Luận án Tiến sĩ Hoá học: Phân lập toxin có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus và Toxin có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn Bungarus fasciatus

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:161

Thêm vào BST

Báo xấu

27
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của Luận án này nhằm khảo sát hoạt tính và xác định cấu trúc của một số hợp chất có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp H. laoticus và một số hợp chất có hoạt tính giảm đau và kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus, nhằm ứng dụng trong y dược. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hoá học: Phân lập toxin có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus và Toxin có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn Bungarus fasciatus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN VŨ THIÊN PHÂN LẬP TOXIN CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU TỪ NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS VÀ TOXIN CÓ HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU, KHÁNG TĂNG SINH TẾ BÀO UNG THƢ TỪ NỌC RẮN BUNGARUS FASCIATUS LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC TP.Hồ Chí Minh – 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN VŨ THIÊN PHÂN LẬP TOXIN CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU TỪ NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS VÀ TOXIN CÓ HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU, KHÁNG TĂNG SINH TẾ BÀO UNG THƢ TỪ NỌC RẮN BUNGARUS FASCIATUS Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã sỗ: 9 44 01 14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TSKH. Hoàng Ngọc Anh 2. TS. Phùng Văn Trung TP.Hồ Chí Minh – 2021
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của TSKH. Hoàng Ngọc Anh và TS. Phùng Văn Trung. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Trần Vũ Thiên
ii LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới TSKH. Hoàng Ngọc Anh và TS. Phùng Văn Trung - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi vô cùng biết ơn GS.TSKH. Utkin Yuri Nikolaevich, Viện Sinh hóa hữu cơ mang tên Shemyakin-Ovchinnikov, Moskva, Viện Hàn lâm Khoa học Nga đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc xác định cấu trúc phân tử của các chất. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng cùng tập thể cán bộ của Viện đã quan tâm giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Ths.Dược sĩ Nguyễn Thị Thùy Trang – giảng viên bộ môn Dược Lý, trường Đại học Nguyễn Tất Thành, TS. Phạm Đình Chương – giảng viên bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Tôn Đức Thắng cùng các em Trần Thụy Trúc Vy, Trần Thái Đạt – sinh viên trường Đại học Tôn Đức Thắng, đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong việc thực hiện khảo sát các tác dụng dược lý của nọc bò cạp và nọc rắn cùng những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và Công nghệ, bộ phận đào tạo, phòng Quản lý tổng hợp đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tới Lãnh đạo Trường Đại học Trà Vinh và các đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Trần Vũ Thiên
iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan……………………………………………………………………... ……i Lời cảm ơn…………………………………………………………….………… …...ii Mục lục………………………………………………………………………....... …..iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt………………………………………….. ....viii Danh mục các bảng………………………………………………………..……... …..xi Danh mục các hình vẽ, đồ thị…………………………………………..………… …xiii MỞ ĐẦU……………………………………………………………………........ …...1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN…………………………………………….………. …...3 1.1. Giới thiệu về bò cạp……………………………………………….……….. …...3 1.2. Giới thiệu chung về rắn…………………………………………………….. …...5 1.2.1. Giới thiệu về rắn cạp nong………………………………………..……. …...5 1.2.2. Phân bố sinh thái……………………………………………………….. …...6 1.3. Tình hình nghiên cứu về nọc bò cạp…………………………….....………. …...6 1.3.1. Tình hình nghiên cứu nọc bò cạp trên thế giới……………………........ …...6 1.3.2. Tình hình nghiên cứu bò cạp ở Việt Nam……………………………… ….11 1.4. Tình hình nghiên cứu về nọc rắn………………………………….………... ….12 1.4.1. Tình hình nghiên cứu về nọc rắn trên thế giới ………………………… ….12 1.4.2. Những nghiên cứu về rắn cạp nong ở Việt Nam……...……...………… ….24 CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM………… ….27 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu……………………………………………………… ….27 2.1.1. Khảo sát và phân lập các chất có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp H. laoticus…………………...…………………………………...... ….27 2.1.2. Khảo sát và phân lập các chất có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thƣ từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus………………...…....... ….27 2.2. Thiết bị nghiên cứu………………………………………………………… ….27 2.3. Phƣơng pháp phân lập và xác định các toxin từ nọc bò cạp H. laoticus…… 28
iv 2.3.1. Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc bò cạp H. laoticus……... ….28 2.3.2. Tách protein trong nọc bò cạp H. laoticus bằng sắc ký lọc gel trên cột với Sephadex G-50…………………………………………………….. ….29 2.3.3. Phân tách phân đoạn 5 nọc bò cạp H. laoticus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC)…………………………………………. ….31 2.3.4. Khảo sát tác động của các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn 5 nọc bò cạp H. laoticus lên quá trình đông – chảy máu………………………… ….32 2.3.5. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính chống đông máu.. ….38 2.4. Phƣơng pháp phân lập và xác định các toxin từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus........................................................................................................ ….38 2.4.1. Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus..................................................................................................... ….38 2.4.2. Tách protein trong nọc rắn cạp nong B. fasciatus bằng sắc ký lọc gel trên gel Superdex HR75............................................................................. .....39 2.4.3. Khảo sát KLPT các phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus bằng phƣơng pháp điện di…………………………………… ….41 2.4.4. Khảo sát tác dụng giảm đau……………………………………………. ….44 2.4.4.1. Khảo sát tác dụng giảm đau ngoại biên của nọc rắn cạp nong B. fasciatus toàn phần và các phân đoạn. ……….………….…………….. ….45 2.4.4.2. Khảo sát tác dụng giảm đau trung ƣơng của nọc rắn cạp nong B. fasciatus toàn phần và các phân đoạn ………………………………… .…46 2.4.5. Tách các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn BF4 nọc rắn cạp nong B. fasciatus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC)………… .…48 2.4.6. Khảo sát hoạt tính giảm đau của một số phân đoạn thứ cấp tách ra từ phân đoạn BF4………………...………………………………………… .…49 2.4.7. Phân tích thống kê kết quả thử hoạt tính giảm đau…………………… .…50 2.4.8. Phƣơng pháp xác định KLPT của protein có hoạt tính giảm đau……… .…50 2.4.9. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của nọc thô và các phân đoạn rắn cạp nong B. fasciatus theo phƣơng pháp MTT……………………. .…51
v 2.4.10. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào... .…55 2.4.10.1. Xác định KLPT dựa trên MALDI TOF/TOF MS ………………... .…55 2.4.10.2. Xác định trình tự amino acid dựa trên LC-MS/MS.…………..….. .....55 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN…………….............. ….57 3.1. Kết quả về bò cạp H. laoticus………………………………………............ ….57 3.1.1. Sắc ký lọc gel nọc bò cạp H. laoticus………………….……….……… ….57 3.1.2. Tách phân đoạn 5 nọc bò cạp H. laoticus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) ……………………….…………………………… ….59 3.1.3. Tác động của các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn 5 nọc bò cạp H. laoticus lên quá trình đông - chảy máu………………………………....…… ….60 3.1.4. Làm sạch hợp chất có hoạt tính chống đông máu từ phân đoạn 5.5 và 5.22……….………………………………………………………………….. ….63 3.1.4.1. Làm sạch phân đoạn 5.5 …………………………………………… .....63 3.1.4.2. Làm sạch phân đoạn 5.22 ………………………………..………… ….64 3.1.5. Hoạt tính chống đông máu của phân đoạn 5 và các hợp chất sạch: 5.5.1, 5.22.3, 5.21.1 (dipeptide Leu – Trp)………………………………..…. ….65 3.1.6. Xác định cấu trúc các chất có hoạt tính chống đông máu (5.5.1 và 5.22.3) từ phân đoạn 5.5 và 5.22 bằng MS và NMR…………..…………….. .....69 3.1.6.1. Cấu trúc của toxin 5.5.1……………………………………………. .....69 3.1.6.2. Cấu trúc của toxin 5.22.3 ………………………………………… .…72 3.2. Kết quả về rắn cạp nong B. fasciatus……………………………..…........... ….75 3.2.1. Sắc ký lọc gel của nọc rắn cạp nong B. fasciatus……………..….......... ….75 3.2.2. Xác định KLPT của các phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus bằng phƣơng pháp điện di................................................................. ….76 3.2.3. Tác dụng giảm đau ngoại biên của nọc rắn cạp nong B. fasciatus toàn phần và các phân đoạn…………………...…………………………………... ….78 3.2.4. Tác dụng giảm đau trung ƣơng của nọc rắn cạp nong B. fasciatus toàn phần và các phân đoạn………………….……………...……………….……. ….79 3.2.5. Phân tách phân đoạn BF4 từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus có hoạt
vi tính giảm đau bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC)….……………… ….81 3.2.6. Hoạt tính giảm đau của một số phân đoạn thứ cấp của phân đoạn BF4.. ….81 3.2.6.1. Giảm đau ngoại biên…………………………………..…………… ….81 3.2.6.2. Giảm đau trung ƣơng………………………………….....………… ….84 3.2.7. Xác định KLPT của protein BF4.11 và protein BF4.12 có hoạt tính giảm đau………...……………………………....................…………….…... ….86 3.2.8. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của nọc rắn cạp nong B. fasciatus………………………………………………………….……………. ….87 3.2.8.1. Khả năng gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 của nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5). ……………………………………….………. ….87 3.2.8.2. Khả năng gây độc tế bào ung thƣ phổi A549 của nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5). ……………………….……………………... ….89 3.2.9. Phân lập phân đoạn BF3 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC)... ….91 3.2.10. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 và ung thƣ phổi A549 của các phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4) từ phân đoạn BF3…............................................................................................................... ….92 3.2.10.1. Khả năng gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 của các phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4) …………………………………….. ….92 3.2.10.2. Khả năng gây độc tế bào ung thƣ phổi A549 của các phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4)……………………………………... ….94 3.2.11. Khả năng gây độc tế bào thƣờng HK2 ở ngƣời của nọc thô (BF), các phân đoạn (BF1 – BF5) và các phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4)……………………………………………………………………….. .....96 3.2.12. Xác định cấu trúc bậc một (trình tự amino acid) của protein 3.3 có hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 và ung thƣ phổi A549…………. ….97 3.2.12.1. Xác định KLPT của BF3.3 dựa trên MALDI TOF/TOF MS...…... ….97 3.2.12.2. Xác định trình tự amino acid của protein 3.3 dựa trên LC- MS/MS……………………………………………………………………... ….98 KẾT LUẬN ………………………………………………………….................... 101
vii KIẾN NGHỊ……………………………………………………………..……….. 103 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN………………………………… .104 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………….…………….. ...106 PHỤ LỤC………………………………………………………………………… ...118
viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Diễn giải 3FTx Three – Finger Toxin ADP Adenosine di phosphate aPTT Activated partial thromboplastin time Adenocarcinoma human alveolar basal A549 epithelial cells B. fasciatus Bungarus fasciatus Rắn cạp nong BF Bungarus fasciatus BF – CT Bungarus fasciatus Cytotoxin Bungarus fasciatus – L - amino acid BF – LAAO oxidase BFPA Bungarus fasciatus Phospholipase A2 Nọc rắn cạp nong toàn BFV Bungarus fasciatus venom phần (thô) Phân đoạn 1 đến 5 (sau BF1 - BF5 Fraction 1 – Fraction 5 khi chạy sắc ký lọc gel nọc rắn cạp nong) Phân đoạn thứ cấp 3.1 đến 3.4 của phân đoạn BF3.1 - BF3.4 Fraction 3.1 – Fraction 3.4 3 (sau khi chạy sắc ký pha đảo nọc rắn cạp nong) Cell viability (% of control) Lƣợng tế bào sống (%) Concentration (µg/mL) Nồng độ (µg/mL) C Control Chứng Complete Dulbecco's Modified cDMEM Eagle Medium Da Daltons DMSO Dimethyl sulfoxide ĐC Standard drug Đối chứng
ix EAC Ehrlich ascites carcinoma Nồng độ hiệu quả trung EC50 Half maximal effective concentration bình EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Electrospray ionization mass ESI-MS spectrometry FBS Fetal Bovine Serum FDA Food and Drug Administration H. laoticus Heterometrus laoticus Bò cạp đen High Performance Liquid HPLC Chromatography The half maximal inhibitory IC50 Nồng độ ức chế 50% concentration IL Interleukin kDa KiloDalton KLPT Molecular mass Khối lƣợng phân tử, Da LD Lethal dose Liều tử vong LD50 Mean lethal dose Liều tử vong trung bình Matrix-assisted laser MALDI desorption/ionization MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 MS Mass spectroscopy 3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, MTT Thuốc thử MTT 5-diphenyl-2H-teyrazolium bromide Phân tử lƣợng trung MW Molecular weight bình, g/mol nAChRs Nicotinic Acetylcholine receptors NB Peripheral Ngoại biên NMR Nuclear Magnetic Resonance P Probability Độ tin cậy PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PBS Photphat buffer saline Phân đoạn (sau khi PĐ Fraction chạy sắc ký)
x PL Phụ lục PLA2 Phospholipase A2 PT Prothrombin time Q-TOF Quardrupole - Time of flight RPC Reversed phase chromatography Reversed phase - High Performance RP-HPLC Liquid Chromatography SDS Sodium dodecyl sulfate Sephadex G-50 Sephadex G series number 50 Superdex HR75 Superdex High Resolution 75 TB Cell Tế bào TE Trypsin/EDTA TFA Trifluoroacetic acid TNF Tumor necrosis factor TOF Time of flight TT Thrombin time TW Central Trung ƣơng UV Ultra Violet Tia cực tím Vinj Volume Injections Thể tích tiêm X-Ray X-radiation
xi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Cấu trúc bậc một của một số chất ức chế ion quan trọng từ bò cạp……….…...7 Bảng 1.2. Một số hợp chất/peptide có hoạt tính từ nọc bò cạp……………………………..10 Bảng 1.3. Cấu trúc hoặc chuỗi amino acid của thuốc được chế tạo từ các thành phần nọc độc rắn trên thị trường và thử nghiệm lâm sàng………………………………………...……13 Bảng 1.4. Thuốc từ nọc rắn trên thị trường và thử nghiệm lâm sàng………………...……15 Bảng 1.5. Một số toxin được phân lập từ loài cạp nong – cạp nia………………………....16 Bảng 1.6. Ứng dụng của nọc thô/toxin phân lập từ loài cạp nong – cạp nia………….…17 Bảng 2.1. Thành phần bản gel……………………………………………………………….….42 Bảng 2.2. Thành phần dung dịch xử lý protein…………………………………………….….43 Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm chạy điện di……………………………………….….43 Bảng 2.4. Thành phần dung dịch nhuộm Comassie Blue R-250……………………………43 Bảng 2.5. Thành phần dung dịch giải nhuộm…………………………………………..……..44 Bảng 3.1. Khối lượng 5 phân đoạn nọc bò cạp H. laoticus sau khi chạy lọc gel …….….57 Bảng 3.2. Thời gian chảy máu của các phân đoạn có tác động chống đông máu từ nọc thô bò cạp H. laoticus …..………………………………………….…………………………....58 Bảng 3.3. Thời gian đông máu của các phân đoạn có tác động chống đông máu từ nọc thô bò cạp H. laoticus ……………………………………………..………………………...….59 Bảng 3.4. Thời gian chảy máu của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 nọc bò cạp H. laoticus ………………………………………………………….……………..………....61 Bảng 3.5. Thời gian đông máu của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 nọc bò cạp H. laoticus …………………………………………………………………………………....62 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các hợp chất khảo sát lên quá trình đông máu…………...……65 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các hợp chất khảo sát lên quá trình chảy máu………………...66 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian chảy máu…………………………………...67 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian đông máu …………………………..………68 Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất 5.5.1 và hợp chất tham khảo………………....70 Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất 5.22.3 và hợp chất tham khảo……………..…74 Bảng 3.12. Khối lượng 5 phân đoạn nọc rắn B. fasciatus sau khi chạy sắc kí lọc gel .....76
xii Bảng 3.13. Số lần đau quặn của chuột do ảnh hưởng của BF1 – BF5………………...…..78 Bảng 3.14. Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột do ảnh hưởng của BF1 – BF5…..80 Bảng 3.15. Số lần đau quặn của chuột do ảnh hưởng của BF4.7 – BF4.15…..……….….82 Bảng 3.16. Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột do ảnh hưởng của BF4.7 – BF4.15………………………………………………………………………………………………84 Bảng 3.17. Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5)…………………………….………………………………………………………….88 Bảng 3.18. Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của nọc thô (BF) và phân đoạn BF3 …………………...…………………………………………………..…………………………..….89 Bảng 3.19. Khả năng gây độc tế bào ung thư A549 của nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5)……………………...………………………………………………………...….…..90 Bảng 3.20. Khả năng gây độc tế bào ung thư A549 của nọc thô (BF) và phân đoạn BF3 ……………………………………………………………………………………………………….91 Bảng 3.21. Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của phân đoạn BF3 và (BF3.1 - BF3.3)……………………………………………………………………………………………....93 Bảng 3.22. Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của phân đoạn BF3 và BF3.3.……………………………………………………………………………………………….94 Bảng 3.23. Khả năng gây độc tế bào ung thư A549 của phân đoạn BF3 và (BF3.1 - BF3.3)……………………………………………………………………………………………....94 Bảng 3.24. Khả năng gây độc tế bào ung thư A549 của phân đoạn BF3 và BF3.3….…..96
xiii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Bò cạp đen Heterometrus laoticus ………………………………………...……….5 Hình 1.2. Rắn cạp nong Bungarus fasciatus……………………………………...………..….5 Hình 1.3. Cấu trúc không gian của các chất độc 3 ngón tay – 3FTx………...……...……20 Hình 2.1. Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc bò cạp H. laoticus………….…28 Hình 2.2. Sơ đồ đông máu………………………………………………………………………34 Hình 2.3. Cơ chế tác động của các thuốc trên dòng thác đông máu……………………...34 Hình 2.4. Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc rắn B. fasciatus……………….39 Hình 3.1. Sắc ký đồ sắc kí lọc gel của nọc bò cạp H. laoticus……………………....…….57 Hình 3.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) của phân đoạn 5 (PĐ5) nọc bò cạp H. laoticus ……………………………………………….……………………………...60 Hình 3.3. Tác động của phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 lên thời gian chảy máu…………………………………………..………………………………………………..…..61 Hình 3.4. Tác động của phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 lên thời gian đông máu……………………………………………………………………………..……………..…..62 Hình 3.5. Sắc ký đồ RP-HPLC của phân đoạn thứ cấp 5.5…………………………..……63 Hình 3.6. Sắc ký đồ của chất có hoạt tính chống đông máu 5.5.1…………………….…..64 Hình 3.7. Sắc ký đồ RP-HPLC của phân đoạn thứ cấp 5.22………………………………64 Hình 3.8. Sắc ký đồ của chất có hoạt tính chống đông máu 5.22.3………………….……65 Hình 3.9. Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian chảy máu…………………………………..67 Hình 3.10. Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian đông máu…………………………….…..68 Hình 3.11. Phổ MS của 5.5.1……………………...………………………………………..….69 Hình 3.12. Cấu trúc của toxin 5.5.1 (Adenosine)………………………………………...….72 Hình 3.13. Phổ MS của 5.22.3………………………...……………………………………….72 Hình 3.14. Cấu trúc của toxin 5.22.3 (Ile-Trp)………………………………….…………..75 Hình 3.15. Hình sắc ký lọc gel của nọc rắn cạp nong B. fasciatus…………………….….76 Hình 3.16. Hình điện di nọc rắn cạp nong B. fasciatus……………………………..….…..77 Hình 3.17. Số lần đau quặn của chuột do ảnh hưởng của BF1 – BF5…………..…...…..79 Hình 3.18. Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột do ảnh hưởng của BF1 –
xiv BF5…………………………………………………………………………………………….…..80 Hình 3.19. Sắc ký đồ RP-HPLC phân đoạn BF4 ....…………………………………....…..81 Hình 3.20. Số lần đau quặn của chuột do ảnh hưởng của BF4.7 – BF4.15…………......83 Hình 3.21. Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột do ảnh hưởng của BF4.7 – BF4.15……………………………………………………………...…………………………..…85 Hình 3.22. Sắc ký đồ RP-HPLC phân đoạn BF3.……………………………………………92 Hình 3.23. Phổ MALDI-TOF/TOF-MS của các phân đoạn (BF3.1 – BF3.4) nọc rắn B. fasciatus…………………………………………………………………………………………...98 Hình 3.24. Khối phổ phân giải cao (HR-MS) của BF3.3. ……..………..…………………99 Hình 3.25. Trình tự amino acid của protein 3.3 ……………..………………………......100
1 MỞ ĐẦU Với xu hƣớng phát triển của ngành dƣợc, các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ cây cỏ, động vật, đặc biệt là từ nọc các động vật nhƣ rắn, bò cạp, ong… đã và đang đƣợc nghiên cứu dùng làm thuốc để chữa bệnh. Trên thế giới đã có các nghiên cứu các toxin từ nọc độc động vật nhƣ Crotamine - một polypeptide đƣợc phân lập từ loài rắn đuôi chuông Nam Mỹ Crotalus durissus terriﬁcusas có tác dụng gây giảm đau cao hơn khoảng 500 lần so với morphine hoặc Hannalgesin - một neurotoxin chuỗi dài phân lập đƣợc từ loài rắn Ophiophagus hannah, độc tố thần kinh này có tác dụng tạo ra giảm đau trong phạm vi liều 16–32 ng/g mà không gây ra bất kỳ rối loạn thần kinh hoặc cơ [1]. Ngoài tác dụng gây giảm đau thì các toxin còn có khả năng gây độc tế bào khối u nhƣ hoạt tính gây độc tế bào của cytotoxin 1 (CTX1) - 6,7 kDa từ nọc rắn hổ mang Naja atra Cantor lên bốn dòng tế bào khối u theo thứ tự MCF-7> P388 ≈ K562> H22 ≈ 16HBE (dòng tế bào ngƣời bình thƣờng) đã phản ánh tính chọn lọc của hoạt tính từ toxin này [1]. Bên cạnh nọc rắn thì nọc bò cạp chứa nhiều các polypeptide toxin, có tác động lên các receptor và các kênh ion của màng tế bào, đã và đang đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu để điều chế ra các loại thuốc chữa bệnh nhƣ Parkinson, bệnh cao huyết áp, ung thƣ, Alzheimer [2 - 7]. Ngày nay, những vấn đề về đột quỵ, mất máu, chậm đông máu, thiếu máu não, hoặc bệnh ung thƣ đang là vấn đề đƣợc rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, trong đó có cả Việt Nam. Việt Nam với nguồn nguyên liệu dồi dào về nọc bò cạp và nọc rắn, và cũng đã có những công trình nghiên cứu về nọc độc của hai loài này. Kết quả nghiên cứu từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus cho thấy nọc thô và các phân đoạn có hoạt tính giảm đau, kháng viêm, độc tính với côn trùng. Từ phân đoạn 4 của nọc bò cạp Heterometrus laoticus ngƣời ta đã phân lập đƣợc toxin Hetlaxin có ái lực mạnh với kênh Kv1.3, còn từ phân đoạn 5 có độc tính với côn trùng của nọc bò cạp này ngƣời ta đã phân lập đƣợc một dipeptide đó là Leu-Trp [8]. Bên cạnh đó, ngƣời ta đã xác định các phân đoạn 2, 4 và 5 của nọc bò cạp H. laoticus còn có hoạt tính chống đông máu [9]. Bên cạnh các nghiên cứu nọc bò cạp, thì nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus cũng đã có những công trình nghiên cứu. Những kết quả đã công bố cho thấy nọc thô và các phân đoạn từ loài rắn này có hoạt tính giảm đau, kháng viêm, chống đông máu [10-11]. Để thừa kế
2 và phát triển những nghiên cứu về nọc bò cạp H.laoticus và nọc rắn cạp nong B.fasciatus, tác giả của luận án này đã tiến hành đề tài: “ Phân lập toxin có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus và toxin có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thƣ từ nọc rắn Bungarus fasciatus”. Mục tiêu của luận án là phân lập một số toxin có các hoạt tính kể trên từ nọc bò cạp H.laoticus, nọc rắn B.fasciatus và xác định cấu trúc của chúng, nhằm tìm kiếm ứng dụng của chúng trong y dƣợc. Đề tài này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, hứa hẹn sẽ có nhiều đóng góp mới vào việc nghiên cứu thành phần toxin và hoạt tính sinh học của nọc độc động vật, một lĩnh vực mới và chƣa có nhiều công trình nghiên cứu ở Việt Nam.
3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về bò cạp Bò cạp là loài động vật chân khớp đã có từ lâu đời trên thế giới. Trải qua hơn 450 triệu năm tiến hóa, hình dạng của bò cạp không thay đổi nhiều [12 – 13]. Bên cạnh việc nghiên cứu đặc điểm hình thái, tính đa dạng loài, phƣơng diện sinh thái, các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu các thành phần của nọc độc bò cạp. Hƣớng nghiên cứu này đang thu hút đƣợc nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học vì nọc bò cạp chứa nhiều thành phần có hoạt tính sinh học. Phân bố địa lý Bò cạp có thể gặp ở mọi miền địa lý trên thế giới, thƣờng xuất hiện ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Bò cạp sống trong rừng, sa mạc, trong hang và vài loài còn đƣợc tìm thấy dƣới các tảng đá ở những núi có độ cao 5000 m [14]. Có khoảng 2000 loài bò cạp, thuộc 20 họ khác nhau, phân bố rộng rãi nhất tại những vùng phía nam của vĩ tuyến 45 Bắc (ngoại trừ New Zealand và Nam cực). Ví dụ nhƣ: giống Androctonus, Leiurus: phân bố chủ yếu ở Châu Á, Bắc Phi, Trung Đông [15 – 16]; giống Tityus phân bố ở Nam Mỹ (chủ yếu ở Brazil, Venezuela, Colombia và Argentina) [17]; giống Centruroides phân bố ở Trung Mỹ [18]; giống Heterometrus phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam Á (Campuchia, Lào, Thái Lan, Việt Nam), cũng nhƣ Ấn Độ, Sri Lanka, Nepal và Trung Quốc (Tây Tạng) [19 - 20]. Ở Việt Nam, bò cạp phân bố khắp nơi trong nƣớc từ đồng bằng đến miền núi trong những khu rừng ẩm ƣớt và hải đảo. Có bốn họ thuộc bộ Bò Cạp: Buthidae, Scorpionidae, họ Chaerilidae và họ Pseudochactidae. Trong đó, họ Buthidae và Scorpionidae chiếm nhiều nhất. Chúng phân bố ở các vùng khác nhau [21 – 26]: Họ Buthidae: - Loài Lychas mucronatus Fabricius, 1798: phân bố ở các tỉnh miền Trung và miền Nam, phát triển mạnh về số lƣợng cá thể ở Đồng Phú (Bình Phƣớc). - Loài Isometrus basilicus Karsch, 1879: phân bố ở các tỉnh Nghệ An, Quảng Trị, Bình Định, Khánh Hoà (Trƣờng Sa), Bình Phƣớc (Đồng Phú). - Loài Isometrus (Reddyanus) petrzelkai Kovařik, 2003: phân bố ở Nghệ An (Vinh).
4 - Loài Isometrus deharvengi Lourenco, 2010: phân bố ở Hòn Chồng, Kiên Giang. Họ Scorpionidae: - Loài Heterometrus spinifer Ehrenberg, 1828: phân bố ở Bình Phƣớc (Bù Đốp, Bù Gia Mập, Đồng Phú). - Loài Heterometrus petersii Thorell, 1876: phân bố ở thành phố Hồ Chí Minh, Bình Thuận, Khánh Hoà, Gia Lai, Lâm Đồng, Quảng Ninh. - Loài Heterometrus laoticus Couzijn, 1981: phân bố ở Thành phố Hồ Chí Minh, Tây Ninh, Đồng Nai (Biên Hoà), An Giang. - Loài Heterometrus cyaneus C. L. Koch, 1836: phân bố ở Thừa Thiên Huế, Quảng Trị. Họ Chaerilidae: - Loài Chaerilus petrzelkai Kovařík, 2000: miền Nam Việt Nam, đảo Côn Sơn. - Loài Chaerilus variegatus Simon, 1877: miền Nam Việt Nam. - Loài Chaerilus vietnamicus Lourenco and Zhu, 2008: phân bố ở miền Bắc. - Loài Chaerilus julietteae Lourenco, 2011: phân bố ở miền Nam. - Loài Chaerilus phami Lourenco, 2011: tập trung ở đảo Côn Sơn. Họ Pseudochactidae: - Loài Vietbocap canhi Lourenco & Pham, 2010. - Loài V. thienduongensis Lourenco & Pham, 2012. Và trong năm 2013, vừa phát hiện loài bọ cạp mới ở miền núi phía bắc Việt Nam có tên có tên khoa học Euscorpiops cavernicola Lourenco & Phạm. Loài bò cạp mới này thuộc họ Euscorpiidae, phân bố ở hang Hua Ma, xã Quảng Khê (huyện Ba Bể, tỉnh Bắc Kạn) [27].