Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của 3 loài ngoại mộc tái (allophylus livescens gagnep.), cày ri ta Hạ Long (chirita halongensis kiew& t.h.nguyen) và An Điền lá thông [oldenlandia pinifolia (wall. ex g.don) kuntze] của Việt Nam

Chia sẻ: Lê Thị Hồng Nhung | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:161

Thêm vào BST

Báo xấu

52
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu thành phần hoá học của ba loài Allophylus livescens Gagnep, Chirita halongensis Kiew & T. H. Nguyen và Oldenlandia pinifolia (Wall. ex G. Don) Kuntze ở Việt Nam nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của 3 loài ngoại mộc tái (allophylus livescens gagnep.), cày ri ta Hạ Long (chirita halongensis kiew& t.h.nguyen) và An Điền lá thông [oldenlandia pinifolia (wall. ex g.don) kuntze] của Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- KHIẾU THỊ TÂM NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA 3 LOÀI: NGOẠI MỘC TÁI (ALLOPHYLUS LIVESCENS GAGNEP.), CÀY RI TA HẠ LONG (CHIRITA HALONGENSIS KIEW& T.H.NGUYEN) VÀ AN ĐIỀN LÁ THÔNG [OLDENLANDIA PINIFOLIA (WALL. EX G.DON) KUNTZE] CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ……..….***………… KHIẾU THỊ TÂM NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA 3 LOÀI: NGOẠI MỘC TÁI (ALLOPHYLUS LIVESCENS GAGNEP.), CÀY RI TA HẠ LONG (CHIRITA HALONGENSIS KIEW& T.H.NGUYEN) VÀ AN ĐIỀN LÁ THÔNG [OLDENLANDIA PINIFOLIA (WALL. EX G.DON) KUNTZE] CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Nguyễn Thị Hoàng Anh 2. PGS. TS. Trần Văn Lộc HÀ NỘI – 5/2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Thị Hoàng Anh và PGS. TS. Trần Văn Lộc. Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực, được đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả Khiếu Thị Tâm
LỜI CẢM ƠN Luận án được hoàn thành tại phòng Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên và phòng Tổng hợp hữu cơ – Viện Hóa học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thị Hoàng Anh và PGS. TS. Trần Văn Lộc những thầy cô đã từng bước hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến tất cả các cô chú, anh chị phòng Nghiên cứu các Hợp chất Thiên nhiên và phòng Tổng hợp Hữu cơ – Viện Hóa học đã hết lòng chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong thời gian tôi tiến hành thực nghiệm tại Viện Hóa học. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học và Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Khoa học đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với sự động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Khiếu Thị Tâm
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................i DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ii DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... iii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về chi Allophylus..............................................................................3 1.1.1. Giới thiệu về thực vật chi Allophylus ................................................................ 3 1.1.2. Ứng dụng của chi Allophylus trong y học cổ truyền......................................... 3 1.1.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Allophylus ........................ 4 1 1 3 1 Hợp chất phenol ............................................................................................. 4 1 1 3 2 Hợp chất terpenoid và steroid ........................................................................ 7 1 1 3 3 Các hợp chất khác .......................................................................................... 9 1.1.4. Tình hình nghiên cứu cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep) ...... 11 1.2. Tổng quan về chi Chirita..................................................................................11 1.2.1. Giới thiệu về thực vật chi Chirita ................................................................... 11 1.2.2. Ứng dụng của chi Chirita trong y học cổ truyền ............................................ 12 1.2.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Chirita ................................................................................................................................... 12 1.2.3.1. Các hợp chất phenylethanoid ....................................................................... 13 1 2 3 2 Các hợp chất quinone ................................................................................... 14 1 2 3 3 Các hợp chất flavonoid ................................................................................ 16 1 2 3 4 Các hợp chất triterpenoid ............................................................................. 16 1 2 3 5 Các nhóm chất khác ..................................................................................... 18 1.2.4. Tình hình nghiên cứu cây Cày ri ta Hạ long (Chirita halongensis Tên tác giả) ................................................................................................................................... 19 1.3. Tổng quan về chi Oldenlandia.........................................................................19 1.3.1. Giới thiệu thực vật về chi Oldenlandia ........................................................... 19 1.3.2. Ứng dụng của chi Oldenlandia trong y học cổ truyền .................................... 21 1.3.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Oldenlandia ................... 22 1.3 3 1 Các alkaloid từ chi Oldenlandia .................................................................. 22 1.3 3 2 Các anthraquinone từ chi Oldenlandia ........................................................ 23
1.3 3 3 Các flavonoid từ chi Oldenlandia ................................................................ 26 1.3 3 4 Các iridoid từ chi Oldenlandia ..................................................................... 28 1.3.3.5 Các hợp chất khác từ chi Oldenlandia ......................................................... 32 1.3.4. Tình hình nghiên cứu về cây An điền lá thông [Oldenlandia pinifolia (Wall. Ex G. Don) Kuntze] ................................................................................................... 32 1.4. Hợp chất iridoid...............................................................................................33 1.4.1. Giới thiệu chung về hợp chất iridoid .............................................................. 33 1.4.2. Phân loại các hợp chất iridoid........................................................................ 34 1.4.2.1. Iridoid glycoside........................................................................................... 34 1.4.2.2. Iridoid aglycone .......................................................................................... 35 1.4.2.3. Secoiridoid ................................................................................................... 35 1.4.2.4. Bis iridoid ..................................................................................................... 35 1.4.3. Hoạt tính sinh học các iridoid......................................................................... 36 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................... 37 2.1. Thu hái mẫu thực vật và xác định tên khoa học...........................................37 2.2. Phƣơng pháp xử lý và chiết mẫu....................................................................38 2.3. Phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật.......................................................................................................38 2.4. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập đƣợc.......39 2.5. Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào....................................................39 2.6.. Phƣơng pháp thử hoạt tính cảm ứng apoptosis ........................................... 42 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM ............................................................................. 44 3.1. Tách chiết, phân lập các chất từ cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens).44 3.1.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách ..................................................................... 44 3.1.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ cây Ngoại mộc tái ....................... 46 3 1 2 1 Hợp chất 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1) ............................................... 46 3 1 2 2 Hợp chất catechin (AL2).............................................................................. 46 3 1 2 3 Chất stigmasterol (AL3) .............................................................................. 46 3 1 2 4 Hợp chất β-sitosterol (AL4) ......................................................................... 46 3 1 2 5 Hợp chất β-sitosterol glucoside (AL5) ........................................................ 46 3.1.3. Hoạt tính gây độc tế bào của chất AL1 ......................................................... 47 3.2. Tách chiết, phân lập các chất từ cây Cày ri ta Hạ long ...............................47
3.2.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách ..................................................................... 47 3.2.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ cây Cày ri ta Hạ long .................. 50 3 2 2 1 Hợp chất 7-hydroxytectoquinone (CH1): .................................................... 50 3 2 2 2 Hợp chất 3α,24-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (CH2) .......................... 50 3 2 2 3 Hợp chất ursolic acid (CH3) ........................................................................ 50 3 2 2 4 Hợp chất oleanolic acid (CH4) .................................................................... 51 3 2 2 5 Hợp chất 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethyl-β-D-glucopyranoside (CH5) ...... 50 3 2 2 6 Hợp chất acteoside (CH6)............................................................................ 52 3 2 2 7 Hợp chất isoacteoside (CH7) ....................................................................... 52 3 2 2 8 Hợp chất decaffeoylacteoside (CH8)........................................................... 52 3 2 2 9 Hợp chất β-hydroxyacteoside (CH9) ........................................................... 52 3.2.3. Thử hoạt tính độc tế bào ................................................................................. 52 3.3. Tách chiết, phân lập các chất từ cây An điền lá thông (Oldenlandia pinifolia)...................................................................................................................52 3.3.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách ..................................................................... 52 3.3.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ cây An điền lá thông.................... 56 3 3 2 1 Hợp chất 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone (HP1) ........................ 56 3 3 2 3 Hợp chất 1,6-dihydroxy-2-methylanthraquinone (HP3) ............................. 56 3 3 2 4 Hợp chất digiferruginol (HP4)..................................................................... 56 3 3 2 5 Hợp chất lutein (HP5) .................................................................................. 57 3 3 2 6 Hợp chất ursolic acid (HP6) ........................................................................ 57 3 3 2 7 Hợp chất oleanolic acid (HP7) .................................................................... 57 3 3 2 8 Hợp chất asperuloside (HP8) ....................................................................... 57 3 3 2 9 Hợp chất deacetyl asperuloside (HP9) ........................................................ 57 3 3 2 10 Hợp chất asperulosidic acid (HP10) .......................................................... 57 3 3 2 11 Hợp chất scandoside methyl ester (HP11)................................................. 57 3 3 2 11 Hợp chất afzelin (HP12) ............................................................................ 58 3 3 2 13 Hợp chất isorhamnetin-3-O-β-rutinoside (HP13)...................................... 58 3 3 2 14 Hợp chất rutin (HP14) ............................................................................... 58 3.3.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết và các chất phân lập từ cây An điền lá thông ............................................................................................................. 58
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 60 4.1. Kết quả nghiên cứu về cây Ngoại mộc tái......................................................60 4.1.1. Các hợp chất phân lập từ cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens) ............ 60 4 1 1 1 Hợp chất 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1) ............................................... 60 4 1 1 2 Hợp chất catechin (AL2).............................................................................. 64 4 1 1 3 Hợp chất stigmasterol và β-sitosterol (AL3 và AL4) .................................. 65 4 1 1 4 Hợp chất β-sitosterol glucoside (AL5) ........................................................ 66 4.1.2. Hoạt tính gây độc tế bào của AL1 được phân lập từ cây Ngoại mộc tái ........ 66 4.2. Kết quả nghiên cứu về cây Cày ri ta Hạ long................................................607 4.2.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được ............................................. 67 4.2.1.1. Hợp chất 7-hydroxytectoquinone (CH1) ..................................................... 68 4.2.1.2. Hợp chất 3α,24-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (CH2) .......................... 70 4 2 1 3 Hợp chất ursolic acid (CH3) ........................................................................ 73 4 2 1 4 Hợp chất oleanolic acid (CH4) .................................................................... 73 4.2.1 5 Hợp chất 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl-β-D-glucopyranoside (CH5) ....... 74 4 2 1 6 Hợp chất acteoside (CH6)............................................................................ 76 4 2 1 7 Hợp chất isoacteoside (CH7) ....................................................................... 79 4 2 1 8 Hợp chất decaffeoylacteoside (CH8)........................................................... 80 4.2.1.9. Hợp chất β-hydroxyacteoside (CH9) ........................................................... 81 4.3. Kết quả nghiên cứu về cây An điền lá thông.................................................84 4.3.1. Các hợp chất phân lập từ cây An điền lá thông .............................................. 85 4 3 1 1 Hợp chất 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone (HP1) ........................ 86 4 3 1 2 Hợp chất 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone (HP2) ............................... 90 4 3 1 3 Hợp chất 1,6-dihydroxy-2-methylanthraquinone (HP3) ............................. 93 4 3 1 4 Hợp chất digiferruginol (HP4)..................................................................... 94 4 3 1 4 Hợp chất lutein (HP5) .................................................................................. 95 4 3 1 6 Hợp chất ursolic acid (HP6) ......................................................................100 4 3 1 7 Hợp chất oleanolic acid (HP7) ..................................................................101 4.3.1.8. Hợp chất asperuloside (HP8) .....................................................................101 4.3.1.9. Deacetyl asperuloside (HP9) .....................................................................105 4 3 1 10 Hợp chất asperulosidic acid (HP10) ........................................................107
4 3 1 11 Hợp chất scandoside methyl ester (HP11)...............................................109 4.3.1.12. Hợp chất afzelin (HP12) ..........................................................................111 4 3 1 13 Hợp chất isorhamnetin-3-O-β-rutinoside (HP13)....................................113 4 3 1 14 Hợp chất rutin (HP14) .............................................................................116 4.3.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các cao chiết và các hợp chất phân lập được ...................................................................................................................118 4 3 2 1 Kết quả thử hoạt tính cảm ứng apoptosis của cao chiết n-butanol trên tế bào bạch cầu OCI-AML.................................................................................................118 4.3.2.2 Kết quả thử hoạt tính cảm ứng apoptosis của cao chiết n-butanol và một số hợp chất phân lập từ cao chiết này trên dòng tế bào ung thư máu K562 ................122 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 129 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN..................................................... 131 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................................................................................................................................133
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 H-NMR Proton Nuclear Phổ cộng hưởng từ hạt nhân MagneticResonance Spectrocopy proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectrocopy carbon DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ HMBC Coherence HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ HSQC Coherence COSY Correlation Spectrocopy Phổ tương tác proton ESI-MS Electron Spray IonizationMass Phổ khối ion hóa bằng phun mù Spectrocopy điện tử HR-ESI- High Resolution ElectronSpray Phổ khối phân giải cao ion hóa MS Ionization- Mass Spectrocopy bằng phun mù điện tử IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% tế bào thử nghiệm KB Human epidermic carcinoma Ung thư biểu mô ở người HepG2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người Lu Human lung carcinoma Ung thư phổi ở người MCF-7 Human breast carcinoma Ung thư vú ở người HL-60 Human promyeloccytic leukemia Ung thư máu cấp tính ở người DMSO Dimethyl sulfoxide CH2Cl2 Diclomethane CHCl3 Chloroform EtOAc Ethyl acetate MeOH Methanol H2 O Nước TLTK Tài liệu tham khảo KH Kí hiệu i
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các loài thực vật thuộc chi Allophylus ở Việt Nam ................................... 3 Bảng 1.2. Các hợp chất flavonoid được phân lập từ chi Allophylus ........................... 4 Bảng 1.3. Các hợp chất phenolic được phân lập từ chi Allophylus ............................ 6 Bảng 1.4. Các hợp chất steroid và terpenoid được phân lập từ chi Allophylus .......... 7 Bảng 1.5. Các hợp chất khác được phân lập từ chi Allophylus ................................... 9 Bảng 1.6 Danh sách các loài thuộc chi Chirita ở Việt Nam .................................... 12 Bảng 1.7 Các hợp chất phenylethanoid được phân lập từ chi Chirita ..................... 13 Bảng 1.8 Các hợp chất quinone được phân lập từ chi Chirita ................................. 14 Bảng 1.9. Các hợp chất flavonoid được phân lập từ chi Chirita .............................. 16 Bảng 1.10. Các hợp chất triterpenoid được phân lập từ chi Chirita ......................... 17 Bảng 1.11. Các nhóm chất khác được phân lập từ chi Chirita ................................. 18 Bảng 1.12. Các loài thuộc chi Oldenlandia ở Việt Nam .......................................... 20 Bảng 1.13. Các alkaloid được phân lập từ chi Oldenlandia ..................................... 23 Bảng 1.14. Các anthraquinone được phân lập từ chi Hedyotis ................................. 25 Bảng 1.15 Các flavonoid được phân lập từ chi Oldenlandia ................................... 26 Bảng 1.16. Các iridoid được phân lập từ chi Oldenlandia ....................................... 28 Bảng 4.1. Số liệu phổ 1H-và 13C-NMR (500/125 MHz, CDCl3) của chất AL1 ....... 63 Bảng 4.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất AL1 .......................... 67 Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) của CH6-CH9 ...................... 82 Bảng 4.4 Số liệu phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD)của CH6-CH9 ...................... 83 Bảng 4.6. Số liệu phổ 1H-và 13C-NMR (500/125 MHz) của hợp chất HP1 ............. 90 Bảng 4.7. Số liệu phổ 1H-và 13C-NMR (500/125 MHz, CDCl3) của hợp chất HP2 93 Bảng 4.8 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR (500/125 MHz, CDCl3) của HP5 và lutein 99 Bảng 4.9 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR (500/125 MHz, CD3OD) của HP8 và HP9.106 Bảng 4.10 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR (500/125 MHz, CD3OD) của HP10 và HP11 . 110 Bảng 4.11. Phổ 1H-, 13C-NMR (500/125 MHz, CD3OD) của HP13 và HP14.......117 Bảng 4.12 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết n-butanol và các hợp chất phân lập trên dòng tế bào K562 .......................................................................122 Bảng 4.13 Tổng kết 26 hợp chất phân lập được từ ba loài nghiên cứu .................125 Bảng 4.14 Tổng kết hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết và các hợp chất phân lập được từ ba loài nghiên cứu ......................................................................................125 ii
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Các hợp chất flavonoid phân lập được từ chi Allophylus ........................... 6 Hình 1.2. Một số phenol được phân lập từ chi Allophylus ......................................... 7 Hình 1.3. Các hợp chất steroid và terpenoid được phân lập từ chi Allophylus ........... 9 Hình 1.4. Các hợp chất khác được phân lập từ chi Allophylus ................................. 10 Hình 1.5 Cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep.) .................................. 11 Hình 1.6. Các hợp chất phenylethanoid được phân lập từ chi Chirita ..................... 11 Hình 1.7. Các hợp chất quinone được phân lập từ chi Chirita ................................. 11 Hình 1.8. Các hợp chất flavonoid được phân lập từ chi Chirita ............................... 11 Hình 1.9. Các hợp chất triterpenoid được phân lập từ chi Chirita ........................... 17 Hình 1.10. Các nhóm chất khác được phân lập từ chi Chirita .................................. 18 Hình 1.11 Hình ảnh cây Chirita halongensis ........................................................... 19 Hình 1.12 Các hợp chất alkaloid phân lập được từ chi Oldenlandia ....................... 19 Hình 1.13. Các hợp chất anthraquinone phân lập được từ chi Hedyotis................... 26 Hình 1.14 Các flavonoid được phân lập từ chi Oldenlandia .................................... 27 Hình 1.15. Các iridoid được phân lập từ chi Oldenlandia ........................................ 31 Hình 1.16. Hình ảnh cây An điền lá thông mọc ở Huế ............................................. 33 Hình 2.1 Mẫu tiêu bản cây Ngoại mộc tái ............................................................... 37 Hình 2.2 Mẫu tiêu bản cây Cày ri ta Hạ long .......................................................... 37 Hình 2.3 Mẫu cây An điền lá thông ......................................................................... 38 Hình 3.1 Sơ đồ chiết và phân lập các chất từ cây Ngoại mộc tái ............................. 45 Hình 3.2 Sơ đố chiết và phân lập các chất từ cây Cày ri ta Hạ long ........................ 49 Hình 3.3 Sơ đố chiết và phân lập các chất từ cây An điền lá thông ........................ 55 Hình 4.1 Cấu trúc của các hợp chất được phân lập từ cây Ngoại mộc tái ............... 60 Hình 4.2 Cấu trúc hóa học và một số tương tác chính trên phổ HMBC của AL1 ... 60 Hình 4.3. Phổ ESI-MS của AL1 ............................................................................... 61 Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của AL1 (CDCl3) ............................................................... 61 Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của AL1 (CDCl3) .............................................................. 62 Hình 4.6. Phổ HMBC của AL1 ................................................................................. 62 Hình 4.7. Phổ 1H-NMR của AL2 .............................................................................. 64 Hình 4.8. Phổ 13C-NMR của AL2 ............................................................................. 65 Hình 4.10 Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ HMBC (HC) của CH1. 68 iii
Hình 4.11 Phổ 1H-NMR của CH1 (CD3OD) ........................................................... 68 Hình 4.12 Phổ 13C-NMR của CH1 (CD3OD) .......................................................... 69 Hình 4.13 Phổ HMBC của CH1 .............................................................................. 70 Hình 4.14 Phổ (-)-ESI-MS của CH2 ....................................................................... 71 Hình 4.15 Phổ 1H-NMR của CH2 (CDCl3 + CD3OD) ............................................ 71 Hình 4.16 Phổ 13C-NMR của CH2 (CDCl3 + CD3OD) ........................................... 72 Hình 4.17 Cấu trúc và một số tương tác chính (HC) trên phổ HMBC của CH5. 74 Hình 4.18. Phổ 1H NMR của CH5 (CD3OD) ........................................................... 75 Hình 4.19 Phổ 13C-NMR của CH5 (CD3OD) .......................................................... 75 Hình 4.20. Phổ 1H-NMR của CH6 ........................................................................... 77 Hình 4.21 Phổ 13C-NMR của CH6 (CD3OD) .......................................................... 78 Hình 4.22 Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ HMBC của CH9 .............. 81 Hình 4.23. Cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ cây An điền lá thông .......816 Hình 4.24 Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ HMBC (HC) của HP1 . 86 Hình 4.25 Phổ HR-ESI-MS của HP1 ...................................................................... 87 Hình 4.26 Phổ 1H-NMR của HP1 (CDCl3 + CD3OD) ............................................ 87 Hình 4.27 Phổ 13C-NMR của HP1 (CDCl3 + CD3OD) ........................................... 88 Hình 4.28 Phổ 1H-NMR của HP1 (DMSO-d6) ........................................................ 89 Hình 4.29 Phổ HMBC của HP1 ............................................................................... 89 Hình 4.30 Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ HMBC (HC) của HP2 . 90 Hình 4.31 Phổ 1H-NMR của HP2 (CDCl3) ............................................................. 91 Hình 4.32 Phổ 13C-NMR của HP2 (CDCl3) ............................................................ 91 Hình 4.33 Phổ HMBC của HP2 ............................................................................... 92 Hình 4.34 Cấu trúc và một số tương tác xa trên phổ HMBC (HC) của HP4 ...... 94 Hình 4.35 Cấu trúc và một số tương tác xa trên phổ HMBC (HC) của HP5 ...... 95 Hình 4.36. Phổ (+) ESI-MS của HP5 ...................................................................... 96 Hình 4.38 Phổ 1H-NMR giãn của HP5 .................................................................... 97 Hình 4.39 Phổ 13C-NMR của HP5 (CDCl3) ............................................................ 97 Hình 4.40 Phổ HMBC của HP5 ............................................................................... 98 Hình 4.41. Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ COSY và HMBC của HP8 ... 101 Hình 4.42 Phổ (-)-ESI-MS của HP8 ......................................................................101 Hình 4.43 Phổ 1H-NMR của HP8 (CD3OD) .........................................................102 iv
Hình 4.44 Phổ 13C-NMR của HP8 (CD3OD) ........................................................103 Hình 4.45 Phổ DEPT của HP8 ..............................................................................103 Hình 4.46. Phổ HMBC của HP8 .............................................................................104 Hình 4.47. Phổ COSY của HP8 ..............................................................................105 Hình 4.48 Cấu trúc và một số tương tác chính (HC) trên phổ HMBC của HP10 .... 107 Hình 4.49. Phổ 1H-NMR của HP10 (MeOD) .........................................................107 Hình 4.50. Phổ 13C-NMR của HP10 (CD3OD) ......................................................108 Hình 4.51. Phổ HMBC của HP10 ...........................................................................108 Hình 4.52 Phổ ESI-MS của HP12 ........................................................................111 Hình 4.53 Phổ 1H-NMR của HP12 (CD3OD) .......................................................111 Hình 4.54 Phổ 13C-NMR của HP12 (CD3OD) ......................................................112 Hình 4.55 Cấu trúc và một số tương tác chính (HC) trên phổ HMBC của HP13 .... 113 Hình 4.56 Phổ ESI-MS của HP13 .........................................................................113 Hình 4.57 Phổ 1H-NMR của HP13 (CD3OD) .......................................................114 Hình 4.58 Phổ DEPT của HP13 ............................................................................115 Hình 4.59 Phổ 13C-NMR của HP13 (CD3OD) ......................................................115 Hình 4.60. Phổ HMBC của HP13 ...........................................................................116 Hình 4.61. Số tế bào sống sót sau 24 giờ nuôi cấy ở 5 nồng độ khác nhau của cao chiết n-butanol so với EtOH/H2O ...........................................................................118 Hình 4.62. Phần trăm tế bào có hiện tượng apoptosis sau 24 giờ nuôi cấy với các nồng 300, 150, 75, 37,5, 18,75 μg/mL của cao chiết n-butanol so với EtOH/H2O 119 Hình 4.63: Số tế bào trong pha G0/G1 của chu kỳ tế bào.......................................120 Hình 4.64: Số tế bào trong pha S của chu kỳ tế bào ...............................................120 Hình 4.65. Số tế bào trong pha G2/M của chu kỳ tế bào .........................................120 Hình 4.66. Cao chiết n-butanol và các hợp chất HP9, HP11, HP13, HP14 ức chế tăng sinh tế bào K562 trong thời gian 72 giờ ..........................................................121 Hình 4.67. Phần trăm tế bào K562 apoptosis gây ra bởi cao chiết n-butanol và các hợp chất HP9, HP11, HP13, HP14 sau 24 giờ ......................................................123 Hình 4.68 Hình ảnh tế bào nhuộm Hoechst 33342 dưới tác động của cao chiết n- butanol và các hợp chất HP9, HP11, HP13, HP14................................................123 Hình 4.69. Hoạt tính caspase 3 của cao chiết n-butanol và các hợp chất HP9, HP11, HP13, HP14 trên tế bào K562 trong thời gian 24 giờ. ...........................................124 v
1 MỞ ĐẦU Ngày nay, kinh tế càng phát triển thì nhu cầu chăm sóc và bảo vệ sức khỏe của cộng đồng càng trở nên cấp thiết Do đó, nhu cầu sử dụng thuốc để phòng ngừa và chữa trị những căn bệnh nan y đặc biệt là bệnh ung thư ngày càng cao Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ung thư là nguyên nhân gây tử vong thứ hai sau tim mạch. Mỗi năm thế giới có thêm 14,1 triệu bệnh nhân mắc ung thư, 8,2 triệu người tử vong vì căn bệnh này. Hiện nay, một trong những hướng nghiên cứu thu hút các nhà khoa học để tìm ra thuốc phòng ngừa và chữa trị ung thư là đi từ các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên. Đến nay, nhiều hợp chất thiên nhiên hoặc các sản phẩm được tổng hợp, bán tổng hợp từ các hợp chất tự nhiên đã được sử dụng một cách hiệu quả trong việc điều trị, phòng ngừa bệnh ung thư và các bệnh tật khác giúp con người chống lại bệnh tật, nâng cao sức khỏe cộng đồng. Các nhà khoa học vẫn đang cố gắng tìm hiểu, khám phá tác dụng chống ung thư và các hoạt tính sinh học khác của các hợp chất được phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau. Việt Nam có nguồn thực vật phong phú và đa dạng với khoảng 12.000 loài trong đó đã điều tra có gần 3 900 loài được sử dụng làm thuốc thuộc 309 họ. Song bản chất hóa học của chúng cũng như mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học và tác dụng dược lý thì mới được biết rất ít hoặc chưa biết. Do đó, việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thực vật nhằm tìm kiếm các chất có hoạt tính có giá trị là rất cần thiết. Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep.), Cày ri ta Hạ Long (Chirita halongenis Kiew & T. H. Nguyen) là hai loài thực vật đặc hữu của Vịnh Hạ Long, chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. An điền lá thông [Oldenlandia pinifolia (Wall. ex G. Don) Kuntze] có tác dụng thanh nhiệt, giảm đau và chữa vết thương, tuy nhiên cho đến nay chỉ có một thông báo kết quả ban đầu về thành phần hóa học và chưa có nghiên cứu nào về hoạt tính sinh học của loài này. Để đóng góp vào việc tìm hiểu, nghiên cứu, đánh giá, góp phần bảo tồn những loài thực vật quý hiếm, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của ba loài: Ngoại mộc tái (Allophylus
2 livescens Gagnep.), Cày ri ta Hạ Long (Chirita halongenis Kiew & T. H. Nguyen) và An điền lá thông [Oldenlandia pinifolia (Wall. ex G. Don) Kuntze] của Việt Nam”. Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của ba loài nêu trên của Việt Nam nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo. Nội dung luận án bao gồm: 1. Phân lập các hợp chất từ ba loài Allophylus livescens, Chirita halongensis và Oldenlandia pinifolia ở Việt Nam bằng phương pháp sắc ký cột. 2 Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ MS, 1D-NMR, 2D-NMR. 3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết và các hợp chất phân lập được.
3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi Allophylus 1.1.1. Giới thiệu về thực vật chi Allophylus Chi Allophylus là một trong những chi lớn nhất thuộc họ Bồ hòn (Sapindaceae), gồm khoảng 255 loài [1], phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó có khoảng 55 loài được tìm thấy ở Châu Á và Châu Đại Dương và 26 loài (Bảng 1.1) ở Việt Nam phân bố tại Bắc Giang, Lạng Sơn, Cao Bằng, Quảng Ninh, Hà Nội [2a, 3]. Bảng 1.1. Các loài thực vật thuộc chi Allophylus ở Việt Nam KH Tên Khoa học KH Tên Khoa học 1 A. brachypetalus Gagnep. 14 A. hirsutus Radlk. 2 A. brachystachyus Radlk. 15 A. laxiflorus Gagnep. 3 A. caudatus Radlk. 16 A. livescens Gagnep. 4 A. capillipes Gagnep. 17 A. longifolius Radlk. 5 A. cobbe (L.) Raeusch. 18 A.longipes Radlk. 6 A. cochinchinensis Lecomte. 19 A. macrodontus Merr. 7 A. dimorphus Radlk. 20 A. pallidus Radlk. 8 A. eustachys Radlk. 21 A. petelotii Merr. 9 A. fuscus Radlk. 22 A. racemosus Boerl. 10 A. glaber var acutissimus Radlk. 23 A. salinarius Gagnep. 11 A. grandiflorus Radlk. 24 A. serratus (Hiern.) Kurz. 12 A. grossedentatus (Turcz.) Fern.-Vill. 25 A. serrulatus Radlk. 13 A. hayatae Gagnep. 26 A. viridis Radlk. Về đặc điểm thực vật, các loài thuộc chi Allophylus mọc hoang dưới tán rừng thưa, trong lùm bụi, thường là những cây nhỏ hay cây bụi hay cây dây leo, có từ 3 - 5 lá chét. Hoa nhỏ, hình cầu, có cuống, cánh hoa đơn hay kép, nhị 8. Quả hạch hình trứng ngược hay hình cầu [3]. 1.1.2. Ứng dụng của chi Allophylus trong y học cổ truyền Từ xa xưa, các loài thuộc chi Allophylus là những bài thuốc quý được con người dùng để chữa các bệnh như kiết lỵ, điều trị gãy xương, phong thấp, viêm thận, viêm gan [4]. Ở Ấn độ, lá của A. serratus được dùng để chữa bệnh vảy nến,
4 phù nề, gãy xương, phát ban, biếng ăn, một số rối loạn tiêu hóa [5]. Ở Việt Nam, vỏ thân A. glaber dùng sắc uống chữa kiết lỵ [3]. Tuy nhiên, cho đến nay, trên thế giới chỉ có rất ít công trình công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Allophylus. Mặc dù vậy, các kết quả nghiên cứu cho thấy các loài thuộc chi này có cấu trúc hóa học đa dạng và nhiều hoạt tính sinh học đáng quý 1.1.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Allophylus Cho đến nay, trong số 255 loài của chi Allophylus, chỉ có rất ít loài được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Đó là các loài A. longipes, A. serratus, A. edulis, A. cobbe. Bộ phận của cây được nghiên cứu chủ yếu là hoa và lá. Kết quả nghiên cứu cho thấy chúng là nguồn của các hợp chất phenol thuộc nhóm chất flavonoid; các hợp chất ligan và tannin, terpenoid và các hợp chất khác. 1.1.3.1. Hợp chất phenol  Hợp chất flavonoid Có 18 hợp chất flavonoid được phân lập từ các loài A. serratus, A. edulis và A. laevigatus thuộc các khung chất tiêu biểu là flavonol và flavone, chủ yếu là các C-glycosylflavone. Bảng 1.2. Các hợp chất flavonoid được phân lập từ chi Allophylus KH Hợp chất Tên loài TLTK 1 Luteolin-7-O--D-glucoside A. serratus [6] 2 Apigenin-4’-O--D-glucoside A. serratus [7] 3 Quercetin A. serratus [7] 4 Rutin A. serratus [7] 5 Vitexin 2"-O-rhamnoside A. edulis [8, 9] 6 Isovitexin A. edulis [8] 7 Vicenin -2 A. edulis [8] 8 Vitexin A. edulis [8] 9 Quercetin 3-O-(2"-O-galloyl)-glucoside A. edulis [8] 10 Mollupentin 2"-O-rhamnoside A. edulis [9] 11 Schaftoside A. edulis [9 ] 12 Lucenin-2 A. edulis [9 ]
5 13 Isovitexin 2"-O-rhamnoside A. edulis [9 ] 14 Isoorientin 2"-O-rhamnoside A. edulis [9 ] 15 Cerarvensin 2"-O-rhamnoside A. edulis [9 ] 16 Orientin 2"-O-rhamnoside A. edulis [9 ] 17 Saponarin A. edulis [9 ] 18 Apigenin-8-C-- rhamnoside A. laevigatus [10] R1 OH OH R2 OH HO O OH R5 O HO O CH 2OH O OH 3 OH R O OH O OH HO O R4 O OH O HO O O O HO 4 1 R1 = R2 = R4 = OH, R3 = H, R5 = OGlc HO HO O HO 2 R1 = R3 = OH, R2 = OGlc, R4 =R5 = OH HO OH HO 5 3 R1 = R2 = R3 = R4 = R5 = OH OH OH OH OH OH O OH HO O HO O OH HO O HO OH HO O OH O HO OH 6 OH O 7 OH HO OH HO OH HO O OH OH ORha O OH O OH O OH OH O OH OH O HO O HO O OH O HO HO O HOH 2C OH O OH O 9 8 10 OH HO HO OH CH 2OH HO O OH OH O OH OH OH HO O HO O OH HO O HO GlcO OH OH O OH O 11 12
6 OH OH OH HO O HO O O R O HO HO HO HO ORha ORha OH O OH O 13 R = H OH 15 14 R = OH O OH HO OH OH HO O HO HO OH OH HO OH O HO OH O O OH O ORha HO OH HO OH HO O O OH 17 18 16 OH O O OH Hình 1.1. Các hợp chất flavonoid phân lập được từ chi Allophylus Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ dịch chiết n-butanol của cây A. edulis gồm vitexin 2"-O-rhamnoside (5), isovitexin (6), vicenin-2 (7), vitexin (8) cho thấy chúng ức chế enzyme chuyển hóa angiotensin (ACE) với giá trị IC50 tương đương với giá trị IC50 của geraniin và (±)-catechin [10]. Một nghiên cứu khác cho thấy các hợp chất flavonoid vitexin 2"-O- rhamnoside (5), isovitexin 2"-O-rhamnoside (13), isoorientin 2"-O-rhamnoside (14), cerarvensin 2"-O-rhamnoside (15) và saponarin (17) có hoạt tính bảo vệ gan mạnh trong phép thử CCl4 và galactosamine. Như vậy, hợp chất C-glycosylflavone là thành phần chính bảo vệ gan của A. edulis [9]. Một công bố khác cho thấy hợp chất rutin (4) phân lập được từ A. serratus có hoạt tính chống loãng xương đáng kể [11].  Các hợp chất phenol khác Ngoài ra, có nhiều các hợp chất phenol thuộc lớp chất phenolic acid, polyphenol cũng được phân lập từ chi Allophylus. Bảng 1.3. Các hợp chất phenol được phân lập từ chi Allophylus KH Hợp chất Tên loài TLTK 19 Bergenin A. edulis [8] 20 11-O-galloylbergenin A. edulis [9 ] 21 Gallic acid A. edulis [9 ] 22 4-Hydroxy-3-methoxybenzaldehyde A. longipes [12]