Luận án Tiến sĩ Nuôi trồng thủy sản: Sử dụng cây sài đất (Wedelia chinensis) để phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:187

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Sử dụng cây sài đất (Wedelia chinensis) để phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)" được hoàn thành với mục tiêu nhằm xác định một số hoạt chất sinh học trong cao chiết sài đất có hoạt tính kháng khuẩn và hiệu suất chiết xuất cao toàn phần; Nhằm đánh giá hiệu quả của cao chiết sài đất lên đáp ứng miễn dịch và khả năng phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng (P. vannamei).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nuôi trồng thủy sản: Sử dụng cây sài đất (Wedelia chinensis) để phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN NGUYÊN NGỌC SỬ DỤNG CÂY SÀI ĐẤT (Wedelia chinensis) ĐỂ PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP (AHPND) DO VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY RA TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN HUẾ, NĂM 2024
ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN NGUYÊN NGỌC SỬ DỤNG CÂY SÀI ĐẤT (Wedelia chinensis) ĐỂ PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP (AHPND) DO VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY RA TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ngành: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 9620301 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Nguyễn Quang Linh PGS. TS. Nguyễn Ngọc Phước HUẾ, NĂM 2024
i LỜI CAM ĐOAN Tôi tên là Trần Nguyên Ngọc, nghiên cứu sinh ngành Nuôi trồng Thủy sản, khóa 2021 của khoa Thủy sản, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế. Tôi xin cam đoan Luận án “Sử dụng cây sài đất (Wedelia chinensis) để phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)” là công trình nghiên cứu khoa học của bản thân tôi được sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Quang Linh và PGS.TS. Nguyễn Ngọc Phước. Luận án này được tài trợ bởi đề tài cấp nhà nước mã số ĐTĐL.CN-56/22 (Ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất một số chế phẩm bổ sung vào thức ăn thủy sản) và Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF) và nhóm nghiên cứu mạnh của Đại học Huế mã số NCM.DHH.2022.005. Do đó, các thông tin được sử dụng tham khảo trong Luận án được thu thập từ các nguồn đáng tin cậy, đã được kiểm chứng, được công bố và được tôi trích dẫn nguồn tham khảo rõ ràng. Kết quả nghiên cứu trong Luận án được thực hiện một cách khoa học, trung thực và chưa từng được bảo vệ ở bất kỳ một học vị nào. Tôi xin cam kết và đảm bảo những lời khai này hoàn toàn đúng sự thật. Thừa Thiên Huế, ngày….tháng….năm 2024 TÁC GIẢ LUẬN ÁN Trần Nguyên Ngọc
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thiện Luận án, ngoài sự cố gắng không ngừng nghỉ của bản thân, cá nhân tôi còn nhận được nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế nơi tôi đang học tập và công tác đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian, kinh phí và công việc để tôi có thể vừa học tập, nghiên cứu vừa giảng dạy tại Nhà trường; xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Phòng Đào tạo và Công tác sinh viên trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế đã giúp đỡ tôi về các thủ tục pháp lý để hoàn thiện Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản; Bộ môn Nuôi trồng Thủy sản, Bộ môn Bệnh học Thủy sản đã quan tâm tạo điều kiện, bố trí phân công các học phần giảng dạy hợp lý để tôi có thể vừa nghiên cứu vừa tham gia giảng dạy các học phần chuyên môn đang phụ trách. Ngoài ra, Ban chủ nhiệm Khoa, Bộ môn và quý thầy cô trong khoa Thủy sản cũng đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về cơ sở vật chất, trang thiết bị, phòng thí nghiệm để tôi thực hiện đầy đủ các nội dung nghiên cứu của Luận án. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Quang Linh và PGS.TS. Nguyễn Ngọc Phước là hai nhà khoa học hướng dẫn Luận án, những người thầy tận tâm, mẫu mực, người đã mở ra định hướng nghiên cứu có tính hàn lâm cao và tận tình giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành Luận án. Đồng thời, tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến GS.TS. Lê Đức Ngoan, PGS.TS. Nguyễn Ngọc Phước, PGS.TS. Lê Văn Dân, PGS.TS. Nguyễn Duy Quỳnh Trâm, PGS.TS. Tôn Thất Chất đã trực tiếp giảng dạy và hướng dẫn các học phần trong quá trình thực hiện Luận án. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Khoa dược, trường Đại học Y Dược, Đại học Huế đã tạo điều kiện và hỗ trợ về cơ sở vật chất trong việc triển khai một số nội dung nghiên cứu về xác định các hoạt chất sinh học và chân thành cảm ơn GS.TS. Nguyễn Thị Hoài (Trưởng khoa Dược), em Đoàn Quốc Tuấn đã hỗ trợ cho tôi trong việc thực hiện một số nội dung về định tính và định lượng các hoạt chất. Chúng tôi xin cảm ơn Quỹ học bổng đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF) đã tài trợ một phần kinh phí để tôi thực hiện Luận án. Cảm ơn đề tài cấp quốc gia với mã số ĐTĐL.CN-56/22 do TS. Nguyễn Xuân Huy làm chủ nhiệm đã hỗ trợ nguồn kinh phí để thực hiện Luận án. Xin cảm ơn nhóm nghiên cứu mạnh Đại học Huế mã số NCM.DHH.2022.005 do PGS.TS. Nguyễn Ngọc Phước trưởng nhóm đã hỗ trợ kinh phí cho tôi hoàn thành bản Luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các em sinh viên khóa K52, K53, K54 của Khoa Thủy sản, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế, đã hỗ trợ cho tôi trong việc thực hiện các thí nghiệm của Luận án. Cuối cùng, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình hai bên nội ngoại đã luôn luôn động viên tinh thần cho tôi trong thời gian thực hiện Luận án, đặc biệt tôi
iii xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình nhỏ thân yêu của tôi là vợ và hai con đã luôn đồng hành sát cánh vượt qua mọi khó khăn, hỗ trợ đắc lực cho tôi về tất cả mọi mặt để tôi hoàn thành chương trình nghiên cứu sinh và Luận án. Mặc dù đã có nhiều nỗ lực và cố gắng để hoàn thành Luận án nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong nhận được những góp ý chân thành từ các nhà khoa học, quý thầy giáo, cô giáo, đồng nghiệp và độc giả để Luận án được hoàn thiện hơn. Trân trọng cảm ơn! TÁC GIẢ LUẬN ÁN Trần Nguyên Ngọc
iv TÓM TẮT Tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) có tốc độ sinh trưởng nhanh, nuôi mật độ cao và khả năng thích nghi tốt với độ mặn, được nuôi phổ biến không những ở Việt Nam mà còn nhiều nước trên thế giới. Dịch bệnh do Vibrio là thách thức lớn nhất cho nghề nuôi tôm thẻ chân trắng hiện nay, đặc biệt bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là một trong những nguyên nhân chính gây tỷ lệ chết lên đến 100% cho tôm nuôi, làm sụt giảm nghiêm trọng sản lượng tôm nuôi ở các nước Đông Nam Á và Châu Mỹ. Kháng sinh thường được sử dụng để trị bệnh do vi khuẩn gây ra trên động vật thuỷ sản, nhưng lại không có tác dụng với bệnh này và lại gây ô nhiễm môi trường, mất vệ sinh an toàn thực phẩm và tạo ra các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh. Luận án “Sử dụng cây sài đất (Wedelia chinensis) để phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)” tại Thừa Thiên Huế được thực hiện từ 2021 đến 2024 với mục tiêu xác định được khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) của cao chiết cây sài đất trên tôm thẻ chân trắng nhằm đưa ra giải pháp phòng bệnh an toàn và hiệu quả cho nghề nuôi tôm tại Việt Nam. Nội dung nghiên cứu bao gồm: (1) Xác định thành phần hoạt chất sinh học có trong cây sài đất; (2) Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng của cao chiết sài đất; (3) Ảnh hưởng của cao chiết sài đất đến đáp ứng miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng; (4) Đánh giá hiệu quả của cao chiết cây sài đất lên khả năng phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng. Kết quả nghiên cứu về thành phần các hoạt chất sinh học trong cây sài đất, đã định tính được một số hoạt chất sinh học hiện diện trong ba dung môi methanol, hoặc ethanol, hoặc nước cất như alkaloid, flavonoid, polyphenol, carotenoid, chất béo, tinh dầu, tanin, acid hữu cơ và hợp chất khử. Hai hoạt chất có tính kháng khuẩn như polyphenol tổng và flavonoid được xác định thông qua hai đường chuẩn acid gallic và rutin. Hàm lượng polyphenol tổng có trong cao chiết với dung môi methanol hoặc ethanol hoặc nước cất lần lượt là 74,33 ± 4,49 (mg GAE/g cao chiết); 73,65 ± 5,44 (mg GAE/g cao chiết); 53,07 ± 1,48 (mg GAE/g cao chiết), hàm lượng flavonoid trong dung môi methanol (24,59 ± 2,19 mg RE/g cao chiết), ethanol (20,63 ± 4,30 mg RE/g cao chiết) hoặc nước cất (3,20 ± 0,07 mg RE/g cao chiết). Đồng thời đã xác định được hiệu suất cao chiết toàn phần trong cây sài đất ở dung môi methanol (11%), ethanol (11,3%) hoặc nước cất (18,2%). Cao chiết sài đất trong ba dung môi đều có khả năng kháng khuẩn mạnh với V. parahaemolyticus với đường kính vòng diệt khuẩn dao động từ 13,1 đến 15,1 mm, trong đó cao chiết ở dung môi methanol cho khả năng kháng khuẩn tốt nhất (đường kính vòng diệt khuẩn cao nhất là 15,1 mm). Giá trị MIC của cao chiết sài đất đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus trong các dung môi methanol hoặc ethanol hoặc nước cất lần lượt là
v 31,25 mg/L; 62,5 mg/L và 2500 mg/L. Giá trị MBC của cao chiết sài đất trong dung môi methanol là 31,25 mg/L; ethanol là 62,5 mg/L và nước cất là 5000 mg/L. Khi cho tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn có bổ sung cao chiết sài đất ở các hàm lượng khác nhau là 31,25 mg/kg thức ăn (NT1); 312,5 mg/kg thức ăn (NT2) và 625 mg/kg thức ăn (NT3) trong 3 tuần, bổ sung 2 lần với liệu trình cách tuần cho thấy tôm có tốc độ tăng trưởng tốt, cải thiện hoạt động đáp ứng miễn dịch thông qua tăng cường các chỉ số tế bào máu, hoạt động sản xuất của các loại enzyme lysozyme (LYS), phenoloxydase (PO), superoxide dismutase (SOD), hoạt động thực bào (PA) và gia tăng tỷ lệ sống khi cảm nhiễm với V. parahaemolyticus. Tỷ lệ chết tích lũy ở thí nghiệm cảm nhiễm với vi khuẩn V. parahaemolyticus theo con đường tiếp xúc trực tiếp (nuôi chung tôm cảm nhiễm với tôm không cảm nhiễm) ở các nghiệm thức bổ sung cao chiết sài đất là 24% (NT1), 12% (NT2) và 16% (NT3) thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng (không bổ sung cao chiết) chiếm (44%). Tỷ lệ chết tích lũy ở thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus theo con đường tiếp xúc gián tiếp (nuôi riêng tôm cảm nhiễm với tôm không cảm nhiễm) ở nghiệm thức đối chứng (không bổ sung cao chiết) chiếm 24%, nghiệm thức NT1 là 8%, NT2 là 4% và NT3 là 8%. Tỷ lệ bảo hộ cao chiết sài đất (RPS) bổ sung vào thức ăn của NT1, NT2 và NT3 lần lượt là 63%, 69% và 55%. Kết quả phân tích mô bệnh học cho thấy khi bổ sung cao chiết sài đất vào thức ăn ở liều lượng (31,25; 312,5 và 625 mg/kg thức ăn) không làm thay đổi cấu trúc gan tụy, tạo điều kiện tôm sinh trưởng tốt hơn và tỷ lệ sống cao hơn. Đây là nghiên cứu hoàn chỉnh đầu tiên trên cây sài đất từ việc xác định được các hoạt chất sinh học có trong cao chiết sài đất, xác định khả năng kháng khuẩn, ngưỡng an toàn và ảnh hưởng của cao chiết sài đất lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng. Từ khóa: Vibrio, thảo dược, độc tính, đáp ứng miễn dịch, khả năng kháng bệnh.
vi ABSTRACT White-leg shrimp (Penaeus vannamei) is a penaeid species which has a potential better growth rate than others, are amenable to culture at very high stocking densities and tolerates a wide range of salinities. It is widely cultured in Viet Nam and other countries worldwide. One of the biggest challenges for white-leg shrimp farming development is the outbreak disease of Vibrio, especially acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) caused by Vibrio parahaemolyticus, which is an important shrimp disease, as the mortalities can reach up to 100 percent, led to severe losses to shrimp producers in Southeast Asia and America. Antibiotics have been considered for use as a therapeutic agent in aquaculture to treat bacterial diseases. However, there is already evidence of antibiotic-resistant AHPND-caused Vibrio strains. Moreover, the use of antibiotics can result in contamination of the environment, risk to food safety. The study of Using the herb of Wedelia chinensis to prevent the acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) caused by Vibrio parahaemolyticus in whiteleg shrimp (Penaeus vannamei) which was carried out from 2021 to 2024, aims to determine the antimicrobial ability of Wedelia chinensis extract and its application in the prevention of AHPND in white-leg shrimp in order to provide a safe and effective solution for sustainable development of shrimp farming in Vietnam. The content of this study was designed with four chapters: (1) Determining the biologically active ingredients in the plant; (2) Evaluate the ability of W. chinensis extract to resist V. parahaemolyticus bacteria causing acute hepatopancreatic necrosis disease in white shrimp; (3) Effect of Solanum extract on immune response in white-leg shrimp; (4) Evaluate the effectiveness of the W. chinensis extract procumbent on the ability to prevent acute hepatopancreatic necrosis disease in white-leg shrimp. This study identified the biological composition consisting of alkaloid, flavonoid, polyphenol, carotenoid, fat, essential oil, tannin and organic acid, reducing agents in the W. chinensis extract in three solvents: methanol or ethanol or distilled water. The two antimicrobial compostion including total polyphenol and flavonoid, were determined by the standard curve of gallic acid or rutin, respectively. The total polyphenol content in the W. chinensis extract in the solvents of methanol or ethanol or water is 74.33 ± 4.49 (mg GAE/g extract), 73.65 ± 5.44 (mg GAE/g extract); 53.07 ± 1.48 (mg GAE/g extract), respectively; flavonoid content in methanol solvent was 24.59 ± 2.19 mg RE/g or in ethanol was 20.63 ± 4.30 mg RE /g, or in the distilled water was 3.20 ± 0.07 mg RE/g. The extraction efficiency of this herb was 11%, 11.3% or 18.2% in the solvent of methanol or ethanol or distilled water, respectively. The extract of W. chinensis in three solvents have strong antibacterial ability toward to V. parahaemolyticus with the diameter of antimicrobial ring was ranged from 13.1 to 15.1 mm, in which the extract of W. chinensis in methanol showed t the best
vii antibacterial ability (the diameter of antibacterial ring was up to 15.1 mm). The MIC values of the W. chinensis extract in methanol, or ethanol, or water were 31.25 mg/L; 62.5 mg/L and 2500 mg/L, respectively. The MBC value of the W. chinensis extract in methanol was 31.25 mg/L or ethanol was 62.5 mg/L or water was 5000 mg/L. When whiteleg shrimp were fed W. chinensis extract incorporated in feed at different concentrations of 31.25 mg/kg feed (NT1), 312.5 mg/kg feed (NT2) or 625 mg/kg feed (NT3) for three weeks with supplementation at seven-day intervals, they exhibited improved immune response. This included an increase in total haemocyte count (THC), and enhanced activity of lysozyme enzyme (LYS), phenoloxidase (PO), superoxide dismutase (SOD), and phagocyte activity (PA), as well as a higher survival rate when challenged experimentally with V. parahaemolyticus. In the cohabitation challenge experiment with V. parahaemolyticus (direct physical contact), the cumulative mortality rate of shrimp supplemented with W. chinensis extract was 24% (NT1), 12% (NT2), and 16% (NT3), significantly lower than the control group 44%. In a second cohabitation challenge experiment with V. parahaemolyticus (indirect physical contact), the cumulative mortality rate of shrimp supplemented with the extract was 8% (NT1), 4% (NT2), and 8% (NT3), also notably lower than the control group 24%. The relative percentage of survival (RPS) with W. chinensis extract was 63% for the treatment of NT1, 69% for NT2 and 55% for NT3. Histopathological analysis showed all the dosage of W. chinensis extract incorporated in feed (31.25 or 312.5 or 625 mg/kg of feed) used in this study which did not effect to the structure of the hepatopancreas. Additionally, the extract improved both the growth rate and survival rate of the shrimp. This study is the first to explore the use of this herb, identifying its bioactive compounds and their antimicrobial efficacy against AHPND-causing V. parahaemolyticus. Furthermore, it demonstrates the application of W. chinensis extract in enhancing the innate immune response of shrimp and their resistance to to AHPND-causing V. parahaemolyticus in white-leg shrimp. Keywords: Vibrio, herb, toxicity, immune response, bacterial disease resistant.
viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ Giải thích chữ viết tắt Tiếng việt (nếu có) viết tắt Acute Hepatopancreatic Necrosis AHPND Bệnh hoại tử gan tụy cấp Disease AMP Antimicrobial Peptides Peptide kháng khuẩn BC Bạch cầu CFU Colony Forming Unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc CP Clotting Protein Protein đông máu CS Cộng sự ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long ĐC Đối chứng DNA Deoxyribonucleic Acid Axit deoxyribonucleic EMS Early Mortality Syndrome Hội chứng chết sớm Food and Agriculture Organization Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp FAO of the United Nations của Liên hợp quốc GAE Gallic Acid Equivalent Lượng axit gallic tương đương Global Biodiversity Information Cơ sở thông tin đa dạng sinh học GBIF Facility toàn cầu Global Outlook for Aquaculture GOAL Leadership H&E Haematoxylin & Eosin HC Hyaline Cell Tế bào Hyaline HSP70 Heat Shock 70kDa Protein Protein sốc nhiệt 70kDa Ig Immunoglobulin Globulin miễn dịch IMNV Infectious Myonecrosis Virus Virus gây hoại tử cơ vân Kg Kilogram LC Large granular Cell Tế bào hạt LD50 Lethal Dose 50 Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm LPS Lipopolysaccharides LYS Lysozyme MBC Minimum Bactericidal Concentration Nồng độ tiêu diệt vi khuẩn tối thiểu MHC Major Histocompatibility Complex MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu NA Nutrient Agar Môi trường thạch dinh dưỡng NACA Network of Aquaculture Centres in Mạng lưới nuôi trồng thủy sản ở châu
ix Chữ Giải thích chữ viết tắt Tiếng việt (nếu có) viết tắt Asia-Pacific Á - Thái Bình Dương NB Nutrient Broth Môi trường lỏng dinh dưỡng National Center for Biotechnology Trung tâm thông tin Công nghệ Sinh NCBI Information học Quốc gia NN và Nông Nghiệp và Phát Triển PPNT Nông Thôn NOS Nitric Oxide Synthetase NT Nghiệm thức OD Optical Density Mật độ quang học World Organisation for Animal OIE Tổ chức Thú ý Thế giới Health PA Phagocytic Activity Hoạt động thực bào PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PG Peptidoglycan PL Postlarvae Hậu ấu trùng PO Phenoloxidase ProPO Prophenoloxidase RE Rutin Equivalent Lượng rutin tương đương ROS Reactice Oxygen Species RPS Relative Percentage Survival Tỷ lệ bảo hộ SGC Semi-Granular Cell Tế bào bán hạt SOD Superoxide Dismutase Môi trường đặc trưng nuôi cấy vi TCBS Thiosulfate-Citrate Bile Salts khuẩn Vibrio TFC Total flavonoid content Hàm lượng flavonoid toàn phần THC Total Hemocyte Count Tổng số tế bào máu TPC Total polyphenol content Hàm lượng polyphenol tổng TSA Tryptic Soy Agar TSB Tryptic Soy Broth TSV Taura Syndrome Virus Virus hội chứng Taura USD United States Dollar Đô la Mỹ WoRMS World Register of Marine Species Phân loại thế giới về sinh vật biển WSSV White Spot Syndrome Virus Virus gây bệnh đốm trắng YHV Yellow Head Virus Virus gây bệnh đầu vàng
x MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii TÓM TẮT.......................................................................................................................iv ABSTRACT ...................................................................................................................vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... viii MỤC LỤC .......................................................................................................................x DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... xiii DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................xv MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 1. Đặt vấn đề ....................................................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................................2 2.1. Mục tiêu chung .........................................................................................................2 2.2. Mục tiêu cụ thể .........................................................................................................2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .....................................................................................3 3.1. Ý nghĩa khoa học ......................................................................................................3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ......................................................................................................3 3.3. Những điểm mới của luận án ...................................................................................3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................4 1.1. Tổng quan về tôm thẻ chân trắng .............................................................................4 1.1.1. Giới thiệu về tôm thẻ chân trắng ...........................................................................4 1.1.2. Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng hiện nay ..........................................................5 1.1.3. Tổng quan về đáp ứng miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng ....................................8 1.2. Tổng quan về bệnh vi khuẩn Vibrio gây ra trên tôm thẻ chân trắng ......................14 1.2.1. Tổng quan vi khuẩn Vibrio ..................................................................................14 1.2.2. Tổng quan về bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) trên tôm thẻ chân trắng .......16 1.2.3. Giải pháp phòng trị bệnh vi khuẩn Vibrio gây ra trên tôm..................................25 1.3. Thảo dược và vai trò của thảo dược trong phòng và trị bệnh ở động vật thuỷ sản ..........................................................................................................................27 1.3.1. Tổng quan về thảo dược sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản ...............................27
xi 1.3.2. Vai trò và tác dụng thảo dược trong phòng, trị bệnh trên tôm thẻ chân trắng ....31 1.4. Tổng quan về cây sài đất ........................................................................................35 1.4.1. Hệ thống phân loại...............................................................................................35 1.4.2. Đặc điểm cây sài đất ............................................................................................36 1.4.3. Sinh thái và phân bố cây sài đất ..........................................................................37 1.4.4. Thành phần hóa học trong cây sài đất .................................................................37 1.4.5. Tác dụng dược lý của cây sài đất ........................................................................38 1.4.6. Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây sài đất ......................................................39 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......41 2.1. Địa điểm và đối tượng nghiên cứu .........................................................................41 2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .......................................................................41 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................41 2.2. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................42 2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................43 2.3.1. Phương pháp xác định thành phần các hoạt chất sinh học có trong cây sài đất ..43 2.3.2. Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng của cao chiết sài đất. .......................................................................48 2.3.3. Phương pháp đánh giá ngưỡng an toàn của cao chiết sài đất lên tôm thẻ chân trắng ......................................................................................................................50 2.3.4. Phương pháp xác định ảnh hưởng của cao chiết sài đất đến các chỉ tiêu miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng ..........................................................................................54 2.3.5. Phương pháp đánh giá hiệu quả của cao chiết cây sài đất lên khả năng phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng ..........................................................................57 2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................................62 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................63 3.1. Kết quả xác định các thành phần hoạt chất sinh học và hiệu suất chiết xuất cao toàn phần có trong cây sài đất .......................................................................................63 3.1.1. Xác định các thành phần hoạt chất sinh học có trong cây sài đất .......................63 3.1.2. Hiệu suất chiết xuất cao toàn phần có trong cao chiết cây sài đất ......................68 3.2. Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng của cao chiết sài đất ........................................................................69
xii 3.2.1. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết sài đất ở ba dung môi với vi khuẩn V. parahaemolyticus ......................................................................................................69 3.2.2. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), nồng độ tiêu diệt tối thiểu (MBC) của cao chiết sài đất ở ba loại dung môi đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND ..........................................................................................................72 3.3. Kết quả đánh giá ngưỡng an toàn của cao chiết sài đất trên tôm thẻ chân trắng ..75 3.4. Ảnh hưởng của cao chiết sài đất đến khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng .........................................................................................................78 3.4.1. Ảnh hưởng của cao chiết sài đất lên tổng số tế bào máu (THC) trên tôm thẻ chân trắng ......................................................................................................................78 3.4.2. Ảnh hưởng của cao chiết sài đất lên hoạt tính enzyme lysozyme (LYS) trên tôm thẻ chân trắng.................................................................................................................80 3.4.3. Ảnh hưởng của cao chiết sài đất lên hoạt tính enzyme phenoloxidase (PO) trên tôm thẻ chân trắng .........................................................................................................81 3.4.4. Ảnh hưởng của cao chiết sài đất lên hoạt tính superoxide dismutase (SOD) trên tôm thẻ chân trắng .........................................................................................................82 3.4.5. Ảnh hưởng của cao chiết sài đất lên hoạt động thực bào trên tôm thẻ chân trắng ......................................................................................................................84 3.5. Đánh giá hiệu quả của cao chiết sài đất lên khả năng phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng .........................................................................................................86 3.5.1. Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung (liệu trình bổ sung) cao chiết sài đất lên khả năng phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp gây bệnh thực nghiệm trực tiếp. ............................................................................................................86 3.5.2. Hiệu quả của cao chiết sài đất lên khả năng phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng. .....................................................................................................................97 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................102 4.1. Kết luận.................................................................................................................102 4.2. Kiến nghị ..............................................................................................................103 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................104 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .......136 PHỤ LỤC ....................................................................................................................140
xiii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Diện tích, sản lượng và năng suất nuôi tôm thẻ chân trắng ở Việt Nam từ 2009 đến 2023 .................................................................................................................7 Bảng 1.2. Chức năng hoạt động miễn dịch của các loại tế bào máu ở giáp xác ...........10 Bảng 1.3. Đặc điểm sinh hóa của một số loài vi khuẩn Vibrio .....................................15 Bảng 1.5. Một số loại thảo dược sử dụng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản .............30 Bảng 1.6. Cơ chế diệt khuẩn của các nhóm hoạt chất tách chiết từ thảo dược .............33 Bảng 2.1. Bảng đánh giá mức độ kháng vi sinh vật của cao chiết sài đất.....................49 Bảng 2.2. Thí nghiệm xác định ngưỡng an toàn của cao chiết sài đất lên tôm thẻ chân trắng lần thứ nhất. ..........................................................................................................52 Bảng 2.3. Thí nghiệm xác định ngưỡng an toàn của cao chiết sài đất lên tôm thẻ chân trắng lần thứ hai. ............................................................................................................53 Bảng 2.4. Các nghiệm thức thí nghiệm xác định liệu trình bổ sung cao chiết lên khả năng phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng.......................................................57 Bảng 2.5. Thí nghiệm đánh giá hiệu quả của cao chiết sài đất lên khả năng phòng bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng ...................................................................................60 Bảng 3.1. Kết quả xác định các hoạt chất sinh học có trong cây sài đất .......................63 Bảng 3.2. Hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid toàn phần trong ba loại dung môi ........................................................................................................................66 Bảng 3.3. Hiệu suất chiết xuất cao toàn phần của sài đất..............................................68 Bảng 3.4. Đường kính vòng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus của cao chiết sài đất với ba dung môi methanol, ethanol và nước cất. ...........................................................69 Bảng 3.5. Kết quả sàng lọc và xác định nồng độ MIC của cao chiết sài đất lên vi khuẩn V. parahaemolyticus ......................................................................................................72 Bảng 3.6. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ tiêu diệt tối thiểu (MBC) của cao chiết sài đất lên vi khuẩn V. parahaemolyticus. .....................................................73 Bảng 3.7. Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng trong đánh giá ngưỡng an toàn lần thứ nhất. .........................................................................................................................75 Bảng 3.8. Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng trong đánh giá ngưỡng an toàn lần thứ hai ............................................................................................................................76 Bảng 3.9. Tổng số tế bào máu của tôm ở các nghiệm thức không cho ăn và cho ăn cao chiết sài đất ....................................................................................................................78
xiv Bảng 3.10. Hoạt tính lysozyme của tôm ở các nghiệm thức không cho ăn và cho ăn cao chiết sài đất ....................................................................................................................80 Bảng 3.11. Hoạt tính enzyme PO của tôm ở các nghiệm thức thí nghiệm không cho ăn và cho ăn cao chiết sài đất .............................................................................................81 Bảng 3.12. Hoạt tính SOD của tôm ở các nghiệm thức thí nghiệm không cho ăn và cho ăn cao chiết sài đất .........................................................................................................83 Bảng 3.13. Hoạt động thực bào của tôm ở các nghiệm thức không cho ăn và cho ăn cao chiết sài đất..............................................................................................................84 Bảng 3.14. Tỷ lệ bảo hộ cao chiết (RPS) của tôm chân trắng được sử dụng cao chiết sài đất trộn với thức ăn sau khi ngâm với V. parahaemolyticus ...................................89
xv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tôm thẻ chân trắng ..........................................................................................4 Hình 1.2. Biểu đồ nuôi tôm thẻ chân trắng các nước trên thế giới (màu cam) ...............5 Hình 1.3. Sản lượng nuôi tôm ở các nước châu Á từ năm 2010 đến năm 2024 .............6 Hình 1.4. Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu ở tôm......................................................9 Hình 1.5. Hình dạng tế bào máu tôm thẻ chân trắng .....................................................10 Hình 1.6. Bản đồ xuất hiện bệnh AHPND ở các nước trên thế giới (mũi tên màu đỏ) 17 Hình 1.7. Plasmid mang gene pirA và pirB của các chủng V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm. .................................................................................................18 Hình 1.8. Hình thái vi khuẩn V. parahaemolyticus dưới kính hiển vi điện tử (trái) và nhuộm Gram (phải) .......................................................................................................19 Hình 1.9. Trình tự gene plasmid pVHvo liên quan đến AHPND trong V. owensii, nhận dạng trình tự của plasmid pVH .....................................................................................20 Hình 1.10. Tôm thẻ chân trắng không bị bệnh AHPND với khối gan tụy sậm màu, sắc nét, ruột đầy (A); tôm thẻ chân trắng bị bệnh AHPND có màu nhợt nhạt ruột rỗng, gan tụy nhợt nhạt, teo (B). ....................................................................................................22 Hình 1.11. Mô bệnh học gan tụy tôm bị bệnh AHPND, (A) tế bào biểu mô biểu hiện nhân trương to (mũi tên đen) và (B) mô bệnh học gan tụy tôm khỏe ...........................23 Hình 1.12. Giai đoạn cấp tính sớm của bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng, (A) tế bào biểu mô bong tróc (mũi tên đen), (B) sự xuất hiện của các hạt nhân trương to (mũi tên đỏ) ............................................................................................................................23 Hình 1.13. Gan tụy tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) bị ảnh hưởng bởi AHPND, giai đoạn cấp tính, bong tróc các tế bào biểu mô ống (mũi tên đỏ) .....................................24 Hình 1.14. Tôm thẻ chân trắng bị nhiễm AHPND, giai đoạn cuối. ..............................24 Hình 1.15. Tỷ lệ % hoạt tính các chiết xuất thảo dược sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ..........................................................................................................................29 Hình 1.16. Cây sài đất (W. chinensis) ...........................................................................35 Hình 1.17. Một số bộ phận của cây sài đất (W. chinensis) ............................................36 Hình 2.1. Cao chiết cây sài đất (W. chinensis) ..............................................................41 Hình 2.2. Khuẩn lạc vi khuẩn V. parahaemolyticus trên môi trường TCBS ................42 Hình 2.3. Tôm thẻ chân trắng thí nghiệm (P. vannamei) ..............................................42
xvi Hình 2.4. Sơ đồ tạo cao chiết toàn phần ở ba dung môi ................................................44 Hình 2.5. Sơ đồ xác định các nhóm hoạt chất sinh học từ ba dung môi .......................45 Hình 2.6. Phản ứng giữa flavonoid và AlCl3 .................................................................47 Hình 2.7. Thức ăn sau khi phối trộn với cao chiết sài đất .............................................51 Hình 2.8. Thí nghiệm đánh giá ngưỡng an toàn của cao chiết sài đất...........................53 Hình 2.9. Hệ thống thí nghiệm ảnh hưởng cao chiết sài đất lên đáp ứng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng .........................................................................................................54 Hình 2.10. Phương pháp lấy máu tôm ...........................................................................55 Hình 2.11. Hình dạng tế bào máu tôm (mũi tên xanh) ..................................................55 Hình 2.12. Phương pháp cảm nhiễm trực tiếp V. parahaemolyticus với tôm thẻ chân trắng ......................................................................................................................58 Hình 2.13. Phương pháp cảm nhiễm gián tiếp V. parahaemolyticus với tôm thẻ chân trắng bằng hình thức nuôi chung ...................................................................................59 Hình 2.14. Phương pháp cảm nhiễm gián tiếp V. parahaemolyticus với tôm thẻ chân trắng bằng hình thức nuôi riêng .....................................................................................60 Hình 3.1. Phương trình đường chuẩn acid gallic...........................................................65 Hình 3.2. Phương trình đường chuẩn rutin ....................................................................66 Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn V. parahaemolyticus của cao chiết sài đất với ba loại dung môi (1) ethanol, (2) methanol và (3) nước cất...............................................70 Hình 3.4. Kết quả khi thử resazurin của V. parahaemolyticus trên đĩa 96 giếng ..........73 Hình 3.5. Tôm thẻ chân trắng ở NT ĐC và tôm ở các NT bổ sung cao chiết sài đất ....76 Hình 3.6. Cấu trúc gan tụy của tôm thí nghiệm ............................................................77 Hình 3.7. Sự ngưng kết của vi khuẩn trên các tế bào máu tôm (mũi tên đỏ) ................85 Hình 3.8. Tỷ lệ chết tích lũy của tôm thẻ chân trắng sau 7 ngày cho ăn cao chiết sài đất và cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus ................................................................86 Hình 3.9. Tỷ lệ chết của tôm thẻ chân trắng sau khi cho ăn cao chiết sài đất với liệu trình 2 lần cách tuần và cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus. .............................87 Hình 3.10. Tôm thẻ chân trắng bình thường (A) và tôm bị nhiễm bệnh AHPND (B)..90 Hình 3.11. Tôm khỏe mạnh với gan tụy sẫm màu và sắc nét........................................91 Hình 3.12. Cấu trúc khối gan tụy bình thường của tôm khỏe mạnh cho thấy ống gan bình thường với khoang ở trung tâm và sự hiện diện của tế bào mầm ........................92
xvii Hình 3.13. Tôm khỏe mạnh với chế độ ăn có bổ sung cao chiết sài đất (A), tôm bị nhiễm V. parahaemolyticus (B) với chế độ ăn không bổ sung cao chiết sài đất. ..........93 Hình 3.14. Biểu mô gan tụy tôm sau khi cảm nhiễm V. parahaemolyticus vào ngày thứ 7 .....................................................................................................................93 Hình 3.15. Tôm khỏe có gan tụy màu hơi nâu với chế độ ăn có bổ sung cao chiết sài đất (A) và tôm với chế độ ăn không bổ sung cao chiết sài đất có gan tụy nhợt nhạt, ngả vàng (B) vào ngày thứ 14 sau khi cảm nhiễm với V. parahaemolyticus.......................94 Hình 3.16. Gan tụy tôm khỏe với khoang ống bình thường khi được cho ăn thức ăn có bổ sung sài đất với liều 312,5 mg/kg thức ăn (A), 625 mg/kg thức ăn (B). ..................94 Hình 3.17. Sự phá hủy nghiêm trọng ở ống gan tụy với sự thâm nhiễm và lan rộng của các tế bào máu (B) và tế bào gan tụy bị hoại tử hoàn toàn kèm theo sự xuất hiện của vi khuẩn (A). ......................................................................................................................95 Hình 3.18. Hình thái khuẩn lạc V. parahaemolyticus trên môi trường TCBS ..............97 Hình 3.19. Tỷ lệ chết tích lũy của tôm thẻ chân trắng sau khi cảm nhiễm với vi khuẩn V. parahaemolyticus (Nhóm 1) .....................................................................................98 Hình 3.20. Tỷ lệ chết tích lũy của tôm thẻ chân trắng sau khi cảm nhiễm với vi khuẩn V. parahaemolyticus (Nhóm 2) .....................................................................................99 Hình 3.21. Dấu hiệu bệnh lý của tôm nhiễm bệnh và tôm khỏe .................................100
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nuôi trồng thuỷ sản đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế nước ta, với sản lượng thuỷ sản Việt Nam đứng thứ tư trên thế giới, kim ngạch xuất khẩu lên đến hàng tỷ USD hàng năm [86]. Tuy nhiên, dịch bệnh xảy ra đặc biệt bệnh do vi khuẩn là một trong những thách thức chính cho sự phát triển thủy sản nước ta cũng như trên thế giới [41]. Hiện nay, để điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra trên động vật thuỷ sản, người nuôi chủ yếu sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh gây ra nhiều tác động xấu cho môi trường và tồn dư kháng sinh ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Quan trọng hơn hết, kháng sinh trong môi trường nước có thể tạo ra các chủng vi sinh vật kháng thuốc, các plasmid chứa gene kháng thuốc có thể lan truyền cùng loài hay khác loài, nguy hiểm hơn là các gene kháng thuốc này có thể lan truyền cho các chủng vi khuẩn gây bệnh trên người và động vật khác [3]. Đặc biệt, trong bối cảnh Việt Nam đã cam kết hướng đến việc loại bỏ kháng sinh khỏi thực phẩm chăn nuôi từ năm 2018 [3] và việc cấm sử dụng một số loại kháng sinh trong chăn nuôi và thủy sản từ năm 2022 của Liên minh Châu Âu (EU) [204], thì việc sử dụng các chất sinh học hay thảo dược trong phòng và trị bệnh vi khuẩn gây ra trên động vật thuỷ sản đáp ứng yêu cầu vệ sinh thực phẩm, an toàn cho người sử dụng là một yêu cầu cấp thiết. Bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute hepatopancreatic necrosis disease - AHPND), là một bệnh nguy hiểm có thể gây ra tỷ lệ chết cao (lên tới 100%) ở tôm nuôi trên toàn thế giới [222]. AHPND gây ra do nhóm vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Vibrio, chủ yếu là Vibrio parahaemolyticus (viết tắt là VpAHPND) mang plasmid chứa các gene độc tố nhị phân PirA và PirB (Photorhabdus insect-related -Pir) gây ra [222], [229], [253]. Vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên các loài tôm thuộc họ tôm he Penaeid, trong đó tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) và tôm sú (Penaeus monodon) là hai loài tôm nuôi nhạy cảm nhất. Bệnh AHPND được phát hiện đầu tiên trên tôm thẻ chân trắng nuôi tại Trung Quốc, Malaysia và Việt Nam vào năm 2010, sau đó được báo cáo ở tôm thẻ chân trắng nuôi tại Thái Lan (2011), Mexico (2013), Philippines (2014), các nước Nam Mỹ (2014 - 2016), Bangladesh (2017), Mỹ (2017), Đài Loan (2018), Hàn Quốc (2019) và Nhật Bản (2020) [68], [100], [126], [181], [183], [184]. Theo báo cáo của Shinn và cs (2018), thiệt hại do bệnh AHPND gây ra trong ngành nuôi tôm trên thế giới ước tính khoảng 7 tỷ USD mỗi năm [208]. Do khả năng lây lan nhanh và gây ra thiệt hại lớn, AHPND được đưa vào danh mục các bệnh nguy hiểm của tổ chức sức khoẻ động vật thế giới (World Organisation for Animal Health - OIE) [182]. Nghiên cứu các giải pháp phòng và trị bệnh này trên tôm nuôi mà không sử dụng kháng sinh đang là mối quan tâm hàng đầu của các nước trên thế giới. Thảo dược được xem là một trong những giải pháp để thay thế kháng sinh, trong thảo dược chứa các hoạt chất sinh học kháng khuẩn tự nhiên được xem là giải pháp an toàn