Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây đu đủ đực (Carica papaya L.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:147

Thêm vào BST

Báo xấu

42
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học của hoa và lá cây đu đủ đực (Carica papaya L.); đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro của các hợp chất phân lập được nhằm tìm kiếm các hoạt chất làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo, tạo ra sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây đu đủ đực (Carica papaya L.)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ĐỖ THỊ THÚY VÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ Đà Nẵng - Năm 2020
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ĐỖ THỊ THÚY VÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) Ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 9 44 01 14 (62 44 01 14) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. Đào Hùng Cường 2. PGS.TS. Giang Thị Kim Liên Đà Nẵng - Năm 2020
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TS. Đào Hùng Cường và PGS.TS. Giang Thị Kim Liên. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Đỗ Thị Thúy Vân
ii LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Khoa Hóa - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của thầy cô, nhà khoa học, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc và sự kính trọng nhất tới GS.TS. Đào Hùng Cường và PGS.TS. Giang Thị Kim Liên - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, Ban Chủ nhiệm Khoa Hóa cùng tập thể cán bộ của Khoa đã quan tâm giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng nghiên cứu Cấu trúc - Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đặc biệt là TS. Phạm Hải Yến và ThS. Đan Thị Thúy Hằng về sự ủng hộ to lớn, những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ trung tâm tiên tiến về Hóa sinh Hữu cơ - Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tập thể cán bộ phòng thử nghiệm Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng tập thể cán bộ phòng thử nghiệm Sinh học - Khoa Dược - Trường Đại học Yonsei - Hàn Quốc đã giúp đỡ tôi hoàn thành việc thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Đà Nẵng, ngày tháng năm 2020 Tác giả Đỗ Thị Thúy Vân
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii TRANG THÔNG TIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ......................................................... vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ......................................... viii DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... xi DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... xiii DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ................................................................................xv MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Đ t vấn đ .........................................................................................................1 2. M c đ ch nghiên cứu ........................................................................................2 3. Đối tượng và ph m vi nghiên cứu ....................................................................2 4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................3 5. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................3 6. ngh a khoa học và thực ti n của nghiên cứu.................................................3 7. Những đóng góp mới của luận án.....................................................................4 8. Cấu trúc của luận án .........................................................................................4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................5 1.1. Giới thiệu v cây đu đủ ........................................................................................5 1.2. Tình hình nghiên cứu v thành phần hóa học của cây đu đủ ...............................6 1.2.1. Tình hình nghiên cứu v thành phần hóa học của cây đu đủ trong nước ...7 1.2.2. Tình hình nghiên cứu v thành phần hóa học của cây đu đủ trên thế giới ..............................................................................................................................8 1.3. Tình hình nghiên cứu v ho t tính sinh học của cây đu đủ ................................15 1.3.1. Tác d ng trị giun sán ................................................................................15 1.3.2. Tác d ng h huyết áp ................................................................................16 1.3.3. Tác d ng kháng sinh, kháng nấm .............................................................16 1.3.4. Tác d ng trị u bướu, ung thư ....................................................................17 1.3.5. Tác d ng chống oxy hóa ...........................................................................25 1.3.6. Các tác d ng dược l khác........................................................................26 1.4. Giới thiệu v enzyme tyrosinase ........................................................................27 1.4.1. Khái niệm và vai trò của enzyme tyrosinase ............................................27 1.4.2. Các chất ức chế enzyme tyrosinase ..........................................................28 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU ...................30 2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................30 2.2. Hóa chất, d ng c và thiết bị ..............................................................................31 2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................31
iv 2.3.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật ..............................................................31 2.3.2. Phương pháp đánh giá ho t t nh gây độc tế bào ung thư của các cao chiết ...........................................................................................................................31 2.3.3. Phương pháp phân lập các hợp chất ........................................................32 2.3.4. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất ......................33 2.3.5. Phương pháp đánh giá ho t t nh gây độc tế bào ung thư của các hợp chất ............................................................................................................................33 2.3.6. Phương pháp đánh giá ho t tính ức chế enzyme tyrosinase .....................35 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM .............................................................................36 3.1. Đánh giá ho t t nh gây độc tế bào ung thư của các cao chiết ............................36 3.1.1. Chuẩn bị các cao chiết ..............................................................................36 3.1.2. Đánh giá ho t t nh gây độc tế bào ung thư của các cao chiết...................36 3.2. Phân lập các hợp chất .........................................................................................37 3.2.1. Phân lập các hợp chất từ hoa cây đu đủ đực.............................................37 3.2.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây đu đủ đực ...............................................45 3.3. Tính chất vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất ..............................................46 3.3.1. Hợp chất 1 (C1): Rutin .............................................................................46 3.3.2. Hợp chất 2 (C2): Acid gallic ....................................................................46 3.3.3. Hợp chất 3 (C3): Daucosterol ...................................................................48 3.3.4. Hợp chất 4 (CP1): 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2- carbaldehyde (Hợp chất lần đầu phân lập từ nguồn tự nhiên) ..................................48 3.3.5. Hợp chất 5 (CP3): Vitexoid ......................................................................48 3.3.6. Hợp chất 6 (CP4): Lariciresinol ...............................................................48 3.3.7. Hợp chất 7 (CP5): Dehydrodiconiferyl alcohol .......................................48 3.3.8. Hợp chất 8 (CP6): Benzyl-O--D-glucopyranoside .................................48 3.3.9. Hợp chất 9 (CP9): 6-hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid ...........48 3.3.10. Hợp chất 10 (CP10): 6-hydroxy-2,6-dimethyloct-7-enoic acid .............49 3.3.11. Hợp chất 11 (CP14): 2,6-dimethylocta-2,7-diene-1,6-diol ....................49 3.3.12. Hợp chất 12 (CP11): Hỗn hợp 2 chất 3-hydroxy-3-methyl-5- hexanolide và leucine ................................................................................................49 3.3.13. Hợp chất 13 (CP12A): Caricapapayol (Hợp chất mới) ..........................49 3.3.14. Hợp chất 14 (CP17A): Ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat (Hợp chất mới) ..........................................................................................................49 3.3.15. Hợp chất 15 (CP19): Indole-3-aldehyde ................................................49 3.3.16. Hợp chất 16 (CP20): 3β,7α-dihydroxycholest-5-ene .............................50 3.3.17. Hợp chất 17 (CP21): Cholest-5-ene-3β,7β-diol .....................................50 3.3.18. Hợp chất 18 (CP22): Saringosterol ........................................................50 3.3.19. Hợp chất 19 (CPE1): Kaempferol ..........................................................50 3.3.20. Hợp chất 20 (CPE5): Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside ............50
v 3.3.21. Hợp chất 21 (CPE4): Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside ...............50 3.3.22. Hợp chất 22 (CPE7): Kaempferol-3-O-α-L-arabinopyranoside ............51 3.3.23. Hợp chất 23 (CPE2): Quercetin..............................................................51 3.3.24. Hợp chất 24 (CPE3): Quercitrin .............................................................51 3.3.25. Hợp chất 25 (CPE6): Quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside ................51 3.3.26. Hợp chất 26 (CPE8): Myricitrin .............................................................51 3.3.27. Hợp chất 27 (CPL-C1): Tetratriacontanyl palmitate ..............................51 3.3.28. Hợp chất 28 (CPL-C2): 1-hentriacontanol .............................................52 3.3.29. Hợp chất 29 (CPL-C3): Vanillin ............................................................52 3.3.30. Hợp chất 30 (CPL-C4): Stigmasterol .....................................................52 3.4. Đánh giá ho t t nh gây độc tế bào ung thư của các hợp chất .............................52 3.5. Đánh giá ho t tính ức chế enzyme tyrosinase của cao methanol và các hợp chất ............................................................................................................................53 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................54 4.1. Kết quả đánh giá ho t t nh gây độc tế bào ung thư của các cao chiết................54 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất ......................................................56 4.2.1. Hợp chất 1 (C1): Rutin .............................................................................56 4.2.2. Hợp chất 2 (C2): Acid gallic ....................................................................57 4.2.3. Hợp chất 3 (C3): Daucosterol ...................................................................58 4.2.4. Hợp chất 4 (CP1): 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2- carbaldehyde (Hợp chất lần đầu phân lập từ nguồn tự nhiên) ..................................60 4.2.5. Hợp chất 5 (CP3): Vitexoid ......................................................................64 4.2.6. Hợp chất 6 (CP4): Lariciresinol ...............................................................65 4.2.7. Hợp chất 7 (CP5): Dehydrodiconiferyl alcohol .......................................66 4.2.8. Hợp chất 8 (CP6): Benzyl-O--D-glucopyranoside .................................68 4.2.9. Hợp chất 9 (CP9): 6-hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid ...........69 4.2.10. Hợp chất 10 (CP10): 6-hydroxy-2,6-dimethyloct-7-enoic acid .............70 4.2.11. Hợp chất 11 (CP14): 2,6-dimethylocta-2,7-diene-1,6-diol ....................71 4.2.12. Hợp chất 12 (CP11): Hỗn hợp 2 chất 3-hydroxy-3-methyl-5- hexanolide và leucine ................................................................................................72 4.2.13. Hợp chất 13 (CP12A): Caricapapayol (Hợp chất mới) ..........................74 4.2.14. Hợp chất 14 (CP17A): Ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat (Hợp chất mới) ..........................................................................................................79 4.2.15. Hợp chất 15 (CP19): Indole-3-aldehyde ................................................83 4.2.16. Hợp chất 16 (CP20): 3β,7α-dihydroxycholest-5-ene .............................83 4.2.17. Hợp chất 17 (CP21): Cholest-5-ene-3β,7β-diol .....................................85 4.2.18. Hợp chất 18 (CP22): Saringosterol ........................................................86 4.2.19. Hợp chất 19 (CPE1): Kaempferol ..........................................................88 4.2.20. Hợp chất 20 (CPE5): Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside ............89
vi 4.2.21. Hợp chất 21 (CPE4): Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside ...............90 4.2.22. Hợp chất 22 (CPE7): Kaempferol-3-O-α-L-arabinopyranoside ............91 4.2.23. Hợp chất 23 (CPE2): Quercetin..............................................................93 4.2.24. Hợp chất 24 (CPE3): Quercitrin .............................................................94 4.2.25. Hợp chất 25 (CPE6): Quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside ................95 4.2.26. Hợp chất 26 (CPE8): Myricitrin .............................................................96 4.2.27. Hợp chất 27 (CPL-C1): Tetratriacontanyl palmitate ..............................98 4.2.28. Hợp chất 28 (CPL-C2): 1-hentriacontanol .............................................98 4.2.29. Hợp chất 29 (CPL-C3): Vanillin ............................................................99 4.2.30. Hợp chất 30 (CPL-C4): Stigmasterol ...................................................100 4.3. Kết quả đánh giá ho t t nh gây độc tế bào ung thư của các hợp chất ..............106 4.4. Kết quả đánh giá ho t tính ức chế enzyme tyrosinase của cao methanol và các hợp chất .............................................................................................................111 KẾT LUẬN ............................................................................................................113 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................115 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................116 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ....................130 PHỤ LỤC
vii TRANG THÔNG TIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Tên luận án: Nghiên cứu thành phần hóa học và ho t tính sinh học của cây đu đủ đực (Carica papaya L.) Ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 9 44 01 14 (62 44 01 14) Nghiên cứu sinh: Đỗ Thị Thúy Vân Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Đào Hùng Cường 2. PGS.TS. Giang Thị Kim Liên Cơ sở đào tạo: Trường Đ i học Sư ph m - Đ i học Đà Nẵng Tóm tắt: Từ hoa và lá cây đu đủ đực (Carica papaya L.), 30 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học. Theo tra cứu tài liệu t i thời điểm nghiên cứu, trong các hợp chất đã phân lập có 2 hợp chất mới bao gồm caricapapayol và ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat, 1 hợp chất lần đầu phân lập từ nguồn tự nhiên là 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carbaldehyde, 18 hợp chất lần đầu phân lập từ loài cây này: vitexoid; lariciresinol; dehydrodiconiferyl alcohol; 6-hydroxy-2,6- dimethyl-2,7-octadienoic acid; 6-hydroxy-2,6-dimethyloct-7-enoic acid; hỗn hợp 3-hydroxy-3-methyl- 5-hexanolide và leucine; 2,6-dimethylocta-2,7-diene-1,6-diol; indole-3-aldehyde; 3β,7α- dihydroxycholest-5-ene; cholest-5-ene-3β,7β-diol; saringosterol; quercitrin; kaempferol-3-O-α-L- rhamnopyranoside; quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside; kaempferol-3-O-α-L-arabinopyranoside; tetratriacontanyl palmitate; 1-hentriacontanol và vanillin. Có 24/30 hợp chất phân lập từ hoa và lá cây đu đủ đực đã được thử nghiệm ho t t nh gây độc trên các dòng tế bào ung thư ở người A549, MCF-7 và Hep3B, trong đó 19/24 hợp chất có mức ho t t nh ức chế các dòng tế bào ung thư ở người với giá trị IC50 trong khoảng 26,72±0,76 đến 93,07±5,03 µg/mL. Cũng theo tra cứu tài liệu t i thời điểm nghiên cứu, lần đầu tiên có 9/26 hợp chất phân lập từ hoa cây đu đủ đực đƣợc thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase, trong đó 7/9 hợp chất có mức ho t t nh ức chế enzyme tyrosinase với giá trị IC50 trong khoảng 14,3±2,7 đến 82,1±3,6 µM. Từ khóa: Carica papaya L., cytotoxic activity, enzyme tyrosinase, ethyl-(9E)-8,11,12- trihydroxyoctadecenoat, caricapapayol, 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carbaldehyde. INFORMATION PAGE OF DOCTORAL THESIS Name of thesis: Study on chemical composition and biological activities of male Carica papaya L. Major: Organic chemistry Code No: 9 44 01 14 (62 44 01 14) Full name of PhD student: Do Thi Thuy Van Supervisors: 1. Prof.Dr. Dao Hung Cuong 2. Assoc.Prof.Dr. Giang Thi Kim Lien Training institution: University of Science and Education, The University of Danang Abstract: From male Carica papaya flowers and leaves are isolated into 30 compounds and determinated the structure of 30 compounds. Among them, caricapapayol and ethyl-(9E)-8,11,12- trihydroxyoctadecenoat are two new compounds. 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2- carbaldehyde is firstly isolated from natural source. Vitexoid; lariciresinol; dehydrodiconiferyl alcohol; 6-hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid; 6-hydroxy-2,6-dimethyloct-7-enoic acid; mixture of 3-hydroxy-3-methyl-5-hexanolide and leucine; 2,6-dimethylocta-2,7-diene-1,6-diol; indole-3- aldehyde; 3β,7α-dihydroxycholest-5-ene; cholest-5-ene-3β,7β-diol; saringosterol; quercitrin; kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside; quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside; kaempferol-3-O-α-L- arabinopyranoside; tetratriacontanyl palmitate; 1-hentriacontanol and vanillin are firstly isolated from male Carica papaya flowers and leaves. In addition, 24/30 compounds from male Carica papaya flowers and leaves are tested for cytotoxic activity on cancer cell lines A549, MCF-7 and Hep3B. Among them, 19/24 compounds have activity levels with IC50 from 26,72±0,76 to 93,07±5,03 µg/mL. 9/26 compounds from male Carica papaya flowers are firstly tested for tyrosinase inhibitory activity. Among them, 7/9 compounds have activity levels with IC50 from 14,3±2,7 đến 82,1±3,6 µM. Key words: Carica papaya L., cytotoxic activity, enzyme tyrosinase, ethyl-(9E)-8,11,12- trihydroxyoctadecenoat, caricapapayol, 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carbaldehyde.
viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng anh Diễn giải Các phƣơng pháp sắc ký CC Column Chromatography Sắc ký cột TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng Các phƣơng pháp phổ 1 Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ h t nhân H-NMR Resonance Spectroscopy proton 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ h t nhân C-NMR Resonance Spectroscopy carbon 13 COSY Correlation Spectroscopy Phổ tương tác hai chi u 1H-1H Distortionless Enhancement by DEPT Phổ DEPT Polarisation Transfer Electrospray Ionization Mass Phổ khối ion hóa phun mù điện ESI-MS Spectrometry tử Heteronuclear Mutiple Bond Phổ tương tác hai chi u dị h t HMBC Connectivity nhân qua nhi u liên kết High Resolution Electronspray Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS Ionization Mass Spectrum phun mù điện tử Heteronuclear Single-Quantum Phổ tương tác hai chi u dị h t HSQC Coherence nhân qua 1 liên kết Nuclear Overhauser NOESY Phổ NOESY Enhancement Spectroscopy Rotating frame nuclear ROESY Overhauser Enhancement Phổ ROESY Spectroscopy Độ dịch chuyển hóa học tính δ (ppm) δ (ppm = part per million) bằng phần triệu s singlet d doublet t triplet q quartet m multiplet dd double doublet dt double triplet br broad br s broad singlet br d broad doublet ddd double doublet double
ix Kí hiệu Tiếng anh Diễn giải Các dòng tế bào A549 LU-1 Human lung carcinoma Ung thư phổi PC14 NCI-H460 Bcap-37 MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thư vú MDA-MB-21 TD47 Hep3B Hep-G2 Human hepatoma Ung thư gan Hepa1c1c7 LNCaP Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến ti n liệt PC3 HeLa Human cervical adenocarcinoma Ung thư cổ tử cung HL-60 Human promyelocytic leukemia Ung thư máu cấp tính H2452 KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô SCC25 P-388 Lymphocytic leukemia Ung thư máu lympho UACC62 Melanoma Ung thư hắc tố Các ký hiệu viết tắt khác CS % Tỷ lệ tế bào sống sót CTPT Công thức phân tử Dulbecco’s Modified Eagle DMEM Medium C c Quản lý Thực phẩm và FDA Dược phẩm Hoa Kỳ I% Tỷ lệ ức chế enzyme tyrosinase IC50 Nồng độ ức chế 50% mp Melting point Điểm chảy NCI National Cancer Institute Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ OD Optical Density Mật độ quang SRB Sulforhodamine B TB Tế bào TMS Tetramethylsilane CHCl3 Chloroform
x Kí hiệu Tiếng anh Diễn giải CH2Cl2 Dichloromethane DMSO Dimethylsulfoxide EtOAc Ethyl acetate MeOH Methanol Me Methyl OMe Methoxy Cao n-hexane của hoa cây đu CPH đủ đực Cao chloroform của hoa cây đu CPC đủ đực Cao dichloromethane của hoa CPD cây đu đủ đực Cao ethyl acetate của hoa cây CPET đu đủ đực Cao n-hexane của lá cây đu đủ CPLH đực Cao chloroform của lá cây đu CPLC đủ đực Ghi chú: Tên các hợp chất, lớp chất, nhóm thế, nhóm chức hóa học được viết theo nguyên bản Tiếng Anh để đảm bảo tính thống nhất và chính xác.
xi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học cây đu đủ .............................................................................. 14 Bảng 1.2. Tác d ng của dịch chiết và hợp chất hóa học từ cây đu đủ lên các dòng tế bào ung thư khác nhau trong đi u kiện in vitro............................................................................. 20 Bảng 1.3. Ho t t nh gây độc tế bào ung thư của glucosinolate, phenolic, flavonoid, carotenoid và alkaloid trong cây đu đủ .................................................................................. 22 Bảng 3.1. Các lo i silica gel và hệ dung môi sử d ng trong sơ đồ phân lập ở Hình 3.2 ..... 39 Bảng 3.2. Các lo i silica gel và hệ dung môi sử d ng trong sơ đồ phân lập ở Hình 3.3 ..... 42 Bảng 3.3. Các lo i silica gel và hệ dung môi sử d ng trong sơ đồ phân lập ở Hình 3.4 ..... 43 Bảng 3.4. Các lo i silica gel và hệ dung môi sử d ng trong sơ đồ phân lập ở Hình 3.6 ..... 46 Bảng 4.1. Ho t t nh gây độc tế bào ung thư của các cao chiết .............................................. 55 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất C1 và hợp chất tham khảo................................. 57 Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất C2 và hợp chất tham khảo................................. 58 Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất C3 và hợp chất tham khảo................................. 59 Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP1 và hợp chất tham khảo .............................. 61 Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP3 và hợp chất tham khảo .............................. 64 Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP4 và hợp chất tham khảo .............................. 66 Bảng 4.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP5 và hợp chất tham khảo .............................. 67 Bảng 4.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP6 và hợp chất tham khảo .............................. 69 Bảng 4.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP9 và hợp chất tham khảo ............................ 70 Bảng 4.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP10 và hợp chất tham khảo .......................... 71 Bảng 4.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP14 và hợp chất tham khảo .......................... 72 Bảng 4.13.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP11.1 và hợp chất tham khảo .................... 73 Bảng 4.13.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP11.2 và hợp chất tham khảo .................... 74 Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP12A .............................................................. 75 Bảng 4.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP17A và hợp chất tham khảo ....................... 79 Bảng 4.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP19 và hợp chất tham khảo .......................... 83 Bảng 4.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP20 và hợp chất tham khảo .......................... 84 Bảng 4.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP21 và hợp chất tham khảo .......................... 86 Bảng 4.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất CP22 và hợp chất tham khảo .......................... 87 Bảng 4.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất CPE1 và hợp chất tham khảo.......................... 88 Bảng 4.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất CPE5 và hợp chất tham khảo.......................... 90 Bảng 4.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất CPE4 và hợp chất tham khảo.......................... 91 Bảng 4.23. Số liệu phổ NMR của hợp chất CPE7 và hợp chất tham khảo.......................... 92 Bảng 4.24. Số liệu phổ NMR của hợp chất CPE2 và hợp chất tham khảo.......................... 93
xii Bảng 4.25. Số liệu phổ NMR của hợp chất CPE3 và hợp chất tham khảo.......................... 94 Bảng 4.26. Số liệu phổ NMR của hợp chất CPE6 và hợp chất tham khảo.......................... 96 Bảng 4.27. Số liệu phổ NMR của hợp chất CPE8 và hợp chất tham khảo.......................... 97 Bảng 4.28. Số liệu phổ NMR của hợp chất CPL-C3 và hợp chất tham khảo ..................... 99 Bảng 4.29. Số liệu phổ NMR của hợp chất CPL-C4 và hợp chất tham khảo ................... 100 Bảng 4.30. Thống kê các hợp chất phân lập từ cây đu đủ đực ........................................... 102 Bảng 4.31. Ho t t nh gây độc tế bào ung thư của các hợp chất .......................................... 106 Bảng 4.32. Ho t t nh ức chế enzyme tyrosinase của cao methanol.................................... 111 Bảng 4.33. Ho t t nh ức chế enzyme tyrosinase của các hợp chất ..................................... 112
xiii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh cây đu đủ.................................................................................................... 6 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất phân lập từ cây đu đủ .............................. 13 Hình 2.1. Hoa và lá cây đu đủ đực.......................................................................................... 30 Hình 2.2. Bột hoa và lá cây đu đủ đực.................................................................................... 30 Hình 3.1. Sơ đồ t o các cao chiết từ hoa cây đu đủ đực ........................................................ 38 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chloroform của hoa cây đu đủ đực.............. 39 Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao dicholoromethane của hoa cây đu đủ đực .. 41 Hình 3.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetate của hoa cây đu đủ đực............ 44 Hình 3.5. Sơ đồ t o các cao chiết từ lá cây đu đủ đực ........................................................... 45 Hình 3.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chloroform của lá cây đu đủ đực................. 47 Hình 4.1. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất C1 ................ 56 Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất C2.......................................................................... 57 Hình 4.3. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất C3 ................ 58 Hình 4.4. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất CP1 .............. 60 Hình 4.5. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất CP1 ....................................................................... 61 Hình 4.6. Phổ 1H-NMR của hợp chất CP1 ............................................................................ 62 Hình 4.7. Phổ 13C-NMR của hợp chất CP1 ........................................................................... 62 Hình 4.8. Phổ HSQC của hợp chất CP1................................................................................. 63 Hình 4.9. Phổ HMBC của hợp chất CP1 ............................................................................... 63 Hình 4.10. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY ch nh (b) của hợp chất CP3............................................................................................................................................ 64 Hình 4.11. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất CP4 ............ 65 Hình 4.12. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất CP5 ............ 68 Hình 4.13. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất CP6 ............ 68 Hình 4.14. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất CP9 ............ 69 Hình 4.15. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất CP10 .......... 70 Hình 4.16. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất CP14 .......... 71 Hình 4.17.1. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất CP11.1.... 72 Hình 4.17.2. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất CP11.2.... 73 Hình 4.18. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất CP12A....... 74 Hình 4.19. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất CP12A................................................................ 76 Hình 4.20. Phổ 1H-NMR của hợp chất CP12A ..................................................................... 76 Hình 4.21. Phổ 13C-NMR của hợp chất CP12A .................................................................... 77 Hình 4.22. Phổ DEPT của hợp chất CP12A .......................................................................... 77
xiv Hình 4.23. Phổ HSQC của hợp chất CP12A ......................................................................... 78 Hình 4.24. Phổ HMBC của hợp chất CP12A ........................................................................ 78 Hình 4.25. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất CP17A....... 79 Hình 4.26. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất CP17A................................................................ 80 Hình 4.27. Phổ 1H-NMR của hợp chất CP17A ..................................................................... 81 Hình 4.28. Phổ 13C-NMR của hợp chất CP17A .................................................................... 81 Hình 4.29. Phổ HSQC của hợp chất CP17A ......................................................................... 82 Hình 4.30. Phổ HMBC của hợp chất CP17A ........................................................................ 82 Hình 4.31. Cấu trúc hóa học của hợp chất CP19 ................................................................... 83 Hình 4.32. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất CP20 .......... 84 Hình 4.33. Cấu trúc hóa học của hợp chất CP21 ................................................................... 85 Hình 4.34. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC ch nh (b) của hợp chất CP22 .......... 87 Hình 4.35. Cấu trúc hóa học của hợp chất CPE1................................................................... 88 Hình 4.36. Cấu trúc hóa học của hợp chất CPE5................................................................... 89 Hình 4.37. Cấu trúc hóa học của hợp chất CPE4................................................................... 90 Hình 4.38. Cấu trúc hóa học của hợp chất CPE7................................................................... 92 Hình 4.39. Cấu trúc hóa học của hợp chất CPE2................................................................... 93 Hình 4.40. Cấu trúc hóa học của hợp chất CPE3................................................................... 94 Hình 4.41. Cấu trúc hóa học của hợp chất CPE6................................................................... 95 Hình 4.42. Cấu trúc hóa học của hợp chất CPE8................................................................... 96 Hình 4.43. Cấu trúc hóa học của hợp chất CPL-C1 .............................................................. 98 Hình 4.44. Cấu trúc hóa học của hợp chất CPL-C2 .............................................................. 99 Hình 4.45. Cấu trúc hóa học của hợp chất CPL-C3 .............................................................. 99 Hình 4.46. Cấu trúc hóa học của hợp chất CPL-C4 ............................................................ 101 Hình 4.47. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ cây đu đủ đực......................... 105
xv DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Ph l c 1. Các phổ của hợp chất C1 ....................................................................... PL1 Ph l c 2. Các phổ của hợp chất C2 ....................................................................... PL4 Ph l c 3. Các phổ của hợp chất C3 ....................................................................... PL5 Ph l c 4. Các phổ của hợp chất CP3 ..................................................................... PL8 Ph l c 5. Các phổ của hợp chất CP4 .................................................................... PL11 Ph l c 6. Các phổ của hợp chất CP5 .................................................................... PL13 Ph l c 7. Các phổ của hợp chất CP6 .................................................................... PL15 Ph l c 8. Các phổ của hợp chất CP9 .................................................................... PL17 Ph l c 9. Các phổ của hợp chất CP10 .................................................................. PL19 Ph l c 10. Các phổ của hợp chất CP14 ................................................................ PL21 Ph l c 11. Các phổ của hợp chất CP11 ................................................................ PL23 Ph l c 12. Các phổ của hợp chất CP19 ................................................................ PL27 Ph l c 13. Các phổ của hợp chất CP20 ................................................................ PL29 Ph l c 14. Các phổ của hợp chất CP21 ................................................................ PL32 Ph l c 15. Các phổ của hợp chất CP22 ................................................................ PL34 Ph l c 16. Các phổ của hợp chất CPE1 ................................................................ PL37 Ph l c 17. Các phổ của hợp chất CPE5 ................................................................ PL39 Ph l c 18. Các phổ của hợp chất CPE4 ................................................................ PL41 Ph l c 19. Các phổ của hợp chất CPE7 ................................................................ PL43 Ph l c 20. Các phổ của hợp chất CPE2 ................................................................ PL44 Ph l c 21. Các phổ của hợp chất CPE3 ................................................................ PL45 Ph l c 22. Các phổ của hợp chất CPE6 ................................................................ PL47 Ph l c 23. Các phổ của hợp chất CPE8 ................................................................. Pl49 Ph l c 24. Các phổ của hợp chất CPL-C1 ............................................................ PL51 Ph l c 25. Các phổ của hợp chất CPL-C2 ............................................................ PL53 Ph l c 26. Các phổ của hợp chất CPL-C3 ............................................................ PL55 Ph l c 27. Các phổ của hợp chất CPL-C4 ............................................................ PL57 Ph l c 28. Biên bản thử ho t t nh gây độc tế bào ung thư của các hợp chất........ PL59 Ph l c 29. Biên bản giám định tên khoa học của cây đu đủ đực.......................... PL64
1 MỞ ĐẦU 1. Đ t vấn đ Cùng với sự phát triển không ngừng v mọi m t của xã hội, con người đang phải đối m t với nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhi u hơn. Một trong những giải pháp hiện nay là xu hướng quay v với thiên nhiên, dùng những sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân t o, nhất là hợp chất thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta. Cây đu đủ (Carica papaya L.) là một lo i cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở Việt Nam, cây đu đủ được trồng phổ biến ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các lo i đất phù sa. Cây đu đủ có lợi thế là lo i cây d trồng, ra quả sớm, năng suất cao đồng thời các bộ phận của cây đu đủ đ u được sử d ng với nhi u m c đ ch chữa bệnh khác nhau [19]. Quả đu đủ là nguồn cung cấp nhi u lo i enzyme khác nhau. Papain, pepsin giúp tiêu hóa protein trong thức ăn ở môi trường acid, ki m và trung tính. Lipase, một enzyme hydrolase liên kết ch t chẽ với phần không tan trong nước của quả xanh, là một chất xúc tác sinh học cố định. Ngoài ra, acid folic tìm thấy trong quả đu đủ là chất chuyển đổi homocysteine thành các acid amin như cysteine ho c methionine. Quả đu đủ chín là thuốc nhuận tràng đảm bảo cho ruột ho t động bình thường [148]. H t đu đủ có nhi u ho t tính sinh học tốt như đ c tính kháng khuẩn và có hiệu quả chống l i vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus; đi u trị ký sinh trùng đường ruột ở người mà không có tác d ng ph ; bảo vệ thận; giúp giải độc gan; h sốt; chữa bệnh tr ; thương hàn và chống lão hóa [148]. Bên c nh đó, h t đu đủ còn được sử d ng làm thuốc chống trầm cảm, kích thích kinh nguyệt [59]. Dịch chiết từ r cây đu đủ được sử d ng để đi u trị bệnh giang mai, bệnh tr , khối u của tử cung và lo i bỏ sự đông kết ure [59]. Một số nước ở Châu Á đã sử d ng nước ép từ r cây đu đủ để đi u trị chứng khó tiêu và giảm tiểu tiện [148]. Trong dân gian lá cây đu đủ được sử d ng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, giảm đau, chữa sốt rét, trừ giun sán,... Đã có nhi u công trình nghiên cứu v ho t tính sinh học của lá cây đu đủ. Lá cây đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất m nh [35], [134]. Ho t tính chống oxy hóa này do các hợp chất phenol gây ra [114]. Ngoài ra, lá cây đu đủ có ho t tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kháng nhi u lo i vi khuẩn gram âm, gram dương và các lo i nấm [28]. Đ c biệt, người dân một số quốc gia đã dùng lá cây đu đủ chữa bệnh ung thư. Người dân nước Úc đã dùng lá cây đu đủ để trị bệnh ung thư. Một nhóm nghiên cứu người Nhật Bản và Mỹ đã thông báo dịch chiết nước lá cây đu đủ có tác d ng ức chế một số dòng tế bào ung thư như ung thư d dày, ung thư phổi, ung thư máu,...[112]. Ở Việt Nam, cao chiết với cồn từ lá cây đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình
2 ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác d ng ức chế sự phát triển của khối u gây ra bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng [11]. Gần đây, người dân địa phương ở Quảng Nam-Đà Nẵng đã sử d ng hoa cây đu đủ đực để đi u trị các bệnh v đường hô hấp như viêm họng, ho, mất tiếng, khản tiếng; các bệnh v hệ bài tiết như đái rắt, đái buốt, đau niệu đ o; chữa sỏi thận; tác d ng k ch th ch tiêu hóa. Ngoài ra, hoa cây đu đủ đực còn được dùng để hỗ trợ đi u trị bệnh ung thư như ung thư phổi, ưng thư vú, ung thư gan,...[14], [106]. Chính bởi công d ng chữa bệnh của cây đu đủ như trên, có nhi u đ tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và ho t tính sinh học của loài cây này, chủ yếu là các bộ phận của cây đu đủ cái. Thế nhưng vẫn còn rất ít nghiên cứu v các bộ phận của cây đu đủ đực. Việc sử d ng các bộ phận của cây đu đủ đực hiện nay để chữa bệnh vẫn chỉ theo kinh nghiệm dân gian, nhi u người còn e ng i vì chưa có các cơ sở khoa học để chứng minh. Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và chỉ ra được thành phần ho t chất c thể của cây đu đủ đực có ho t tính sinh học là một việc làm hết sức cần thiết, t o cơ sở khoa học cho việc ứng d ng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc đi u trị một số lo i bệnh, trong đó có bệnh ung thư. Do đó, đ tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và ho t tính sinh học của cây đu đủ đực (Carica papaya L.)” đã được lựa chọn. 2. Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học của hoa và lá cây đu đủ đực (Carica papaya L.); - Đánh giá ho t tính gây độc tế bào ung thư và ho t tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro của các hợp chất phân lập được nhằm tìm kiếm các ho t chất làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo, t o ra sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu - Hoa và lá cây đu đủ đực; - Các cao chiết n-hexane, chloroform, dichloromethane và ethyl acetate; - Các hợp chất phân lập được. 3.2. Phạm vi nghiên cứu - Hoa và lá cây đu đủ đực được thu hái t i Quảng Nam-Đà Nẵng vào tháng 12 năm 2016; - Một số cao chiết từ hoa và lá cây đu đủ đực được lựa chọn để tiến hành phân lập và xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất ở quy mô phòng thí nghiệm; - Đánh giá ho t tính gây độc tế bào ung thư và ho t tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro của các hợp chất phân lập được.
3 4. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá ho t t nh gây độc tế bào ung thư in vitro của các cao chiết từ hoa và lá cây đu đủ đực; - Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ hoa và lá cây đu đủ đực; - Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập được; - Đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase in vitro của cao methanol và các hợp chất phân lập được. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu 5.1. ư t t - Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên; - Tham khảo các công trình nghiên cứu v thành phần hóa học và ho t tính sinh học của cây đu đủ trên thế giới và trong nước; - Tổng quan các tài liệu v đ c điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ho t tính sinh học và ứng d ng của loài cây này. 5.2. ư t i - Các phương pháp lựa chọn và xử lý mẫu thực nghiệm; - Các phương pháp chiết mẫu thực vật; - Các phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất; - Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất; - Các phương pháp đánh giá ho t t nh gây độc tế bào ung thư; - Các phương pháp đánh giá ho t t nh ức chế enzyme tyrosinase; - Các phương pháp xử lý số liệu bằng toán học. 6. ngh a hoa học và thực tiễn của nghiên cứu 6.1. Ý ĩa k oa ọc - Cung cấp thêm các thông tin v thành phần hoá học và ho t tính sinh học của cây đu đủ đực, làm giàu thêm kho tàng hợp chất thiên nhiên của thế giới nói chung và của Việt Nam nói riêng. - Kết quả của nghiên cứu này là cơ sở cho việc nghiên cứu phân lập các hợp chất có ho t tính sinh học từ các loài thực vật khác của địa phương. 6.2. Ý ĩa t c tiễn - Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo tốt, có t nh thời sự cao đối với việc giảng d y cho sinh viên ngành Hóa, Sinh học phân tử, Y dược; góp phần bồi dưỡng năng lực nghiên cứu khoa học, kỹ năng nghiên cứu của các giảng viên và nhà nghiên cứu ngành Hóa. - Góp phần khai thác hợp l và bảo tồn các loài thuốc dân gian qu của địa phương, sử d ng có hiệu quả các loài thuốc dân gian này, giúp ph c v chăm sóc sức khỏe cộng đồng, có khả năng t o ra các sản phẩm hỗ trợ đi u trị một số căn bệnh hiểm nghèo từ cây đu đủ đực, mang l i hiệu quả kinh tế-xã hội cao.