Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt (Furuncle) ở người

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:208

Thêm vào BST

Báo xấu

64
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án nhằm phân lập và định danh được một số dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại các vùng sinh thái có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus và xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và kháng oxy hóa từ cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với vi khuẩn Staphylococcus aureus.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt (Furuncle) ở người

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ HUỲNH VĂN TRƯƠNG NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH Ở CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata Thunb.) CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TRÊN VI KHUẨN Staphylococcus aureus TỪ MỤN NHỌT (Furuncle) Ở NGƯỜI LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành: 62420201 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ HUỲNH VĂN TRƯƠNG NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH Ở CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata Thunb.) CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TRÊN VI KHUẨN Staphylococcus aureus TỪ MỤN NHỌT (Furuncle) Ở NGƯỜI LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành: 62420201 Người hướng dẫn khoa học PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP 2021 i
XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG Luận án này với tựa đề “Phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt (Furuncle) ở người” do nghiên cứu sinh Huỳnh Văn Trương thực hiện theo sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp đã báo cáo và được Hội đồng thông qua. Ủy viên Thư ký (ký tên) (ký tên) Phản biện 1 Phản biện 2 (ký tên) (ký tên ) Cán bộ hướng dẫn Chủ tịch Hội đồng (ký tên) (ký tên ) i
LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Thầy PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp và cô PGS.TS. Đái Thị Xuân Trang đã dành nhiều thời gian, công sức và tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện luận án và học tại trường. Thầy cô đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho việc nghiên cứu và học tập tại Viện NC và PT Công nghệ sinh học, các nghiên cứu sinh và bạn Trần Chí Linh học viên cao học khóa 25 ngành Công nghệ sinh học của trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giúp cho tôi hoàn thành luận án. Xin được gửi lời biết ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Cần Thơ, trường Đại học Y Dược Cần Thơ; Ban lãnh đạo Viện NC và PT Công nghệ Sinh học và khoa Sau đại học, trường Đại học Cần Thơ cùng quý thầy cô và các đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập. Cuối cùng, sự thành công của luận án không thể không kể đến sự đóng góp không nhỏ của các thành viên trong gia đình, vợ Lý Tú Hương và con Huỳnh Gia Bảo, những người luôn ủng hộ, động viên và giúp tôi vượt qua rất nhiều khó khăn trong thời gian học tập. Trân trọng cảm ơn. Cần Thơ, ngày tháng năm 2021 Ký tên Huỳnh Văn Trương ii
ABSTRACT Many studies using Houttuynia cardata Thunb. for disease treatment are based on the fact that Houttuynia cardata Thunb. has antibacterial, anti- inflammatory and anti-oxidant activities. However, the study of endophytic bacteria and extracts of endophytic bacteria in Houttuynia cardata Thunb. with antibacterial activity on Staphylococcus aureus from furuncles in humans has not been studied. The objectives of the research were to isolate and identify some endophytic bacterial strains of Houttuynia cardata Thunb. with antibacterial activity on Staphylococcus aureus and determine antibacterial, anti- inflammatory and anti-oxidant activities of extracts of endophytic bacteria in Houttuynia cardata Thunb. with high antibacterial activity against Staphylococcus aureus. The result showed that 231 endophytic bacteria strains that are found in all parts of Houttuynia cardata Thunb. such as leaves, stems and roots of Houttuynia cardata Thunb. grown in various ecological regions such as salt water, brackish water and fresh water or sea, islands, high mountains and plains in Kien Giang, Soc Trang, An Giang and Can Tho. Among 231 strains 65 endophytic bacteria ones in Houttuynia cardata Thunb. with antibacterial activity on Staphylococcus aureus isolated from human furuncles. Thirteen endophytic bacteria strains in Houttuynia cardata Thunb. which had strongest antibacterial activity on Staphylococcus aureus with a sterile ring of 20-33 mm. Endophyic bacteria were identified and belonged to Bacillus genus. The ethyl acetate extract from selected endophytic bacterial culture (RGT2) determined antibacterial activity on Staphylococcus aureus bacteria strain with high concentration of minimal inhibitory extract (MIC) fluctuated from 80 to 160 µg/mL. The minimum bactericidal concentration (MBC) of the extract on the Staphylococcus aureus fluctuated from 640 to 1280 µg/mL. The antioxidant activity of ethyl acetate extract from selected endophytic bacterial fluid culture (RGT2) was determined through free radical neutralization methods DPPH, ABTS, RP, TAC and FRAP with EC50 iii
successive values of 57,38 µg/mL; 57,01 µg/mL; 32,00 µg/mL; 94,80 µg/mL and 41,41 µg/mL respectively. The anti-inflammatory activity of extracts was investigated based on the inhibitory activity of the denaturation of bovine serum albumin. Extraction was capable of 50% inhibition of denaturation at a concentration of 73,74 µg/mL. The result of this study showed that endophytic bacteria strain (RGT2) in Houttuynia cardata Thunb not only has antibacterial activity, but also has antioxidant and anti-inflammatory activities which are potential in treatment of human diseases of furuncles and skin infections caused by Staphylococcus aureus. Keywords: Antibacterial, Bacillus sp., endophytic bacteria, furuncle, Houttuynia cordata Thunb. iv
TÓM TẮT Nhiều công trình nghiên cứu cây Diếp cá cho việc điều trị bệnh dựa trên cơ sở cây Diếp cá có các hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và kháng oxy hóa. Tuy nhiên, việc nghiên cứu vi khuẩn nội sinh và cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người chưa được nghiên cứu nhiều. Mục tiêu của luận án là phân lập và định danh được một số dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, kháng oxy hóa của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn cao với vi khuẩn Staphylococcus aureus. Kết quả nghiên cứu phân lập được 231 dòng vi khuẩn nội sinh, các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được đều hiện diện ở các bộ phận như lá, thân và rễ của cây Diếp cá, trồng tại các vùng sinh thái như nước mặn, nước lợ và nước ngọt hay biển đảo, núi cao và đồng bằng thể hiện ở Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ. Trong số 231 dòng có 65 dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập từ mụn nhọt ở người. Mười ba dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trên dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus với vòng vô khuẩn từ 20 – 33 mm. Các dòng vi khuẩn nội sinh được nhận diện thuộc chi Bacillus. Cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) được tuyển chọn nghiên cứu, có nồng độ cao chiết ức chế tối thiểu (MIC) dao động từ 80 đến 160 µg/mL. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết trên dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus dao động từ 640 đến 1280 µg/mL. Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấy tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) được tuyển chọn nghiên cứu, xác định thông qua các phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH, ABTS+, RP, TAC và FRAP với giá trị EC50 lần lược là 57,38 µg/mL, 57,01 µg/mL, 32,00 µg/mL, v
94,80 µg/mL và 41,41 µg/mL. Ngoài ra, hoạt tính kháng viêm của cao chiết được khảo sát dựa trên hoạt tính ức chế sự biến tính của albumin huyết thanh bò, có khả năng ức chế 50% sự biến tính ở nồng độ 73,74 µg/mL. Kết quả nghiên cứu chứng tỏ được rằng dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) ở cây Diếp cá không chỉ có hoạt tính kháng khuẩn mà còn có khả năng kháng oxy hóa, kháng viêm rất có tiềm năng trong lĩnh vực điều trị các bệnh lý cho con người về mụn nhọt và nhiễm khuẩn da do vi khuẩn Staphylococcus aureus. Từ khóa: Bacillus sp., cây Diếp cá, hoạt tính kháng khuẩn, mụn nhọt, vi khuẩn nội sinh. vi
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án “Nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt (Furuncle) ở người” là công trình nghiên cứu của tôi với sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được người khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp NCS. Huỳnh Văn Trương vii
MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ .................................................................................................... ii ABSTRACT...................................................................................................... iii TÓM TẮT .......................................................................................................... v LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ vii MỤC LỤC ...................................................................................................... viii DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... xv DANH MỤC HÌNH ....................................................................................... xvii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................ xix Chương 1. GIỚI THIỆU .................................................................................... 1 1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu ...................................................................... 1 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ................................................................ 2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát ................................................................................ 2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể ..................................................................................... 2 1.3 Nội dung nghiên cứu.................................................................................... 3 1.4 Những đóng góp mới về khoa học............................................................... 4 1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ........................................................ 4 Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 5 2.1 Đặc điểm thực vật cây Diếp cá .................................................................... 5 2.1.1 Phân loại ............................................................................................... 6 2.1.2 Thành phần hóa học ............................................................................. 6 2.1.2.1 Tinh dầu ........................................................................................ 6 2.1.2.2 Flavonoid ...................................................................................... 6 2.1.2.3 Alkaloid ......................................................................................... 7 2.1.2.4 Acid hữu cơ và acid béo................................................................ 7 2.1.2.5 Sterol ............................................................................................. 7 2.1.2.6 Các acid amin ................................................................................ 8 2.1.2.7 Các thành phần khác ..................................................................... 8 2.1.3 Công dụng của cây Diếp cá .................................................................. 8 2.1.3.1 Tác dụng kháng khuẩn .................................................................. 8 2.1.3.2 Tác dụng kháng virus .................................................................... 9 viii
2.1.3.3 Tác dụng hoạt tính tế bào ung thư................................................. 9 2.1.3.4 Tác dụng kháng viêm .................................................................. 10 2.1.3.5 Tác dụng kháng dị ứng................................................................ 10 2.1.3.6 Tác dụng kháng oxy hóa ............................................................. 10 2.1.3.7 Các tác dụng khác ....................................................................... 11 2.2 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh thực vật ....................................................... 11 2.2.1 Vi khuẩn nội sinh thực vật ................................................................. 11 2.2.2 Các dòng vi khuẩn nội sinh thực vật thường gặp ............................... 13 2.2.2.1 Vi khuẩn Pseudomonas sp. ......................................................... 13 2.2.2.2 Vi khuẩn Burkholderia sp. .......................................................... 14 2.2.2.3 Vi khuẩn Bacillus sp. .................................................................. 14 2.3 Tổng quan về da người .............................................................................. 15 2.3.1 Thượng bì (epidemis) ......................................................................... 16 2.3.2 Trung bì (dermis)................................................................................ 16 2.3.3 Hạ bì (hypodermis) ............................................................................. 17 2.3.4 Phần phụ của da .................................................................................. 17 2.3.4.1 Thần kinh da................................................................................ 17 2.3.4.2 Tuyến mồ hôi .............................................................................. 17 2.4 Vi khuẩn Staphylococcus aureus ............................................................... 20 2.5 Sơ lược về khuếch tán đĩa thạch (Disk diffusion assay) ............................ 22 2.6 Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử ..................................................... 23 2.6.1 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction ................................................. 23 2.6.2 Giải trình tự DNA ............................................................................... 24 2.6.3 Phần mềm phân tích trình tự DNA ..................................................... 25 2.7 Nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu ......................... 25 2.8 Phương pháp xác định tác nhân oxy hóa ................................................... 26 2.9 Sơ lược về viêm ......................................................................................... 34 2.9.1 Giới thiệu về viêm .............................................................................. 34 2.9.2 Phân loại viêm .................................................................................... 34 2.9.3 Các tác nhân gây viêm........................................................................ 34 2.9.4 Cơ chế đáp ứng của viêm ................................................................... 35 ix
2.9.5 Điều trị viêm ....................................................................................... 36 Chương 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 38 3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................. 38 3.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ...................................................... 38 3.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu ................................................................. 38 3.1.1.2 Phạm vi nghiên cứu..................................................................... 38 3.1.1.3 Thời gian nghiên cứu .................................................................. 38 3.1.1.4 Địa điểm nghiên cứu ................................................................... 38 3.1.2 Vật liệu ............................................................................................... 38 3.1.3 Dụng cụ và thiết bị ............................................................................. 39 3.1.4 Hóa chất .............................................................................................. 40 3.1.5 Công thức môi trường nuôi cấy.......................................................... 41 3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 41 3.2.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu trong nghiên cứu .......................... 41 3.2.1.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus .................................................... 41 3.2.2 Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá ............................... 42 3.2.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá ................................. 42 3.2.3 Khảo sát đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn được phân lập. 44 3.2.3.1 Mô tả đặc điểm khuẩn lạc quan sát vi khuẩn trên đĩa thạch môi trường PDA......................................................................................... 44 3.2.3.2 Khảo sát khả năng di động .......................................................... 44 3.2.3.3 Khảo sát tế bào vi khuẩn ............................................................. 44 3.2.4 Xác định khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được ở cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus. ............... 45 3.2.4.1 Tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus. ................................................ 45 3.2.4.2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus ............................. 46 3.3 Nhận diện những dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn cao trên vi khuẩn Staphylococcus aureus .......................................................... 46 3.3.1 Ly trích DNA vi khuẩn ....................................................................... 46 x
3.3.2 Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR ............................... 47 3.3.3 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose ............................................. 48 3.4 Khảo sát dịch nội bào, dịch ngoại bào và dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus ................................................................................ 49 3.5 Điều chế các cao chiết từ dịch nuôi dòng vi khuẩn nội sinh ..................... 50 3.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethyl acetate từ vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá. ...................................................................................... 50 3.6.1 Định tính thành phần hóa học trong của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh .................................................................... 50 3.6.1.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm alkaloid .... 51 3.6.1.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm flavonoid .. 51 3.6.1.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm steroid – tri terpenoid ............................................................................................. 52 3.6.1.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm glycoside .. 52 3.6.1.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm saponin ..... 53 3.6.1.7 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm tannin ....... 53 3.6.1.8 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm polyphenol 53 3.6.2 Định lượng thành phần hóa học trong cao chiết ly trích từ dịch nuôi dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá ........................................................ 53 3.6.3 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ................................... 54 3.6.3.1 Phương pháp khuếch tán giếng thạch bằng cách xác định đường kính vòng vô khuẩn ............................................................................ 54 3.6.3.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC ................ 55 3.6.3.3 Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) ...... 56 3.7 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ethyl acetate từ dòng vi khuẩn nội sinh in vitro ................................................................................. 56 3.7.1 Phương pháp kháng oxy hóa tổng (TAC) .......................................... 56 3.7.2 Phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS ........................................... 57 3.7.3 Phương pháp xác định năng lực khử (RP) ......................................... 57 3.7.4 Khảo sát hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH .................................... 58 xi
3.7.5 Phương pháp xác định tiềm năng khử (FRAP) .................................. 58 3.8 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro của cao chiết ly trích từ vi khuẩn nội sinh ........................................................................................................ 59 3.9 Phân tích và xử lý số liệu ........................................................................... 59 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 60 4.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá trồng ở Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ. .................................................. 60 4.1.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn phân lập ở cây Diếp cá tại Kiên Giang ....................................................................................................... 60 4.1.2 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại Sóc Trăng ....................................................................................................... 61 4.1.3 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại An Giang ....................................................................................................... 62 4.1.4 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại Cần Thơ .......................................................................................................... 64 4.1.5 Kết quả khảo sát các đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm của các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá phân lập được trong nghiên cứu .............. 65 4.1.5.1 Kết quả khảo sát đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá ............................................................................... 65 4.1.5.2 Kết quả khảo sát đặc điểm của các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá ................................................................................................ 67 4.2 Kết quả khảo sát đặc điểm pH đất trồng cây Diếp cá trong nghiên cứu ... 69 4.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus...................................................... 70 4.3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại tỉnh Kiên Giang ..................... 70 4.3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại tỉnh Sóc Trăng ....................... 71 4.3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại tỉnh An Giang ........................ 72 xii
4.3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại Cần Thơ ................................. 74 4.3.5 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphyloccus aureus tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ ............................................................................. 75 4.4. Kết quả giải trình tự vùng 16S rRNA của 13 dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá tại 13 địa điểm lấy mẫu nghiên cứu ............................................... 81 4.5 Cây phả hệ của các dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus ............................................... 83 4.6. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch ngoại bào, dịch nội bào và dịch nuôi tăng sinh của dòng vi khuẩn RGT2 trên vi khuẩn Staphylococcus aureus ................................................................................ 86 4.7 Kết quả điều chế, định tính và định lượng thành phần hóa học cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 là vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá ........... 89 4.7.1 Điều chế cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 . 89 4.7.2 Định tính các nhóm hóa học từ cao chiết dịch nuôi dòng vi khuẩn RGT2 ....................................................................................................... 89 4.7.3 Định lượng hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid toàn phần từ cao chiết dịch nuôi dòng vi khuẩn RGT2 ...................................................... 90 4.8 Kết quả khảo sát đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 và kháng sinh vancomycin trên vi khuẩn Staphylococcus aureus ..................................................................... 92 4.9 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 và kháng sinh vancomycin trên vi khuẩn Staphylococcus aureus ... 97 4.10 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2. ........................................................ 102 4.10.1 Kết quả khảo sát hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH .................. 102 4.10.2 Kết quả hiệu quả khảo sát hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS.+.. 103 4.10.3 Kết quả tiềm năng kháng oxy hóa tổng (TAC) .............................. 105 xiii
4.10.4 Kết quả tiềm năng khử (FRAP) của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2. ............................................................ 107 4.10.5 Kết quả năng lực khử (RP) của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2. .................................................................... 109 4.10.6 So sánh kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 của các phương pháp trong nghiên cứu ............................................................................................. 111 4.11 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng viêm của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) ở cây Diếp cá. ................................. 113 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................ 117 5.1 Kết luận .................................................................................................... 117 5.2 Đề xuất ..................................................................................................... 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 119 Phụ lục nghiên cứu ........................................................................................- 1 - xiv
DANH MỤC BẢNG Bảng 3. 1 Thành phần môi trường PDA .......................................................... 41 Bảng 3. 2 Thành phần môi trường PDA bán đặc............................................. 41 Bảng 3. 3 Thành phần hóa chất của phản ứng PCR ........................................ 48 Bảng 4. 1 Địa điểm nơi lấy mẫu và phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại Kiên Giang ................................................................................ 60 Bảng 4. 2 Địa điểm lấy mẫu và phân lập vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá tại Sóc Trăng .............................................................................................. 61 Bảng 4. 3 Địa điểm nơi lấy mẫu và phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại An Giang ................................................................................... 63 Bảng 4. 4 Địa điểm nơi lấy mẫu và phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại Cần Thơ ..................................................................................... 64 Bảng 4. 5 Đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập được ở cây Diếp cá tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ ........................ 66 Bảng 4. 6 Đặc điểm các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được ở cây Diếp cá tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ ........................ 67 Bảng 4. 7 Đặc điểm pH đất trồng cây Diếp cá nơi lấy mẫu để phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ................................................................... 69 Bảng 4. 8 Đường kính (mm) vòng vô khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại Kiên Giang có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus aureus ............................................................................................. 70 Bảng 4. 9 Đường kính (mm) vòng vô khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại Sóc Trăng có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus aureus ............................................................................................. 72 Bảng 4. 10 Đường kính (mm) vòng vô khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại An Giang có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus aureus ............................................................................................. 73 xv
Bảng 4. 11 Đường kính (mm) vòng vô khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại Cần Thơ có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus aureus ............................................................................................. 74 Bảng 4. 12 Kết quả giải trình tự các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá được tuyển chọn tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ ........................................................................................................ 82 Bảng 4. 13 Kết quả khảo sát đường kính (mm) vòng vô khuẩn của dịch nội bào, dịch ngoại bào và dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh ........................................................................................................ 86 Bảng 4. 14 Kết quả khảo sát các nhóm chức có hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 ........................................ 90 Bảng 4. 15 Kết quả hàm lượng polyphenol và flavonoid của cao chiết .......... 91 Bảng 4. 16 Đường kính (mm) vòng vô khuẩn ở các nồng độ của cao chiết và vancomycin trên Staphylococcus aureus ....................................... 93 Bảng 4. 17 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết và vancomycin ............................................. 97 Bảng 4. 18 Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 ................................................... 103 Bảng 4. 19 Hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS+ của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 ................................................... 105 Bảng 4. 20 Giá trị Absorbance (Abs) và hàm lượng chất kháng oxy hóa tương đương (µg/mL) của cao chiết ....................................................... 106 Bảng 4. 21 Giá trị độ hấp thu quang phổ (Abs) và hàm lượng chất kháng oxy hóa tương đương (µg/mL) của trolox và cao chiết (mg/mL) ....... 108 Bảng 4. 22 Giá trị Abs của chất chuẩn trolox ................................................ 109 Bảng 4. 23 Giá trị Abs và hàm lượng kháng oxy hóa tương đương trolox của cao chiết ........................................................................................ 110 Bảng 4. 24 Nồng độ trung hòa và khử được 50% gốc tự do của cao chiết ... 111 Bảng 4. 25 Hoạt tính kháng viêm của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) và chất đối chứng Diclofenac................. 114 xvi
Bảng 4. 26 Giá trị IC50 của hoạt tính kháng viêm của cao chiết và chất Diclofenac .................................................................................... 115 xvii
DANH MỤC HÌNH Hình 2. 1 Cây Diếp cá sử dụng trong nghiên cứu ............................................. 5 Hình 2. 2 Cơ chế xâm nhập của vi khuẩn nội sinh thực vật ............................ 13 Hình 2. 3 Vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá chụp KHV điện tử quét SEM ...... 15 Hình 2. 4 Cấu tạo của da cơ thể người ............................................................ 16 Hình 2. 5 Sơ đồ cấu tạo của lông, nang lông và hành lông ............................. 18 Hình 2. 6 Vi khuẩn Staphylococcus aureus chụp KHV điện tử quét SEM ..... 21 Hình 2. 7 Viêm nang lông do tụ cầu ................................................................ 22 Hình 3. 1 Cây, thân và rễ cây Diếp cá ............................................................. 42 Hình 3. 2 Lá và thân cây Diếp cá sử dụng trong nghiên cứu .......................... 42 Hình 3. 3 Quy trình phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá ....................... 42 Hình 3. 4 Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các dòng VKNS ..... 45 Hình 3. 5 Vòng vô khuẩn khảo sát tính kháng khuẩn của dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá trên Staphylococcus aureus ............................. 46 Hình 3. 6 Quy trình ly trích DNA của vi khuẩn nội sinh ................................ 46 Hình 3. 7 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR...................................................... 47 Hình 4. 1 Cây phả hệ các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus aureus trong nghiên cứu .......... 84 Hình 4. 2 Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá dòng RGT2 trên Staphylococcus aureus ........................................ 88 Hình 4. 3 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 và vancomycin trên Staphylococcus aureus ....................... 94 Hình 4. 4 Đường kính (mm) vòng vô khuẩn của cao chiết từ dịch nuôi dòng RGT2 và kháng sinh thương mại Vancomycin trên Staphylococcus aureus .. 95 Hình 4. 5 Thử nghiệm cao chiết và kháng sinh vancomycin .......................... 98 Hình 4. 6 Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh ............................................................................................... 100 Hình 4. 7 Hiệu suất trung hòa gốc tự do DPPH của trolox ........................... 102 Hình 4. 8 Hiệu suất trung hòa gốc tự do ABTS của trolox ........................... 104 xvii