Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:160

Thêm vào BST

Báo xấu

21
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Hóa học "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam" nghiên cứu phân lập các hợp chất từ củ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và lá Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam bằng các phương pháp sắc ký kết hợp; Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được; Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính ức chế sản sinh NO và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các chất phân lập được nhằm tìm kiếm các hoạt tính mới từ 2 loài thực vật này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) VÀ SÂM VIỆT NAM (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2023
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) VÀ SÂM VIỆT NAM (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) Ở VIỆT NAM Ngành: Hoá học Mã số: 9440112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Vũ Đình Hoàng 2. PGS. TS. Nguyễn Hữu Tùng Hà Nội - 2023
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Vũ Đình Hoàng và PGS. TS. Nguyễn Hữu Tùng. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào ngoài tôi và tập thể hướng dẫn. Hà Nội, ngày…..tháng….năm …. Tập thể hướng dẫn Nghiên cứu sinh PGS. TS. Vũ Đình Hoàng Nguyễn Thị Hoàng Anh PGS. TS. Nguyễn Hữu Tùng i
LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Bộ môn Công nghệ Hóa Dược và Bảo vệ thực vật, Viện Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, Khoa Dược- Đại học Phenikaa và Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với sự với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Khoa học và Công nghệ cấp Bộ với mã số B2019 – BKA-02 và đề tài thuộc Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (NAFOSTED) với mã số 108.05-2019.01 Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Vũ Đình Hoàng và PGS. TS. Nguyễn Hữu Tùng – là những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Phạm Quang Dương, các anh, chị, em Trung tâm Phát triển Công nghệ cao, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam đã quan tâm, hỗ trợ tôi để có thể hoàn thành bản luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Bộ môn CN Hóa dược và Bảo vệ thực vật, Bộ môn Hóa hữu cơ, các thầy cô Ban lãnh đạo Viện Kỹ Thuật Hóa học đã luôn ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và Phòng Đào tạo & Công tác Học sinh Sinh viên đã luôn quan tâm, tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành bản luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Và đặc biệt, xin gửi tặng món quà này đến bố mẹ kính yêu của tôi. Xin trân trọng cảm ơn! ii
MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3 1.1. Giới thiệu về Chi Panax ...................................................................................... 3 1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố .............................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật ............................................................................................ 4 1.1.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học ................................................................. 5 1.1.4. Nguyên cứu về hoạt tính sinh học .................................................................... 8 1.2. Giới thiệu về Sâm vũ diệp ............................................................................. 11 1.2.1. Tên khoa học .................................................................................................. 11 1.2.2. Đặc điểm thực vật .......................................................................................... 11 1.2.3. Phân bố và sinh thái ...................................................................................... 12 1.2.4. Nghiên cứu về thành phần hóa học của Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) ..... 13 1.2.5. Nguyên cứu về hoạt tính sinh học của Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) ........ 16 1.3. Giới thiệu về Sâm việt nam .......................................................................... 18 1.3.1. Tên khoa học .................................................................................................. 18 1.3.2. Đặc điểm thực vật .......................................................................................... 18 1.3.3. Phân bố và sinh thái ...................................................................................... 19 1.3.4. Nghiên cứu về thành phần hóa học của Sâm việt nam (P. vietnamensis) ..... 20 1.3.5. Nguyên cứu về hoạt tính sinh học của Sâm việt nam (P. vietnamensis) ....... 33 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 38 2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 38 2.1.1. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) .................................................... 38 2.1.2. Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ...................................... 38 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 39 2.2.1. Phương pháp phân lập chất ........................................................................... 39 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các chất ......................................... 39 2.2.2.1. Góc quay cực riêng ............................................................................ 39 2.2.2.2. Phổ khối lượng (MS) ................................................................................... 39 2.2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ........................................................... 39 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu sinh học ................................................................. 40 2.2.3.1. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ............................................................... 40 2.2.3.1. Đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh NO .................................................. 42 2.2.3.3. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase ...................................... 45 2.2.4. Phương pháp xác định cấu hình đường bằng thủy phân acid ....................... 40 iii
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM ............................................................................. 47 3.1. Phân lập các hợp chất từ Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) ............................. 47 3.1.1. Quy trình phân lập các chất ........................................................................... 47 3.1.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus)........................................................................................................... 49 3.1.2.1. Hợp chất SVD-1: Panabipinoside A (Hợp chất mới) ................................. 49 3.1.2.2. Hợp chất SVD-2: Panabipinoside B (Hợp chất mới) ................................. 49 3.1.2.3. Hợp chất SVD-3: Ginsenoside Ro .............................................................. 49 3.1.2.4. Hợp chất SVD-4: Kalopanax-saponins E ................................................... 49 3.1.2.5. Hợp chất SVD-5: Spinasaponin A 28-O-glucoside .................................... 50 3.1.2.6. Hợp chất SVD-6: Stipuleanoside R1 ........................................................... 50 3.1.2.7. Hợp chất SVD-7: Stipuleanoside R2 ........................................................... 50 3.1.2.8. Hợp chất SVD-8: Araloside A ..................................................................... 50 3.1.2.9. Hợp chất SVD-9: 20(S)-Ginsenoside Rg3 ................................................... 50 3.12.10. Hợp chất SVD-10: Chikusetsusaponin VI .................................................. 50 3.2. Phân lập các hợp chất từ loài Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha & et Grushv.) .................................................................................................................... 51 3.2.1. Quy trình phân lập các chất ........................................................................... 51 3.2.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ Sâm việt nam (P. vietnamensis) ............................................................................................................ 53 3.2.2.1. Hợp chất SVN-1: Notoginsenoside E.......................................................... 53 3.2.2.2. Hợp chất SVN-2: Ginsenoside Rd .............................................................. 53 3.2.2.3. Hợp chất SVN-3: Pseudoginsenoside-RS1 .................................................. 53 3.2.2.4. Hợp chất SVN-4: Ginsenoside Rg1 ............................................................. 53 3.2.2.5. Hợp chất SVN-5: Ginsenoside Rb1 ............................................................. 53 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 54 4.1. Các hợp chất phân lập từ Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) ............................ 54 4.1.1. Hợp chất SVD-1: Panabipinoside A (chất mới) ............................................ 54 4.1.2. Hợp chất SVD-2: Panabipinoside B (Chất mới) .......................................... 62 4.1.3. Hợp chất SVD-3: Ginsenoside Ro ................................................................. 68 4.1.4. Hợp chất SVD-4: Kalopanax-saponins E ...................................................... 71 4.1.5. Hợp chất SVD-5: Spinasaponin A 28-O-glucoside........................................ 74 4.1.6. Hợp chất SVD-6: Stipuleanoside R1 .............................................................. 77 4.1.7. Hợp chất SVD-7: Stipuleanoside R2 .............................................................. 80 4.1.8. Hợp chất SVD-8: Araloside A ........................................................................ 83 4.1.9. Hợp chất SVD-9: 20(S)-ginsenoside Rg3 ....................................................... 86 4.1.10. Hợp chất SVD-10: Chikusetsusaponin VI .................................................... 89 iv
4.2. Các hợp chất phân lập từ Sâm việt nam.......................................................... 95 4.2.1. Hợp chất SVN-1: Notoginsenoside E............................................................. 95 4.2.2. Hợp chất SVN-2: Ginsenoside Rd ................................................................. 98 4.2.3. Hợp chất SVN-3: Pseudoginsenoside-RS1 ................................................... 100 4.2.4. Hợp chất SVN-4: Ginsenoside Rg1 .............................................................. 103 4.2.5. Hợp chất SVN-5: Ginsenoside Rb1 .............................................................. 106 4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được .................... 110 4.3.1. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ Sâm vũ diệp . 110 4.3.1.1 Kết quả đánh giá tác dụng gây độc tế bào ................................................. 110 4.3.1.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế sản sinh NO ........................................ 111 4.3.1.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase........................... 113 4.3.2. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ Sâm việt nam .... 114 4.3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế sản sinh NO ........................................ 114 4.4. Bàn luận về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được ........................................................................................................ 115 4.4.1. Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) .................................................................... 115 4.4.1.1. Hợp chất SVD-1 panabipinoside A (chất mới), SVD-2 panabipinoside B (chất mới)................................................................................................................ 116 4.4.1.2. Hợp chất SVD-3: Ginsenoside Ro ............................................................ 117 4.4.1.3. Hợp chất SVD-4: Kalopanax-saponins E ................................................. 118 4.4.1.4. Hợp chất SVD-5: Spinasaponin A 28-O-glucoside .................................. 118 4.4.1.5. Hợp chất SVD-6: Stipuleanoside R1 ......................................................... 118 4.4.1.6. Hợp chất SVD-7: Stipuleanoside R2 ......................................................... 119 4.4.1.7. Hợp chất SVD-8: Araloside A ................................................................... 119 4.4.1.8. Hợp chất SVD-9: 20(S)-ginsenoside Rg3 .................................................. 120 4.4.1.9. Hợp chất SVD-10: Chikusetsusaponin VI ................................................. 120 4.4.2. Sâm việt nam (P. vietnamensis) .................................................................... 121 4.4.2.1. Hợp chất SVN-1: Notoginsenoside E........................................................ 121 4.4.2.2. Hợp chất SVN-2: Ginsenoside Rd ............................................................ 122 4.4.2.3. Hợp chất SVN-3: Pseudoginsenoside-RS1 ................................................ 122 4.4.1.4. Hợp chất SVN-4: Ginsenoside Rg1 ........................................................... 122 4.4.1.5. Hợp chất SVN-5: Ginsenoside Rb1 ........................................................... 123 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................. 125 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ............. 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 128 v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt  Các phương pháp sắc ký: CC Column chromatography Sắc ký cột YMC RP18 Reversed – phase C18 Sắc ký cột pha đảo C18 TLC Thin-layer chromatography Sắc ký lớp mỏng  Các phương pháp phổ: HR-ESI-MS High resolution electrospray Phổ khối lượng phân giải cao ionization - mass spectroscopy phun mù điện tử IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại 1 H-NMR Proton nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân resonance spectroscopy proton 13 C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân resonance spectroscopy carbon-13 COSY Correlation spectroscopy Phổ tương tác 2 chiều đồng hạt nhân 1H-1H HSQC Heteronuclear single quantum Phổ tương tác hai chiều trực tiếp correlation dị hạt nhân 1H-13C HMQC Heteronuclear multipe quantum Phổ tương tác hai chiều liên kết coherence đa lượng tử dị hạt nhân 1H-13C HMBC Heteronuclear multipe bond Phổ tương tác hai chiều đa liên correlation kết dị hạt nhân 1H-13C δH Proton chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của proton δC Carbon chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của carbon δ (ppm) Chemical shift (parts per Độ chuyển dịch hóa học (phần million) triệu) J (Hz) Coupling constant (Hertz) Hằng số tương tác (Hertz) s singlet br broad d doublet dd double-doublet t triplet dt double-triplet q quartet dq double-quartet m multiplet  Thử hoạt tính sinh học: MIC Minimum inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu concentration NO Nitric oxide Oxit nitric OD Optical density Mật độ quang học IC50 Half maximal inhibitory Nồng độ ức chế 50% đối tượng concentration thử HL-60 Human hepatocellular Dòng tế bào ung thư máu tủy carcinoma cell line sống cấp tính vi
FBS Fetal bovine serum Huyết thanh phôi bò RPMI 1640 Roswell park memorial institute Môi trường nuôi cấy tế bào RPMI 1640 ATCC American type culture collection Ngân hàng chủng chuẩn Hoa Kỳ DMEM Dulbecco's Modified Eagle Môi trường nuôi cấy tế bào Medium DMEM MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- Thuốc thử MTT 2,5-Diphenyltetrazolium bromide RAW264.7 Macerophage cell line Dòng đại thực bào ở chuột LPS Lipopolysaccharide  Các hóa chất, dung môi (tên của các hợp chất được viết theo nguyên bản Tiếng Anh): DMSO Dimethyl sulfoxide EtOAc Ethyl acetate DPPH 2,2-diphenyl-1-picryhydrazine SRB Sulforhodamine B MeOH Methanol TMS Tetramethylsilane EtOH Ethanol Glc β-D-glucopyranosyl n-BuOH n-Butanol Xyl β-D-xylopyranosyl Ara(p) α-L-arabinopyranosyl Ara(f) α-L-arabinofuranosyl GluA β-D-glucuronopyranosyl Me Methyl MeCN Acetonitrile  Các ký hiệu khác: VAST Vietnam Aademy of Science Viện Hàn lâm Khoa học và Công and Technology nghệ Việt Nam nd not determined Không xác định vii
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1.1: Phân bố một số loài Panax trên thế giới ......................................................... 3 Bảng 1.1.3.1: Một số saponin dẫn xuất của 20(S)-protopanaxadiol trong chi Panax ........ 5 Bảng 1.1.3.2: Một số saponin dẫn xuất của acid oleanolic trong chi Panax...................... 6 Bảng 1.1.3.3: Một số saponin khung dammarane khác trong chi Panax............................ 6 Bảng 1.1.3.4: Một số Saponin khung ocotillol trong chi Panax ......................................... 7 Bảng 1.1.3.5: Một số hợp chất polyacetylene trong chi Panax........................................... 7 Bảng 1.2.4.1: Các hợp chất saponin đã phân lập từ Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) ...... 14 Bảng 1.2.4.2: Một số amino acid của Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) ............................. 15 Bảng 1.2.4.3: Một số lipid của Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) ....................................... 16 Bảng 1.2.4.4: Một số nguyên tố đa lượng và vi lượng của Sâm vũ diệp ........................... 16 Bảng 1.3.4.1: Thành phần saponin của phần dưới mặt đất của một số loài Panax ......... 23 Bảng 1.3.4.2: Các ginsenoside khung protopanaxadiol ở phần dưới mặt đất của Sâm việt nam (P. vietnamensis) ....................................................................................................... 24 Bảng 1.3.4.3: Các ginsenoside khung protopanaxatriol ở phần dưới mặt đất của Sâm việt nam (P. vietnamensis) ....................................................................................................... 25 Bảng 1.3.4.4: Các ginsenoside khung ocotillol ở phần dưới mặt đất của ........................ 27 Bảng 1.3.4.5: Các ginsenoside khung oleanane ở phần dưới mặt đất của ....................... 27 Bảng 1.3.4. 6: Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol ở phần trên mặt đất của Sâm việt nam (P. vietnamensis) ......................................................................................... 28 Bảng 1.3.4. 7: Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol ở phần trên mặt đất của Sâm việt nam (P. vietnamensis) ......................................................................................... 29 Bảng 1.3.4. 8: Các saponin có cấu trúc ocotillol ở phần trên mặt đất của....................... 30 Bảng 1.3.4.9: Các hợp chất polyacetylene của Sâm việt nam (P. vietnamensis) .............. 30 Bảng 1.3.4.10: Các hợp chất amino acid của Sâm việt nam (P. vietnamensis) ................ 31 Bảng 1.3.4.11: Các hợp chất acid béo của Sâm việt nam (P. vietnamensis) .................... 32 Bảng 1.3.4.12: Các nguyên tố vi lượng của Sâm việt nam (P. vietnamensis) ................... 32 Bảng 1.3.5.1: Tổng hợp các tác dụng dược lý chính của Sâm việt nam ........................... 36 Bảng 4.1.1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVD-1 và hợp chất tham khảo ................... 60 Bảng 4.1.2: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVD-1, SVD-2 ............................................ 66 Bảng 4.1.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVD-3 và hợp chất tham khảo ................... 69 Bảng 4.1.4: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVD-4 và hợp chất tham khảo ................... 72 Bảng 4.1.5: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVD-5 và hợp chất tham khảo ................... 75 viii
Bảng 4.1.6: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVD-6 với hợp chất tham khảo .................. 78 Bảng 4.1.7: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVD-7 và hợp chất tham khảo ................... 81 Bảng 4.1.8: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVD-8 với hợp chất tham khảo .................. 84 Bảng 4.1.9: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVD-9 và hợp chất tham khảo ................... 87 Bảng 4.1.10: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVD-10 và hợp chất tham khảo ............... 90 Bảng 4.2. 1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVN-1 và hợp chất tham khảo .................. 96 Bảng 4.2.2: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVN-2 và hợp chất tham khảo ................... 99 Bảng 4.2.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVN-3 và hợp chất tham khảo ................. 101 Bảng 4.2.4: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVN-4 và hợp chất tham khảo ................. 104 Bảng 4.2.5: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất SVN-5 và hợp chất tham khảo ................. 107 Bảng 4.3.1.1: Tác dụng của phân đoạn cao chiết tổng và phân đoạn giàu saponin của Sâm vũ diệp trên tỷ lệ tế bào sống của dòng tế bào ung thư máu HL-60................................ 110 Bảng 4.3.1.2: Ảnh hưởng của dịch chiết tổng ethanol và stipuleanoside đối với việc ức chế quá trình sản xuất NO do LPS gây ra trên tế bào RAW 264,7 ........................................ 111 Bảng 4.3.1.3: Tác dụng ức chế sự sản sinh NO trong tế bào RAW 264.7 khi bị kích thích bởi LPS của các chất SVD 1-5, 9, 10 (20 µg/mL) ........................................................... 112 Bảng 4.3.1.4: Giá trị IC50 hoạt tính ức chế sản sinh NO trong tế bào RAW 264.7 khi bị kích thích bởi LPS của các chất SVD 2-5,10 .......................................................................... 113 Bảng 4.3.1.5: Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của các hợp chất SVD-4, SVD-6, SVD-7, SVD-8, Cao EtOH của Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) .................................... 113 Bảng 4.3.2.1: Tác dụng gây độc tế bào RAW 264.7 khi bị kích thích bởi LPS của các chất SVN 1-5 ........................................................................................................................... 114 Bảng 4.3.2 2: Tác dụng ức chế sản sinh NO trong tế bào RAW 264.7 khi bị kích thích bởi LPS của các chất SVN 1-5 .............................................................................................. 115 ix
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.2.1.1: Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) ................................................. 11 Hình 1.3.2.1: Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .................................... 18 Hình 2.1.1: Mẫu tiêu bản Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) .............................. 38 Hình 2.1.2: Mẫu tiêu bản Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................. 38 Hình 3.1. 1: Sơ đồ chiết và phân lập các hợp chất sạch từ Sâm vũ diệp .......................... 48 Hình 3.1.2: Sơ đồ chiết và phân lập các hợp chất sạch từ Sâm việt nam ......................... 52 Hình 4.1.1.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC, COSY chính của ........................... 54 Hình 4.1.1.2: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất SVD-1 ........................................................ 54 Hình 4.1.1.3: Phổ IR của hợp chất SVD-1 ........................................................................ 55 Hình 4.1.1.4: Phổ 1H-NMR của hợp chất SVD-1 ............................................................. 56 Hình 4.1.1.5: Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất SVD-1 ............................................. 57 Hình 4.1.1.6: Phổ 13C-NMR giãn rộng của hợp chất SVD-1 ............................................ 57 Hình 4.1.1.7: Phổ HMBC của hợp chất SVD-1 ................................................................ 58 Hình 4.1.1.8: Phổ COSY của hợp chất SVD-1 .................................................................. 58 Hình 4.1.1.9: Phổ HSQC của hợp chất SVD-1 ................................................................. 59 Hình 4.1.1.10: Cấu trúc hóa học của hợp chất erythrodiol .............................................. 60 Hình 4.1.2.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC, COSY chính của ........................... 62 Hình 4.1.2.2: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất SVD-2 ........................................................ 63 Hình 4.1.2.3: Phổ IR của hợp chất SVD-2 ........................................................................ 63 Hình 4.1.2.4: Phổ 1H-NMR của hợp chất SVD-2 ............................................................. 64 Hình 4.1.2.5: Phổ 13C-NMR của hợp chất SVD-2 ............................................................ 65 Hình 4.1.2.6: Phổ HMBC giãn rộng của hợp chất SVD-2 ............................................... 65 Hình 4.1.3.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC, COSY chính .................................. 68 Hình 4.1.4.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất SVD-4 ............ 71 Hình 4.1.5.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất SVD-5 ............ 74 Hình 4.1.6.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất SVD-6 ............ 77 Hình 4.1.7.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất SVD-7 ............ 80 Hình 4.1.8.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất SVD-8 ............ 83 Hình 4.1.9.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất SVD-9 ............ 86 Hình 4.1.10.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất SVD-10 ........ 89 Hình 4.2.1.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất SVN-1 ............ 95 x
Hình 4.2.2.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất SVN-2 ............ 98 Hình 4.2.3.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất SVN-3 .......... 100 Hình 4.2.4.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất SVN-4 .......... 103 Hình 4.2.5.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất SVN-5 .......... 106 xi
LỜI MỞ ĐẦU Từ xa xưa, ông cha ta đã sử dụng các loại thảo mộc để làm thuốc chữa bệnh cứu người. Công dụng của các loài thảo dược đó được lưu truyền qua nhiều thế hệ và đến tận ngày nay, người dân vẫn có thói quen sử dụng cây cỏ phổ biến để điều trị một số bệnh thông thường như dùng nhọ nồi để hạ sốt, cam thảo để thanh nhiệt, giải độc cơ thể. Do có nguồn gốc từ thực vật tự nhiên, nên các sản phẩm dược liệu có độc tính thấp, phù hợp với quy luật sinh lý của cơ thể và thân thiện với môi trường. Vì thế, việc nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học để làm thuốc và thực phẩm chức năng đang là xu hướng phát triển của ngành hóa học, dược phẩm và thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Bên cạnh đó, Việt Nam được thiên nhiên ưu đãi với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm cùng một hệ sinh thái phong phú, đa dạng, trong đó có rất nhiều loại thực vật có thể dùng làm dược liệu. Đây là điều kiện thuận lợi để phát triển nguồn dược liệu phục vụ nhu cầu sản xuất trong nước cũng như xuất khẩu sang thị trường thế giới. Tuy nhiên, nhiều loài dược liệu quý chưa được nghiên cứu một cách hệ thống, bài bản mà chỉ dừng lại ở việc đúc kết kinh nghiệm mà cha ông để lại. Việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các loài thực vật không chỉ giúp việc sử dụng dược liệu một cách hiệu quả hơn mà còn là cơ sở khoa học để tiến hành tổng hợp hoặc bán tổng hợp các hoạt chất mới có hoạt tính sinh học tốt nhưng ít tác dụng phụ khi sử dụng. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với việc phát triền nền công nghiệp hóa học và dược phẩm hiện nay. Ở trên thế giới cũng như ở Việt Nam, các loài thuộc chi Panax được sử dụng phổ biến làm thuốc bổ và là thành phần trong một số bài thuốc y học cổ truyền của dân tộc. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng saponin và polyacetylen là thành phần hóa học chính của chi Panax. Các saponin được phân lập từ chi này được chứng minh là có tác dụng lên thần kinh trung ương, chống ung thư, kháng viêm, cầm máu, chống oxi hóa, bảo vệ tim mạch, huyết áp [1,2,3]. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một trong ba loài thuộc chi Panax mọc tự nhiên tại Việt Nam. Đây là cây thuốc quý được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian có tác dụng giảm stress, tăng cường tính đề kháng, chống ung thư, chống thổ huyết [3,4,5]. Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) được phát hiện lần đầu tiên trong tự nhiên ở vùng núi Ngọc Linh, Kon 1
Tum và được định danh thực vật vào năm 1985. Sâm việt nam được biết tới là loài thảo mộc quý có giá trị kinh tế cao, có tác dụng bổ dưỡng, tăng cường sức khỏe, kích thích miễn dịch, chống ung thư, bảo vệ gan [1,6,7]. Hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) được sử dụng trong dân gian từ rất lâu, tuy nhiên qua tìm hiểu cho thấy rằng nghiên cứu về mặt hóa học cũng như hoạt tính sinh học của hai loài này còn hạn chế, chưa tương xứng với tiềm năng. Chính vì vậy, việc nghiên cứu một cách toàn diện về Sâm vũ diệp và Sâm việt nam là rất cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, góp phần hoàn thiện cơ sở dữ liệu hóa thực vật. Và để góp phần nghiên cứu và khẳng định lại tác dụng của Sâm vũ diệp và Sâm việt nam, luận án đã được chọn với đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam”. Mục tiêu của luận án: 1. Nghiên cứu thành phần hóa học của củ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và lá Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) thu hái tại Việt Nam. 2. Đánh giá một số hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra sản phẩm chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng và góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh từ các loài này. Nội dung luận án bao gồm: 1. Nghiên cứu phân lập các hợp chất từ củ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và lá Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam bằng các phương pháp sắc ký kết hợp. 2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được. 3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính ức chế sản sinh NO và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các chất phân lập được nhằm tìm kiếm các hoạt tính mới từ 2 loài thực vật này. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về Chi Panax 1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố Trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), vị trí của chi Panax L., họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [8]. Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Hoa tán (Apiales) Họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Chi Sâm (Panax L.) Còn có nhiều quan điểm khác nhau về số lượng loài Panax L. trên thế giới, những nghiên cứu được cập nhật gần đây thì số lượng loài của chi Panax L. cũng có sự thay đổi. Theo Phan Kế Long (2014) [9] và Nguyễn Văn Đạt (2017) [10], trên thế giới chi Panax L. có 8 loài. Còn theo Lu Liu (2020) [11] thì chi Panax L. có 13 loài và 5 thứ. Ở Việt Nam, số lượng loài của chi Panax L. cũng có những quan điểm khác nhau từ 4-6 loài, theo Phạm Hoàng Hộ (1999) [12], chi Sâm có 4 loài gồm Sâm hai lần kép (Panax bipinnatifidus Seem.), Sâm Nhật (P. japonica (Nees) Mayer), Sâm (Panax pseudoginseng Wall.), Sâm việt nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Còn theo Nguyễn Tiến Bân (2003) [13] chi Panax L. có các loài như Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng), tam thất (Panax pseudoginseng Wall.). Theo Nguyễn Phương Đạt thì chi Panax L. ở Việt Nam có 6 loài gồm các loài đã nêu cùng 1 số loài nhập nội như Panax notoginseng và Panax japonica [10]. Hiện nay có 3 loài Sâm được ghi trong sách đỏ Việt Nam là Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng) và Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) [14]. Bảng 1.1.1: Phân bố một số loài Panax trên thế giới [11] STT Tên khoa học Tên thông thường Phân bố 1 Panax bipinnatifidus Nhân sâm Hymalaya Phía Nam Trung Quốc, Seem. (Himalayan gingseng) Phía Bắc Việt Nam 3
2 Panax ginseng Nhân sâm Đông Bắc Á: Hàn Quốc, C.A.Meyer (Korean ginseng) Triều Tiên, Trung Quốc 3 Panax japonicus Nhân sâm Nhật bản Nhật Bản C.A.Meyer (Japanese ginseng) Phía Nam Trung Quốc 4 Panax notoginseng Tam thất (Chinese Trung Quốc (Vân Nam) F.H.Chen ginseng, Sanchi ginseng) 5 Panax pseudoginseng Giả nhân sâm Nepal, phía Đông dãy núi Wall. (Nepal ginseng) Himalaya 6 Panax quinquefolius L. Sâm Mỹ Phía Bắc Hoa Kỳ, (American ginseng) Phía Nam Canada 7 Panax sokpayensis Shiva Phía Đông dãy Himalaya K.Sharma & Pandit 8 Panax stipuleanatus Bái tử Phía Bắc Việt Nam H.T.Tsai et K.M.Feng (Ye-sanchi ginseng) 9 Panax trifolius L. Sâm lùn Nova Scotia đến Wincosin, (Dwarf, Peanut ginseng) phía Nam Hoa Kỳ 10 Panax vietnamensis Ha Sâm ngọc linh Việt Nam et Grushv. (Vietnamese ginseng) 11 Panax wangianus (Wang’s Sanqi) Trung Quốc S.C.Sun 12 Panax zingiberensis Sâm gừng Phía Nam Trung Quốc C.Y.Wu et Feng (Ginger ginseng) 13 Panax assamicus R.N. Phía Đông dãy Himalaya Banerjee 1.1.2. Đặc điểm thực vật Cây thảo sống lâu năm, có thân rễ mập, thân không gai, có vẩy ở gốc. Cây chỉ có hoa lưỡng tính hoặc cây có cả hoa lưỡng tính hoặc hoa đực. Lá kép chân vịt, mọc vòng 3-5 lá, lá chét nguyên đến có răng nhỏ, có răng hay có thùy lông chim, lá kèm nhỏ. Cụm hoa đơn độc, ở đỉnh cành, dạng tán. Cuống hoa có khớp dưới hoa lưỡng tính, không có khớp dưới hoa đực. Đài có 5 răng ngắn. Tràng 5, rời, xếp lớp. Nhị 5, chỉ nhị dài bằng hoặc dài hơn cánh tràng, chỉ nhị xếp xen kẽ với cánh tràng. Bầu 2 lá noãn, vòi nhụy 2, rời hay hợp ở gốc. Quả hạch, hình cầu đôi khi hơi dẹt hoặc có 3 gốc. Hạt thường dẹt một bên, số lượng hạt bằng số lá noãn, phôi nhũ đồng nhất [13]. 4
1.1.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng saponin và polyacetylene là hai nhóm hoạt chất chính trong chi Panax [15]. a. Saponin Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chính quyết định hoạt tính của các loài này. Đến nay các nhà khoa học đã chiết tách và xác định cấu trúc hơn 500 saponin từ các loài Panax khác nhau, gồm các saponin dẫn xuất của 20(S)- protopanaxadiol, 20(S)-protopanaxatriol, saponin khung dammarane khác, saponin dẫn xuất ocotillol, saponin dẫn xuất của acid oleanolic. + Saponin dẫn xuất của 20(S)-protopanaxadiol Bảng 1.1.3.1: Một số saponin dẫn xuất của 20(S)-protopanaxadiol trong chi Panax [15] STT Tên R1 R2 Loài 1 Ginsenoside Rb1 Glc(2,1)Glc Glc(6,1)Glc P. ginseng 2 Ginsenoside Rb2 Glc(2,1)Glc Glc(6,1)Ara(p) P. ginseng 3 Ginsenoside Rd Glc(2,1)Glc Glc P. ginseng + Saponin dẫn xuất của 20(S)-protopanaxatriol Bảng 1.1.3.2: Một số saponin dẫn xuất của 20(S)-protopanaxatriol trong chi Panax [15] STT Tên R1 R2 R3 Loài 1 Ginsenoside Re H Glc(2,1)Rha Glc P. ginseng 2 Ginsenoside Rf H Glc(2,1)Glc H P. ginseng 3 Ginsenoside Rg1 H Glc Glc P. ginseng 5
+ Saponin dẫn xuất của acid oleanolic: Bảng 1.1.3.2: Một số saponin dẫn xuất của acid oleanolic trong chi Panax [15] STT Tên R1 R2 Loài 1 Ginsenoside Ro GluA(2,1)Glc Glc P. ginseng 2 Zingibroside R1 GluA(2,1)Glc H P. zingiberensis ‘+ Saponin khung dammarane: Bảng 1.1.3.3: Một số saponin khung dammarane khác trong chi Panax [15] STT Tên Loại R1 R2 R3 R4 Loài 1 Majonoside F4 A Glc H H Glc P. vietnamensis 2 Chikusetsusaponin L9a A H OH H H P. japonicus 3 Majonoside F3 B Glc H H Glc P. vietnamensis 4 Majonoside F2 C Glc H H Glc P. vietnamensis 5 Chikusetsusaponin L9bc C H OH Glc H P. vietnamensis 6 Chikusetsusaponin LT8 D Glc - - Glc P. japonicus 6
+ Saponin khung ocotillol Bảng 1.1.3.4: Một số Saponin khung ocotillol trong chi Panax [15] STT Tên Kiểu R Loài 1 Pseudoginsenoside F11 (A) Glc(2,1)Rha P. quinquefolius 2 Majonoside R1 (B) Glc(2,1)Glc P. japonicus 3 Majonoside R2 (B) Glc(2,1)Xyl P. japonicus b. Hợp chất polyacetylene Một số hợp chất polyacetylene tìm thấy trong một số loài thuộc chi Panax. Bảng 1.1.3.5: Một số hợp chất polyacetylene trong chi Panax [15] STT Loài Hợp chất 1 P.ginseng Panaxynol C.A. Meyer Panaxytriol Panaxydol Hepadeca-1-en-4,6-diyn-3,9-diol Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol Heptadeca-1,4-dien-6,8-diyn-3,10-diol Panaxacol 9,10 –Epoxy-1,16-heptadecadien-4,6-diyn-3 ol 10-Cloro-,16-heptaFdecadien-4,6-diyn-3,9,10-triol 9,10–Epoxy-4,6-heptadecadien-3-on 9,10 –Epoxy-1-heptadecen-4,6-diyn-3-on 3-Acetoxy-9,10–epoxy-1,16-heptadecadien-4,6-diyn 3-Acetoxy-9,10–epoxy-4,6-heptadecadiyn 3-Acetoxy-9,10–epoxy-16-heptadecen-4,6-diyn Falcarinol 2 P. notoginseng 8-Acetoxy-9,10-1-heptadecen-4,6-diyn-3,9-diol 7