trí thời gian, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án của mình. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên tinh thần, khích lệ những lúc khó khan để tôi vượt qua và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày ……. tháng ….. năm 2020 Đinh Thị Thu Lê ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG...........................................................................................vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ .................................................................. ix MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 5 1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây ............................................................................. 5 1.1.1 Nguồn gốc............................................................................................................... 5 1.1.2. Phân loại ................................................................................................................ 5 1.1.3. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam ....................................... 6 1.2 Giới thiệu khoai tây chế biến chip ............................................................................ 9 1.3 Tìm hiểu về virus hại khoai tây ............................................................................... 10 1.3.1 Giới thiệu chung ................................................................................................... 10 1.3.2. Giới thiệu về PVY ............................................................................................... 12 1.3.3 Tác hại của PVY đến sản xuất khoai tây .............................................................. 14 1.4 Các hướng nghiên cứu khắc phục bệnh virus hại khoai tây ............................... 15 1.4.1 Xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh .................................... 15 1.4.2 Thanh lọc vệ sinh đồng ruộng, nhổ bỏ các cây nhiễm virus .............................. 19 1.4.3 Chọn tạo giống kháng bệnh virus ....................................................................... 20 1.5 Phương pháp chọn tạo giống khoai tây kháng virus .......................................... 20 1.5.1 Phương pháp chọn tạo giống truyền thống ......................................................... 21 1.5.2. Phương pháp công nghệ sinh học ........................................................................ 22 Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 51 2.1. Vật liệu nghiên cứu................................................................................................. 51 2.1.1. Các dòng khoai tây nghiên cứu ........................................................................... 51 2.1.2. Hóa chất ............................................................................................................... 53 2.1.3. Thiết bị ................................................................................................................. 53 2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 54 2.2.1. Nội dung 1: Xác định các thông số tối ưu cho quy trình dung hợp khoai tây từ các nguyên liệu nhị bội (2n = 2x), tứ bội (2n = 4x) và khoai tây dại (pnt2G, trn3G, blb2G) ....................................................................................................................................... 54 2.2.2. Nội dung 2: Xác định và đánh giá các thể lai soma của các tổ hợp dung hợp khoai tây nhị bội (2n = 2x) ...................................................................................................... 56 iii
2.2.3. Nội dung 3: Xác định các thể lai soma của các tổ hợp dung hợp giữa khoai tây dại (2n = 2x) và khoai tây trồng (2n = 4x). Đánh giá khả năng kháng PVY của chúng. ...... 56 2.2.4. Nội dung 4: Đánh giá con lai backcross (BC1) của thể lai soma (khoai tây dại và khoai tây trồng) với khoai tây trồng .............................................................................. 56 2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 58 2.3.1. Tách tế bào trần ................................................................................................... 58 2.3.2. Dung hợp tế bào trần ........................................................................................... 59 2.3.3. Xác định con lai bằng đếm độ bội flow cytometry ............................................. 60 2.3.4. Chiết tách DNA tổng số ...................................................................................... 60 2.3.5. Xác định con lai bằng sinh học phân tử .............................................................. 61 2.3.6. Lây nhiễm nhân tạo PVY .................................................................................... 62 2.3.7. Kiểm tra gen kháng PVY của các con lai soma bằng chỉ thị phân tử .............. 62 2.3.8. Đánh giá các đặc tính nông sinh học ................................................................... 63 2.3.9. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh. ........................................................................... 63 2.3.10. Lai lại (backcross) giữa một số tổ hợp khoai tây có triển vọng với khoai tây trồng. ....................................................................................................................................... 65 2.3.11. Các chỉ tiêu theo dõi .......................................................................................... 65 2.3.12. Xử lý số liệu ...................................................................................................... 67 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 68 3.1. Xác định các thông số tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần giữa các dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại và khoai tây trồng ....................................................................... 68 3.1.1. Nghiên cứu các thông số tách tế bào trần của các dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại, khoai tây trồng phục vụ cho dung hợp tế bào trần........................................... 68 3.1.2. Xác định các thông số dung hợp tế bào trần ....................................................... 73 3.1.3. Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp ............................................... 79 3.2. Xác định và đánh giá các thể lai soma của tổ hợp dung hợp khoai tây nhị bội (2n = 2x) ............................................................................................................................ 82 3.2.1. Tạo con lai ........................................................................................................... 82 3.2.2. Xác định độ bội thể của cây tái sinh.................................................................... 83 3.2.3. Xác định con lai soma bằng đo chỉ thị phân tử ................................................... 85 3.2.4. Đánh giá phẩm chất củ của các con lai soma trong điều kiện chậu vại .......... 88 3.2.5. Kiểm tra sự có mặt của gen kháng trong các con lai soma từ vật liệu nhị bội ... 90 3.3. Xác định các thể lai soma của tổ hợp dung hợp giữa khoai tây dại (2n=2x) và khoai tây trồng (2n = 4x). Đánh giá khả năng kháng virus PVY của chúng .......................... 92 3.3.1. Xác định con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng bằng đo độ bội thể ....................................................................................................................................... 93 iv
3.3.2. Xác định con lai soma giữa khoai tây dại và khai tây bằng chỉ thị phân tử ................. 94 3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen kháng PVY trong các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng .......................................................................................................... 95 3.3.4. Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng bằng lây nhiễm nhân tạo ................................................................................ 97 3.3.5. Đánh giá các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng về các tính trạng nông sinh học và phẩm chất củ ..................................................................................... 98 3.4. Đánh giá con lai backcross (BC1) của thể lai soma (khoai tây dại và khoai tây trồng) với khoai tây trồng ....................................................................................................... 104 3.4.1. Lai hữu tính giữa các con lai soma (của khoai tây dại và khoai tây trồng) với các giống khoai tây trồng và chọn lọc các con lai có đặc tính mong muốn ...................... 104 3.4.2. Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai BC1 triển vọng trên đồng ruộng và kiểm gia sự có mặt của gen kháng PVY bằng chỉ thị phân tử ............................. 113 3.4.3. Khảo sát diện hẹp các dòng lai BC1 triển vọng trên đồng ruộng ..................... 114 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 125 4.1. Kết luận ................................................................................................................ 125 4.2. Đề nghị ................................................................................................................. 125 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ............................................... 127 CỦA LUẬN ÁN ......................................................................................................... 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 128 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 139 v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BA 6 - benzyl amino purine BC1 Backcross CNSH Công nghệ sinh học CT Công thức DAS – ELISA Double Antibody Sandwich – Enzyme linked imunosorbent assay DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme – linked imunosorbent assay FAO Food and Agriculture Organization GA3 Gibberellic Acid IAA Indole-3-acetic acid KLCTB Khối lượng củ trung bình LSD Least significant difference MS Murashige and Skoog NAA Naphthaleneacetic acid NSLT Năng suất lý thuyết NSTT Năng suất thực thu NST Nhiễm sắc thể OD Optical density PCR Polymerase chain reaction PEG Polyethylene glycol PVY Potato virus Y SSR Simple sequence repeat TB Tế bào vi
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Mười lăm quốc gia sản xuất khoai tây nhiều nhất thế giới năm 2019 ......... 7 Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây của Việt Nam ......................... 8 Bảng 1.3. Hệ thống sản xuất các cấp giống khoai tây trên đồng ruộng tại Canada ... 16 Bảng 1.4. Tiêu chuẩn ruộng giống khoai tây Việt Nam ............................................ 18 Bảng 1.5. Thời gian chọn tạo giống khoai tây theo phương pháp truyền thồng ...... 22 Bảng 1.6. Tóm tắt kết quả quá trình chọn tạo giống khoai tây thông qua dung hợp protoplast các loài Solanum (1985 - 2016) ................................................................ 31 Bảng 2.1. Các vật liệu đã thu thập, nguồn gốc, độ bội và các tính trạng mong muốn phục vụ cho lai soma ................................................................................................. 51 Bảng 2.2. Trình tự và nhiệt độ gắn mồi sử dụng trong phân tích PCR chọn lọc con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng ............................................................... 61 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ macerozyme và cellulase trong dung dịch enzyme đến mật độ tế bào trần của các dòng khoai tây nhị bội (Tế bào trần /ml môi trường) ........... 68 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzyme đến mật độ tế bào trần thu được ............................................................................................................. 71 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tuổi cây in vitro đến mật độ tế bào trần thu được từ mẫu lá.. 72 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần tạo xung điện đến khả năng tạo mô sẹo của tổ hợp B186 (+) B208 và tổ hợp trn3G (+) Delikat ................................ 73 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ Ca2+ đến khả năng kết dính thành hàng của tế bào trong quá trình dung hợp (tế bào/hàng) và khả năng tế bào phân chia sau dung hợp.75 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của mật độ protoplast đến kết quả dung hợp bằng xung điện của tổ hợp nhị bội B186 (+) B208 ................................................................................... 77 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của mật độ protoplast đến kết quả dung hợp bằng xung điện của tổ hợp khoai tây dại và khoai tây trồng Trn3G (+) Delikat ....................................... 78 Bảng 3.8. Sự phân chia của các tổ hợp lai nhị bội và tổ hợp lai giữa khoai tây dại và khoai tây trồng trên các môi trường nuôi cấy khác nhau ........................................... 79 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai ................................................................................................................... 81 Bảng 3.10. Kết quả dung hợp, nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai nhị bội sau dung hợp .................................................................................................................................. 83 Bảng 3.11. Kết quả xác định độ bội các con lai sau dung hợp ................................. 83 vii
Bảng 3.12. Kết quả xác định con lai soma của các tổ hợp dung hợp ......................... 85 Bảng 3.13. Một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng lai soma khoai tây và dòng nguyên liệu .................................................................................................................................. 89 Bảng 3.14. Kết quả nuôi cấy tái sinh chồi của các tổ hợp lai khoai tây dại và khoai tây trồng sau dung hợp .................................................................................................... 93 Bảng 3.15. Kết quả tái sinh và phân tích độ bội thể của các tổ hợp lai khoai tây dại và khoai tây trồng sau dung hợp .................................................................................... 93 Bảng 3.16. Kết quả sử dụng marker phân tử trong xác định con lai soma ................ 95 Bảng 3.17: Kết quả mức độ kháng bệnh của các con lai soma 4x sau khi lây nhiễm nhân tạo ..................................................................................................................... 97 Bảng 3.18. Đánh giá các đặc tính nông sinh học của các con lai soma trong điều kiện chậu vại ................................................................................................................... 101 Bảng 3.19. Kết quả lai hữu tính giữa các con lai soma và khoai tây trồng tứ bội.... 104 Bảng 3.20. Khả năng nảy mầm của hạt lai BC1 ....................................................... 105 Bảng 3.21. Đánh giá khả năng kháng bệnh virus của con lai BC1 ở giai đoạn cây con. ................................................................................................................................ 106 Bảng 3.22. Bảng đánh giá hình thái và kiểu sinh trưởng của các con lai BC1 ......... 107 Bảng 3.23. Bảng đánh giá năng suất và hình thái củ của các con lai BC1 ............... 108 Bảng 3.24. Tình hình sinh trưởng, phát triển các vật liệu khảo sát sau 60 ngày trồng . 110 Bảng 3.25. Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng/giống khoai tây khảo sát .... 111 Bảng 3.26. Đặc tính nông sinh học các dòng/giống khoai tây khảo sát trên điều kiện đồng ruộng .............................................................................................................. 115 Bảng 3.27. Thời gian sinh trưởng qua các giai đoạn của các dòng/giống khoai tây 117 Bảng 3.28. Kết quả đánh giá tình hình sinh trưởng, phát triển của các con lai BC1 và các giống khoai tây trồng vụ đông xuân 2017-2018 ................................................ 118 Bảng 3.29. Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng/giống khoai tây khảo sát 119 Bảng 3.30. Đặc điểm hình thái củ khoai tây các dòng/giống khảo sát..................... 120 Bảng 3.31 Đánh giá cảm quan về chất lượng củ qua ăn nếm của các dòng/giống khoai tây ........................................................................................................................... 121 Bảng 3.32 Đánh giá hàm lượng chất khô của dòng/ giống khoai tây ...................... 122 viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Sơ đồ hệ thống sản xuất khoai tây giống của Viện Sinh học Nông nghiệp........... 19 Hình 1.2. Sơ đồ lai khoai tây ......................................................................................... 23 Hình 1.3 Cơ chế làm câm gene nhờ RNAi ................................................................ 47 Hình 1.4. Sử dụng cây chuyển gen amiRNA để tạo cây kháng virus.. ...................... 48 Hình 2.1. Các loài khoai khoai tây dại nhị bội thu thập từ CHLB Đức ..................... 53 Hình 3.1. Hình ảnh tế bào trần của các dòng khoai tây khác nhau với các enzyme phù hợp. ........................................................................................................................... 70 Hình 3.2. Chất lượng tế bào sau dung hợp và sự hình thành macrocallus ở các tần và số lần xung khác nhau. .............................................................................................. 74 Hình 3.3. Hình ảnh tế bào phân tạo hàng trong dung dịch dung hợp dung hợp có nồng độ Ca2+ khác nhau trong quá trình dung hợp của tổ hợp B186 (+) B208 .................. 76 Hình 3.4. Hình ảnh phân chia tế bào sau 5 ngày nuôi cấy ......................................... 79 Hình 3.5 Dung hợp và nuôi cấy các tổ hợp lai sau dung hợp .................................... 82 Hình 3.6. Hình ảnh độ bội của dòng khoai tây “bố mẹ” và con lai............................ 84 Hình 3.7. Xác đinh con lai soma của tổ hợp A15 (+) A56 với cặp mồi STM 3023 .. 86 Hình 3.8. Xác định con lai soma của tổ hợp B186 (+) B208 với cặp mồi STM 3023 ........ 87 Hình 3.9. Sự khác nhau về số lượng và kích thước củ của một số dòng lai soma sau......... 88 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu GP 122406 liên kết chặt với gen Rysto trong bố mẹ nhị bội và con lai soma ....................................... 91 Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR được cắt với enzym cắt giới hạn EcoRV ......... 92 Hình 3.12. Hình ảnh độ bội thể của dòng khoai tây “bố mẹ” và con lai .................... 94 Hình 3.13. Minh họa kết quả điện di cho phân tích chỉ thị phân tử STM2022 để xác định kiểu gen dị hợp nhân của tổ hợp lai trn 3G (+) Rasant ...................................... 94 Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi GP 122406 của ADN các con lai soma và các dòng bố mẹ khoai tây dại và khoai tây trồng ........................................ 96 Hình 3.15. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY của các dòng lai soma và dòng bố mẹ khoai tây dại và khoai tây trồng ............................................................. 96 Hình 3.16. Đánh giá các đặc tính nông sinh học của con lai soma và các dòng bố mẹ ....... 98 Hình 3.17. Đánh giá các tính trạng về năng suất và phẩm chất củ của con lai soma và dòng bố mẹ: A- Atlantic; B- 254/1; C- pnt2G ........................................................... 98 ix
Hình 3.18. Các biến dị ở con lai soma....................................................................... 99 Hình 3.19. Hạt nảy mầm đến giai đoạn 2 lá thật của các hạt lai BC1 ...................... 106 Hình 3.20. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY khi chạy cặp mồi GP 122406 ................................................................................................................................ 113 Hình 3.21. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY sau khi cắt bằng enzyme giới hạn EcoRV ....................................................................................................... 113 Hình 3.22. Màu sắc vỏ củ, thịt củ các dòng/giống khảo sát .................................... 121 x
MỞ ĐẦU Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong những cây trồng quan trọng trong chương trình an ninh lương thực thế giới chỉ sau ngô, lúa mỳ và gạo. Theo thống kê của tổ chức Nông lương thế giới (FAOSTAT, 2019), diện tích khoai tây trên thế giới năm 2017 đạt 19,30 triệu ha, năng suất trung bình đạt 20,11 tấn/ha, với tổng sản lượng 388,2 triệu tấn. Trong đó, diện tích khoai tây châu Âu chiếm 29,1% và sản lượng chiếm 31,9%; diện tích châu Á chiếm 51,9% và sản lượng chiếm 48,8% (FAOSTAT, 2016). Tại Việt Nam, khoai tây cũng là cây trồng lý tưởng cho vụ Đông ở Đồng bằng Sông Hồng, tuy nhiên diện tích trồng hiện nay của cả nước chỉ là 20.480 ha với năng suất 14,8 tấn/ha, sản lượng 303 nghìn tấn (FAOSAT, 2017). Có nhiều nguyên nhân cả về mặt kinh tế lẫn kỹ thuật dẫn đến sự hạn chế phát triển khoai tây ở Việt Nam. Về mặt kinh tế, nguyên nhân chính là do trồng khoai tây kém hiệu quả so với các cây trồng khác và đầu ra hạn chế (trừ khoai tây chế biến). Về mặt kỹ thuật, nguyên nhân chủ yếu là do hiện tượng thoái hóa giống gây ra do virus. Bệnh virus hại khoai tây rất phổ biến, dễ lan truyền thông qua môi giới truyền bệnh (côn trùng trích hút). Khoai tây được trồng và nhân giống bằng củ, khi cây bị nhiễm virus toàn bộ củ cũng bị lây nhiễm. Củ giống bị nhiễm virus khi trồng sẽ cho năng suất, chất lượng thấp. Đây chính là hiện tượng thoái hóa giống khoai tây gây ra do virus [1]. Có nhiều loại virus hại khoai tây, trong đó PVY là một trong 10 loại virus phổ biến gây tổn thất năng suất nghiêm trọng nhất trong các nước nhiệt đới trồng khoai tây [2]. Ước tính cứ 1% củ giống bị nhiễm PVY thì sẽ giảm năng suất khoảng 180kg/ha tương ứng 18 $/ha [3]. Hàng loạt các chiến lược làm giảm hậu quả của bệnh virus hại khoai tây đã được triển khai như: thay thế giống nhiễm virus bằng giống sạch hàng năm, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật tiêu diệt vector truyền bệnh. Trong đó, việc sản xuất giống sạch virus là biện pháp khá phổ biến được thực hiện ở hầu hết các nước trồng khoai tây quy mô lớn (Pháp, Đức, Hà Lan,…). Việc sản xuất giống sạch virus phải qua nhiều công đoạn phức tạp như nuôi cấy mô nguyên liệu sạch bệnh, nhân và trồng vật liệu trong điều kiện cách ly, sản xuất củ giống ở các vùng chuyên sản xuất giống rất tốn kém về chi phí, nhân lực và thời gian. Trong các giải pháp khắc phục bệnh virus hại khoai tây, có thể nói biện pháp hiệu quả và có tính bền vững nhất là việc tạo và sử dụng giống kháng virus. Phương pháp chọn tạo giống khoai tây kinh điển là phương pháp lai tạo. Phương pháp này vấp phải những khó khăn về mặt di truyền do bộ NST của khoai tây là tứ bội (2n=4x=48). Bộ genome tứ bội (2n=4x=48) tạo ra tỷ lệ phân ly lớn sau lai tạo, quá trình chọn lọc gặp khó khăn với một quần thể rất lớn trước khi tìm được một con lai có tính trạng mong muốn để phát triển thành giống. Thông thường tạo ra một giống khoai tây 1
mới thời gian chọn lọc đòi hỏi 10 - 12 năm [4]. Chuyển gen kháng bệnh, gen mang các tính trạng mong muốn vào cây trồng cũng đã và đang được áp dụng trong chương trình chọn tạo giống của nhiều cây trồng. Công nghệ này có thể rút ngắn thời gian chọn tạo giống khoai tây so với phương pháp chọn tạo giống kinh điển. Tuy nhiên, do những lo ngại về an toàn sinh học của các thể GMO (Genetically Modified Organism) nên hiện nay kỹ thuật chuyển gen đang là vấn đề còn nhiều tranh luận. Trước bối cảnh này, việc sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để có thể chuyển và tích hợp các gen mong muốn nổi lên như một giải pháp có tính khả thi cao. Dung hợp tế bào trần trong tạo giống khoai tây đã được Wenzel et al., vào năm 1979 trải qua hơn 40 năm phát triển, kỹ thuật này đang ngày một hoàn thiện. Với kỹ thuật này có thể i) tạo ra các con lai soma có thể duy trì những tính trạng mong muốn cho đời sau và là nguồn vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống, ii) chuyển 1 gen hoặc tích hợp nhiều gen từ các vật liệu dung hợp, iii) tái tổ hợp được genome nhân tế bào và tế bào chất, iv) tránh được những luật lệ liên quan đến chuyển gen [5]. Trên thế giới, các nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây gần đây đã sử dụng các nguồn khoai tây dại như dại S. Tarnii, S. Pinnatisectum, S. bulbocastanum [6], các dòng khoai tây nhị bội [7, 8] làm vật liệu nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY thông qua dung hợp tế bào trần. Nhằm góp phần nghiên cứu tạo giống khoai tây (nhất là khoai tây có khả năng chế biến) mang tính kháng bệnh virus PVY, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở Việt Nam” đã được thực hiện. Mục tiêu Ứng dụng thành công kỹ thuật tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần, xác định con lai soma, chọn lọc con lai backcross (BC1) để tạo nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY có đặc tính nông sinh học mong muốn. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tập trung thực hiện trên các đối tượng là các dòng khoai tây nhị bội (2n = 2x = 24), khoai tây dại (2n = 2x = 24) kháng virus PVY, giống khoai tây trồng (2n = 4x = 48) Thời gian thực hiện: tháng 5/2015 đến tháng 12/2018 Địa điểm nghiên cứu: Các nội dung nghiên cứu về tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần và chọn lọc con lai soma được thực hiện tại Viện Sinh học Nông nghiệp (Học viện Nông nghiệp Việt Nam); các con lai BC1 được lai tạo và đánh giá tại Sapa; các nghiên cứu về đánh giá tính kháng 2
virus và đặc tính nông sinh học của các con soma và con lai BC1 được thực hiện tại Viện Sinh học Nông nghiệp (Học Viện Nông nghiệp Việt Nam) và đồng ruộng Quế Võ - Bắc Ninh. Những đóng góp mới của đề tài 1) Khẳng định được các thông số tách, nuôi cấy, dung hợp, tái sinh, xác định con lai soma phục vụ cho các nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần trên các vật liệu khoai tây nhị bội (A15, A16, A56, B186, B208), khoai tây dại (Solanum tarnii, Solanum pinatisectum, Solanum bulbocastanum) và khoai tây tứ bội (Rasant, Delikat, Atlantic). 2) Chứng minh và góp phần khẳng định được khả năng duy trì tính kháng bệnh virus PVY từ các dòng nhị bội của khoai tây trồng Solanum tuberosum và khả năng chuyển đặc tính kháng bệnh virus từ các loài khoai tây dại Solanum tarnii, Solanum pinatisectum, Solanum bulbocastanum sang khoai tây trồng tứ bội Solanum tuberosum qua dung hợp tế bào trần. 3) Đã tạo ra các dòng khoai tây 47/7, 47/26, 81-2, 131/11 là sản phẩm dung hợp của hai dòng nhị bội Solanum tuberosum và các dòng BC1 13.1300.3; BC1 13.1305.6 là sản phẩm lai lại của con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng. Các dòng này vừa có khả năng kháng bệnh virus PVY vừa mang các đặc tính nông sinh học quý có thể sử dụng cho chương trình tạo giống khoai tây kháng virus PVY có năng suất cao, phẩm chất tốt. Ý nghĩa khoa học của đề tài Đề tài đã chứng minh và góp phần khẳng định khả năng duy trì tính kháng virus và cải thiện đặc tính nông sinh học của các dòng nhị bội qua dung hợp tế bào trần và khả năng chuyển đặc tính kháng bệnh virus PVY từ các loài khoai tây dại Solanum tarnii, Solanum pinatisectum, Solanum bulbocastanum sang khoai tây trồng tứ bội Solanum tuberosum khi dung hợp tế bào trần. Con lai soma có thể làm vật liệu khởi đầu trong công tác chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus và mang đặc tính nông sinh học mong muốn. Đây là những dẫn liệu khoa học quý, mới mẻ phục vụ nghiên cứu, giảng dạy công nghệ tế bào thực vật, công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng. 3
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả nghiên cứu của đề tài luận án đã tạo ra các dòng khoai tây 47/7, 47/26, 81- 2, 131/11 là sản phẩm dung hợp của hai dòng nhị bội Solanum tuberosum và các dòng BC1 13.1300.3; BC1 13.1305.6 là sản phẩm lai lại của con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng. Các dòng này vừa có khả năng kháng bệnh virus, vừa mang các đặc tính nông sinh học quí có thể sử dụng cho chương trình tạo giống khoai tây kháng virus có năng suất cao, phẩm chất tốt. Ngoài ra, kết quả của đề tài cũng là cơ sở kỹ thuật để tham khảo xây dựng quy trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY, mang được những đặc tính nông sinh học mong muốn thông qua việc sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần. 4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây 1.1.1 Nguồn gốc Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một cây trồng cổ đại. Các bằng chứng về khảo cổ học, lịch sử và ngôn ngữ học cũng như thực vật học đều chứng minh rằng khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ. Nhiều loài khoai tây hoang dại còn tồn tại tới ngày nay, đặc biệt ở dãy Andes thuộc Peru, Bolivia [1]. Khoai tây được đem tới Tây Ban Nha và Châu Âu trong thế kỷ thứ 16, nhanh chóng thích nghi với điều kiện tự nhiên tại đây và sớm trở thành loại thực phẩm chính tại thời điểm mà dân số thế giới tăng nhanh. Khoai tây vào Pháp năm 1600 do hai nhà thực vật học người Thụy Sỹ C. Bauhin và J. Bauhin mang tới, được trồng rộng rãi vào năm 1773. Từ Châu Âu khoai tây sang tới Ấn Độ năm 1610, vào Trung Quốc năm 1700 và năm 1766 vào Nhật Bản. Khoai tây đến với Áo, Italia, Đức và các vùng lãnh thổ Châu Âu vào cuối thế kỷ XVII. Khoai tây được trồng trên quy mô lớn vào những năm 1800 và tới khoảng thế kỷ XIX mới thực sự phổ biến trên các châu lục. Ở Việt Nam, khoai tây được người Pháp đưa vào trồng năm 1890 ở một số vùng: Tú Sơn – Hải Phòng, Trà Lĩnh – Cao Bằng (1907), Thường Tín – Hà Tây (Hồ Hữu An, 2005). Hiện nay, khoai tây được trồng tập trung chủ yếu ở Đồng Bằng Sông Hồng, Sapa, Đà Lạt những vùng có khí hậu mát mẻ, ôn hòa… [9]. 1.1.2. Phân loại Khoai tây (Solanum tuberosum L.) thuộc loài S. tuberosum, chi Solanum, họ cà Solanaceae, bộ Solanales, phân lớp Asteridae, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta. Các loài khoai tây thuộc một chi (genus) rất lớn và rất đa dạng về mặt di truyền bao gồm 7 loài khoai tây trồng và 228 loài khoai tây dại (Hawkes, 1994). Trong 7 loài khoai tây trồng thì loài Solanum tuberosum có hai loài phụ đặc biệt quan trọng là S. tuberosum spp. Tuberosum (Tuberosum group) và S. tuberosum spp. Andigena (Andigena group) [10] Khoai tây trồng (Cultivated potatoes) Theo Hawkes (1994) có 7 loài khoai tây trồng có mức bội thể khác nhau với số lượng nhiễm sắc thể gốc 12 (x = 12), nằm trong phạm vi từ nhị bội cho tới ngũ bội. Bao gồm các loài nhị bội thể (diploid, 2n = 2x = 24) có S. Stenotonum, S. Ajanhuii và S. Phureja; tam bội thể (triploid, 2n = 3x = 36) có S. Chaucha và S. Juzepczukii; tứ bội thể (tetraploid, 2n = 4x = 48) có S.tuberosum (có 2 loài phụ là S.tuberosum. subsp. tuberosum và S.tuberosum. subsp. Andigena) và ngũ bội thể (pentaploid, 2n = 5x = 60) 5
có S. curtilobum. Trong các loài khoai tây trồng, loài phổ biến nhất, quan trọng nhất được trồng trên khắp thế giới là loài tứ bội S.tuberosum L. (2n = 4x = 48). Tuy nhiên, nền di truyền của của các giống Tuberosum ở Châu Âu và Bắc Mỹ là hẹp trong khi nhóm giống Andigena (loài phụ Solanum tuberosum subsp andigena) (2n = 4x = 48) trồng ở vùng cao Andes lại giàu về nguồn gen của nhiều tính trạng. [10, 11, 12] Khoai tây dại (Wild potatoes) Theo Hawkes (1994) khoai tây có số lượng các loài hoang dại nhiều hơn bất kỳ một loại cây trồng nào khác (228 loài). Chúng đều chứa cùng bộ NST gốc (x = 12) như các loài khoai tây trồng nhưng thay đổi trong phạm vi từ nhị bội (2n = 2x = 24) tới lục bội (2n = 6x = 72). Điều rất quan trọng là các dòng khoai tây dại này có phạm vi phân bố rất rộng rãi nên có tính thích nghi về mặt sinh thái rất lớn. Phạm vi phân bố của chúng là toàn bộ Nam Mỹ, từ vùng đồng bằng tới vùng núi cao (3000 - 4500m). Với phạm vi tồn tại cực kỳ rộng lớn, các loài khoai tây dại mang nhiều gen thích ứng với nhiều kiều kiện ngoại cảnh bất lợi cũng như chống chịu mạnh mẽ với nhiều loại sâu bệnh. Chính vì thế các loài khoai tây dại là nguồn gen rất phong phú về tính thích ứng với stress phi sinh học cũng như nguồn gen kháng quan trọng với nhiều loại sâu bệnh phục vụ chọn tạo giống. 1.1.3. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam 1.1.3.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới Khoai tây được xếp là cây lương thực quan trọng thứ 4 trên thế giới sau ngô, lúa mì, gạo và khoai tây được coi là cây lương thực không hạt quan trọng nhất với lượng sản xuất hàng năm đạt 376,8 triệu tấn (năm 2019) và ngày càng được tiêu thụ nhiều trong vài thập kỷ gần đây (World Potato Statiscs, 2019). Trung Quốc và Nga là hai nước có mức độ sản xuất khoai tây lớn nhất thế giới, khoảng 96 và 45,5 triệu tấn trong năm 2019. 6
Bảng 1.1. Mười lăm quốc gia sản xuất khoai tây nhiều nhất thế giới năm 2019 STT Quốc gia Khoai tây sản xuất (triệu tấn) 1 Trung Quốc 96,0 2 Ấn Độ 45,5 3 Nga 31,5 4 Ukraine 23,7 5 Mỹ 20,0 6 Đức 11,8 7 Bangladesh 9,45 8 Ba Lan 8,2 9 Pháp 8,0 10 Thụy Điển 7,33 11 Belarus 6,41 12 Anh 6,2 13 Iran 5,1 14 Thổ Nhĩ Kỳ 4,8 15 Peru 4,78 1.1.3.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam Ở Việt Nam, khoai tây do người Pháp đưa vào năm 1890, sau đó được trồng rộng rãi và tập trung chủ yếu ở lưu vực Đồng bằng sông Hồng. Trong những năm gần đây, sản xuất khoai tây ở nước ta đã có những bước tiến triển đáng kể về diện tích cũng như năng suất, chất lượng củ. Sô liệu thống kê của FAOSTAT (2018) qua 10 năm, từ năm 2007 đến năm 2017 đã chứng minh điều đó. 7
Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây của Việt Nam giai đoạn 2007 – 2017 Chỉ tiêu Diện tích Năng suất Sản lượng Năm (hecta) (tấn) (tấn/ha) 2007 36000 372000 10,33 2008 36000 380000 10,56 2009 37000 388000 10,49 2010 29663 352949 11,90 2011 22611 311604 13,78 2012 27585 403717 14,64 2013 23077 313383 13,58 2014 22823 321700 14,10 2015 21767 318321 14,62 2016 21173 302229 14,27 2017 20480 303675 14,83 Mặc dù diện tích trồng không mở rộng thêm, nhưng năng suất cây khoai tây không ngừng tăng lên qua các năm, đặc biệt là trong hai năm gần đây 2016 – 2017, năng suất khoai tây đạt 14,27 và 14,83 tấn/ha. Theo thời gian, cây khoai tây đã và đang khẳng định vị trí của mình, dần trở thành cây trồng quan trọng trong cơ cấu nông nghiệp của nước ta. Vấn đề khó khăn nhất hiện nay đối với ngành sản xuất khoai tây đó là giống, đặc biệt là các giống khoai tây sạch bệnh. Việc sử dụng một cách phổ biến các loại củ giống có chất lượng thấp để trồng, không sãn có nguồn củ giống tốt với giá cả hớp lý, thiếu những giống ưu tú về năng suất, chất lượng và đặc chống chịu được virus là những nguyên nhân chủ yếu hạn chế việc phát triển cây khoai tây. Hiện nay, giống khoai tây mà người dân sử dụng hầu hết do nông dân tự duy trì từ vụ này sang vụ khác hoặc giống do người dân tự mua không rõ nguồn gốc, do vậy mà giống không những bị thoái hóa mà còn có tỷ lệ nhiễm bệnh hại cao cộng với hao hụt 8