Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:221

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học "Tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên" trình bày các nội dung chính sau: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ cây hồ tiêu tại Tây Nguyên, định danh các chủng có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium và kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ trên cây hồ tiêu tại Tây Nguyên; Nghiên cứu đặc tính và xác định hoạt chất kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne của các chủng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG TUYỂN CHỌN, NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH KHÁNG TÁC NHÂN GÂY BỆNH VÀ TẠO CHẾ PHẨM PHÒNG TRỪ BỆNH RỄ CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÙNG RỄ CÂY HỒ TIÊU (Piper nigrum L.) TẠI TÂY NGUYÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh – 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG TUYỂN CHỌN, NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH KHÁNG TÁC NHÂN GÂY BỆNH VÀ TẠO CHẾ PHẨM PHÒNG TRỪ BỆNH RỄ CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÙNG RỄ CÂY HỒ TIÊU (Piper nigrum L.) TẠI TÂY NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS. TS Nguyễn Anh Dũng 2. TS. Lê Thị Ánh Hồng Tp. Hồ Chí Minh – 2022
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. TS Nguyễn Anh Dũng và TS. Lê Thị Ánh Hồng. Các số liệu và kết quả thu được trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Trịnh Thị Huyền Trang
LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, thực hiện luận án tôi đã nhận được sự quan tâm, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Quý cơ quan, thầy cô, đồng nghiệp, anh chị, bạn bè và gia đình. Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến GS. TS Nguyễn Anh Dũng và TS. Lê Thị Ánh Hồng, những người thầy, người hướng dẫn khoa học mà tôi hết mực kính trọng đã luôn tận tình chỉ bảo và hướng dẫn các nội dung, phương pháp và thực hiện các thí nghiệm cũng như giúp tôi trưởng thành hơn trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận án; TS. Võ Thị Phương Khanh, một người thầy đặc biệt đã luôn dìu dắt, giúp đỡ, chỉ bảo và động viên, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Em xin được gửi đến cô lòng biết ơn chân thành và sâu sắc. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh và Phòng đào tạo Sau đại học thuộc Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn tất các môn học trong suốt quá trình học tập tại Viện. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Trường ĐH Tây Nguyên, Khoa KHTN&CN, Viện CNSH&MT đã luôn hỗ trợ, hướng dẫn giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. Các bạn bè, đồng nghiệp, đặc biệt là quý thầy cô trong Bộ môn Sinh học, Khoa KHTN&CN đã luôn hỗ trợ, tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận án. Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tập thể Quý thầy cô, bạn bè. Gia đình đã luôn bên tôi, yêu thương, động viên, chia sẻ khó khăn, buồn vui và là động lực để tôi cố gắng và hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn các đề tài cấp Bộ thuộc Chương trình khoa học và công nghệ “Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học trong phát triển bền vững cây hồ tiêu (Piper Nigrum L.) ở Tây Nguyên” của Bộ Giáo dục và Đào tạo đã hỗ trợ một phần kinh phí cho các nghiên cứu trong luận án này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới các em sinh viên yêu quý lớp CNSH &SH K14, CNSH &SH K15, CNSH&SH K16 đã đồng hành và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận án Tác giả luận án Trịnh Thị Huyền Trang
MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của luận án .......................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án ............................................................................2 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án ...........................................................2 4.Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.....................................................................2 4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................2 4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................................3 5. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................................3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................4 1.1. Tổng quan về cây hồ tiêu .....................................................................................4 1.1.1. Vị trí phân loại ..................................................................................................4 1.1.2. Đặc điểm thực vật học cây hồ tiêu ....................................................................4 1.2. Thực trạng sản xuất hồ tiêu của Việt Nam và các tỉnh Tây Nguyên ...................6 1.2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu ở các tỉnh Tây Nguyên ...................6 1.2.2. Tình hình sâu bệnh hại trên cây hồ tiêu ở Tây Nguyên ....................................7 1.3. Bệnh hại rễ trên cây hồ tiêu .................................................................................8 1.3.1. Bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu do Phytophthora ..........................................8 1.4. Các giải pháp tổng hợp để kiểm soát dịch bệnh trên cây hồ tiêu và sản xuất bền vững ...........................................................................................................................20 1.4.1. Thiết kế vườn trồng hồ tiêu ............................................................................20 1.4.2. Vệ sinh đồng ruộng .........................................................................................21 1.4.3. Sử dụng giống chống chịu bệnh ......................................................................21 1.4.4. Sử dụng phân bón cân đối, hợp lý cho cây hồ tiêu .........................................21 1.4.5. Phòng trừ bằng thuốc bảo vệ thực vật .............................................................22 1.4.6. Biện pháp sinh học ..........................................................................................22 1.5. Vai trò của các chủng vi khuẩn vùng rễ trong kiểm soát sinh học ....................23 1.5.1. Vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ ...........................................................................23 1.5.2. Sự phân bố của vi khuẩn vùng rễ ....................................................................24 1.5.3. Cơ chế kháng bệnh rễ trên cây hồ tiêu của vi khuẩn vùng rễ .........................24 1.6. Tình hình nghiên cứu về vi sinh vật vùng rễ trên cây hồ tiêu ............................28 i
1.6.1. Trên thế giới ....................................................................................................28 1.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ....................................................................30 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................34 2.1.Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................34 2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................36 2.2.1. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ cây hồ tiêu tại Tây Nguyên, định danh các chủng có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium và kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ trên cây hồ tiêu tại Tây Nguyên ...36 2.2.2. Nghiên cứu đặc tính và xác định hoạt chất kháng Phytophthora/Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne của các chủng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn .......51 2.2.3. Bước đầu tạo chế phẩm vi sinh phòng trừ nấm và tuyến trùng từ các chủng vi khuẩn tuyển chọn ......................................................................................................63 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu...............................................................................64 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................65 3.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ cây hồ tiêu tại Tây Nguyên, định danh các chủng có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium và kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ trên cây hồ tiêu tại Tây Nguyên .............................65 3.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ ở cây hồ tiêu trong điều kiện in vitro .......................................................................................................65 3.1.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ ở cây hồ tiêu trong điều kiện vườn ươm ..................................................................................................74 3.1.3. Định danh các chủng có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium, kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ ở cây hồ tiêu .................................................92 3.2. Nghiên cứu đặc tính và xác định hoạt chất kháng Phytophthora/Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne của các chủng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn .................98 3.2.1. Nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn vùng rễ tuyển chọn ...................................................................................................................................98 3.2.2. Xác định đặc tính kháng Phytophthora, Fusarium của chủng vi khuẩn tuyển chọn .........................................................................................................................105 ii
3.2.3. Phân tách, xác định cấu trúc và hoạt tính kháng tuyến trùng, kháng nấm của các hợp chất thứ cấp từ chủng vi sinh vật tuyển chọn ............................................120 3.3. Bước đầu tạo chế phẩm vi sinh phòng trừ nấm và tuyến trùng từ các chủng vi khuẩn tuyển chọn ....................................................................................................126 3.3.1. Sản xuất chế phẩm vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng Phytophthora ......126 3.3.2. Sản xuất chế phẩm vi sinh vật ngoại sinh vùng rễ có khả năng kháng nấm Fusarium .................................................................................................................128 3.3.3. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật ngoại sinh vùng rễ có khả năng kháng tuyến trùng ..............................................................................................................130 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................133 1. Kết luận ...............................................................................................................133 2. Kiến nghị .............................................................................................................133 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................134 iii
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích AE : Antagonistic Efficacy (Hiệu suất đối kháng) B : Bacillus BM : Buôn Ma Thuột BH : Buôn Hồ DS : Đắk Song DC : Đức Cơ DR : Đắk Rlấp ĐC : Đối chứng Cs : Cộng sự CS : Chư Suê CP : Chư Pứh CJ : Cư Jut CK : Cư Kuin EK : Ea Kar F : Fusarium HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) IJ : Infective Juvenile (Ấu trùng cảm nhiễm) ISR : Induced Systemic Resistance (Hệ thống kháng cảm ứng) KN : Krông Năng LB : Luria-Bertani Broth LC-MS : Liquid chromatography-mass spectrometry M : Meloidogyne NMR : Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) NNPTNT : Nông nghiệp Phát triển nông thôn P : Phytophthora PGA : Potato Glucose Agar PGPR : Plant-Growth Promoting Rhizobacteria (Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật) PPN : Plant parastic nematodes (Tuyến trùng ký sinh thựcvật) PPA : Penicillin và Pimaricin Agar RB Rhizobacteria (Vi khuẩn vùng rễ) RKN : Root knot nematode (tuyến trùng gây sần rễ) VSV : Vi sinh vật iv
DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Diện tích, sản lượng hồ tiêu của Việt Nam từ năm 2010-2019 ..................6 Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu một số vùng chính ở Việt Nam 7 Bảng 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ có tiềm năng kháng Phytophthora capsici ......................................................................................42 Bảng 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn chủng vi sinh vật vùng rễ có khả năng kháng nấm Fusarium trên cây hồ tiêu con trong điều kiện vườn ươm .....................44 Bảng 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn chủng vi sinh vật vùng rễ có khả năng kháng tuyến trùng Meloidogyne sp. trên cây hồ tiêu con trong điều kiện vườn ươm ...................................................................................................................................47 Bảng 2.4. Thành phần của môi trường nuôi cấy vi khuẩn ........................................51 Bảng 2.5. Chương trình pha động trên cột C18 ........................................................56 Bảng 3.1. Hiệu suất đối kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ cây hồ tiêu tại 3 tỉnh Tây Nguyên .............................................................................66 Bảng 3.2. Hiệu quả kháng Phytophthora capsici trên đoạn thân hồ tiêu ...................68 Bảng 3.3. Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đối với nấm Fusarium trong điều kiện in vitro ..............................................................................................69 Bảng 3.4. Khả năng kháng nấm Fusarium sp. trên đoạn thân hồ tiêu của 06 chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu .........................................................................................71 Bảng 3.5. Tỷ lệ tử vong tuyến trùng của 43 chủng vi khuẩn vùng rễ .......................73 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến sinh trưởng thân, lá của cây hồ tiêu sau 90 ngày lây nhiễm Phytophthora capsici ..................................................................75 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến sinh trưởng rễ của cây hồ tiêu sau 90 ngày lây nhiễm Phytophthora ...................................................................................76 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn vùng rễ đến một số chỉ tiêu sinh trưởng và kháng bệnh của cây hồ tiêu vườn ươm sau 90 ngày lây nhiễm Phytophthora .........77 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đến sinh trưởng thân và lá của cây hồ tiêu vườn ươm................................................................................................80 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đến sinh trưởng rễ và mật độ vi sinh vật tổng số trong đất của cây hồ tiêu vườn ươm ...........................................81 v
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến một số chỉ tiêu sinh trưởng và kháng bệnh của cây hồ tiêu sau 120 ngày lây nhiễm nấm Fusarium ..................................84 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đến sinh trưởng thân và lá của cây hồ tiêu vườn ươm ...........................................................................................................85 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đến rễ của cây hồ tiêu ...................87 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đến một số chỉ tiêu bệnh trên cây hồ tiêu trong vườn ươm..................................................................................................88 Bảng 3.15. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa của các chủng có hoạt tính kháng nấm và tuyến trùng cao .............................................................................................92 Bảng 3.16. Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA các chủng có hoạt tính kháng nấm và tuyến trùng cao ....................................................93 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của chủng RB.DS29 ...................................................................................................................................98 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của chủng RB.CJ41 và RB.EK7 ................................................................................................................99 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của chủng RB.DS29, RB.CJ41 và RB.EK7 ...................................................................................................................100 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn RB.DS29 .................................................................................................................................101 Bảng 3.21. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng RB.DS29, RB.CJ41 và RB.EK7 ..............................................................................................................103 Bảng 3.22. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh trưởng của chủng RB.DS29, RB.CJ41 và RB.EK7 ..............................................................................................................104 Bảng 3.23. Khả năng ức chế nấm bệnh của các dịch nuôi cấy chủng RB.DS29 ....106 Bảng 3.24. Các hợp chất thứ cấp kháng Phytophthora của của chủng RB.DS29 bằng phân tích GC-MS ....................................................................................................108 Bảng 3.25. Phân tích LC- MS các hợp chất kháng Phytophthora của chủng RB.DS29 .................................................................................................................................109 Bảng 3.26. Khả năng ức chế nấm bệnh của các dịch nuôi cấy chủng RB.CJ41 .....110 Bảng 3.27. Kết quả phân tích GC-MS của chủng Bacillus subtilis RB.CJ41 chứa 8 chất có các đỉnh (peak) rõ .......................................................................................113 Bảng 3.28. Kết quả phân tích LC-MS của chủng Bacillus subtilis RB.CJ41 .........114 vi
Bảng 3.29. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng RB.EK7 đến tỷ lệ tử vong (%) tuyến trùng Meloidogyne sp. .............................................................................................115 Bảng 3.30. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng RB.EK7 đến tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng Meloidogyne sp. .............................................................................................117 Bảng 3.31 Kết quả phân tích GC-MS các hợp chất hoá học do chủng vi khuẩn RB.EK7 tổng hợp ....................................................................................................119 Bảng 3.32 Khả năng ức chế tuyến trùng Meloidogyne sp. của cao chiết phân đoạn .................................................................................................................................121 Bảng 3.33. Ảnh hưởng của dẫn xuất của Uracil đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng .................................................................................123 Bảng 3.34. Ảnh hưởng của dẫn xuất của Thymine đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng ............................................................................123 Bảng 3.35. Ảnh hưởng của hexahydropyrrolo [1,2-a] pyrazine-1,4-dione đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng .........................................124 Bảng 3.37. Hiệu suất đối kháng (%) nấm Fusarium sp. của dẫn xuất của Uracil, dẫn xuất của Thymine và hexahydropyrrolo [1,2-a] pyrazine-1,4-dione ......................125 Bảng 3.38. Ảnh hưởng của chất mang đến mật độ chủng RB.DS29 ......................126 Bảng 3.39. Ảnh hưởng của chất mang đến khả năng kháng nấm của vi khuẩn Bacillus velezensis RB.DS29 ................................................................................................128 Bảng 3.40. Ảnh hưởng của chất mang đến mật độ chủng RB.CJ41 .......................129 Bảng 3.41. Ảnh hưởng của chất mang đến hiệu suất đối kháng (%) nấm Fusarium oxysporum của vi khuẩn Bacillus subtilis RB.CJ41 ...............................................130 Bảng 3.43. Ảnh hưởng của chất mang đến hoạt tính kháng tuyến trùng trong in vitro của chế phẩm chứa chủng RB.EK7.........................................................................132 vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1. Vòng đời của Phytophthora capsici và tác nhân gây hại [37] ..................10 Hình 1.2. Bào tử hậu của các loài Fusarium [45], [50] ............................................14 Hình 1.3. Bào tử đính lớn [53] ..................................................................................15 Hình 1.4. Sự hình thành và các loại bào tử đính nhỏ do các loài Fusarium tạo ra ...16 Hình 1.5. Chu kỳ sống của tuyến trùng sần rễ [64] ..................................................18 Hình 2.1. Thông số thiết bị MS/MS dùng để nhận danh ..........................................57 Hình 2.2 Quy trình điều chế cao chiết ......................................................................59 Hình 2.3. Quy trình phân tách các hợp chất VK01, VK02, VK03 và VK05 ............60 Hình 2.4. Quy trình phân tách thu nhận hợp chất VK04 ..........................................62 Hình 3.1 Khả năng kháng Phytophthora của một số chủng vi khuẩn sau 7 ngày ....65 Hình 3.2. Tác động của vi khuẩn vùng rễ đến hệ sợi Phytophthora ........................67 Hình 3.3 Chiều dài của đoạn thân hồ tiêu sau 4 ngày lây nhiễm Phytophthora .......68 Hình 3.4. Khả năng đối kháng nấm bệnh Fusarium của 6 chủng vi khuẩn vùng rễ.70 Hình 3.5. Khả năng kháng nấm Fusarium sp. của 06 chủng vi khuẩn vùng rễ trên đoạn thân hồ tiêu .......................................................................................................71 Hình 3.6. Chiều cao cây hồ tiêu sau 90 ngày lây nhiễm với nấm bệnh ....................78 Hình 3.7. Chiều cao cây và chiều dài rễ của cây hồ tiêu vườn ươm.........................82 Hình 3.8 Mật độ vi sinh vật tổng số trong đất hồ tiêu ở các nghiệm thức ................83 Hình 3.9. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đến mật độ VSV tổng số .................91 Hình 3.10. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của 3 chủng RB.DS29, RB.CJ41 và RB.EK7 .....................................................................................................................93 Hình 3.11. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của chủng RB.DS29 với các chủng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI .............................................................................94 Hình 3.12. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của chủng RB.CJ41 với các chủng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI .................................................................................94 Hình 3.13. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của chủng RB.CJ41 với các chủng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI .................................................................................95 Hình 3.14. Cây phân loại thể hệ mối liên quan giữa chủng RB.DS29, RB.CJ41 và RB.EK7 với các loài gần gũi dựa trên trình tự 16S rRNA .......................................96 viii
Hình 3.15. Mối tương quan giữa hoạt tính enzyme và hoạt tính kháng Phytophthora .................................................................................................................................107 Hình 3.16. Mối tương quan giữa hoạt tính enzyme và hoạt tính kháng Fusarium .111 Hình 3.17. Hệ sợi nấm Fusarium dưới tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn RB.CJ41khi bổ sung bào tử nấm Fusarium sp. ......................................................112 Hình 3.18. Mối tương quan giữa hoạt tính enzyme và tỷ lệ tử vong tuyến trùng ...116 Hình 3.19. Tác động của enzyme ngoại bào của vi khuẩn vùng rễ đến quá trình nở của trứng tuyến trùng và gây chết tuyến trùng trưởng thành ........................................118 Hình 3.20. Sắc ký lớp mỏng các hợp chất phân tách ..............................................122 ix
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Hồ tiêu (Piper nigrum L.) là cây công nghiệp có giá trị kinh tế và xuất khẩu cao của Việt Nam. Sản lượng hạt tiêu của Việt Nam chiếm tới 40% tổng sản lượng hạt tiêu toàn cầu. Theo quy hoạch đến năm 2020, tầm nhìn đến 2025, diện tích hồ tiêu của cả nước là 50.000 ha, nhưng chỉ trong vài năm gần đây, riêng Tây Nguyên đã có tới gần 93.000 ha, nâng tổng diện tích hồ tiêu cả nước lên 150.000 ha. Năm 2020, xuất khẩu hạt tiêu ước đạt 288 nghìn tấn, trị giá 665 triệu USD, tăng 1,2% về lượng, nhưng giảm 6,8% về trị giá so với cùng kỳ năm 2019 [1]. Trong những năm gần đây, trước tình trạng diện tích hồ tiêu phát triển quá nhanh, nhiều vườn hồ tiêu được đầu tư thâm canh cao độ, dịch bệnh được xem là yếu tố quan trọng hàng đầu dẫn đến việc nhiều vườn tiêu bị phá hủy. Hiện tượng hồ tiêu chết hàng loạt ở nhiều vùng trên cả nước đặc biệt là Tây Nguyên đã ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển bền vững của ngành hồ tiêu Việt Nam. Theo số liệu thống kê, diện tích hồ tiêu đạt cao điểm vào năm 2017 là 151.982 ha, sau đó giảm dần qua từng năm 2018 và 2019 còn 140.000 ha, giảm 11.900 ha qua hai năm do dịch bệnh. Nguyên nhân diện tích giảm do dịch bệnh chủ yếu là bệnh chết nhanh và bệnh vàng lá chết chậm. Bệnh chết nhanh do Phytophthora capsici và bệnh vàng lá chết chậm do tuyến trùng ký sinh thực vật Meloidogyne kết hợp với nấm Fusarium sp. được xem là bệnh rễ phổ biến và nghiêm trọng nhất trên cây hồ tiêu hiện nay [2-8]. Ba biện pháp được sử dụng nhiều nhất trong quản lý bệnh chết nhanh và chết chậm trên cây hồ tiêu gồm sử dụng các giống kháng, luân canh cây trồng và dùng các thuốc hóa học để diệt nấm [9-11]. Tuy nhiên, việc sử dụng các thuốc hoá học diệt nấm sẽ gây ô nhiễm môi trường, giảm chất lượng sản phẩm, đa dạng vi sinh vật và tăng sự đề kháng của tác nhân lây bệnh [12]. Gần đây, các nghiên cứu sử dụng các tác nhân kiểm soát sinh học thân thiện với môi trường đang được ưu tiên hàng đầu trong các chương trình quản lý dịch hại tổng hợp nhằm thay thế cho hóa chất nông nghiệp. Các tác nhân kiểm soát sinh học như nấm đối kháng, vi khuẩn nội sinh, vùng rễ kháng nấm bệnh, tuyến trùng và kích thích sinh trưởng bộ rễ [13-14]. Trong đó, vi khuẩn vùng rễ (Rhizobacteria) kháng nấm bệnh, tuyến trùng và thúc đẩy sinh trưởng thực vật đang được nhiều nghiên cứu quan tâm [15-17]. Vi khuẩn vùng rễ cạnh tranh với vi sinh vật gây 1
bệnh tại vùng rễ để làm giảm nguồn bệnh phát sinh từ đất và thúc đẩy sinh trưởng ở thực vật một cách trực tiếp dựa trên hoạt tính cố định N, phân giải P khó tan và sinh tổng hợp IAA. Sử dụng vi khuẩn vùng rễ làm chế phẩm vi sinh được coi là xu hướng trong tương lai vì nó làm giảm đáng kể việc sử dụng hóa chất, phân bón hoá học từ đó góp phần làm tăng năng suất, chất lượng sản phẩm một cách bền vững [16-26]. Hướng nghiên cứu về ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đến khả năng sinh trưởng và kháng bệnh rễ trên cây hồ tiêu còn được ít quan tâm ở Việt Nam và chưa có nghiên cứu nào một cách hệ thống trên cây hồ tiêu ở khu vực Tây Nguyên. Vì vậy, đề tài nghiên cứu “Tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu ( Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên” là rất cần thiết. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Tuyển chọn, xác định được đặc tính kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án 1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ cây hồ tiêu tại Tây Nguyên, định danh các chủng có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium và kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ trên cây hồ tiêu tại Tây Nguyên. 2. Nghiên cứu đặc tính và xác định hoạt chất kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne của các chủng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn. 3. Bước đầu tạo chế phẩm vi sinh phòng trừ nấm và tuyến trùng từ các chủng vi khuẩn tuyển chọn. 4.Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học Xác định một số chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng Phytophthora sp., Fusarium sp. và tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh rễ trên cây hồ tiêu đồng thời cung cấp dẫn liệu khoa học về khả năng đối kháng của một số chủng vi khuẩn làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn đối kháng làm chế phấm sinh học phòng trừ Phytophthora sp., Fusarium sp. và tuyến trùng Meloidogyne sp. 2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn Góp phần vào việc tạo ra các chế phẩm sinh học để phòng trừ bệnh rễ do Phytophthora sp., Fusarium sp. và tuyến trùng Meloidogyne sp. gây nên nhằm ứng dụng các biện pháp sinh học phòng trừ bệnh rễ trên cây hồ tiêu có hiệu quả tốt và an toàn với môi trường tự nhiên và sức khỏe con người. 5. Phạm vi nghiên cứu Vùng chuyên canh hồ tiêu của ba tỉnh Tây Nguyên là Đắk Lắk, Đắk Nông và Gia Lai. Nghiên cứu phân lập, sàng lọc hoạt tính sinh học các chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng bệnh rễ trên cây hồ tiêu được thực hiện trong phòng thí nghiệm, các thực nghiệm nhà lưới. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây hồ tiêu 1.1.1. Vị trí phân loại Hồ tiêu có tên khoa học là Piper nigrum L., thuộc giới Plantae, lớp Equisetopsida, bộ Piperales, họ Piperaceae. Họ hồ tiêu (Piperaceae) thuộc loại cây thân thảo đứng hoặc leo bò trên vách đá hay bám trên các cây thân gỗ khác nhờ rễ bám. Thân lá có mùi thơm cay, lá hình tim. Hiện nay, ở nước ta cây hồ tiêu được trồng phổ biến từ tỉnh Quảng Trị trở vào phía Nam, thích hợp ở độ cao dưới 800m [27-28]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật học cây hồ tiêu * Thân, cành, lá Cây hồ tiêu thuộc loại cây thân thảo, mềm dẻo, mỗi nhánh được phân thành nhiều đốt, mỗi đốt có một lá đơn. Lá có cuống, phiến lá hình trái tim, mọc cách. Ở nách lá có các mầm ngủ có thể phát sinh thành các cành tược, cành lươn, cành quả tùy theo từng giai đoạn phát triển của cây hồ tiêu [27]. Dây thân (cành tược) phát triển từ mầm nách lá ở những cây hồ tiêu nhỏ hơn 1 năm tuổi. Từ một dây thân chính sẽ có những dây thân cấp thấp phát sinh. Cành tược có độ phân cành thấp, chỉ dưới 45o nên cành dường như mọc thẳng hướng lên trên. Dây thân sinh trưởng khỏe, có lóng ngắn, phần đốt thường có rễ có tác dụng giúp dây tiêu bám vào trụ. Dây thân thường dùng để làm hom giống nhờ khả năng phát triển rễ mạnh giúp cây sinh trưởng tốt [27]. Dây lươn (cành lươn) được phát sinh ở mầm nách tại các đốt nằm gần sát gốc, cành thường có lóng dài và nằm dài ra đất. Dây lươn không cho quả nhưng lại có khả năng sinh trưởng khỏe, thích hợp sử dụng để giâm, chiết cây. Tuy nhiên thời gian ra quả chậm hơn là dây thân, nhưng thời gian khai thác được lâu dài hơn. Nhánh ác (cành quả) là những cành mang trái, số lượng cành quả trên trụ sẽ quyết định đến năng suất của cây hồ tiêu, tuy nhiên mỗi nách lá chỉ có một mầm ngủ có khả năng phát triển thành cành quả. Cành quả có độ góc phân cành lớn, lóng ngắn. Độ dài cành thường chỉ đạt dưới 1m, cành khúc khuỷu. Từ những lóng ngắn của cành quả sẽ có những mầm ngủ có thể phát sinh thành những cành quả cấp 2, cấp 3. Lá hồ tiêu thuộc lá đơn, hình trái tim, mọc cách. Cuống lá dài 2 – 3 cm, phiến lá dài 10cm đến 25 cm, rộng 5 cm đến 10 cm tùy thuộc vào giống. Lá cũng là bộ phận để nhận diện giống, trên phiến lá có 5 gân lá hình lông chim, mặt trên bóng láng và xanh đậm hơn mặt dưới [27]. 4
*Rễ: Rễ cây hồ tiêu thuộc loại rễ chùm, ăn sâu vào đất. Trong hệ thống cây hồ tiêu thường có tới 3 - 6 rễ cái và rất nhiều chùm rễ phụ. Ngoài ra các đốt rễ trên dây lươn sẽ giúp cây bám vào trụ và vươn lên. - Rễ cái: Đây là rễ quan trọng nhất của cây hồ tiêu với tác dụng hút nước và các chất dinh dưỡng để nuôi cây. Rễ cái phát triển mạnh và ăn sâu vào trong lòng đất. Rễ cái thuộc loại háo khí và không chịu được ngập úng nên phải ăn sâu vào lòng đất. - Rễ phụ: Các rễ phụ được mọc thành chùm và có khả năng phát triển theo chiều ngang, các rễ nhỏ mọc dày đặc tại những đốt rễ cái và phân bố nhiều ở tầng đất từ 15- 40 cm. Nhiệm vụ chính của rễ phụ là hút nước và chất dinh dưỡng. Rễ phụ cũng không chịu được ngập úng do đó cần chú ý các biện pháp cải tạo, thoát nước và giúp đất được tơi xốp vì tầng rễ phụ mọc rất dễ bị ngập úng. Nếu trong vòng 12- 24 giờ mà rễ bị ngập úng sẽ dẫn tới hư thối và chết dần. - Rễ bám: Rễ bám là những chân rễ mọc tại các đốt của dây lươn có tác dụng chủ yếu là giúp cây bám vào trụ, tường hay bề mặt để giúp cây vươn lên. Rễ bám thường ngắn và chỉ dài từ 1- 3 cm nên không có tác dụng trong việc hút nước và chất dinh dưỡng [27]. * Hoa và quả: Hoa của cây hồ tiêu mọc theo dạng hoa tự hình gié, dài từ 7- 12 cm tùy từng giống hồ tiêu và điều kiện chăm sóc. Trên mỗi hoa có bình quân từ 20- 60 hoa xếp thành hình xoắn ốc, hoa lưỡng tính và đơn tính. Thông thường những giống hồ tiêu có hoa lưỡng tính sẽ cho năng suất cao nhờ khả năng tự thụ phấn. Độ ẩm cao của môi trường sẽ giúp hoa thụ phấn được cao hơn. Quả hồ tiêu thuộc loại quả hạch, không có cuống và chỉ mang 1 hạt hình cầu bám vào giá. Thời gian phát triển từ khi hoa thụ phấn đến khi hạt chín mất từ 7- 10 tháng chia làm 3 giai đoạn gồm: - Hoa hình thành trên gié và có đầy đủ các bộ phận mất 1 – 1,5 tháng. - Hoa thụ phấn và phát triển trái trong khoảng 4- 5,5 tháng. Trong giai đoạn này hạt phát triển nhanh chóng, kích thước lớn tối đa sau 5 tháng. Giai đoạn này cần cung cấp đầy đủ nước và chất dinh dưỡng để hạt phát triển tối đa. -Trái chín trong khoảng từ 2-3 tháng hạt bắt đầu phát triển. *Hột tiêu: Cấu tạo bởi 2 lớp, bên ngoài gồm có vỏ hạt và bên trong chứa phôi nhũ và các phôi (đây là bộ phận tiêu dùng) [27]. 5
1.2. Thực trạng sản xuất hồ tiêu của Việt Nam và các tỉnh Tây Nguyên 1.2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu ở các tỉnh Tây Nguyên Diện tích trồng hồ tiêu nước ta trong những năm qua có xu hướng tăng mạnh, năm 2010 cả nước chỉ có 51 nghìn ha và sản lượng đạt 105,4 nghìn tấn, đặc biệt đến năm 2017, tổng diện tích hồ tiêu cả nước tăng lên 151,982 nghìn ha (trong đó có 93,5 nghìn ha cho sản phẩm) (bảng 1.1). Tuy nhiên, đến năm 2020, tổng diện tích hồ tiêu của cả nước giảm xuống còn 140,2 nghìn ha trong khi đó diện tích cho sản phẩm ngày càng tăng với 112,9 nghìn ha. Sản lượng hồ tiêu tăng từ 105,4 nghìn tấn vào năm 2010 đến 270,2 nghìn tấn vào năm 2020 (tăng hơn 164,6 nghìn tấn) [29]. Bảng 1.1. Diện tích, sản lượng hồ tiêu của Việt Nam từ năm 2010-2019 Năm Diện tích (1000 ha) Sản lượng (1000 tấn) 2010 51,000 105,400 2011 52,500 111,960 2012 54,500 120,280 2013 61,500 125,020 2014 85,500 151,760 2015 97,500 176,790 2016 105,000 216,430 2017 151,982 238,157 2018 148,744 246,096 2019 140,000 240,000 (Nguồn: Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam, 2019) Đắk Nông: Diện tích hồ tiêu năm 2019 là 32.286 ha (bảng 1.2), tăng lên 34.957 ha (năm 2020), chiếm 39,95% diện tích toàn vùng. Năng suất đạt 20,5 tạ/ha. Sản lượng đạt 44,750 ngàn tấn (chiếm 26,19 % toàn vùng). Bên cạnh đó, Đắk Nông đã ban hành Nghị quyết số 05/ NQ-HĐND ngày 02/8/2018 về việc phê duyệt Đề án Tái cơ cấu ngành nông nghiệp. Nghị quyết số 12/NQ-HĐND ngày 02/8/2019 về việc phê duyệt Đề án Quy hoạch vùng nông nghiệp ứng dụng công nghệ cao trên địa bàn tỉnh Đắk Nông đến năm 2030, định hướng đến năm 2035; trong đó đã định hướng phát triển cây hồ tiêu trên địa bàn tỉnh đến năm 2020 ổn định diện tích là 27.000 ha. Đến năm 2030 diện tích không thay đổi [30]. 6
Đắk Lắk: Diện tích hồ tiêu năm 2019 là 36.396 ha (bảng 1.2). Năm 2020 diện tích hồ tiêu là 34.500 ha (chiếm 40,1% diện tích toàn vùng), giảm 1.896 ha so với năm 2019, trong đó diện tích cho sản phẩm 30.150 ha; năng suất trên diện tích cho sản phẩm 25,15 tạ/ha; sản lượng 75.818 tấn (chiếm 43,3% toàn vùng), tăng 1.696 tấn so với năm 2019. Diện tích hồ tiêu giảm nguyên nhân là do giá bán hạt tiêu thấp và một số diện tích tiêu bị bệnh chết, người dân chuyển sang trồng cà phê và cây ăn quả [31]. Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu một số vùng chính ở Việt Nam Diện tích (ha) Sản lượng Tỉnh Tổng Thu hoạch (tấn) Đăk Lăk 36.396 29.865 49.750 Đăk Nông 32.286 28.484 42.893 Bình Phước 16.216 14.201 34.941 Đồng Nai 18.191 14.546 30.000 Bà Rịa Vũng Tàu 13.161 11.337 23.837 Gia Lai 13.731 11.604 42.900 (Nguồn: Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam, 2019) Gia Lai: Năm 2019, diện tích hồ tiêu toàn tỉnh đạt 13.731 ha (Sản lượng 42.900 tấn) tuy nhiên đến năm 2020, diện tích hồ tiêu toàn tỉnh đạt 14.682 ha, chiếm 16,77% diện tích toàn vùng Tây Nguyên (2020). Gia Lai là tỉnh có năng suất cao nhất đạt 37,9 tạ/ha. Sản lượng đạt 45,287 ngàn tấn (Chiếm 26,5% toàn vùng) [30]. Các tỉnh Đông Nam Bộ: Bình Phước, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu diện tích hồ tiêu cũng đạt lần lượt 16.216ha, 18.191ha và 13.161ha với sản lượng đạt 34.941 tấn, 30.000 tấn, 23.837 tấn (bảng 1.2). Đây là những vùng trồng hồ tiêu trọng điểm của cả nước cùng với 03 tỉnh Tây Nguyên (Đắk Lắk, Đắk Nông và Gia Lai). 1.2.2. Tình hình sâu bệnh hại trên cây hồ tiêu ở Tây Nguyên Đắk Lắk: Năm 2020, bệnh vàng lá chết chậm có diện tích nhiễm là 86,8 ha (giảm 423,8 ha so với năm 2019); Bệnh chết nhanh có diện tích nhiễm là 20,3ha (giảm 766,3 so với năm 2019). Ngoài bệnh chết nhanh, chết chậm trên cây hồ tiêu còn xuất hiện một số đối tượng gây hại khác như: Bệnh đốm tảo với tỷ lệ bệnh 5-25%, diện tích nhiễm 24 ha (Krông Buk, Krông Năng); Tỷ lệ bệnh do tuyến trùng: 2-35% diện tích, diện tích nhiễm 29,2 ha (Buôn Hồ, Ea H’leo, Ea Kar, Krông Pắk); Tỷ lệ bệnh do Bọ xít lưới 2-25%, diện tích nhiễm 26 ha (Krông Buk, Krông Năng, Ea Kar, Krông Pắk); và một số sâu, bệnh khác gây hại rải rác [31]. 7