Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển các vector nhị thể ứng dụng trong cải biến di truyền một số loài nấm sợi

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:214

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được thực hiện với mục tiêu nhằm tạo được các vector nhị thể mới và thiết lập được hệ thống chuyển gen tối ưu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho ba loài nấm sợi là Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum và Penicillium digitatum. Điều tra được vai trò của gen laeA ở cả ba loài nấm sợi nghiên cứu nhờ áp dụng hệ thống chuyển gen tối ưu đã thiết lập. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển các vector nhị thể ứng dụng trong cải biến di truyền một số loài nấm sợi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ SỐ : 9420101.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. TRẦN VĂN TUẤN 2. PGS.TS. NGUYỄN QUANG HUY HÀ NỘI – 2019
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Trần Văn Tuấn và PGS.TS. Nguyễn Quang Huy. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trong các Tạp chí Khoa học, phần còn lại chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2019 Tác giả luận án Vũ Xuân Tạo
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Văn Tuấn, Trƣởng Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN là ngƣời thầy cho tôi cơ hội đƣợc thực hiện luận án, tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Quang Huy, Trƣởng Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, ngƣời thầy đã tận tình truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu, luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, đặc biệt là PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà và TS. Phạm Thế Hải đã giảng dạy, truyền đạt cho tôi những kiến thức mới và luôn luôn tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành đƣợc khóa học này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, Giám đốc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein và tập thể cán bộ Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành các nghiên cứu. Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận đƣợc sự hỗ trợ từ đề tài NAFOSTED (mã số: 106-NN.04-2014.75 và 106.04-2018.36). Tôi luôn trân trọng sự hỗ trợ này. Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học và Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại Trƣờng. Cuối cùng tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, ngƣời thân - những ngƣời luôn luôn ở bên, ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2019 Tác giả luận án Vũ Xuân Tạo
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 Chƣơng 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .....................................4 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum VÀ Penicillium digitatum…………………………………………………………...4 1.1.1. Sơ lƣợc về chi nấm Aspergillus ....................................................................4 1.1.2. Nấm Aspergillus niger ..................................................................................5 1.1.3. Sơ lƣợc về chi nấm Penicillium ....................................................................7 1.1.4. Nấm Penicillium chrysogenum .....................................................................9 1.1.5. Nấm Penicillium digitatum .........................................................................12 1.2. PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO NẤM SỢI THÔNG QUA VI KHUẨN A. tumefaciens (ATMT) ............................................................................................15 1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn A. tumefaciens .............................................................16 1.2.2. Cơ chế chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens ......................................17 1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ............................................................................................19 1.2.4. Vector dùng trong chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens ....................20 1.2.5. Marker chọn lọc cho chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ............................................................................................................23 1.2.6. Promoter điều hòa biểu hiện gen ở nấm sợi ................................................25 1.2.7. Gen chỉ thị DsRed và GFP dùng trong chuyển gen ở nấm sợi ...................26 1.2.8. Ƣu điểm của phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ...............................................................................................................................28 1.2.9. Sử dụng phƣơng pháp ATMT trong nghiên cứu chuyển gen ở nấm sợi ....29 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ GEN laeA Ở NẤM SỢI ..............................32 1.3.1. Protein LaeA và tƣơng tác trong phức hệ protein velvet ở nấm sợi ...........32 1.3.2. Nghiên cứu về vai trò của gen laeA ở nấm sợi ...........................................33 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................36
2.1. VẬT LIỆU .........................................................................................................36 2.1.1. Chủng vi sinh vật ........................................................................................36 2.1.2. Các vector sử dụng trong nghiên cứu .........................................................37 2.1.3. Thiết bị và hóa chất .....................................................................................38 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................38 2.2.1. Thu bào tử và hệ sợi nấm ............................................................................39 2.2.2. Đánh giá khả năng mẫn cảm kháng sinh.....................................................40 2.2.3. Tách chiết DNA, RNA và tổng hợp cDNA ................................................40 2.2.4. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen ..............................................41 2.2.5. Tối ƣu quy trình chuyển gen ở nấm A. niger, P. digitatum và P. chrysogenum thông qua vi khuẩn A. tumefaciens .................................................49 2.2.6. Xóa và phục hồi gen laeA ở các nấm sợi nghiên cứu .................................50 2.2.7. Sàng lọc và xác nhận các thể chuyển gen ...................................................51 2.2.8. Điều tra vai trò của gen laeA ở các loài nấm sợi nghiên cứu ......................52 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................55 3.1. PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN HIỆU QUẢ CAO SỬ DỤNG MARKER KHÁNG KHÁNG SINH ........................................................................55 3.1.1. Nghiên cứu chuyển gen vào nấm A. niger sử dụng phƣơng pháp ATMT và marker là gen kháng kháng sinh............................................................................55 3.1.2. Phát triển hệ thống chuyển gen hiệu quả cao ở nấm P. chrysogenum và P. digitatum sử dụng marker kháng kháng sinh ........................................................57 3.2. PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN SỬ DỤNG MARKER TRỢ DƢỠNG pyrG Ở A. niger VÀ P. chrysogenum ......................................................68 3.2.1. Tạo thành công chủng A. niger N402 và P. chrysogenum VTCC-F1172 đột biến khuyết dƣỡng uridine/uracil ..........................................................................68 3.2.2. Xây dựng quy trình chuyển gen tối ƣu vào A. niger và P. chrysogenum khuyết dƣỡng uridine/uracil ..................................................................................74 3.3. NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN laeA Ở A. niger, P. chrysogenum VÀ P. digitatum....................................................................................................................80
3.3.1. Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở A. niger ................................................80 3.3.2. Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở P. chrysogenum ...................................94 3.3.3. Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở P. digitatum .......................................106 KẾT LUẬN ............................................................................................................117 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................119 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ...............................................................................................................120 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................121
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 5-FOA 5-fluoroorotic acid A. nidulans Aspergillus nidulans A. niger Aspergillus niger A. oryzae Aspergillus oryzae A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) CD Czapek-Dox cDNA Complementary deoxyribonucleic acid (ADN bổ trợ) DNA Deoxyribonucleic acid DsRed Red fluorescent protein (Protein huỳnh quang đỏ) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid E. coli Escherichia coli FDA Food and Drug Administration (Cục Quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kỳ) GFP Green fluorescent protein (Protein huỳnh quang xanh) HEPES 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid IM Induction medium (môi trƣờng cảm ứng) ITS Internal transcribed spacer kb Kilobase pair LaeA Loss of aflR-expression A (Mất biểu hiện aflR) LB Luria- Bertani (môi trƣờng LB) /
Left Border (biên trái) MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid MM Minimal medium (môi trƣờng tối thiểu) ORF Open reading frame (khung đọc mở) P. chrysogenum Penicillium chrysogenum P. digitatum Penicillium digitatum PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PDA Potato dextrose agar PEG Polyethylen glycol RB Right Border (biên phải) RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate S. aureus Staphylococcus aureus SM Synthetic medium (Môi trƣờng tổng hợp) ura Uracil uri Uridine vir Virulence gene (gen gây bệnh /gen độc lực) WT Wild type (chủng tự nhiên)
DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1. Danh sách các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu 36 Bảng 2.2. Các vector sử dụng trong nghiên cứu 37 Bảng 3.1. Kết quả xác định số bản sao của gen laeA ở các chủng A. niger 92 biểu hiện quá mức gen laeA
DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Một số đại diện thuộc chi nấm Aspergillus 4 Hình 1.2. Hình ảnh hiển vi của A. niger 6 Hình 1.3. Hình thái một số nấm mốc thuộc chi Penicillium 8 Hình 1.4. Hình thái khuẩn lạc P. chrysogenum trên các môi trƣờng 10 Hình 1.5. Hình thái nấm P. digitatum 12 Hình 1.6. Hình thái vi khuẩn A. tumefaciens dƣới kính hiển vi điện tử 17 Hình 1.7. Cơ chế chuyển gen vào vi nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 18 Hình 1.8. Mốc thời gian quan trọng về nghiên cứu phát triển vector từ năm 21 1970 đến nay Hình 1.9. Cấu trúc vector đồng tích hợp 22 Hình 1.10. Mô hình tổng quát về hệ thống vector nhị thể 23 Hình 1.11. Biểu hiện gen GFP ở nấm sợi A. oryzae 27 Hình 1.12. Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi A.oryzae 28 Hình 1.13. Các protein velvet hình thành các phức hệ phân tử và ảnh hƣởng 33 của chúng đến sự phát triển và sản sinh các chất trao đổi bậc hai ở nấm Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 39 Hình 3.1. Chuyển gen vào A. niger thông qua vi khuẩn A. tumefaciens sử 56 dụng marker là gen kháng hygromycin Hình 3.2. Sơ đồ và kiểm tra vector pPK2-Red, pGreen3 và pPK2-Red2 bằng 58 cắt với enzym giới hạn Hình 3.3. Quy trình chuyển gen tối ƣu vào nấm P. chrysogenum và P. 60 digitatum Hình 3.4. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed và GFP ở P. digitatum PdVN1 63 Hình 3.5. Xác nhận biểu hiện gen GFP ở P. chrysogenum VTCC-F1172 64 Hình 3.6. Biểu hiện gen huỳnh quang đỏ DsRed sử dụng marker là gen 65 kháng phleomycin ở P. digitatum PdVN1 và P. chrysogenum VTCC-F1172
Hình 3.7. Sự xâm nhiễm của nấm P. digitatum PdVN1 mang gen DsRed và 67 GFP trên cam dƣới kính hiển vi huỳnh quang Hình 3.8. Cấu trúc xóa gen pyrG ở A. niger và P. chrysogenum 69 Hình 3.9. Xác nhận các chủng xóa gen pyrG ở A. niger N402 71 Hình 3.10. Khả năng khuyết dƣỡng uridine/uracil và kháng 5-FOA của các 73 chủng P. chrysogenum chuyển gen xóa pyrG Hình 3.11. Cấu trúc và cắt kiểm tra vector pEX2A bằng enzym giới hạn 75 Hình 3.12. Quy trình chuyển gen hiệu quả cao cho nấm A. niger và P. 78 chrysogenum khuyết dƣỡng uridine/uracil Hình 3.13. Biểu hiện gen huỳnh quang đỏ DsRed ở chủng A. niger khuyết 79 dƣỡng uridine/uracil Hình 3.14. Sơ đồ tạo cấu trúc xóa gen laeA ở A. niger 81 Hình 3.15. Xác nhận xóa gen laeA ở A. niger 83 Hình 3.16. Cắt kiểm tra vector phục hồi gen laeA ở A. niger 85 Hình 3.17. Xác nhận phục hồi gen laeA ở A. niger 86 Hình 3.18. Xác nhận biểu hiện quá mức gen laeA ở A. niger 87 Hình 3.19. Sự sinh trƣởng của các chủng A. niger trên các nguồn cacbon 88 Hình 3.20. Sự hình thành bào tử của các chủng A. niger trên các nguồn 89 cacbon Hình 3.21. Sự sinh trƣởng và hình thành bào tử của các chủng A. niger trên 90 nguồn nitơ là nitrat và amon Hình 3.22. Khả năng tạo tủa sữa của các chủng A. niger xóa và phục hồi gen 90 laeA Hình 3.23. Khả năng tạo tủa sữa của các chủng A. niger biểu hiện quá mức 91 gen laeA Hình 3.24. Biểu hiện của một số gen ở chủng xóa gen laeA so với chủng tự 93 nhiên N402 Hình 3.25. Tạo cấu trúc xóa gen laeA ở P. chrysogenum 94
Hình 3.26. Xác nhận chủng xóa gen laeA bằng PCR 96 Hình 3.27. Xác nhận phục hồi gen laeA ở nấm P. chrysogenum 98 Hình 3.28. Xác nhận biểu hiện quá mức gen laeA ở nấm P. chrysogenum 99 khuyết dƣỡng uridine/uracil Hình 3.29. Sự hình thành bào tử của các chủng P. chrysogenum trên nguồn 101 nitơ là nitrat và amon Hình 3.30. Khả năng chịu stress của các chủng P. chrysogenum trên nguồn 103 nitơ là nitrat và amon Hình 3.31. Sự sinh trƣởng và sinh kháng sinh kháng khuẩn của các chủng P. 104 chrysogenum trên nguồn nitơ là nitrat và amon Hình 3.32. Khả năng sinh kháng sinh kháng khuẩn của các chủng P. 106 chrysogenum biểu hiện quá mức gen laeA Hình 3.33. Sơ đồ tạo vector xóa gen laeA ở nấm sợi P. digitatum 107 Hình 3.34. Sơ đồ tạo vector phục hồi gen laeA ở nấm sợi P. digitatum 108 Hình 3.35. Xác nhận xóa và phục hồi gen laeA ở P. digitatum 110 Hình 3.36. Xác nhận biểu hiện quá mức gen laeA ở P. digitatum 111 Hình 3.37. Sự sinh trƣởng của các chủng P. digitatum trên các nguồn cacbon 112 Hình 3.38. Sự hình thành bào tử của các chủng P. digitatum dƣới sự tác động 113 của D-sorbitol Hình 3.39. pH dịch nuôi cấy các chủng nấm P. digitatum 114 Hình 3.40. Khả năng gây hỏng cam của các chủng nấm P. digitatum 115 Hình 3.41. Khả năng gây hỏng cam của chủng biểu hiện quá mức gen laeA 116
MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Nấm sợi là những loài mang lại nhiều lợi ích thiết thực cho con ngƣời nhƣ enzym, protein, chất có hoạt tính sinh học, nhƣng chúng cũng gây ra những thiệt hại khôn lƣờng nhƣ tàn phá cây trồng, gây hỏng thực phẩm, sinh độc tố, gây bệnh cho ngƣời và động vật. Các nghiên cứu trên thế giới về nấm sợi đã bƣớc qua nhiều giai đoạn khác nhau từ những điều tra cơ bản sử dụng các phƣơng pháp truyền thống cho đến các nghiên cứu hiện đại ở mức độ gen và protein. Nhiều loài nấm có lợi đƣợc xếp vào diện an toàn đã đƣợc giải trình tự hệ gen hoàn toàn nhƣ Aspergillus niger và Penicillium chrysogenum. Bên cạnh đó, hệ gen của nấm bệnh thực vật Penicillium digitatum cũng đã đƣợc giải trình và phân tích. Dữ liệu chi tiết về hệ gen của nấm sẽ giúp chúng ta có một cái nhìn tổng quát về các gen chịu trách nhiệm cho sinh tổng hợp các chất, cũng nhƣ các gen giữ những vai trò quan trọng trong quá trình lây nhiễm của nấm bệnh thực vật. A. niger là một trong những loài phổ biến và quan trọng nhất về mặt công nghiệp thuộc chi Aspergillus. Loài nấm này đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất nhiều loại enzym và axit hữu cơ. Gần 99% lƣợng axit citric đƣợc sản xuất trên thế giới là nhờ A. niger. Trong số những loài nấm đƣợc ứng dụng nhiều trong sản xuất công nghiệp, P. chrysogenum nổi tiếng với khả năng sinh tổng hợp kháng sinh penicillin, kháng sinh đầu tiên thuộc họ β-lactam đƣợc phát hiện bởi Alexander Fleming. Nhiều chủng P. chrysogenum tự nhiên đã đƣợc gây đột biến thành công để tạo ra các chủng công nghiệp có hiệu suất sinh tổng hợp penicillin rất cao. Tuy nhiên, năng lực sinh tổng hợp các chất có lợi của các chủng phân lập từ tự nhiên thƣờng tƣơng đối thấp. Để nâng cấp năng lực cho các chủng tự nhiên, các kỹ thuật về cải biến chỉnh sửa hệ gen thƣờng đƣợc áp dụng. Bên cạnh những loài nấm mang lại nhiều lợi ích thiết thực, cũng có nhiều loài gây hại đặc biệt nghiêm trọng đối với sản xuất nông nghiệp. Nấm P. digitatum là tác nhân gây hỏng nhiều loại quả có múi ở giai đoạn sau thu hoạch. Loài nấm này tồn 1
tại phổ biến ở các nƣớc nhiệt đới, trong đó có Việt Nam. Bên cạnh việc tấn công làm hỏng quả, gây tổn thất về kinh tế, các sản phẩm trao đổi chất bậc hai do nấm sinh ra có thể gây nên những ảnh hƣởng tiêu cực đối với sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Nghiên cứu làm sáng tỏ vai trò của các gen liên quan đến gây bệnh ở vi nấm có thể góp phần tạo dựng nền tảng phục vụ phát triển các giải pháp hiệu quả nhằm kiểm soát các vi nấm gây hại. Để cải biến di truyền vi nấm, nhiều phƣơng pháp chuyển gen đã đƣợc phát triển nhƣ chuyển gen qua tế bào trần, chuyển gen bằng xung điện và chuyển gen trung gian qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Phƣơng pháp chuyển gen qua tế bào trần và chuyển gen bằng xung điện có nhiều hạn chế nhƣ kỹ thuật thực hiện phức tạp, chi phí cao và không ổn định. Trong khi đó, phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc chứng minh là hiệu quả và có tính ổn định cao. Nghiên cứu phát triển đƣợc các hệ thống chuyển gen mới với hiệu quả cao, chi phí thấp và có thể sử dụng chung cho nhiều loài nấm sợi là hết sức cần thiết. Hệ thống chuyển gen là sự kết hợp giữa phƣơng pháp chuyển gen tối ƣu nhờ vi khuẩn A. tumefaciens và các vector nhị thể mới đƣợc thiết lập sẽ hỗ trợ tích cực cho các nghiên cứu về cải biến di truyền và điều tra vai trò của các gen quan trọng ở vi nấm. Từ những lý do trên, đề tài luận án đƣợc tiến hành với tiêu đề: “Nghiên cứu phát triển các vector nhị thể ứng dụng trong cải biến di truyền một số loài nấm sợi”. 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Tạo đƣợc các vector nhị thể mới và thiết lập đƣợc hệ thống chuyển gen tối ƣu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho ba loài nấm sợi là Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum và Penicillium digitatum. - Điều tra đƣợc vai trò của gen laeA ở cả ba loài nấm sợi nghiên cứu nhờ áp dụng hệ thống chuyển gen tối ƣu đã thiết lập. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Tạo các vector nhị thể mang marker kháng kháng sinh, marker trợ dƣỡng phục vụ chuyển gen vào ba loài nấm sợi (A. niger, P. chrysogenum và P. digitatum) sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens. 2
- Xây dựng hệ thống chuyển gen tối ƣu dựa trên cơ chế kháng kháng sinh và cơ chế trợ dƣỡng. - Xóa, phục hồi, biểu hiện quá mức gen laeA và điều tra vai trò của gen laeA ở cả ba loài nấm sợi. 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Đây là công trình đầu tiên phát triển đƣợc các hệ thống chuyển gen tối ƣu nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với các vector nhị thể mới để phục vụ cho nghiên cứu cải biến di truyền ba loài nấm sợi quan trọng là Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum và Penicillium digitatum. Đề tài luận án cũng đã chứng minh hiệu quả của hệ thống vector nhị thể tạo đƣợc bằng cách áp dụng trực tiếp vào việc biểu hiện gen, xóa gen ở ba loài nấm sợi khác nhau. Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng cung cấp thêm các dữ liệu mới về vai trò của gen laeA trong điều hòa biệt hóa tế bào và trao đổi chất ở các loài nấm sợi nghiên cứu. 5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN * Đã tạo thành công 13 vector nhị thể mới dùng cho biểu hiện gen, xóa gen và bổ trợ gen ở ba loài nấm sợi gồm A. niger, P. chrysogenum và P. digitatum. * Phát triển thành công hệ thống chuyển gen hiệu quả cao sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens ở ba loài nấm sợi nghiên cứu. Lần đầu tiên, hệ thống chuyển gen hoàn toàn mới dựa trên cơ chế trợ dƣỡng uridine/uracil đƣợc thiết lập ở nấm sợi A. niger và P. chrysogenum. Đồng thời, hệ thống chuyển gen sử dụng marker kháng kháng sinh ở P. chrysogenum và P. digitatum đƣợc tối ƣu và hiệu quả chuyển gen đạt đƣợc cao hơn từ 10 đến 20 lần so với các nghiên cứu trƣớc đây. * Xóa, phục hồi và biểu hiện quá mức thành công gen laeA ở ba loài nấm sợi A. niger, P. chrysogenum và P. digitatum nhờ sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Đặc biệt nghiên cứu này đã phát hiện ra các vai trò hoàn toàn mới của gen laeA liên quan tới biệt hóa hình thái tế bào nấm, trao đổi chất và kiểm soát khả năng gây hỏng quả sau thu hoạch. 3
Chƣơng 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum VÀ Penicillium digitatum 1.1.1. Sơ lƣợc về chi nấm Aspergillus Chi Aspergillus là một trong những nhóm nấm mốc phổ biến và phân bố rộng rãi nhất trên hành tinh và đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp. Năm 1729, nhà sinh học ngƣời Italia Pier Antonio Micheli đã quan sát cấu tạo cuống sinh bào tử của một số loài nấm và phát hiện chúng có chung đặc điểm hình thái giống nhƣ “bình nƣớc thánh”. Từ đó, ông đặt tên chi nấm theo từ Latin spargere [20]. Hình 1.1. Một số đại diện thuộc chi nấm Aspergillus [171] Về mặt hình thái, khuẩn lạc của các loài thuộc chi Aspergillus có màu sắc đa dạng, khá đặc trƣng (Hình 1.1). Hệ sợi nấm có vách ngăn, có thể dài tới vài chục centimet. Các sợi nấm phát triển theo chiều dài từ đỉnh sợi và có thể phân nhánh liên tiếp tạo ra hệ sợi (mycelium) khí sinh xù xì nhƣ bông. Trên môi trƣờng đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, có thể quan sát nấm phát triển thành dạng khuẩn lạc đặc trƣng. Khuẩn lạc thƣờng mang màu sắc của bào tử. Việc tạo màu sắc cũng là 4
đặc điểm quan trọng để phân loại nấm mốc, có khi chỉ xuất hiện ở khuẩn lạc, có khi hòa tan vào trong nƣớc và khuếch tán ra môi trƣờng xung quanh [1]. Nấm Aspergillus sinh sản chủ yếu bằng phƣơng thức hình thành bào tử vô tính. Trong số 250 loài thuộc chi Aspergillus, khoảng 64% chƣa phát hiện có giai đoạn sinh sản hữu tính. Các loài đƣợc biết có sinh sản hữu tính ít gây bệnh cho con ngƣời hơn những loài chỉ đƣợc phát hiện sinh sản nhờ bào tử vô tính [61]. Chi Aspergillus đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học và công nghiệp. Trong công nghệ sinh học, một số loài thuộc chi Aspergillus đã và đang đƣợc sử dụng: A. niger, A. oryzae trong sản xuất thực phẩm và enzym. Tuy nhiên, bên cạnh đó, các loài thuộc chi này cũng gây một số bệnh nhất định cho vật nuôi và động vật hoang dã. Khả năng phát tán bào tử mạnh mẽ của một vài đại diện trong không khí, nƣớc, hạt sấy khô và nguyên liệu thực vật khiến chúng thƣờng xuyên có cơ hội tiếp xúc với động vật. Chúng có thể gây nhiễm trùng cũng nhƣ nhiễm độc. Một số độc tố đáng lƣu ý ở Aspergillus là aflatoxin, axit cyclopiazonic, glyotoxin, patulin…[21]. Trong chi Aspergillus, A. niger là loài nấm đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. 1.1.2. Nấm Aspergillus niger 1.1.2.1. Phân loại và đặc điểm sinh học của nấm A. niger Aspergillus niger là một trong những loài phổ biến nhất trong khoảng 250 loài thuộc chi Aspergillus. A. niger đƣợc mô tả vào năm 1867 trong bản thảo “physiologie des mucédinées” bởi nhà thực vật học ngƣời Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem. Ông phân lập loài nấm này với mục đích nghiên cứu việc sản xuất axit gallic từ quá trình lên men của nấm. Khi đó, ông phân lập đƣợc Penicillium glaucum và Aspergillus sp. có bào tử tƣơng tự Aspergillus glaucus nhƣng có màu đen trên các môi trƣờng khác nhau, tạo ra mùi mốc và một số đặc điểm khác. Ông đã đặt tên nó là A. niger [49]. A. niger thuộc giới nấm, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus, nhóm Aspergillus phân nhóm 5
Nigri, còn gọi là phân nhóm Aspergillus đen. Trong phân nhóm này còn có 14 loài khác cũng có bào tử màu đen, rất dễ nhầm lẫn với A. niger [87]. Khuẩn lạc của nấm A. niger có màu trắng hoặc vàng, bị che khuất bởi màu đen của bào tử sinh sản vô tính mọc trên bề mặt. Hệ sợi nấm kéo dài, có vách ngăn và trong suốt (Hình 1.2). Bào tử đính thƣờng dài từ 900-1600 µm và chứa các bọng bào tử dài khoảng 40-60 µm [46]. Hình 1.2. Hình ảnh hiển vi của A. niger [80, 136] A. niger có khả năng sinh trƣởng mạnh mẽ với giới hạn nhiệt rộng từ 6-47°C. Khoảng nhiệt độ từ 35 tới 37°C là khoảng mà loài nấm này phát triển mạnh mẽ nhất. Độ ẩm cần thiết cho A. niger so với các loài khác cùng chi lại khá cao, đạt 0,88. Khoảng pH cho nấm phát triển rất rộng, trải dài từ 1,4 tới 9,8. Những đặc điểm trên giúp cho A. niger có khả năng sinh trƣởng tốt ở nhiều điều kiện khác nhau, tạo lƣợng lớn bào tử, phát tán dễ dàng trong không khí, có khả năng lây nhiễm và ức chế nhiều loài nấm khác, đặc biệt là khi ở trong môi trƣờng nóng và ẩm ƣớt. A. niger sinh sản chủ yếu bằng bào tử vô tính. Chƣa phát hiện thấy giai đoạn hữu tính tồn tại ở nấm này [148]. A. niger là một vi nấm mô hình quan trọng đối với một số lĩnh vực nghiên cứu, bao gồm nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp protein, enzym, cơ chế phân tử và các cơ chế liên quan tới việc kiểm soát đặc điểm hình thái nấm. Kích thƣớc hệ gen của A. niger đƣợc ƣớc tính có kích thƣớc khoảng 35,5-38,5 Mb, chia thành 8 nhiễm sắc thể/nhóm liên kết có kích thƣớc khác nhau (từ 3,5-6,6 Mb). Hiện tại, có 6
ba dự án khác nhau đang độc lập nghiên cứu về hệ gen của A. niger, thể hiện tầm quan trọng của vi nấm này. Lƣợng dữ liệu phong phú từ nhiều trình tự gen của A. niger sẽ đƣợc đƣa vào các chƣơng trình nghiên cứu cơ bản và ứng dụng cho phát triển quy trình lên men, hình thái và bệnh học [11]. Hiện nay, hệ gen của ba chủng A. niger khác nhau đã đƣợc giải trình tự là NRRL 3, CBS 513.88 và ATCC 1015. Hai trong số các chủng đƣợc giải trình tự, NRRL 3 và ATCC 1015 là các chủng hoang dại, trong khi đó chủng CBS 513.88 là chủng đột biến để nâng cao khả năng sản xuất glucoamylase [192, 194]. 1.1.2.2. Vai trò của nấm A. niger A. niger đóng vai trò quan trọng không thể phủ nhận trong công nghiệp. Sản phẩm tiêu biểu của A. niger là axit citric đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để tạo đồ uống có ga, nƣớc hoa quả, mứt, kẹo và rƣợu. Axit citric do A. niger sản xuất có lƣợng lớn nhiều hơn hẳn so với những axit hữu cơ khác, ví dụ nhƣ axit gluconic [151]. Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã xếp A. niger là một nguồn tạo axit citric tiềm năng [158]. Ngoài ra, A. niger có khả năng sản xuất nhiều loại enzym quan trọng nhƣ pectinase cho sản xuất nƣớc quả và rƣợu để làm giảm độ bột và tăng sự thanh mát, glucose oxidase và catalase để phân giải các thành phần hƣ hại trong thực phẩm. Một số nghiên cứu gần đây khẳng định khả năng phân giải các cơ chất mạnh mẽ của A. niger có thể đƣợc ứng dụng trong xử lý môi trƣờng, bao gồm việc tẩy khoáng cho nƣớc với khả năng hấp thu tới 96,61% lƣợng ion thừa trong nƣớc và phân giải phốt-pho trong đất trồng dạng đá rắn để làm tăng năng suất cây trồng [5]. Về phƣơng diện nghiên cứu, A. niger là sinh vật mô hình có khả năng ứng dụng hiệu quả nhƣ một hệ thống biểu hiện protein ngoại lai. Cải biến di truyền nấm sợi, bắt đầu từ A. nidulans và sau đó là A. niger đã đạt nhiều thành tựu, đặc biệt là trong việc biểu hiện phytase công nghiệp [5, 126]. 1.1.3. Sơ lƣợc về chi nấm Penicillium Chi Penicillium thuộc họ Trichocomaceae là một trong những chi nấm rất phổ biến, phân bố rộng rãi ở nhiều môi trƣờng sống khác nhau trên Trái Đất. Tên Penicillium xuất phát từ những điểm tƣơng đồng của cuống sinh bào tử nấm này với 7