Luận án Tiến sĩ Kĩ thuật: Nghiên cứu công nghệ khai thác tổ hợp polyphenol từ lá chè xanh Việt Nam và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:161

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là xây dựng công nghệ sản xuất polyphenol từ chè xanh phế loại bao gồm lá chè già và chè xanh vụn. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm polyphenol chè xanh trong công nghiệp thực phẩm. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Kĩ thuật: Nghiên cứu công nghệ khai thác tổ hợp polyphenol từ lá chè xanh Việt Nam và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VŨ HỒNG SƠN NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ KHAI THÁC TỔ HỢP POLYPHENOL TỪ LÁ CHÈ XANH VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Hà Nội 2011
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VŨ HỒNG SƠN ðề tài NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ KHAI THÁC TỔ HỢP POLYPHENOL TỪ LÁ CHÈ XANH VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Chuyên ngành: Chế biến thực phẩm và ñồ uống Mã số: 62.54.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Hà Duyên Tư 2. PGS.TS. Nguyễn Duy Thịnh Hà Nội 2011
i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan luận án này là công trình của riêng tôi. Các số liệu công bố trong luận án này là trung thực, một phần ñã ñược công bố trên các tạp chí khoa học với sự ñồng ý của ñồng tác giả, phần còn lại chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào. Tác giả luận án VŨ HỒNG SƠN
ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện công trình nghiên cứu này, tôi ñã nhận ñược nhiều sự giúp ñỡ và hỗ trợ của các thầy cô, ñồng nghiệp, các cơ quan, bạn bè, các em sinh viên và người thân trong gia ñình. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành ñến GS.TS Hà Duyên Tư, người ñã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, khích lệ tôi tận tình trong suốt quá trình làm luận án. Tôi cũng xin bày tỏ sự cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Duy Thịnh ñã tận tình hướng dẫn và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Hoàng ðình Hòa ñã giúp ñỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình làm luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Thị Minh Tú và các ñồng nghiệp trong Bộ môn Quản lý Chất lượng, các thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường ðHBK Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi trong quá trình làm luận án. Xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến các ñồng nghiệp thuộc các ñợn vị sau: - Trung tâm Giáo dục và Phát triển sắc ký, ðHBK Hà Nội - Khoa Vệ sinh thực phẩm-dinh dưỡng, Viện Vệ sinh phòng dịch quân ñội - Viện Pháp y quân ñội, Cục Quân y - Tổ thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ñã giúp tôi thực hiện các nghiên cứu của mình. Xin chân thành cảm ơn KS Nguyễn Tiến Huy, KS Hoàng Thanh Nhung và sinh viên các khóa 47, 48, 49, 50 ngành Công nghệ thực phẩm ñã giúp ñỡ và hỗ trợ tôi rất nhiều trong thời gian làm luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè, người thân và gia ñình hai bên nội ngoại, ñặc biệt vợ tôi Phương Thu Huyền và con gái Vũ Phương Huyền Anh ñã ñộng viên và hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt quá trình làm luận án.
iii MỤC LỤC MỞ ðẦU.....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN.......................................................................................5 1.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY CHÈ....................................................................................5 1.1.1. Tên gọi và nguồn gốc cây chè ......................................................................5 1.1.2. Phân loại các giống chè ................................................................................6 1.1.3. Các vùng chè ở Việt Nam ............................................................................7 1.1.4. Tình hình sản xuất chè trên thế giới và ở Việt Nam ....................................9 1.2. HỢP CHẤT POLYPHENOL THỰC VẬT .......................................................10 1.2.1. ðịnh nghĩa, phân loại ..................................................................................10 1.2.2. Hợp chất flavonoit.......................................................................................11 1.2.2.1. Phân loại hợp chất flavonoit................................................................12 1.2.2.2. Sinh tổng hợp flavonoit ........................................................................13 1.2.3. Hợp chất polyphenol trong chè ...................................................................15 1.2.4. Hoạt tính sinh học của polyphenol..............................................................18 1.2.4.1. Tác dụng chống oxy hóa của polyphenol.............................................18 1.2.4.2. Tác dụng ñối với enzym........................................................................21 1.2.4.3. Tác dụng kháng sinh, chống viêm nhiễm .............................................22 1.2.4.4. Tác dụng ñối với ung thư .....................................................................22 1.2.4.5. Tác dụng ñối với các bệnh tim mạch ...................................................25 1.2.4.6. Tác dụng ñối với HIV/AIDS .................................................................26 1.3. ỨNG DỤNG HỢP CHẤT POLYPHENOL CHÈ XANH ................................26 1.3.1. Ứng dụng polyphenol trong công nghiệp thực phẩm .................................26 1.3.1.1. Vai trò của polyphenol chè xanh ñược bổ sung trong thực phẩm .......27 1.3.1.2. Sự chuyển hóa polyphenol trong hệ tiêu hóa.......................................30 1.3.2. Ứng dụng polyphenol trong Y-Dược ..........................................................33 1.4. CÔNG NGHỆ TRÍCH LY POLYPHENOL CHÈ XANH ................................34 1.4.1. Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình trích ly polyphenol............................34 1.4.2. Các nghiên cứu trên thế giới về công nghệ trích ly polyphenol chè xanh ..36 1.4.2.1. Các phương pháp trích ly cơ bản ........................................................36 1.4.2.2. Các phương pháp trích ly hiện ñại ......................................................39 1.4.3. Các nghiên cứu trong nước về công nghệ trích ly polyphenol chè xanh....40 CHƯƠNG 2. ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................42
iv 2.1. ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...........................................................................42 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................42 2.2.1. Quy trình trích ly polyphenol......................................................................42 2.2.2. Chuẩn bị dịch chiết chè ...............................................................................43 2.2.3. ðịnh lượng polyphenol tổng số - phương pháp Folin-Denis .....................44 2.2.4. ðịnh lượng flavonoit tổng số ......................................................................44 2.2.5. Phân tích thành phần catechin bằng HPLC ................................................45 2.2.6. Xác ñịnh hàm lượng cafein .........................................................................45 2.2.7. Xác ñịnh dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật ..............................................46 2.2.8. Xác ñịnh vết kim loại bằng ICP/MS ..........................................................47 2.2.9. Xác ñịnh vết dung môi bằng SPME/GC ....................................................48 2.2.10. Hoạt tính chống oxy hóa – khả năng quét gốc tự do DPPH ....................49 2.2.11. Hoạt tính chống oxy hóa - khả năng kìm hãm quá trình peroxy hóa lipit màng tế bào gan chuột theo phương pháp Blagodrov C.G. .................................50 2.2.12. Hoạt tính chống oxy hóa - khả năng kìm hãm peroxydaza trong máu người theo phương pháp Xavron E.C. .................................................................52 2.2.13. Nghiên cứu tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư in vitro ...........53 2.2.14. Phương pháp xác ñịnh ñộc tính cấp ..........................................................57 2.2.15. Phương pháp xác ñịnh hoạt lực kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán thạch (Agar Diffusion) ...................................................................................58 2.2.16. Phân tích cảm quan ...................................................................................59 2.2.17. Quy hoạch thực nghiệm ...........................................................................60 2.2.18. Phân tích thống kê kết quả thí nghiệm......................................................62 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................63 3.1. XÁC ðỊNH ðẶC TÍNH CỦA NGUYÊN LIỆU...............................................63 3.1.1. Hàm lượng polyphenol của các giống chè ..................................................63 3.1.2. Hoạt tính chống oxy hóa – khả năng quét gốc tự do DPPH của polyphenol ...............................................................................................................................66 3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH TRÍCH LY POLYPHENOL CHÈ XANH ...........69 3.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình chiết dịch chè......................69 3.2.1.1. Ảnh hưởng của dung môi trích ly.........................................................70 3.2.1.2. Ảnh hưởng của thời gian trích ly .........................................................71 3.2.1.3. Ảnh hưởng của pH trích ly...................................................................72 3.2.1.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu..........................................73
v 3.2.1.5. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ trích ly...........................................................74 3.2.2. Tối ưu hóa quá trình chiết dịch chè.............................................................75 3.2.2.1. Thiết lập mô hình .................................................................................75 3.2.2.2. Tối ưu hóa ............................................................................................80 3.2.3. Tối ưu hóa quá trình tách, tinh chế polyphenol ..........................................81 3.2.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình tách, tinh chế polyphenol ...........................................................................................................................81 3.2.3.2. Thiết lập mô hình .................................................................................83 3.2.3.3. Tối ưu hóa ............................................................................................89 3.2.3.4. Sấy khô chế phẩm polyphenol ..............................................................90 3.3. PHÂN TÍCH MỘT SỐ THÀNH PHẦN CỦA CHẾ PHẨM POLYPHENOL .93 3.3.1. Thành phần catechin ...................................................................................93 3.3.2. Hàm lượng cafein........................................................................................95 3.3.3. Dư lượng HCBVTV....................................................................................96 3.3.4. Vết dung môi hữu cơ...................................................................................97 3.3.5. Thành phần và hàm lượng kim loại ............................................................97 3.4. XÁC ðỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM...............................98 3.4.1. Hoạt tính chống oxy hóa .............................................................................98 3.4.1.1. Khả năng quét gốc tự do DPPH ..........................................................98 3.6.1.2. Khả năng kìm hãm quá trình peroxy hóa lipit màng tế bào gan chuột99 3.4.1.3. Khả năng kìm hãm peroxydaza trong các nhóm máu người .............100 3.4.2. Khả năng kháng khuẩn..............................................................................101 3.4.3. Tác dụng kìm hãm sự phát triển tế bào ung thư in vitro ...........................103 3.4.4. ðộ ñộc tính cấp .........................................................................................105 3.4.4.1. ðộc tính cấp của chế phẩm PP1 trên chuột thí nghiệm ....................105 3.4.4.2. ðộc tính cấp của chế phẩm PP2 trên chuột thí nghiệm ....................106 3.4.4.3. Một số chỉ tiêu huyết học và hóa sinh máu chuột khi cho uống PP1 và PP2 ..................................................................................................................108 3.5. ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM POLYPHENOL CHÈ XANH TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM .........................................................................................................110 3.5.1. Cơ sở khoa học cho việc bổ sung polyphenol vào thực phẩm..................111 3.5.1.1. Sự dung nạp polyphenol chè xanh .....................................................111 3.5.1.2. Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ ñến sự chuyển hóa catechin...112 3.5.2. Ứng dụng polyphenol trong sản xuất một số sản phẩm thực phẩm..........113
vi 3.5.2.1. Quy trình sản xuất kẹo dẻo trà xanh ..................................................113 3.5.2.2. Quy trình sản xuất bánh cookie trà xanh...........................................117 3.5.3. ðánh giá chất lượng sản phẩm thực phẩm có bổ sung polyphenol ..........120 3.5.3.1. Khả năng kìm hãm peroxydaza trong máu người của dịch chiết polyphenol từ sản phẩm ..................................................................................120 3.5.3.2. Khả năng kìm hãm quá trình peroxy hóa màng tế bào gan chuột.....125 KẾT LUẬN .............................................................................................................127 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ðÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ..................129 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................130
vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AChE Acetylcholinesterase ADN Deoxyribonucleic acid (axit deoxyribonucleic) ARN Ribonucleic acid (axit ribonucleic) ATCC American type culture collection (bộ sưu tập giống chuẩn của Mỹ) BHA Butylhydrxyanizol BHT Butylhydroxytoluen BuChE Butylcholinesterase CCK Cholecystokinin CFU Colony forming unit (số khuẩn lạc) CHI Chalcone isomerase (enzym ñồng phân hóa chalcon) CHS Chalcone synthase (enzym tổng hợp chalcon) CoA Coenzyme A COMT Catechol-O-methyltransferase DAD Diode array detector (detector ñiốt phổ rộng) DFR Dihydroflavonol-4-reductase (enzym khử dihydroflavonol) DiMeEGCG Dimethylepigallocatechin gallate DMEM Dubelco’s modified eagle medium DMSO Dimethylsulfoxide DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EC epicatechin ECD Electron capture detector (detector cộng kết ñiện tử) ECG Epicatechin gallate EGC Epigallocatechin EGCG Epigallocatechin gallate F3H Flavanone-3-hydroxylase (enzym hydroxyl hóa flavanon) FBS Fetal bovine serum FDR Flavan 3,4-cis diol-reductase (enzym khử flavandiol) FID Flame ionization detector (detector ion hóa ngọn lửa) GC Gallocatechin GC/MS Sắc ký khí/khối phổ GCG Gallocatechin gallate HCBVTV Hóa chất bảo vệ thực vật
viii HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao IC50 Half maximal inhibitory concentration (nồng ñộ kìm hãm 50%) ICP/MS Inductively coupled plasma/Mass spectrometry (khối phổ plasma cảm ứng) LD50 Lethal dose, 50% (liều gây chết 50% ñộng vật thí nghiệm) MDA Malonyldialdehyde MeEC Methylepicatechin MeEGC Methylepigallocatechin MEME Minimal essential medium eagle MFA Multiple factor analysis (phân tích nhân tố ña chiều) MPA Meat-Pepton-Agar (môi trường MPA) NCI Viện ung thư quốc gia Mỹ OC Organic chlorine (nhóm clo hữu cơ) OECD Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế thế giới OP Organic phosphorus (nhóm phospho hữu cơ) PBS Phosphate buffer saline POL Peroxidation of lipid (peroxy hóa lipit) PP1 Chế phẩm polyphenol từ lá chè già PP2 Chế phẩm polyphenol từ chè xanh vụn PSF Penicilline-Streptomycine-Fungizone SAH S-adenosylhomocysteine SAM S-adenosylmethionine SGOT Serum glutamic oxaloacetic transaminase (men gan) SGPT Serum glutamic pyruvic transaminase (men gan) SPME Solid phase microextraction (vi chiết pha rắn) SRB Sulforhodamine B SULT Sulfotransferase TBA Axit thiobarbituric TCA Axit tricloaxetic TQ Trung Quốc UF3GT UDP glucose flavonoid 3-O-glucosyltransferase UGT Uridin 5’-diphosphoglucuronosyltransferase
ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại hợp chất polyphenol.................................................................11 Bảng 1.2. Các chế phẩm SUNPHENON và ứng dụng trong thực phẩm ..................28 Bảng 1.3. Ứng dụng của chế phẩm “Thea- flan” trong chế biến thực phẩm...........29 Bảng 2.1. Chuẩn bị mẫu thí nghiệm..........................................................................51 Bảng 2.2. Mật ñộ tế bào và khoảng thời gian phù hợp cho phép thử ñộ ñộc tế bào 56 Bảng 3.1. Hàm lượng polyphenol tổng số của các giống chè vùng Phú Hộ ............64 Bảng 3.2. Hàm lượng polyphenol tổng số của các giống chè vùng Thanh Sơn .......65 Bảng 3.3. Hàm lượng polyphenol tổng số của các giống chè vùng Mộc Châu........65 Bảng 3.4. Hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol lá chè xanh vùng Phú Hộ .......67 Bảng 3.5. Hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol lá chè xanh vùng Thanh Sơn ..67 Bảng 3.6. Hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol lá chè xanh vùng Mộc Châu ...68 Bảng 3.7. Giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố thực nghiệm ....................75 Bảng 3.8. Các thí nghiệm tiến hành và kết quả ........................................................76 Bảng 3.9. Kết quả phân tích hồi quy-hiệu suất trích ly (Y1) .....................................77 Bảng 3.10. Kết quả phân tích hồi quy-hoạt tính chống oxy hóa (Y2) .......................78 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ clorofooc/dịch chè ñến quá trình tách, tinh chế polyphenol .................................................................................................................81 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ etyl axetat/dịch chè ñến quá trình tách, tinh chế polyphenol .................................................................................................................82 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nồng ñộ dịch chè ñến quá trình tách, tinh chế polyphenol .................................................................................................................83 Bảng 3.14. Giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố thực nghiệm ..................84 Bảng 3.15. Các thí nghiệm tiến hành và kết quả ......................................................85 Bảng 3.16. Kết quả phân tích hồi quy-hàm lượng polyphenol (Y1) ..........................86 Bảng 3.17. Kết quả phân tích hồi quy-hoạt tính chống oxy hóa (Y2) .......................86 Bảng 3.18. Kết quả phân tích hồi quy-hàm lượng cafein (Y3) ..................................87 Bảng 3.19. Kết quả phân tích các loại catechin trong chế phẩm PP .......................94 Bảng 3.20. Kết quả phân tích cafein trong chế phẩm PP.........................................95 Bảng 3.21. Kết quả phân tích dư lượng HCBVTV ....................................................96 Bảng 3.22. Kết quả phân tích hàm lượng kim loại ...................................................97 Bảng 3.23. Hàm lượng kim loại cho phép trong chè ................................................98 Bảng 3.24. Khả năng quét gốc tự do DPPH của 2 chế phẩm...................................98
x Bảng 3.25. Khả năng kìm hãm quá trình peroxy hoá lipit màng tế bào gan chuột của 2 chế phẩm..........................................................................................................99 Bảng 3.26. Khả năng kìm hãm peroxydaza trong máu người của chế phẩm PP1 100 Bảng 3.27. Khả năng kìm hãm peroxydaza trong máu người của chế phẩm PP2 101 Bảng 3.28. ðường kính vòng kháng khuẩn.............................................................102 Bảng 3.29. ðộ hấp thu quang ban ñầu và trong ñiều kiện ñối chứng âm ..............104 Bảng 3.30. Nồng ñộ ức chế 50% sự phát triển (IC50) của các dòng tế bào ung thư .................................................................................................................................104 Bảng 3.31. ðộc tính cấp của PP1 trên chuột thí nghiệm.......................................105 Bảng 3.32. ðộc tính cấp của PP2 trên chuột thí nghiệm.......................................107 Bảng 3.33. Một số chỉ tiêu huyết học và hóa sinh máu chuột khi cho uống PP1 ...108 Bảng 3.34. Một số chỉ tiêu huyết học và hóa sinh máu chuột khi cho uống PP2 ...109 Bảng 3.35. Thực ñơn sản xuất kẹo dẻo ...................................................................113 Bảng 3.36. Kết quả nghiên cứu bổ sung PP2 ở các thời ñiểm khác nhau..............114 Bảng 3.37. Thực ñơn sản xuất bánh cookie ............................................................117 Bảng 3.38. Khả năng kìm hãm peroxydaza trong máu người của dịch chiết polyphenol từ kẹo dẻo trà xanh ...............................................................................121 Bảng 3.39. Khả năng kìm hãm peroxydaza trong máu người của dịch chiết polyphenol từ thạch trà xanh ..................................................................................122 Bảng 3.40. Khả năng kìm hãm peroxydaza trong máu người của dịch chiết polyphenol từ bánh bao trà xanh ............................................................................123 Bảng 3.41. Khả năng kìm hãm peroxydaza trong máu người của dịch chiết polyphenol từ bánh cookie trà xanh........................................................................124 Bảng 3.42. Khả năng kìm hãm quá trình peroxy hoá màng tế bào gan chuột của dịch chiết polyphenol từ sản phẩm..........................................................................125
xi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ðỒ THỊ Hình 1.1. Chè Trung Quốc lá to ............................................................................... 6 Hình 1.2. Chè Trung Quốc lá nhỏ............................................................................. 6 Hình 1.3. Chè Shan .................................................................................................. 6 Hình 1.4. Chè Ấn ðộ . .............................................................................................. 6 Hình 1.5. Cấu tạo khung cacbon của flavonoit.........................................................12 Hình 1.6. Chu trình sinh tổng hợp tạo thành phenylpropan.....................................13 Hình 1.7. Sơ ñồ sinh tổng hợp flavonoit ...................................................................14 Hình 1.8. Công thức cấu tạo của các catechin trong chè .........................................16 Hình 1.9. Chu trình chuyển hóa của catechin chè xanh ...........................................32 Hình 1.10. Phương pháp trích ly 1............................................................................37 Hình 1.11. Phương pháp trích ly 2............................................................................38 Hình 1.12. Phương pháp trích ly 3...........................................................................38 Hình 2.1. Quy trình trích ly polyphenol chè xanh.....................................................43 Hình 2.2. ðường chuẩn axit gallic............................................................................44 Hình 3.1. Ma trận hệ số tương quan hàm lượng polyphenol giữa các tầng lá.........64 Hình 3.2. Ma trận hệ số tương quan hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol giữa các tầng lá .................................................................................................................68 Hình 3.3. Ảnh hưởng của dung môi ñến hiệu suất trích ly polyphenol ....................71 Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian ñến hiệu suất trích ly và hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol ...................................................................................................71 Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH ñến hiệu suất trích ly và hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol .................................................................................................................72 Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu ñến hiệu suất trích ly và hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol...........................................................................73 Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hiệu suất trích ly và hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol ..........................................................................................................74 Hình 3.8. Ảnh hưởng của các yếu tố ñến quá trình trích ly polyphenol ...................78 Hình 3.9. Bề mặt ñáp ứng của hiệu suất trích ly và hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol .................................................................................................................79 Hình 3.10. Mức ñộ ñáp ứng sự mong ñợi – chiết dịch chè .......................................80 Hình 3.11. Ảnh hưởng của các yếu tố ñến quá trình tách tinh chế polyphenol........88
xii Hình 3.12. Bề mặt ñáp ứng của hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol và hàm lượng cafein ...............................................................................88 Hình 3.13. Mức ñộ ñáp ứng sự mong ñợi – tinh chế polyphenol..............................90 Hình 3.14. Quy trình công nghệ sản xuất polyphenol từ lá chè già .........................92 Hình 3.15. Sắc ký ñồ HPLC mẫu chế phẩm PP1......................................................93 Hình 3.16. Sắc ký ñồ HPLC mẫu chế phẩm PP2......................................................93 Hình 3.17. Sắc ký ñồ HPLC mẫu chuẩn catechin.....................................................94 Hình 3.18. Sắc ký ñồ GC/MS mẫu chế phẩm PP1 và PP2 .......................................95 Hình 3.19. Sắc ký ñồ GC mẫu M1.............................................................................96 Hình 3.20. Phổ MS mẫu chế phẩm PP1 và PP2 .......................................................97 Hình 3.21. Hình ảnh vòng kháng khuẩn .................................................................102 Hình 3.22. Quy trình sản xuất kẹo dẻo trà xanh .....................................................114 Hình 3.23. Phân tích MFA mẫu kẹo - Hình ảnh sản phẩm trên mặt phẳng chính thứ nhất..........................................................................................................................115 Hình 3.24. Phân tích MFA mẫu kẹo – Hình ảnh nhóm người thử trên mặt phẳng chính thứ nhất..........................................................................................................116 Hình 3.25. Phân tích MFA mẫu kẹo – Hình ảnh mẫu và người thử trên mặt phẳng chính thứ nhất..........................................................................................................116 Hình 3.26. Quy trình sản xuất bánh cookie trà xanh..............................................117 Hình 3.27. Phân tích MFA mẫu cookie – Hình ảnh sản phẩm trên mặt phẳng chính thư nhất ...................................................................................................................118 Hình 3.28. Phân tích MFA mẫu cookie– Hình ảnh người thử trên mặt phẳng chính thứ nhất ...................................................................................................................119 Hình 3.29. Phân tích MFA mẫu cookie– Hình ảnh mẫu và người thử trên mặt phẳng chính thứ nhất..........................................................................................................119
1 MỞ ðẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Chè xanh tên khoa học là Camellia sinensis Lindl O.Kuntze, là loại ñồ uống quen thuộc có từ hàng ngàn năm của người châu Á trong ñó có người Việt Nam. Ngày nay nước chè cũng ñã trở thành ñồ uống phổ biến trên toàn thế giới. Nhờ các phương pháp nghiên cứu hiện ñại, tiên tiến những năm gần ñây các nhà khoa học ñã tìm thấy trong lá chè xanh chứa hàm lượng khá lớn polyphenol (mà thành phần chủ yếu là catechin) có tác dụng khử các gốc tự do. Các gốc tự do ñược sinh ra và tích lũy trong quá trình sống, chính là nguyên nhân dẫn ñến bệnh tật và làm gia tăng tốc ñộ quá trình lão hoá cơ thể con người. Ngoài ra, polyphenol chè xanh còn có khả năng hạn chế sự phát triển của nhiều bệnh tật nguy hiểm như: ung thư, tim mạch, cao huyết áp, ñường ruột, răng miệng, béo phì... Chính vì vậy polyphenol từ chè không những ñược sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm mà còn trong hóa mỹ phẩm... Ở nước ta, có nhiều vùng trồng chè như: Thái Nguyên, Tuyên Quang, Yên Bái, Phú Thọ, Mộc Châu, Lâm ðồng... Tuy nhiên ñể sản xuất chè khô cho tiêu dùng trong nước hay xuất khẩu, mới chỉ sử dụng chè búp và lá chè non, còn lại lượng rất lớn lá chè già hơn hiện còn bị bỏ phí, làm cho hiệu quả canh tác cây chè vẫn còn thấp. Ngoài ra ở các nhà máy chè trong quá trình sản xuất còn tạo ra một lượng lớn chè phế phẩm ñó là chè xanh vụn có giá trị sử dụng rất thấp. Như vậy ở ñó tiềm tàng một nguồn lợi lớn, có thể từ ñó tạo ra nguồn nguyên liệu dồi dào làm thuốc chữa bệnh, bổ dưỡng và các chất phụ gia có giá trị cao trong công nghiệp thực phẩm. Nếu khai thác ñược nguồn polyphenol từ lượng lớn lá chè thứ phẩm và phế phẩm chắc chắn sẽ nâng cao ñáng kể hiệu quả của các vùng trồng chè. Cho ñến nay, việc khai thác polyphenol từ lá chè xanh ñã và ñang ñược nghiên cứu theo các phương pháp trích ly thông thường, phương pháp trích ly với sự hỗ trợ vi sóng, siêu âm và trích ly bằng CO2 siêu tới hạn. Polyphenol có thể ñược tinh chế từ dịch trích bằng trích ly lỏng - lỏng hoặc dùng các phương pháp sắc ký. Tuy nhiên ñến nay các phương pháp trích ly polyphenol có sự hỗ trợ của các kỹ
2 thuật hiện ñại tại Việt Nam vẫn tỏ ra chưa phù hợp do vốn ñầu tư lớn và mới chỉ dừng ở phạm vi nghiên cứu. Bên cạnh ñó việc khai thác polyphenol từ chè xanh theo phương pháp trích ly thông thường vẫn chưa ñem lại hiệu quả kinh tế cao do giá thành chế phẩm polyphenol còn cao, ñộ tinh khiết của chế phẩm chưa cao. Từ thực tế cấp thiết trên, chúng tôi chọn ñề tài: “Nghiên cứu công nghệ khai thác tổ hợp polyphenol từ lá chè xanh Việt Nam và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng” cho luận án Tiến sĩ. 2. Mục tiêu nghiên cứu ðề tài tiến hành nhằm mục tiêu: - Xây dựng công nghệ sản xuất polyphenol từ chè xanh phế loại bao gồm lá chè già và chè xanh vụn. - Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm polyphenol chè xanh trong công nghiệp thực phẩm. 3. Nội dung nghiên cứu - Xác ñịnh hàm lượng, hoạt tính sinh học của polyphenol trong các tầng lá khác nhau trên các giống chè tại các ñịa phương, thu hái tại các thời ñiểm khác nhau trong năm. - Xây dựng quy trình chiết, tinh chế polyphenol từ chè xanh phế loại. - Phân tích thành phần chế phẩm polyphenol. - Xác ñịnh hoạt tính sinh học của chế phẩm. - Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm polyphenol chè xanh trong công nghiệp thực phẩm. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 4.1. Ý nghĩa khoa học - ðã xác ñịnh hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol trong 192 mẫu của 4 giống chè thu hái tại 4 thời vụ trong năm ở 3 ñịa phương. ðây là những ñóng góp ñáng tin cậy, làm phong phú thêm nguồn tư liệu khoa học về cây chè của Việt Nam.
3 - ðã xây dựng ñược công nghệ sản xuất polyphenol từ chè xanh phế loại có tính sáng tạo. - Xác ñịnh ñược thành phần catechin của chế phẩm polyphenol từ chè xanh phế loại (PP1 và PP2). - ðã xác ñịnh ñược tác dụng sinh học của hai chế phẩm PP1 và PP2: tác dụng chống oxy hóa; tác dụng chống ung thư trên các dòng tế bào ung thư LU-1, LNCaP, HepG2, Sp2/0 và MCF7; tác dụng kháng khuẩn. - Xác ñịnh ñược ñộc tính cấp của hai chế phẩm PP1 và PP2. 4.2. Ý nghĩ thực tiễn - Dựa vào kết quả xác ñịnh hàm lượng, hoạt tính sinh học của polyphenol trong lá chè có thể giúp ñịnh hướng khai thác hợp chất polyphenol chè xanh theo mục ñích khác nhau nhằm ñạt hiệu quả cao nhất. - Với công nghệ sản xuất polyphenol từ chè xanh phế loại ñược xây dựng ñã thu ñược chế phẩm có hàm lượng polyphenol và epigallocatechin gallat cao, góp phần nâng cao ñáng kể hiệu quả kinh tế của cây chè. - Kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học của chế phẩm tạo tiền ñề cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm xây dựng cơ sở cho việc sản xuất các sản phẩm giàu flavonoit có tác dụng tốt cho sức khỏe con người. - Các sản phẩm: kẹo dẻo trà xanh, thạch trà xanh, bánh bao trà xanh và bánh cookie trà xanh là những sản phẩm thực phẩm hữu ích, có thể xem như một loại thực phẩm chức năng có giá rẻ, ñiều này sẽ hấp dẫn người tiêu dùng. - Tài liệu tham khảo, cũng như các kết quả nghiên cứu của ñề tài là một tài liệu tham khảo khoa học tốt và ñầy ñủ về cây chè và các sản phẩm từ chè xanh cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học và cho cả sản xuất sau này. 5. Những ñiểm mới của luận án - Luận án là công trình nghiên cứu ñầy ñủ về hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol trong 192 mẫu của 4 giống chè thu hái tại 4 thời vụ trong năm ở 3 ñịa phương, là những ñóng góp ñáng tin cậy, làm phong phú thêm nguồn tư liệu khoa học về cây chè của Việt Nam.
4 - Công nghệ sản xuất polyphenol từ chè xanh phế loại ñược xây dựng có khả năng ứng dụng cao cho phép thu ñược chế phẩm có hàm lượng polyphenol và epigallocatechin gallat cao. - Từ chế phẩm polyphenol chè xanh ñã tạo ra ñược một số sản phẩm: kẹo dẻo trà xanh, thạch trà xanh, bánh bao trà xanh và bánh cookie trà xanh có tính chất cảm quan hấp dẫn người tiêu dùng.
5 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY CHÈ 1.1.1. Tên gọi và nguồn gốc cây chè [6], [14], [19] Chè là một loại cây sống xanh tươi quanh năm và sống chủ yếu ở vùng nhiệt ñới, ôn ñới. Cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis Lindl O.Kuntze, tên gọi sinensis trong tiếng Latinh có nghĩa là Trung Quốc. Chè thuộc ngành hạt kín (Angiospermae), lớp hai lá mầm (Dicotyledonae), bộ chè (Theales), họ chè (Theaceae), chi chè (Camellia) ñồng nghĩa với Thea, loài Camellia sinensis. Về nguồn gốc cây chè, ñây là một vấn ñề lịch sử - khoa học - văn hoá chè mà các học giả thế giới ñã nghiên cứu tranh luận hơn 2 thế kỷ qua nhưng vẫn chưa ñi ñến kết luận. ðến nay ñã công bố trên thế giới 5 thuyết về nguồn gốc cây chè, gồm thuyết Trung Hoa (Lục Vũ, 760 - Linné, 1753), thuyết Ấn ðộ (Robert Bruce, 1823), thuyết nhị nguyên (Cohen Stuart, 1918), thuyết chiết trung (ðào Thừa Trân, 1951) và thuyết Việt Nam (Djemukhatze K.M., 1976). Những công trình nghiên cứu của Djemukhatze (1961 - 1976) so sánh về thành phần các chất catechin trong lá các loại chè ñược trồng và chè mọc hoang dại ñã kết luận rằng: những cây chè mọc hoang dại từ cổ xưa, tổng hợp chủ yếu là (-) - epicatechin và (-) -epicatechin gallat, ở chúng phát triển chậm khả năng tổng hợp (-)-epigallocatechin và các gallat của nó ñể tạo thành (+)-gallocatechin gallat. Nghiên cứu các cây chè dại ở Việt Nam cho thấy chúng cũng tổng hợp chủ yếu là (-)-epicatechin và (-)-epicatechin gallat (chiếm 70% tổng số các loại catechin). Năm 1976, Viện sĩ thông tấn Viện Hàn lâm khoa học Liên Xô, sau những nghiên cứu về tiến hoá của cây chè, bằng phân tích chất catechin trong chè mọc hoang dại, ở các vùng chè Tứ Xuyên, Vân Nam Trung Quốc, và các vùng chè cổ Việt Nam (Suối Giàng, Nghĩa Lộ, Lạng Sơn, Nghệ An...) ñã kết luận: Cây chè cổ Việt Nam, tổng hợp các catechin ñơn giản nhiều hơn cây chè Vân Nam. Từ ñó có sơ ñồ tiến hoá cây chè thế giới sau ñây "Chè Việt Nam → Chè Vân Nam lá to (chè Trung Quốc) → Chè Assam (Ấn ðộ)”.
6 1.1.2. Phân loại các giống chè [6], [19], [24], [31] Dựa theo ñặc ñiểm thực vật học, ñặc ñiểm sinh hóa, nguồn gốc phát sinh cây chè, Cohen Stuart (1919) ñã chia Camellia sinensis (L) O. Kuntze thành 4 loại: chè Trung Quốc lá to, chè Trung Quốc lá nhỏ, chè Shan, chè Ấn ðộ. Hình 1.1. Chè TQ lá to a. Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var. macrophylla). ðặc ñiểm: thân gỗ nhỡ cao tới 5m trong ñiều kiện sinh trưởng tự nhiên. Lá to, dài 12-15 cm, rộng 5-7 cm, màu xanh nhạt, bóng. Năng suất phẩm chất tốt. Nguyên sản ở Vân Nam, Tứ Xuyên (Trung Quốc). b. Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var. Hình 1.2. Chè TQ lá nhỏ Bohea). ðặc ñiểm: cây bụi thấp phân cành nhiều. Lá nhỏ, màu xanh ñậm, dài 3,5–6,5 cm. Năng suất thấp, phẩm chất bình thường. Khả năng chịu rét ở nhiệt ñộ -12oC ñến -15oC. Phân bố chủ yếu ở miền ñông, ñông nam Trung Quốc, Nhật Bản và một số vùng khác. c. Chè Shan (Camellia sinensis var. Shan). ðặc ñiểm: thân gỗ, cao từ 6 ñến 10 m. Lá to và dài 15–18 cm màu xanh nhạt. Tôm chè có nhiều lông tơ, Hình 1.3. Chè Shan trắng và mịn trông như tuyết. Có khả năng thích ứng trong ñiều kiện ấm ẩm, ở ñịa hình cao, năng suất cao, phẩm chất thuộc loại tốt nhất. Nguyên sản ở Vân Nam (Trung Quốc), miền bắc của Miến ðiện và Việt Nam d. Chè Ấn ðộ (Camellia sinensis var. Assamica). ðặc ñiểm: thân gỗ cao tới 17 m phân cành thưa. Lá dài tới 20–30 cm, mỏng, mềm, thường có màu xanh ñậm. Hình 1.4. Chè Ấn ðộ