Luận án Tiến sĩ Lâm nghiệp: Nghiên cứu cơ sở khoa học bảo tồn nguồn gen các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại Thanh Hoá

Chia sẻ: Hoamaudon | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:193

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu cơ sở khoa học bảo tồn nguồn gen các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại Thanh Hoá" với mục tiêu nhằm cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn nhằm bảo tồn và phát triển các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) họ Lan (Orchidaceae) tại Thanh Hóa nói riêng và Việt Nam nói chung.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Lâm nghiệp: Nghiên cứu cơ sở khoa học bảo tồn nguồn gen các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại Thanh Hoá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN TRỌNG QUYỀN NGHIÊN CỨU CƠ SỞ KHOA HỌC BẢO TỒN NGUỒN GEN CÁC LOÀI THUỘC CHI LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus Blume) TẠI TỈNH THANH HOÁ Ngành Q Mã số 9620211 LUẬN ÁN TIẾN SĨ LÂM NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. GS.TS. HOÀNG VĂN SÂM 2. PGS. TS. BÙI VĂN THẮNG H Nộ - 2022
i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TS. Hoàng Văn Sâm và PGS. TS. Bùi Văn Thắng. Luận án được thực hiện trong thời gian từ năm 2017-2021. Các kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nào khác trừ các báo cáo, bài báo của chính nghiên cứu và cộng sự. Các số liệu tham khảo, hình ảnh có trích dẫn nguồn rõ ràng. Tác ậ á N ễ T ọ Q ề
ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận án tôi luôn nhận được sự quan tâm, hướng dẫn tận tình của thầy giáo hướng dẫn khoa học, xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến GS.TS. Hoàng Văn Sâm và PGS.TS. Bùi Văn Thắng. Luận án này là một trong các sản phẩm theo hợp đồng của đề tài Quỹ gen cấp Quốc gia mã số NVQG-2016/07. Trân trọng cám ơn lãnh đạo Bộ, lãnh đạo Văn phòng các Chương trình trọng điểm cấp Nhà nước, Vụ Khoa học và CN các ngành kinh tế - kỹ thuật, Bộ Khoa học và Công nghệ, UBND tỉnh Thanh Hóa đã phê duyệt, giao tôi làm Chủ nhiệm đề tài và cho phép sử dụng một số kết quả nghiên cứu của đề tài để thực hiện luận án. Xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến các đồng chí lãnh đạo, cán bộ có liên quan của Sở Nông nghiệp và PTNT, Viện Nông nghiệp, Chi cục Lâm nghiệp (tên gọi trước đây), Chi cục Kiểm lâm, Vườn Quốc gia Bến En, Các Khu BTTN Xuân Liên, Pù Hu, Pù Luông và các khu rừng đặc dụng tỉnh Thanh Hóa, Trung tâm nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ - Viện Dược liệu đã tạo điều kiện giúp tôi trong quá trình điều tra, nghiên cứu của luận án. Quá trình thực hiện luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình của thầy giáo, cô giáo trường Đại học Lâm nghiệp, các Viện nghiên cứu có liên quan; sự cộng tác của các nhà khoa học: TS. Khuất Thị Hải Ninh, ThS. Nguyễn Thị Huyền, ThS. Nguyễn Thị Thơ (Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp), TS. Đỗ Đăng Giáp (Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), ThS. Phan Thị Thơ (chuyên gia xử lý thống kê)... Cho phép tôi gửi lời cám ơn trân trọng nhất về tất cả sự hướng dẫn và cộng tác quý báu ấy. Trân trọng biết ơn gia đình, người thân đã luôn quan tâm động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày 15 tháng 4 năm 2022 Tác N ễ T ọ Q ề
iii MỘT SỐ THUẬT NGỮ DÙNG TRONG LUẬN ÁN Đa dạng sinh học: Sự đa dạng của tất cả các loài sinh vật thuộc về các hệ sinh thái trên mặt đất, biển và các hệ sinh thái dưới nước khác và các tổ hợp sinh thái mà các sinh vật là một thành phần; bao gồm sự đa dạng về loài và hệ sinh thái. Loài đặc hữu: Những loài chỉ phân bố tự nhiên trong giới hạn địa lý một hay nhiều khu vực, lớn hoặc nhỏ Rừng đặc dụng: Rừng được xác định chủ yếu để bảo tồn thiên nhiên, mẫu chuẩn hệ sinh thái rừng của quốc gia; nguồn gen sinh vật rừng; nghiên cứu khoa học; bảo vệ di tích lịch sử, văn hoá, danh lam thắng cảnh; phục vụ nghỉ ngơi, du lịch, kết hợp phòng hộ, góp phần bảo vệ môi trường (bao gồm các Vườn quốc gia, các khu bảo tồn thiên nhiên, rừng cảnh quan và rừng thực nghiệm nghiên cứu khoa học) Rừng phòng hộ: Rừng được xác định chủ yếu để phục vụ cho mục đích bảo vệ và tăng cường khả năng điều tiết nguồn nước, bảo vệ đất, chống xói mòn, chống sa mạc hoá, góp phần hạn chế thiên tai, điều hòa khí hậu, bảo đảm cân bằng sinh thái và an ninh môi trường Rừng sản xuất: Rừng được sử dụng chủ yếu để sản xuất, kinh doanh gỗ, lâm sản ngoài gỗ và kết hợp phòng hộ, bảo vệ môi trường Rừng tự nhiên: Khu rừng được hình thành bởi những loài cây bản địa mà không phải do con người trồng. Rừng trồng: Rừng nhân tạo, thường trồng để phục vụ mục đích, nhu cầu của con người Sách đỏ/Danh lục đỏ: Danh sách những loài hiếm, đang bị đe doạ và nguy cấp do chính phủ các nước hoặc IUCN quy định
iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT STT Vế ắ Nộ d dễ 1 A. Anoectochilus 2 A.formosanus Anoectochilus formosanus Hayata 3 A.calcareus Anoectochilus calcareus Aver Anoectochilus elwesii (C.B.Clarke ex Hook.f.) King & 4 A.elwesii Pantl 5 A.setaceus Anoectochilus setaceus Blume 6 A annamensis Anoectochilus annamensis Aver Viết tắt của “Amplified Fragment Length 7 AFLP Polymorphism”, Đa hình độ dài nhân bản chọn lọc Là chất điều hòa sinh trưởng 6-Benzylaminopurine, 8 BAP benzyl adenine Công ước về thương mại quốc tế các loài động, thực vật 9 CITES hoang dã nguy cấp (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora) Phân tử mang thông tin di truyền quy định mọi hoạt động sống (sinh trưởng, phát triển và sinh sản) của các 10 DNA sinh vật và nhiều loài virus (Viết tắt của cụm từ Deoxyribonucleic acid) 11 Ex situ Bảo tồn ngoại vi (hay bảo tồn chuyển chỗ) 12 GPS Hệ thống định vị toàn cầu (Global Positioning System) 13 GTSD Giá trị sử dụng 14 In-situ Bảo tồn nội vi (hay bảo tồn tại chỗ) 15 In vitro Tiếng Latinh, nghĩa là "trong ống nghiệm" Là tiêu chuẩn về hệ thống quản lý chất lượng áp dụng ISO/IEC chuyên biệt cho phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn, do tổ 16 17025 chức quốc tế về tiêu chuẩn hóa ISO (International Organization for Standardization) ban hành
v Viết tắt của “Inter-Simple Sequence Repeats”, Chuỗi lặp 17 ISSR lại đơn giản giữa Tên gọi chung cho loài thuộc chi Lan Kim tuyến 18 Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) Viết tắt của “Naphthalene axit axetic”, là chất điều hòa 19 NAA sinh học có thể thúc đẩy sự phân chia và mở rộng tế bào Viết tắt của “Murashige and Skoog medium”, là tên của loại môi trường tổng hợp được pha sẵn, được phát minh 20 MS bởi nhà khoa học thực vật Toshio Murashige và Skoog Folke K. vào năm 1962 21 KBTTN Khu bảo tồn thiên nhiên 22 KHCN Khoa học công nghệ Viết tắt của Knudson (Knudson, 1946), tên của loại môi 23 Knud trường tổng hợp được pha sẵn 24 NĐ Nghị Định Viết tắt của "Polymerase-Chain-Reaction", đây là 25 PCR một phản ứng nhân bản DNA dựa trên các chu kỳ nhiệt 26 PIC Viết tắt của “Polymorphic Information Content” Viết tắt của “Random amplified polymorphic DNA” là 27 RAPD một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR. Loại rêu bán sẵn trên thị trường cho nhu cầu trồng lan 28 Rêu khô (còn gọi là dớn) 29 SĐVN Sách đỏ Việt Nam 30 VQG Vườn Quốc gia Viết tắt của “Ultraviolet”; còn gọi là tia tử ngoại, tia cực 31 UV tím Quỹ Quốc tế về Bảo vệ Thiên Nhiên (World Wide Fund 32 WWF For Nature) 33 IUCN Viết tắt của “International Union for Conservation of
vi Nature and Natural Resources”, Liên minh Quốc tế Bảo tồn Thiên nhiên và Tài nguyên Thiên nhiên. Viết tắt của “Endangered”, Nguy cấp (trong sách đỏ 34 EN IUCN) Viết tắt của “Vulnerable”, Sắp nguy cấp (trong sách đỏ 35 VU IUCN) Viết tắt của “Critically Endangered”, Cực kỳ nguy cấp 36 CR (trong sách đỏ IUCN) Viết tắt của “species” phần tên loài cụ thể nếu gặp một 37 sp loài chưa biết (trong danh pháp latinh, hay tên khoa học). Loài phụ là một trong nhiều cấp bậc thấp hơn loài (trong 38 spp danh pháp latinh, hay tên khoa học). Viết tắt của “Unweighted Pair Group Method using 39 UPGMA arithmetic Averages”- phương pháp nhóm cặp không trọng số với giá trị trung bình số học Viết tắt của “National Center for Biotechnology Information”, Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học 40 NCBI Quốc gia, một đơn vị trực thuộc Thư viện Y học Quốc gia Hoa Kỳ, trực thuộc Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ Kiểu rừng nguyên sinh (trong Qui phạm Thiết kế Kinh 41 IVA doanh rừng, QPN 6 – 84 ) Rừng thứ sinh phục hồi (trong Qui phạm Thiết kế Kinh 42 IVB doanh rừng, QPN 6 – 84) Rừng đã bị khai thác quá mức nhưng đã có thời gian phục hồi tốt. Đặc trưng cho kiểu này đã hình thành tầng 43 IIIa2 giữa vươn lên chiếm ưu thế sinh thái với lớp cây địa bộ phận có đường kính 20 – 30cm. Rừng có 2 tầng trở lên, tầng trên tán không liên tục được hình thành chủ yếu từ
vii những cây của tầng giữa trước đây, rải rác còn có một số cây to khoẻ vượt tán của tầng rừng cũ để lại (trong Qui phạm Thiết kế Kinh doanh rừng, QPN 6 – 84 ). Rừng đã bị khai thác vừa phải hoặc phát triển từ IIIA2 lên. Quần thụ tương đối khép kín với 2 hoặc nhiều tầng. Đặc trưng của kiểu này khác với IIIA2 ở chỗ số lượng 44 IIIa3 cây nhiều hơn và đã có một số cây có đường kính lớn (> 35cm) có thể khai thác sử dụng gỗ lớn (trong Qui phạm Thiết kế Kinh doanh rừng, QPN 6 – 84). Kiểu IIIB được đặc trưng bởi những quần thụ đã bị chặt chọn lấy ra một ít gỗ quí, gỗ tốt nhưng chưa làm thay đổi đáng kể về kết cấu ổn định của rừng. Khả năng cung cấp 45 IIIB của rừng còn nhiều, rừng giầu về trữ lượng với thành phần gỗ lớn cao (trong Qui phạm Thiết kế Kinh doanh rừng, QPN 6 – 84). Rừng gỗ xen nứa (Trạng thái gỗ IIIN+ nứa NIII) (trong 46 IIIB-NIII Qui phạm Thiết kế Kinh doanh rừng, QPN 6 – 84) Nứa to D > 5cm (trong Qui phạm Thiết kế Kinh doanh 47 NIII rừng, QPN 6 – 84).
viii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................ii MỘT SỐ THUẬT NGỮ DÙNG TRONG LUẬN ÁN ..............................................iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT .................................................... iv MỤC LỤC ........................................................................................................................viii DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................xiii MỞ ĐẦU.............................................................................................................................. 1 Chươ 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................................. 4 1.1. Thông tin chung về chi Lan kim tuyến .............................................................4 1.2. Thông tin một số loài thuộc chi Lan kim tuyến liên quan đến nghiên cứu ......4 1.2.1. Kim tuyến trung bộ (Anoectochilus annamensis Aver)..............................4 1.2.2. Kim tuyến đá vôi (A.calcareus Aver) .........................................................6 1.2.3. Giải thùy Elwes (A.elwesii (C.B.Clarke ex Hook.f.) King & Pantl) ..........7 1.2.4. Lan gấm (A. formosanus Hayata) ...............................................................8 1.2.5. Kim tuyến tơ (A.setaceus Blume) .............................................................10 1.3. Tình hình nghiên về chi Lan kim tuyến ..........................................................11 1.3.1. Tình hình nghiên cứu đa dạng các loài thuộc chi Lan kim tuyến ............11 1.3.2. Tình hình nghiên cứu bảo tồn nguồn gen các loài thuộc chi Lan kim tuyến ..14 1.3.3. Tình hình nghiên cứu giá trị dược liệu và thành phần dược tính các loài thuộc chi Lan kim tuyến ........................................................................................15 1.4. Tình hình nghiên cứu đối với loài Lan gấm (A.fomosanus) ...........................21 1.4.1. Tình hình nghiên cứu về nhân giống Lan gấm .........................................21 1.4.2. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật trồng Lan gấm ....................................23 1.4.3. Tình hình nghiên cứu về đặc điểm di truyền đối với loài Lan gấm..........26 1.5. Khái quát công tác bảo tồn và thông tin về các khu rừng đặc dụng có phân bố các loài thuộc chi Lan kim tuyến tại tỉnh Thanh Hoá ............................................28 1.5.1. Công tác quy hoạch rừng đặc dụng trên địa bàn tỉnh Thanh Hoá ..........28 1.5.2. Điều kiện tự nhiên các khu rừng đặc dụng có phân bố tự nhiên các loài thuộc chi Lan kim tuyến tại tỉnh Thanh Hoá ........................................................28
ix Chươ 2. NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 37 2.1. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................37 2.2. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................37 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................38 2.3.1. Phương pháp kế thừa tài liệu ...................................................................38 2.3.2. Phương pháp chuyên gia ..........................................................................38 2.3.3. Phương pháp phỏng vấn ..........................................................................38 2.3.4. Phuơng pháp điều tra ngoại nghiệp .........................................................39 2.3.5. Phuơng pháp xây dựng bản đồ phân bố...................................................44 2.3.6. Nghiên cứu đặc điểm di truyền của loài Lan gấm ...................................45 2.3.7. Phuơng pháp phân tích hóa học...............................................................47 2.3.8. Phuơng pháp thí nghiệm ..........................................................................50 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................60 Chươ 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ......................................... 61 3.1. Tính đa dạng thành phần loài thuộc chi Lan kim tuyến tại Thanh Hóa. ........61 3.1.1. Kết quả điều tra đánh giá đa dạng thành phần loài ................................61 3.1.2. Phân bố các loài thuộc chi Lan kim tuyến tại Thanh Hóa. ......................63 3.2. Nghiên cứu mô tả hình thái, sinh thái các loài thuộc chi Lan kim tuyến tại Thanh Hóa..............................................................................................................66 3.2.1. Kim tuyến Trung bộ (Anoectochilus annamensis Aver) ..........................66 3.2.2. Kim tuyến đá vôi (Anoectochilus calcareus Aver) ...................................68 3.2.3. Giải thùy Elwes (Anoectochilus elwesii (C.B.Clarke ex Hook.f.) King & Pantl) ......................................................................................................................69 3.2.4. Lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) .........................................71 3.2.5. Kim tuyến tơ (Anoectochilus setaceus Blume) .........................................72 3.2.2. Cơ sở khoa học tra cứu nhanh nhận biết một số loài thuộc chi Lan kim tuyến tại tỉnh Thanh Hoá ......................................................................................74 3.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Lan gấm nguồn gen tại tỉnh Thanh Hoá..76 3.3.1. Phân tích đa dạng di truyền Lan gấm bằng chỉ thị RAPD ..........................76
x 3.3.2. Phân tích một số trình tự DNA mã vạch của loài Lan gấm .....................80 3.4. Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in-vitro ........................................................92 3.4.1. Khử trùng mẫu và tái sinh chồi ................................................................93 3.4.2. Nhân nhanh chồi ......................................................................................94 3.4.3. Ảnh hưởng của loại giá thể lên sự sinh trưởng của cây mô.................. 100 3.5. Nghiên cứu kỹ thuật trồng Lan gấm ........................................................... 101 3.5.1. Nghiên cứu trồng Lan gấm trong nhà lưới ........................................... 101 3.5.2. Nghiên cứu trồng Lan gấm dưới tán rừng ............................................ 111 3.6. Đề xuất giải pháp bảo tồn và phát triển các loài thuộc chi Lan kim tuyến tại Thanh Hóa ........................................................................................................... 117 3.6.1. Đánh giá mối đe dọa chủ yếu đến các loài thuộc chi Lan kim tuyến tại tỉnh Thanh Hoá................................................................................................................... 117 3.6.2. Đề xuất giải pháp bảo tồn các loài thuộc chi Lan kim tuyến ................ 119 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 121 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO, CÔNG TRÌNH KHOA HỌC .............................. 124 ĐÃ CÔNG BỐ ................................................................................................................ 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 125 PHỤ LỤC
xi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Trình tự các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu ..................................46 Bảng 2.2: Trình tự các cặp mồi và kích thước vùng gen đích theo lý thuyết ...........47 Bảng 2.3: Hoá chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu ........................................48 Bảng 2.4: Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tạo đa chồi ..................................................................................................52 Bảng 2.5: Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của NAA đến tạo cây hoàn chỉnh .......52 Bảng 3.1: Tuyến điều tra chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại 11 khu rừng đặc dụng tỉnh Thanh Hoá ................................................................................................. 40 Bảng 3.2: Toạ độ ghi nhận các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại Thanh Hóa ............................................................................................................61 Bảng 3.3: Phân bố tự nhiên các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại tỉnh Thanh Hóa .....................................................................................................63 Bảng 3.4: Khoá tra cứu nhanh nhận biết một số loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại tỉnh Thanh Hoá ...............................................................75 Bảng 3.5: Vị trí thu thập mẫu Lan gấm (A.formosanus Hayata) ..............................76 Bảng 3.6: Kết quả phân tích đa hình mồi RAPD trong nghiên cứu với 10 mẫu Lan gấm (A.formosanus) ..................................................................................................77 Bảng 3.7: Hệ số tương đồng di truyền khi so sánh theo từng cặp của 10 mẫu Lan gấm (A.formosanus) ..................................................................................................78 Bảng 3.8: Các vị trí nucleotide sai khác trong trình tự gen matK của loài Lan gấm (A.formosanus) nghiên cứu với 7 mã gen công bố trong Ngân hàng gen quốc tế NCBI .........................................................................................................................86 Bảng 3.9: Các vị trí nucleotide sai khác trong trình tự gen rbcL của loài Lan gấm (A.formosanus) nghiên cứu với 5 mã gen công bố trong Ngân hàng gen quốc tế NCBI .........................................................................................................................89 Bảng 3.10: Các vị trí nucleotide sai khác trong trình tự gen ITS2 của loài Lan gấm (A.formosanus) nghiên cứu với 4 mã gen công bố trong Ngân hàng gen quốc tế NCBI .........................................................................................................................91 Bảng 3.11: Vị trí thu thập mẫu Lan gấm (A. formosanus) ở khu bảo tồn các loài thực vật hạt trần quý hiếm Nam Động (Thanh Hóa) ................................................92
xii Bảng 3.12: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tạo mẫu sạch và tái sinh chồi Lan gấm (A. formosanus) ..........................................................................................93 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến nhân nhanh chồi Lan gấm (A.formosanus) ..........................................................................................................94 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng (BAP, Kinetin và NAA) lên khả năng nhân chồi Lan gấm (A. formosanus) .........................................96 Bảng 3.15: Khả năng ra rễ của chồi Lan gấm (A. formosanus) in vitro ...................98 Bảng 3.16: Ảnh hưởng của các loại giá thể đến khả năng sống và sinh trưởng của cây mô Lan gấm (A. fomorsanus) sau 8 tuần ra ngôi ..............................................100 Bảng 3.17: Ảnh hưởng của loại giá thể lên sự sinh trưởng của cây mô Lan gấm (A.formosanus) sau 12 tuần trồng trong nhà lưới ...................................................102 Bảng 3.18: Ảnh hưởng mật độ đến sinh trưởng của Lan gấm (A.fomorsanus) ......103 Bảng 3.19: Ảnh hưởng của phân bón đến sinh trưởng của Lan gấm (A.formosanus) ... 104 Bảng 3.20: Ảnh hưởng của thời vụ đến sinh trưởng của cây mô Lan gấm (A.fomorsanus) sau 12 tuần trồng trong nhà lưới ...................................................105 Bảng 3.21: Sinh trưởng của cây mô Lan gấm (A. formosanus) sau 12 tháng trồng trong nhà lưới ..........................................................................................................107 Bảng 3.22: Thành phần sâu, côn trùng gây hại Lan gấm (A.formosanus) ..............109 Bảng 3.23: Thành phần bệnh hại Lan gấm (A.formosanus) ...................................109 Bảng 3.24: Thành phần động vật hoang dã gây hại Lan gấm (A.formosanus) .......110 Bảng 3.25: Kết quả định lượng tổng flavonoid mẫu Lan gấm (A. formosanus) 12 tháng tuổi nuôi trồng trong nhà lưới .......................................................................111 Bảng 3.26: Sinh trưởng của cây mô Lan gấm (A. formosanus) sau 12 tuần trồng dưới tán rừng ...........................................................................................................112 Bảng 3.27: Sinh trưởng của Lan gấm (A. formosanus) 12 tháng trồng dưới tán rừng hỗn giao gỗ - tre nứa tự nhiên .................................................................................115 Bảng 3.28: Tình hình sâu bệnh, động vật gây hại cây Lan gấm (A. formosanus) dưới tán rừng ...................................................................................................................116 Bảng 3.29: Kết quả phân tích hàm lượng tổng flavonoid .......................................116 Bảng 3.30: Tổng hợp thông tin phỏng vấn người dân địa phương và cán bộ làm công tác bảo tồn tại các khu rừng đặc dụng có phân bố các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại Thanh Hoá ..........................................................117
xiii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Kim tuyến Trung bộ (A.annamensis) ..........................................................5 Hình 1.2: Kim tuyến đá vôi (A.calcareus) ..................................................................6 Hình 1.3: Giải thùy Elwes (A.elwesii).........................................................................7 Hình 1.4: Cây và các bộ phận hoa của Lan gấm (A.formosanus) ...............................9 Hình 1.5: Lan kim tuyến (A.setaceus).......................................................................10 Hình 3.1: Sơ đồ tuyến điều tra chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại 11 khu rừng đặc dụng tỉnh Thanh Hoá ..................................................................................42 Hình 3.2: Sơ đồ phân bố các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại Thanh Hóa ............................................................................................................65 Hình 3.3: Kim tuyến Trung bộ (A.annamensis) được thu thập về nuôi trồng tại khu vực nghiên cứu xã Vạn Xuân, tỉnh Thanh Hoá .........................................................66 Hình 3.4: Sơ đồ phân bố tự nhiên loài Kim tuyến Trung bộ (A.annamensis) tại Thanh Hoá .................................................................................................................67 Hình 3.5: Kim tuyến đá vôi (A.calcareus) nguồn gen tại Thanh Hoá ......................68 Hình 3.6: Sơ đồ phân bố tự nhiên của loài Kim tuyến đá vôi (A.calcareus) tại Thanh Hóa ............................................................................................................................69 Hình 3.7: Giải thùy Elwes (A.elwesii) nguồn gen tại Thanh Hoá .............................69 Hình 3.8: Sơ đồ phân bố loài Giải thùy Elwes (A.elwesii) tại Thanh Hóa ...............70 Hình 3.9: Lan gấm (A.formosanus) nguồn gen tại ....................................................71 Hình 3.10: Sơ đồ phân bố tự nhiên loài Lan gấm (A.formosanus) tại Thanh Hóa ...72 Hình 3.11: Kim tuyến tơ (A.setaceus) nguồn gen tại Thanh Hoá .............................73 Hình 3.12: Sơ đồ phân bố tự nhiên Kim tuyến tơ (A.setaceus) tại Thanh Hóa ........74 Hình 3.13: Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 10 mẫu Lan gấm (A.formosanus) ..........................................................................................................79 Hình 3.14: Các sản phẩm nhân bản đoạn gen ...........................................................82 Hình 3.15: Cây phát sinh chủng loại giữa loài Lan gấm (A.formosanus) nghiên cứu với 6 loài lan khác dựa trên sự so sánh trình tự nucleotide gen matK công bố trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI ...................................................................................85
xiv Hình 3.16: Cây phát sinh chủng loại giữa loài Lan gấm (A.formosanus) nghiên cứu với các loài lan khác dựa trên sự so sánh trình tự nucleotide gen rbcL công bố trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI ...................................................................................88 Hình 3.17: Cây phát sinh chủng loại giữa loài Lan gấm (A.formosanus) nghiên cứu với 4 loài lan khác dựa trên sự so sánh trình tự nucleotide gen ITS2 công bố trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI ...................................................................................90 Hình 3.18: Cụm chồi Lan gấm (A.formosanus) trên môi trường 1/2MS, MS và Knud sau 8 tuần nuôi cấy ....................................................................................................95 Hình 3.19: Chồi Lan gấm (A.formosanus) trên môi trường khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy .....................................................................................................................97 Hình 3.20: Cây Lan gấm (A.fomorsanus) hoàn chỉnh trên các môi trường khác nhau..99 Hình 3.21: Cây mô Lan gấm (A.formosanus) trồng trên các giá thể khác nhau sau 8 tuần ra ngôi ..............................................................................................................101 Hình 3.22: Lan gấm (A.formosanus) trồng trên các giá thể ....................................103 Hình 3.23: Lan gấm (A.formosanus) trồng trong nhà lưới (a: cây giống;b,c, d: cây 12 tháng tuổi) ..........................................................................................................108 Hình 3.24: Sâu hại Lan gấm (A.formosanus): a- Bọ trĩ, b- Sên, c- Châu chấu ......109 Hình 3.25: Bệnh hại Lan gấm (A.formosanus) .......................................................110 Hình 3.26: Bẫy bắt sóc gây hại Lan gấm (A.formosanus) ......................................110 Hình 3.27: Lan gấm (A.formosanus) sau 12 tuần trồng dưới tán rừng ...................113 Hình 3.28: Nhà trông coi bảo vệ và khu rừng nghiên cứu tại xã Vạn Xuân, huyện Thường Xuân (giáp với vùng lõi Khu BTTN Xuân Liên) ......................................114 Hình 3.29: Mô hình trồng Lan gấm (A.formosanus) dưới tán rừng tại KBTTN Xuân Liên..........................................................................................................................116 Hình 3.30: Lan kim tuyến bị người dân thu hái (3/2020) .......................................119
1 MỞ ĐẦU 1. Tí h cấp h ế của l ậ á Chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume), thuộc họ Lan (Orchidaceae), là một chi thực vật có giá trị làm thuốc, chúng được dùng trong việc điều trị các chứng bệnh đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dương, rối loạn gan, lá lách và chứng đau nhói ngực (Nguyễn Tiến Bân, 2005) [6]. Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Lan kim tuyến được dùng làm thuốc để điều trị bệnh tiểu đường, làm tan khối u, giảm lipase trong máu và chữa viêm gan (Đỗ Tất Lợi, 2004) [27]. Nghị định 06/2019/NĐ-CP ngày 22/01/2019 của Chính phủ xếp 3 loài thuộc nhóm IA (A. setaceus Blume, A.acalcaratus Aver, A.calcareus Aver) và các loài còn lại của chi đều thuộc nhóm IIA[12]. Các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) hiện nay đang đứng trước nguy cơ môi trường sống bị mất mát, suy thoái; bị động vật sử dụng làm thức ăn, việc khai thác một cách bừa bãi và nhu cầu sử dụng ngày càng tăng của con người khiến cho nguồn gen tự nhiên ngày càng suy giảm (Zhang và cộng sự, 2013) [102]. Từ thực tế 20 năm công tác liên quan đến nghiên cứu khoa học và công tác bảo tồn của bản thân nhận thấy: thực trạng có nhiều cán bộ Kiểm lâm sở tại và cán bộ kỹ thuật các đơn vị rừng đặc dụng ở tỉnh Thanh Hóa chưa nhận biết, phân biệt đến cấp độ loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume), mới chỉ gọi chung là Lan kim tuyến cho tất cả các loài, dẫn đến nhiều hạn chế trong thực thi pháp luật và tham mưu, đề xuất các giải pháp quản lý, bảo tồn có hiệu quả nguồn gen quý hiếm này. Từ những cơ sở nêu trên, việc “Nghiên cứu cơ sở khoa học bảo tồn nguồn gen các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại Thanh Hoá” là cần thiết và cấp bách. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn nhằm bảo tồn và phát triển các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) họ Lan (Orchidaceae) tại Thanh Hóa nói riêng và Việt Nam nói chung. Mục tiêu cụ thể:
2 Đánh giá được tính dạng về thành phần loài, đặc điểm phân bố, đặc điểm hình thái, sinh thái và giá trị bảo tồn của các loài thuộc chi (Anoectochilus Blume) tại tỉnh Thanh Hóa. Xây dựng được kỹ thuật nhân giống in-vitro, trồng và bảo tồn loài Lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) từ nguồn vật liệu thu từ rừng tự nhiên tại Thanh Hóa. Đề xuất được giải pháp bảo tồn các loài các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại Thanh Hóa. 3. Nhữ đó óp mớ của ậ á Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách hệ thống về đang dạng các loài thuộc chi Anoectochilus Blume tại tỉnh Thanh Hóa, với 5 loài, gồm: Anoectochilus calcareus Aver, Anoectochilus elwesii (C.B.Clarke ex Hook.f.) King & Pantl, Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.., Anoectochilus annamensis Aver và Anoectochilus formosanus Hayata. Bổ sung loài Lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) cho hệ thực vật Việt Nam; 01 loài (Anoectochilus annamensis Aver) cho hệ thực vật khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông. Công trình đầu tiên nghiên cứu nhân giống In vitro, trồng Lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) dưới tán rừng và trong nhà lưới bằng cây giống nuôi cấy mô loài Lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) từ nguồn gen tự nhiên thu được tại Thanh Hoá nói riêng và Việt Nam nói chung. Là công trình đầu tiên công bố (02 mã vạch trình tự gen nêu trên) loài Lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) nguồn gen thu thập tại Việt Nam trên ngân hàng gen quốc tế GenBank. 4. Ý hĩa khoa học và thực tiễn của Luận án 4.1. Ý nghĩa khoa học Cung cấp dữ liệu khoa học cho công tác nhận biết loài, bảo tồn và phát triển nguồn gen các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại Thanh Hóa. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn của Luận án Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học cho việc đề xuất các giải pháp bảo tồn và phát triển các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume), đặc biệt là loài Lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) tại Thanh Hóa.
3 5. Đố ượng và phạm vi nghiên cứu 5.1. Đối tượng Đối tượng nghiên cứu của Luận án là các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại Thanh Hóa. 5.2. Phạm vi nghiên cứu Phạm vi về nội dung: Nghiên cứu thành phần toàn bộ các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) tại Thanh Hóa. Nghiên cứu các loài loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) về đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh thái, phân bố địa lý và giá trị bảo tồn. Luận án chỉ nghiên cứu về đặc điểm di truyền, kỹ thuật nhân giống và trồng loài Lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata). Trong đó nhân giống tập trung vào kỹ thuật nhân giống in vitro. Phạm vi về không gian: Nghiên cứu tại 11 khu rừng đặc dụng trên địa bàn tỉnh Thanh Hóa: Vườn Quốc Gia Bến En; Vườn Quốc gia Cúc Phương (trên địa bàn tỉnh Thanh Hóa); Khu BTTN Xuân Liên; Khu BTTN Pù Luông; Khu BTTN Pù Hu; Khu bảo tồn loài Sến Tam Quy; Khu bảo tồn các loài hạt trần Nam Động; Khu di tích lịch sử văn hóa Hàm Rồng; Khu di tích lịch sử văn hóa Lam Kinh; Khu di tích lịch sử văn hóa Trường Lệ; Khu di tích lịch sử văn hóa Đền Bà Triệu. 6. Cấ úc của l ậ á Luận án bao gồm 137 trang, 30 hình và 29 bảng, gồm các phần: - Mở đầu: 04 trang - Chương 1: Tổng quan các vấn đề nghiên cứu: 33 trang - Chương 2: Nội dung, địa điểm và phương pháp nghiên cứu: 24 trang - Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận: 61 trang - Kết luận và kiến nghị: 03 trang - Danh mục bài báo và tài liệu tham khảo: 12 trang
4 Chươ 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Thô ch về ch La k m ế Chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume), thuộc họ Lan (Orchidaceae), được mô tả lần đầu tiên vào năm 1825 bởi nhà thực vật học Carlvon Blume. Đặc điểm chung của các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) là địa lan, lá màu lục hay có màu, có cuống. Phát hoa có cán tương đối ngắn với vài hoa không to. Lá đài trên và 2 cánh hoa hợp với nhau thành cái nón. Môi hoặc có móng dài hoặc có túi khuất trong lá đài; có 2 tuyến lớn không cọng ở gần miệng của móng hay ở đáy túi, phần giữa của môi hẹp lại, 2 mép gấp lại và chạm vào nhau tạo thành cán môi thường có răng, tua, diềm ở 2 bên, đôi khi có thùy bên rõ rệt ở dưới cán môi; ở phía trước của cán môi rộng ra đột ngột thành 2 thùy ngang. Trụ có 2 cánh ở phía trước hoặc nhỏ hoặc chạy vào trong túi thành 2 phiến rời song song. Nướm thường là 2, ở mỗi bên của đáy cằm (Nguyễn Thiện Tịch, 2001)[40]. 1.2. Thô mộ số o h ộc ch La k m ế q a đế h cứ 1.2.1. Kim tuyến trung bộ (Anoectochilus annamensis Aver) Tên khác: Lan sứa Trung bộ, loài đặc hữu của Việt Nam [48] * Đặc điểm hình thái: Lá mọc cách xắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 - 5 cm, rộng từ 2 - 4 cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc, các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ, đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt; mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ; các gân bên ở rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở dưới không rõ; cuống lá dài 0,6 - 1,2 cm, thường nhẫn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá, bẹ lá nổi rõ và nhẵn; số lá trên một cây thay đổi từ 2 - 6 lá. Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông, thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt; thân khí sinh thường mọc thẳng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng; chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, đường kính thân khí sinh từ 3 - 5 mm, thân khí sinh mang nhiều lóng,
5 mỗi lóng từ 1-4cm. Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài; chiều dài thân rễ từ 5 - 12 cm, đường kính thân rễ từ 3 - 4 mm; chiều dài lóng từ 1 - 6 cm. Thân rễ thường có màu trắng xanh dương, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông. Rễ được mọc ra từ các mấu trên thân rễ, đôi khi rễ cũng được mọc từ thân khí sinh. Cụm hoa dài 10 - 20 cm, mọc ở ngọn thân, mang 4 - 10 hoa mọc thưa; lá bắc hình trứng, dài 6 - 10 mm, màu hồng, các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng dài đến 1,5 cm, mỗi bên gốc mang 6 -8 dải hẹp, đầu chẻ đôi. Mùa hoa tháng 10 – 12. Mùa quả chín tháng 12 – 3 năm sau. Những đặc điểm nêu trên được mô tả dựa trên mô tả của các tác giả: Averyanov LV (2008) [48] Nguyễn Đức Thắng và Vũ Quang Nam (2015) [35], Phan Xuân Bình Minh (2019)[28]. a b c Hình 1.1 K m ế T bộ (Anoectochilus annamensis Aver) (Nguồn: a - Nguyễn Đức Thắng, Vũ Quang Nam (2015); b,c- L. Averyanov(2003) * Phân bố: Trên thế giới: Loài đặc hữu của Việt Nam [48] Ở Việt Nam: Phân bố tại các tỉnh: Phú Thọ (VQG Xuân Sơn), Vĩnh Phúc (VQG: Tam Đảo), Hà Tĩnh (Kỳ Anh), Nghệ An, Quảng Bình (VQG Phong Nha kẻ Bàng), Quảng Trị (KBTTN Bắc Hướng Hóa), Thừa Thiên Huế (VQG Bạch Mã) [28]. * Giá trị bảo tồn: Kim tuyến trung bộ (A.annamensis) thuộc Nhóm IIA, Nghị định 06/2019/NĐ-CP của Chính Phủ [12].